comportamiento de lísteria monocytogenes,...
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Universidad de Costa Rica Facultad de Microbiología
Trabajo Final de Graduación para optar por el grado de Licenciatura en Microbiología y Química Clínica
Comportamiento de Lísteria monocytogenes, Salmonella sp., y Escherichia col¡ 0157:H 7 inoculadas
en queso de cabra durante su vida de almacenaje
Silvia Porras Cordero
Tutor: Dra. María Laura Arias Echandi
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio Julio, 2008
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA VICERRECTOR~A DE DOCENCIA
FACULTAD DE PMZCROBIOLOG~A CIUDAD UNIVERSITARIA RODRIGO FAGIO
Acta de presentación de Requisito Final de Graduación
Sesión del Tribunal Examinador celebrada el lunes 07 de julio del año 2008 con el objeto de recibir el informe oral de la estudiante SfLVL4 P O m S CORDERO, carné 972639, quien se acoge al Reglamento de Trabajos Finales de Graduación bajo la modalidad de PRACTICA DE G R A D U A C I ~ , para optar por el grado académico de LICENCIADA EN MICROBIOLOG~A Y QUÍMICA CL~MCA y el título profesional de DOCTORA EN MICROBIOLDG~A Y QU~MICA CLÍNICA.
Están presentes los siguientes miembros del tribunal:
Dra. María del Mar Gamboa Coronado PRESIDENTA Dra. Lizeth Taylor Castillo Dra. María Laura Arias Echandi Dra. María del Pilar Salas Chaves Dra. Carolina Chaves Ulate
La presidenta informa que el expediente de SILVLA PORRAS CORDERO, contiene todos los documentos de rigor, incluyendo el recibo de pago de los derechos de graduación. Declara que la postulante cumplió con todos los demás requisitos del plan de estudios correspondientes, y por lo tanto, se solicita que proceda a hacer la exposición.
ARTICULO 2
La postulante SILVLA PORRAS CORDERO, hace la exposición oral de su trabajo de graduación titulo uComportamiento de Listesia monocptogenes, Salmoneh sp. y Eschen'chia coLí 0167:H7 inoculadas en queso de cabra durante su vida de almacenaje".
ARTICULO 3
Terminada la disertación, los miembros del Tribunal Bxarninador interrogan a la Postulante durante el tiempo reglamentario y, una vez concluido el interrogatorio, el Tribunal se retira a deliberar.
ARTICULO 4
El tribunal considera el trab final de graduación satisfactorio y le confiere la calificación de:
ARTICULO 6
La presidenta del Tribunal comunica a la Postulante el resultado de la delíberación y la declara acreedora al grado de Licenciada en Microbiología y Qufmica Ciínica y al título profesional de Doctora en Microbiología y Química Clínica.
Se le indica la obligación de presentarse al acto público de juramentacibn al que será oportunamente convocada. Se da lectura al acta que del Tribunal Examinador y a la Postulante, a las horas.
Presidenta f 1 - 671rzdb~ 0 1
. m wg . a& ~ p a ~ ~ r a ~ k a r i a Laura Arias Echandi Dra. María del Pilar Salas
. Chaves
i
S,L"!< j3axz.3 L . Dra. Carolina Chaves Ulate Silvia Porras Cordero
Postulante
A mis padres, Diego e Inés, por su apoyo
incondicional y por siempre creer en mí
Silvia
A la Dra. María Laura Arias por su guía y por la
disposición que siempre tuvo para despejar mis dudas.
A mis lectoras Dra. María del Pilar Salas y Dra. Carolina
Chaves por sus acertadas correcciones y sugerencias a
m i trabajo.
A los miembros del Tribunal Examinador Dra. María del
Mar Gamboa y Dra. Lizeth Taylor por las observaciones y
comentarios que me permitieron completar este texto.
A toda m i familia, en especial a mis hermanos Carolina y
Diego.
CAP~TULO 1: INTRODUCCI~N:
Justificación
Problema de Investigación
Objetivo en eral
Objetivos Específicos
CAP(TULO II : MARCO TE~RICO
Situación actual de la caprinocultura en Costa Rica
Leche y Queso de cabra
Enfermedades de transmisión alimentaria
Listeria monocytogenes
Escherichia coli 0157:H7
Salmonella sp.
viii
vii
PAGINA
CAP~TULO III: METODOLOG~A
Localización del proyecto
Materiales y Métodos
Cepas utilizadas
Medios de cultivo
Queso
Método de trabajo
Esquema de Trabajo
CAP~~ULO IV: RESULTADOS
CAP~~ULO VI: CONCLUSIONES
CAP~~ULO VII: RECOMENDACIONES
Cuadro 1. Recuentos bacterianos de Listeria monocytogenes en queso
de cabra inoculado y mantenido en refrigeración por 12 días
Cuadro 2. Recuentos bacterianos de Escherichia coi¡ 0157:H7 en queso
de cabra inoculado y mantenido en refrigeración por 12 días
Cuadro 3. Recuentos bacterianos de Saimoneiia sp. en queso de cabra
inoculado y mantenido en refrigeración por 12 días
Gráfico 1. Comportamiento de Listeria monocytogenes, Escherichia coli
0157:H7 y Saimoneiia sp. inoculadas en queso de cabra durante
su vida de almacenaje.
Comportamiento de Listeria monocytagenes, Salmonella sp., y Escherichia coli 0157:H7 inoculadas en queso de cabra durante su vida de almacenaje.
Los productos lácteos constituyen una de las mayores fuentes d e ingresos en Costa Rica y
el mercado nacional está dominado por los derivados de la leche de vaca. La producción
costarricense d e leche de cabra y derivados es esencialmente artesanal pero cada vez es
más común la comercialización y el consumo de estos. La importancia de realizar este
estudio radica en que al día de hoy n o se dispone de información sobre el
comportamiento de agentes patógenos peligrosos en este t ipo de producto. Se investiga
el comportamiento de bacterias enteropatógenas en queso de cabra almacenado a
temperatura de refrigeración. Las cepas utilizadas se inoculan en el queso de cabra y se
realiza un recuento inicial, la cantidad restante se almacena a temperatura de
refrigeración (4 - S 9C) por 12 días, cada 72 horas se toman alícuotas del queso inoculado
y se analizan para determinar el compotiamiento de las bacterias en el queso a través del
tiempo. Para Listeria monocHoaenes la concentración bacteriana disminuye en 1
logaritmo, en Escherichia coli 0157:H7 la concentración disminuye en 2 logaritmos y la
mayor disminución se da en el caso d e Salmonella sp. donde la concentración final
obtenida es S logaritmos menor a la inicial. Se concluye que L. monocytogenes y E. col¡
0157:H7 son resistentes a las condiciones de almacenamiento escogidas y Salmonella sp.
es el microorganismo más susceptible de los tres en estudio. La resistencia observada de
estas bacterias a las condiciones de almacenamiento escogidas representa un riesgo
eventual para el consumidor.
Palabras clave: Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Escherichia col¡ 0157:H7, Queso
de cabra
Justificación
Los productos lácteos constituyen una de las mayores fuentes de ingresos en Costa
Rica, siendo una de las agroindustrias más pujantes tanto a nivel agrosilvopastoril como
agroindustrial (Díaz, 2004).
Estos productos forman una cadena en la generación de empleos que va desde la
persona que está en el campo hasta el establecimiento que vende el producto final. No
obstante su amplitud a nivel nacional, este mercado está dominado por los derivados de la
leche de vaca.
La producción costarricense de leche de cabra y derivados es esencialmente
artesanal, no existen grandes plantas procesadoras que se dediquen a la industrialización de
esta clase de lácteos; y mucha de la producción es destinada al abastecimiento doméstico o
para la venta en lugares aledaños al sitio de manufactura (Chacón, 2003).
Actualmente en nuestro país es cada vez más común la comercialización y el consumo
de leche de cabra y sus derivados, entre ellos el queso. De ahí, la importancia de realizar este
tipo de estudios, ya que al día de hoy no se dispone de información sobre el comportamiento
de agentes patógenos peligrosos en este tipo de producto. La oportunidad de generar datos
al respecto es de gran relevancia ya que a partir de estos es posible desarrollar o recomendar
medidas preventivas, si fuese necesario, respecto al almacenaje de este producto, con las
cuales se beneficien tanto la industria como el consumidor.
Problema de investigación
¿Cuál es el comportamiento de bacterias enteropatógenas en el queso de cabra, durante su
vida de almacenaje a temperatura de refrigeración?
Objetivo general
Evaluar el comportamiento de Lísteria monocytogenes, Salmonella sp. y
Escherichia coli 0157: H7 inoculadas en queso de cabra durante su vida de
almacenaje.
Objetivos específicos
Determinar el comportamiento de L. monocytogenes inoculada en queso de
cabra almacenado a temperatura de refrigeración.
m Determinar el comportamiento de Salmonella sp. inoculada en queso de
cabra almacenado a temperatura de refrigeración.
m Determinar el comportamiento de E. col; 0157:H7 inoculada en queso de
cabra almacenado a temperatura de refrigeración.
Situación actual de la caprinocultura en Costa Rica
La caprinocultura costarricense está teniendo un gran impulso en los últimos años por
el potencial que representa su modelo intensivo Agroforestal Caprino. Este modelo es capaz
de producir en concordancia con el ambiente niveles productivos de más de 16.000 kg de
leche/ha/año, lo que unido a su alta rentabilidad económica, constituye un importante factor
socioeconómico para los pequeños productores. El sistema agroforestal caprino ofrece una
alternativa sostenible para aumentar la biodiversidad animal y vegetal, así como, aumentar
los niveles de producción animal. El modelo, se inserta directamente con factores de
desarrollo y se promociona a nivel educativo para impulsar que pequeños empresarios
hagan uso 'del crédito y la incorporación de procesos agroindustriales que permiten un alto I
valor agregado de los productos (%idalgo, 2004).
Gracias al trabajo conjunto de varias entidades, entre ellas el Ministerio de
Agricultura y Ganadería, la Asociación Costarricense de Criadores de Cabras, la Universidad
de Costa- Rica y el Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza que han
desarrollado e impulsado el Modelo Agroforestal Caprino Costarricense es que se ha logrado
que la producción nacional pasara de 90.000 kg de leche en 1975 a 11.000.000 kg en el 2003
(Castro, 2003).
En cuanto al tipo de productos, existe una demanda creciente por los productos
lácteos de cabra tanto a nivel nacional como internacional, por ser un producto delicattesen
(quesos finos, yogurt, cajetas, dulces) los cuales además se complementan por sus cualidades
biomedicinales especialmente indicados por su alto valor nutritivo, fácil digestibilidad, etc.
(Hidalgo, 2004).
Leche y Queso de cabra
La leche es el líquido segregado por las hembras de los mamíferos a través de las
glándulas mamarias, cuya finalidad básica es alimentar a su cría durante un determinado
tiempo; su importancia se basa en su alto valor nutritivo, ya que sus componentes se
encuentran en forma y proporciones adecuadas (Gallo, 2006).
La leche como alimento proporciona proteínas, carbohidratos y vitaminas. Es una
excelente fuente de sales minerales, principalmente de calcio y fósforo. Tiene una infinidad
de formas de industrialización, probablemente debido a que es un producto de mucha
aceptación a nivel de consumidores en todo el mundo. De la leche se pueden obtener
derivados directos, como queso, yogurt, mantequilla, etc; también se puede usar como
ingrediente importante en la elaboración de muchos otros productos alimenticios.
Mundialmente, la cabra es el principal suplidor de ~ roduc tos lácteos y carne para las
poblaciones rurales, este es el primero de tres aspectos que han causado un aumento en su
demanda en los últimos años. El segundo aspecto es el interés del conocedor por productos
derivados de la leche de cabra como quesos y yogures, esto principalmente en países
desarrollados. El Último aspecto que ha causado un aumento en la demanda de este
producto es el uso medicinal que le dan principalmente las personas con problemas de
alergias a la leche de vaca y con otros males gastrointestinales (Haenlein, 2004)
La leche de cabra es de gran valor económico por la eficiencia de producción de los
animales y los altos rendimientos alcanzados. Su composición varía debido a muchos factores
como la raza, período de lactación, estación del año, alimentación y el estado de salud del
animal (Corrales, 2004).
Los constituyentes de la leche básicamente son de tres tipos: el agua, la grasa y los
compuestos sólidos no grasos (proteínas, lactosa y minerales). El agua es el mayor
componente y constituye cerca del 88% de la leche, en el están disueltos todos los otros
compuestos. La grasa presente en la leche de cabra es mejor digerida que la que contiene la
leche de vaca debido a que se encuentra en forma de glóbulos o gotitas de menor tamaño y
esto permite una mayor superficie de exposición para el ataque enzimático (Castro, 2003).
Tiene grandes cantidades de aminoácidos esenciales como metionina y cisteína, y posee
menor cantidad de lactosa que la leche de vaca por lo que se presenta menor cantidad de
problemas relacionados con la intolerancia a este carbohidrato. Además es rica en vitaminas
A y D .
Composición comparativa de las leches de vaca y cabra
Constituyente Origen (96) Vaca Cabra
Proteínas 3.30 3.40 Lactosa 4.80 4.40 Grasa 3.95 4.30
Cenizas (minerales) 0.71 0.77 Sólidos Totales 12.76 12.87
Fuente: Corrales, 2004
La calidad microbiológica de la leche y sus derivados está influenciada por la flora
inicial de la leche cruda, el procesamiento y la contaminación post - pasteurización. La leche
cruda frecuentemente se contamina con microorganismos patógenos provenientes de los
animales o de las personas que manipulan la leche. En el pasado, el consumo de esta leche o - de sus derivados resultaba en brotes de diversas enfermedades entre ellas fiebre tifoidea,
difteria, tuberculosis. La asociación de estos problemas con la leche ha sido esencialmente
eliminada por medio de un mejoramiento en salud animal y sanitización, a través de la
pasteurización de la leche para consumo como tal o para la elaboración de varios productos
(Marth, 2001). A pesar de estas mejoras, la leche y sus derivados no están exentos de
problemas debido a que se siguen presentando cuadros de intoxicación alimentaria por
Staphylococcus aureus u otros tipos de infecciones como salmonelosis, listeriosis o
infecciones por Escherichia coli enteropatogénica o enterohemorrágica.
Sin embargo, en la leche no solamente es posible encontrar microorganismos
patógenos, también se encuentran los que resultan deseables para la elaboración de
productos de buena calidad, por ejemplo, las bacterias acidolácticas.
El queso es una forma de conservar los principales constituyentes de la leche, y una
buena alternativa para transformar y valorizar la leche de cabra.
Enfermedades de transmisión alimentaria
Las enfermedades transmisibles por alimentos (ETA's) son síndromes originados por
la ingestión de alimentos o agua, que contienen agentes etiológicos en cantidades tales que
afectan la salud del consumidor tanto individual o en grupos de población. Cuando dos o más
personas que presentan una enfermedad similar sufren un transtorno después de ingerir
alimentos (incluida el agua) del mismo origen, donde la evidencia epidemiológica y/o el
laboratorio implica a estos como vehículos, esto es lo que se conoce como brote de ETA's.
Según la Organización Panamericana de la Salud (OPS), el Instituto Panamericano de
Protección de Alimentos y Zoonosis (INPPAZ), y su sistema SIRVETA, el hogar, es el lugar
donde ocurren más intoxicaciones de tipo alimentario, y a su vez es el que presenta más
subregistro de todos (Montero y Acuña, 2007).
Tanto en los países desarrollados como en los países en desarrollo existe una
importante cantidad de enfermedades de transmisión alimentaria. Cada año enferman miles
de millones de personas en todo el mundo por consumir alimentos contaminados e
insalubres.
Las enfermedades de origen alimentario se consideran como la mayor causa de
morbilidad, tanto en países industrializados como en vías de desarrollo, y en estos últimos
son causa frecuente de mortalidad. La magnitud del impacto socio-económico que generan
estas enfermedades es difícil de medir, más aún cuando muchos casos ni siquiera son
informados (Arias y Antiltón, 2000). Además del sufrimiento humano que provocan, estas
enfermedades tienen consecuencias especialmente graves para las economías emergentes
ya que ponen a prueba la capacidad de los sistemas de atención sanitaria y afectan a l a
productividad económica general (OMS, 2001).
La etiología de las enfermedades de transmisión alimentaria es amplia e incluye
bacterias, virus, hongos, parásitos, productos químicos y toxinas de origen vegetal y animal.
Oent~o de las bacterias causantes de enfermedades de origen alimentario se destacan
Staphylococcus aureus y Clostridium botulinum como agentes causantes de intoxicación,
Bacillus cereus y Clostridiurn petfringens como agentes causantes de toxiinfección, y diversos
agentes causantes de infección, como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y
Escherichia coli 0157:H7, bacterias descritas por la Organización Mundial de la Salud como
"una nueva y significativa amenaza a la salud pública" (Arias y Antillón, 2000).
E! probtema se ha iricrenientado en tos últimos años debido a ta g!oba!ización, ta I
producción centralizada de alimentos y a los cambioshn los hábitos alimentarios. Por lo
anterior, organismos internacionales como la Organización Panamericana de la Salud
(OPS)/OMS han recomendado el establecimiento de sistemas de vigilancia de estas
enfermedades que permitan detectar oportunamente !a aparición de brotes, conocer la
magnitud del problema y diseñar estrategias de prevención y control de las mismas (Helms et
al, 2006).
En Costa Rica aún no se cuenta con un sistema de vigilancia de las enfermedades de
transmisión alimentaria, por lo que no se dispone de información sistematizada sobre el
probtema. E! Centro Nacional de Referencia en Bacteriología del INCIENSA (CNRB), desde
hace 15 años ha brindado apoyo a l sistema de vigilancia epidemiológica y a los laboratorios
de la red nacional en la investigación de brotes de diarrea que se presentan en el país
(Bolaños-Acuña et al, 2007).
Listeria monocytogenes
El género Listeria consiste en un grupo de bacterias gram positivas con un bajo
contenido de Guanina + Citosina cercanamente relacionado con Bacillus, Clostridium,
Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. (Vázquez-Boland e t al, 2001).
Listeria spp. es un bacilo anaerobio facultativo, que no forma esporas, no tiene
cápsula y presenta movilidad por flagelos peritricos entre los 10 y 25°C. El género incluye
seis especies L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri y L. grayi;
todas son catalasa positiva y oxidasa negativa. L. monocytogenes tiene la capacidad de crecer
en un amplio rango de temperaturas (2 -45°C).
Listeria spp. puede ser aislada de una gran diversidad de ambientes, incluyendo suelo,
agua, una gran variedad de alimentos y heces de humanos y animales. Se cree que el
hábitat natural de estas bacterias se piensa que se trata de rwter ia orgánica en
descomposición, en donde viven como saprófitos. Los rumiantes doméstic b S probablemente
juegan un papel clave en mantener a Listeria spp. en el ambiente rural vía u n ciclo continuo
de enriquecimiento fecal - oral (Vázquez-Boland e t al, 2001 ).
Este patógeno se puede adaptar para sobrevivir y crecer en una amplia gama de
condiciones ambientales y causar listeriosis, enfermedad severa con altas tasas de
hospitalización y muerte. Los ancianos, mujeres embarazadas, neonatos e
inmunocomprometidos son las poblaciones más susceptibles de sufrir listeriosis (Gandhi y
Chikindas, 2007).
La supervivencia y crecimiento a temperaturas de refrigeración (2 - 4°C) es uno de los
factores que dificultan el control de este patógeno y debido a que la refrigeración de
productos es uno de los métodos más utilizados para alargar la vida media de estos, esta es
una de las características más estudiadas de la bacteria.
Dentro de los mecanismos que le permiten a esta bacteria sobrevivir al estrés
causado por las bajas temperaturas se encuentran: cambios en la composición de la
membrana, cambios en la inducción de genes y en la expresión de proteínas, además de la
capacidad de la bacteria para utilizar ciertos solutos como crioprotectores.
El crecimiento a bajas temperaturas resulta en un incremento en la cantidad de
ácidos grasos insaturados en la membrana, con el fin de mantener la fluidez requerida para
una adecuada actividad enzimática y el transporte de solutos a través de la misma
(Gandhi y Chikindas, 2007).
L. monocytogenes tiene la habilidad para acumular solutos compatibles como
glicinbetaína y carnitina. La acumulación de estos es una respuesta común a un aumento
osmótico, manteniendo una presión osmótica favorable sin alteración en la estructura de las
proteínas intracelulares (Becker et al, 2000). En L. monocytogenes ocurre que compuestos
osmoprotectores también actúan como crioprotectores (Bayles y Wilkinson, 2000).
La sobrevivencia a diferentes tipos de estrés incluye una respuesta adaptativa por
parte de la bacteria y esta se encuentra mediada por proteínas que se expresan cuando se
hay exposición a diferentes estímulos. Estas proteínas pueden ser chaperonas, las que
asisten en el adecuado doblamiento o ensamblaje de proteínas dañadas por el estrés o
pueden ser proteasas, que degradan proteínas dañadas (Gandhi y Chikindas, 2007).
Su papel significativo como patógeno humano transmitido por alimentos sólo se hace
evidente a partir de 1980, cuando comienzan a aparecer en la literatura informes
documentados de brotes de listeriosis, detectados por consumo de alimentos contaminados.
Hoy en día, L. monocytogenes se considera uno de los agentes más importantes de
enfermedades de transmisión alimentaria. Las explicaciones posibles de la emergencia de la
listeriosis humana transmitida por alimentos como un asunto de máximo interés de salud
pública comprenden los cambios importantes en la producción, procesamiento y distribución
de los alimentos. Además se mencionan la utilización cada vez mayor de la refrigeración
como medio de conservación primaria de los alimentos, los cambios en los hábitos de comida
de la población, particularmente respecto a la comodidad de los alimentos ya preparados y
un incremento del número de personas consideradas de alto riesgo de sufrir la enfermedad
(OIE, 2004).
L. monocytogenes es patogénica para animales y humanos, no presenta especificidad
de huésped. La infección ocurre en varios pasos: entrada al huésped e internalización celular,
escape antes de la unión fagosoma - lisosoma y multiplicación en el citosol, polimerización
de filamentos de actina y expansión célula a célula. Cada paso requiere de la expresión de
factores de virulencia específicos.
Factores de virulencia de importancia en la adhesión e invasión de la bacteria:
lnternalina A (InlA): Promueve la entrada a las células epiteliales y juega un papel
importante para cruzar la barrera intestinal. Su receptor es la E - cadherina
m lnternalina B (InlB): Promueve la entrada a diferentes líneas celulares, incluyendo
hepatocitos y células no epiteliales.
Principales factores de virulencia involucrados en el ciclo de vida intracelular:
Listeriolisina O (LLO): Proteína formadora de poros, relacionada con el escape del
fagosoma antes de la unión fagosoma - lisosoma.
Fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) y la Fosfolipasa C específica
de fosfatidilcolina (PC-PLC): Son proenzimas, requeridas para la lisis eficiente del
fagosoma secundario formado por el mecanismo de dispersión intercelular.
Act A: Proteína cuya función es polimerizar los filamentos de actina de la célula
que permite el movimiento intra e intercelular de la bacteria.
Los signos clínicos de una infección por L. monocytogenes son similares en todos los
huéspedes susceptibles. La infección se presenta básicamente de dos formas: listeriosis
perinatal y listeriosis en el paciente adulto. En ambos casos, la forma clínica predominante
corresponde a infección diseminada o infección local del Sistema Nervioso Central. (Vázquez-
Boland et al, 2001).
La listeriosis perinatal puede presentarse de dos formas: temprana y tardía. En la
presentación temprana, la infección ocurre durante el embarazo y se da un cuadro de
corioamnionitis. Es asintomática en la madre, o con sintomatología inespecífica como
gastroenteritis leve. Si sobreviene en los primeros tres meses de embarazo puede originar
aborto. Si ocurre después de los seis meses de embarazo, el niño puede nacer con un cuadro
de granulomatosis infantiséptica, en este cuadro el niño nace con el cuerpo cubierto de
granulomas, con infección generalizada y meningitis. Por lo general, el niño no sobrevive, la
enfermedad es muy grave y la supervivencia está asociada a secuelas muy serias. La forma
tardía se presenta ocho o diez días después del nacimiento. Se manifiestan síntomas de
gastroenteritis, neumonía y meningitis en las primeras ocho semanas de vida del bebé. Se da
en forma tardía porque el niño se contamina a través del canal de parto (mujer portadora
asintomática). Las meningitis bacterianas en niños recién nacidos tienen consecuencias muy
serias.
El cuadro más común en adultos es la bacteremia, se reportan además formas atípicas
de enfermedades como artritis, endocarditis, oftalmitis, etc, en forma muy aislada y que
generalmente resuelven rápidamente y no pasan a ser sistémicos.
Los alimentos contaminados-son considerados la principal fuente de infección en
epidemias así como también en casos esporádicos, por lo tanto el tracto gastrointestinal es el
sitio de entrada primario para L. monocytogenes. El desarrollo de la enfermedad depende del
tamaño del inóculo, virulencia de la cepa y susceptibilidad del individuo (Peiris, 2005). La
leche, el queso, los vegetales frescos, el pollo, las setas, el pavo y muchos otros suelen ser los
alimentos implicados más frecuentemente. El queso es uno de los más estudiados
intensivamente debido a su conocida asociación con la listeriosis de origen alimentario
(Farber y Peterkin, 1991).
La dosis mínima infectante no ha sido determinada con exactitud y se estima que
varía de lo2 unidades formadoras de colonia (ufc) a lo9 ufc, dependiendo del estado
inmunológico del huésped; es por esto que existe una política, segun la FDA y otras
entidades, de cero tolerancia de presencia de este patógeno en alimentos ya listos para el
consumo humano (FDA, 2008). El periodo de incubación de la enfermedad varía de 11 a 70
días (media de 21 días) en humanos (Jemmi y Stephan, 2006).
Escherichia col¡ 0157:H7
Escherichia col¡ fue descrita en 1885 por el pediatra alemán Dr. Theodor Escherich
como Bacterium coli commune al aislarla de heces de niños sanos. Todavía hoy se dice que E.
col¡ es la especie más abundante de aerobios facultativos de la microbiota intestinal normal
del humano. Esta simbiosis le provee a la bacteria un ambiente nutritivo y al huésped le
ofrece nutrientes esenciales para el epitelio intestinal y promueve una respuesta inmune
saludable. Además, se sabe que E. col¡ se encuentra involucrada en la síntesis de vitamina K
en el huésped. Ciertas cepas de E. coli son importantes como un factor de inhibición del
crecimiento de enteropatógenos (Eklund, 2005). E. coli es capaz de sorbrevivir en el
ambiente, agua y alimentos; además de diseminarse eficientemente (Faiella-Tommasino y
Reigert, 2002).
Es una bacteria Gram negativa típica de la familia Enterobacteriaceae, donde todos
los miembros comparten las siguientes características: aerobios facultativos, catalasa
positivos y oxidasa negativos, fermentan carbohidratos y no forman esporas.
Aunque es parte de la microflora normal del tracto gastrointestinal de mamíferos y
aves, ciertas cepas han sido asociadas con enfermedades gastrointestinales tanto en
humanos como animales. (Caprioli et al, 2005).
Las cepas patogénicas de E. col¡ poseen diferentes factores de virulencia, como
adhesinas, invasinas, entero y citotoxinas codificadas por plásmidos extracromosomales, islas
de patogenicidad cromosomal o bacteriófagos integrados, para vencer las defensas del
huésped y así causar enfermedades tanto intestinales como extraintestinales. Las
presentaciones clínicas más comunes de infecciones causadas por E. col¡ patogénicas son
infección del tracto urinario, sepsis y meningitis, y enfermedad diarreica (Kaper et al., 2004).
La clasificación de esta bacteria se realiza basándose en diferencias antigénicas
(serotipos) y en diferencias de factores de virulencia (virotipos). Dos componentes de
superficie de E. col¡ son los principales utilizados para la clasificación serológica: el antígem O
del lipopolisacárido (LPS, O) y los antígenos flagelares (H). El antígeno O identifica el
serogrupo de una cepa y la combinación de antígeno O y antígeno H identifica al serotipo
(Pouch e Ito, 2001).
Las cepas diarreogénicas de E. col¡ pueden ser clasificadas en 6 grupos, los cuales
presentan sindromes clínicos similares: a
vscherichia col¡ enterohemorrágica (ECEH)
m Escherichia col¡ enterotoxigénica (ECET)
Escherichia col¡ enteropatogénica (ECEP)
= Escherichia col¡ enteroinvasora (ECEI)
= Escherichia col¡ enteroagregativa (ECEA)
Escherichia col¡ difusamente adherente (ECDA)
El grupo de ECEH es caracterizado por la producción de potentes citotoxinas que
inhiben la síntesis proteica en células eucariotas. Estas toxinas son llamadas Verocitotoxinas
(VT), por la actividad que tienen sobre células Vero o también pueden ser llamadas toxinas
similares a Shiga (Stx), por ser similares a la toxina producida por Shigella dysenteriae. Por
esto, a estas cepas se les conoce como E.coli productoras de Stx (STEC) o E. w l i productoras
de VT (VTEC).
Las STEC son descritas como un grupo heterogéneo de bacterias altamente
patogénicas con una dosis infectante muy baja; incluso de 1 - 100 células son capaces de
causar enfermedad (Eklund, 2005).
El término "E. col¡ enterohemorrágica" (EHEC) se acuñó originalmente para
denominar a cepas que causan colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico, expresan
Stx, presentan un patrón característico de lesión localizada ("Attaching and Effacing" o t ipo
A/E), donde las bacterias se adhieren al tejido y borran las vellosidades del intestino y poseen
el plásmido 60 MDa. Así, con EHEC se denota a un subtipo de STEC e incluye una connotación
clínica que no se implica con el término STEC. Mientras que no todas las cepas STEC son
patogénicas, todas las cepas EHEC por definición son consideradas patógenas (Nataro y
Kaper, 1998).
. Sin embargo otros autores definen a las EHEC como un subtipo de STEC donde la
mayoría posee el gen eae, elcual codifica para una intimina y son patogénicas para humanos
(Tarr e t al, 2005). De acuerdo a la Organización de la Salud, EHEC se define como una
bacteria E. coli productora de Stx.
- Entre los factores de virulencia presentes en las EHEC se encuentran: producción de
S tx l y/o Stx2, formación de un patrón característico en el epitelio intestinal (), actividad
enterohemolítica, producción de serin proteasas Esp, presencia de un sistema especial de
catalasas KatP, producción de ToxB (proteína homologa a las citotoxinas producidas por los
clostridios), metaloproteasa StcE, una enterotoxina estable al calor (EAST), proteína de
adhesión Iha, factores de colonización asociados a fimbrias y endotoxinas del lipopolisacárido
(Eklund, 2005).
La patogénesis se presenta en varios pasos, primero la adherencia a los enterocitos
del colon mediante una fimbria específica, codificada por un plásmido de virulencia, luego se
da una adherencia íntima produciendo la misma lesión "attachement and effacement" o t ipo
A/E observada para ECEP que está mediada por la proteína de membrana externa intimina,
con alteración del citoesqueleto de la célula hospedero y por último la producción de
citotoxinas, las cuales a nivel local producen inhibición de la síntesis proteica y daño celular
directo, lo que da como resultado necrosis hemorrágica de las vellosidades intestinales, con
escasa infiltración de polimorfonucleares y explica la diarrea con sangre (Nataro y Kaper,
1998)
ECEH puede producir desde infecciones asintomáticas, cuadros de diarrea acuosa
(10% de los casos), hasta el cuadro clásico de diarrea con sangre y mucus (90% de los casos),
la que es precedida por 1 a 2 días de deposiciones acuosas, dolor abdominal, fiebre de corta
evolución y vómitos. El periodo de incubación es de 3 a 4 días, y el cuadro de diarrea con
sangre se prolonga por 4 a 10 días. La excreción bacteriana posterior a la resolución del
episodio se mantiene por 17 a 20 días.
Las complicaciones se presentan en un 5 a 10% de los casos, y corresponden a
prolapso rectal, apendicitis, intususpección, cistitis hemorrágica, colecistitis, y alteraciones
~ ~ I ' S N C , siendo el Síndrome Urémico Hemolítico (CUH) la complicación más severa y que se
observa hasta en un 7% de los casos según lo observado en situaciones de un brote. La
letalidad varía en diferentes series entre 1 al 10% (Tarr et al, 2005).
E. col¡ 0157:H7 es un patógeno de origen alimentario emergente que ha sido asociado
con brotes severos de intoxicación alimentaria, en los cuales han sido implicados productos
cárnicos y quesos (Rosenberg, 2003).
Esta bacteria no presenta una resistencia inusual al calor y el cocimiento adecuado de
los alimentos (70 QC por 2 minutos o un equivalente) logra eliminar al microorganismo, por
lo que la pasteurización elimina efectivamente a la bacteria. La temperatura mínima para el
crecimiento 7 QC y la máxima es 44.5eC, con una temperatura óptima de crecimiento de 37
X. E. col¡ 0157:H7 también puede crecer a temperatura ambiente. Este organismo sobrevive
a bajas temperaturas y resiste temperaturas de congelación (Food Safety Authority of
Ireland, 2000).
Salmonella sp.
Los miembros de este género son bacilos gram negativos pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae, flagelados, no encapsulados, no esporulados, anaerobios facultativos. En
su superficie poseen un antígeno somático O y uno flagelar H (proteínas), y los antígenos
termolábiles de la cubierta (Vi). Según el esquema de Kauffmann-White se clasifican 9
serogrupos (A-1) definidos por el antígeno 0, todos los miembros de un serogrupo muestran
un antígeno O mayor y uno o varios antígenos O menores. El antígeno Vi está presente en S.
typhi y raramente en S. paratyphi C; este antígeno es capsular y muestra una gran virulencia
(Gómez et al, 2007). Los antígenos somáticos son termoestables y su especificidad radica en
el componente polisacárido de la endotoxina, complejo proteína - lipopolisacárido. Los
antígenos O se clasifican en mayores y menores; los mayores son los que definen un grupo
antigénico.
En la naturaleza encontramos más de 2.000 serotipos de Salmonella agrupados en
tres apartados según el huésped afectado (Trepat, 2002):
Salmonella serotipos typhi y paratyphi, altamente adaptados al huésped humano.
Salmonella serotipos altamente adaptados a huésped no humano y que
raramente producen patología en el hombre salvo S. dublin (equina) y S.
choleraesuis.
Salmonella no adaptada a huésped específico con más de 1.800 serotipos. Más
del 80 % de gérmenes que causan infecciones en países desarrollados
corresponden a este grupo, y en países en desarrollo un alto porcentaje de casos
corresponden al primer grupo.
Salmonella se encuentra distribuída por todo el mundo y es universalmente reconocida
como un agente zoonótico. Se han identificado muchos reservorios y muchos alimentos
especialmente los de origen animal, han sido identificados como vehículos transmisores de
este patógeno a los humanos.
La transmisión de esta bacteria es fecal oral (Roberts, 2002). Los alimentos más
asociados son los de carácter proteínico: huevo crudo, carne de cerdo, carne de res, pollo,
productos lácteos, vegetales, etc.
Los productos lácteos figuran en un puesto importante como agentes transmisores de
Salmonella, en los últimos años se han descrito muchos casos de salmonelosis humana
debido al consumo de queso contaminado. La ocurrencia de Salmonella en queso
generalmente refleja una contaminación post - pasteurización. También es viable que la
fuente de contaminación sea directamente el ganado debido a que las vacas al padecer
salmonelosis, tuberculosis o brucelosis pueden transmitir la bacteria a la leche. En un brote
ocurrido en Canadá donde el producto involucrado era un queso Cheddar fabricado con
leche sin pasteurizar, las investigaciones llevaron a una granja donde se encontró que una
sola vaca estaba excretando y contaminando la leche con Salmonella en una concentración
de 200 ufc/ml. (Rosenberg, 2003).
Los alimentos de origen animal también se contaminan a través de los equipos sucios
donde son procesados o por ambientes contaminados. La contaminación cruzada se produce
por el contacto de los alimentos crudos durante su proceso de elaboración con alimentos o
utensilios contaminados con Salmonella, pudiendo esta permanecer y multiplicarse en los
equipos y en el ambiente (Gómez Campderá et al, 2006).
La dosis infectante de Salmonella varía entre 10' y lo9 bacterias/gramo, sin embargo,
según la naturaleza del alimento y el estado del huésped, puede ser tan baja 6x10'
bacterias/gramo (Arias et al, 2006). Según Wilm (2006) solamente se necesitan de 10 a 100
bacterias para provocar infección, aunque menciona la posibilidad de que un solo
microorganismo sea capaz de producirla.
Salmonella pasa a través del estómago y sobrevive a su pH ácido produciendo una
respuesta de tolerancia al ácido y coloniza el ileo dista1 (Wilm, 2006). Despúes de la ingestión
de la bacteria, la infección se caracteriza por la adhesión de la bacteria a las células del lumen
intestinal por medio de fimbrias o pili. Selectivamente se adhiere a células epiteliales
especializadas (células M) de la placa de Peyer. La bacteria es entonces internalizada por
medio de un mecanismo de endocitosis mediada por receptor y transportada dentro de un
fagosoma hacia la lámina propia del epitelio, donde es liberada (Zapor y Dooley, 2005).
Las salmonelosis humanas pueden clasificarse en dos grandes grupos: por un lado, las
debidas a serotipos estrictamente humanos, que causan habitualmente síndromes tifoídicos
con presencia de bacterias en la sangre, y las debidas a serotipos ubicuos, que provocan
diarrea, vómitos y fiebre. La duración y entidad de esta enfermedad es variable,
dependiendo del estado general del huésped y que ocasionalmente pueden causar
enfermedades generalizadas.
Los Portadores asintomáticos, eliminan Salmonella en las heces durante cierto tiempo
tras una infección sintomática; Salmonella puede eliminarse por las heces durante un mes en
el 24% de los pacientes y 2 meses en el 17%. Esta bpresión de la infección por Salmonella es
particularmente importante en los manipuladores de alimentos ya que al no estar sufriendo
manifestaciones clínicas de la misma, no son conscientes de que pueden ser una fuente de
contaminación de la bacteria.
Localización del proyecto
Este estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos y Aguas de la
Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica, durante los meses de Febrero y
Mayo del 2007.
Materiales y Métodos
Cepas utilizadas
Las cepas evaluadas fueron Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes y
Escherichia col¡ 0157:H7, todas provenientes de la Bacterioteca de la Facultad de
Microbiología de la Universidad de Costa Rica.
Medios de cultivo
Para el recuento bacteriano se utilizaron medios selectivos suministrados por la
Sección Servicios de Laboratorio de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa
Rica:
Microorganismo -- -- -
~ e d k de cultivo - - - - --
Listeria monocytogenes Agar Oxford
Salmonella enteritidis Aga r XLD
Escherichia col¡ 0157:H7 Agar MacConkey Sorbitol
Queso
Se utilizó tres muestras de 300 g de queso de cabra fresco pasteurizado, las cuales fueron
adquiridas en diferentes comercios. Las muestras fueron recolectadas en la mañana de cada
análisis y fueron transportadas en hielera hasta el laboratorio donde se realizaron las
respectivas pruebas.
Método de trabajo
l. La muestra de 300 gramos se dividió en 3 trozos de aproximadamente 100 gramos
cada uno.
2. Cada cepa se inoculó en Caldo Tripticasa Soya (CTS) y se incubó a 35 GC por 24 horas.
Después de este periodo de incubación se tomó 10 ml de cada suspensión bacteriana
y se inoculó en el trozo de queso correspondiente, posteriormente se homogenizó en
un Stomacher con el fin de lograr una distribución adecuada de las bacterias en el
queso.
3. Se determinó la concentración inicial de las bacterias en la muestra inoculada
realizando diluciones decimales de la misma hasta en Agua Peptonada Estéril.
(APE) 0,1%, para luego platear la dilución en el agar correspondiente.
4. Las muestras de queso inoculadas se mantuvieron en refrigeración (4 - 5 "C) y cada 72
horas se tomaron alícuotas de 10 gramos para determinar la concentración de
bacterias que sobrevivieron a lo largo del tiempo transcurrido. En total se cuantificó la
población en cinco ocasiones, incluyendo el tiempo O.
5. Se realizó una dilución 1:10 de cada alícuota en APE 0.1% y a partir de esta se efectuó
una serie de diluciones decimales hasta también realizadas en APE 0.1%.
6. Se cultivó 0.1 ml de cada dilución en el medio de cultivo específico para cada bacteria
mediante la técnica de esparcimiento. Cada una de las placas se incubó a 35QC por 24
horas, excepto las correspondientes a L. monocytogenes que se incubaron a 35QC por
48 horas.
7. Se contaron aquellos platos que tuvieran entre 25 y 250 UFC/g, para lo cual se
siguieron las reglas de conteo establecidas por Vanderzant v S~littoesser, 1992.
Se realizó un control de crecimiento de las cepas con el fin de determinar las
características morfológicas de las colonias obtenidas. Para lo cual se tomó 0,l m1 de las
cepas crecidas en CTS, se rayó directamente en los medios de cultivo específicos para cada
bacteria y se incubó el tiempo y a la temperatura indicada anteriormente para cada bacteria.
Determinación del crecimiento de E. coli 0157:H7: Las colonias típicas se caracterizaron por
tener forma circular, borde entero y elevación conveka, además de no fermentar el sorbitol.
Determinación del crecimiento de Salmonella SD.: Las colonias típicas se caracterizaron por
tener forma circular, borde entero y color rojo con centro negro.
Determinación de Listeria monocvtoaenes: Las colonias típicas se caracterizaron por tener
forma circular, borde entero y color oscuro (café oscuro - negro) con una depresión central.
Esquema de trabajo
100 g Queso + 10 ml de suspención bacteriana
5 - 7 "C por 12 días
10 g Queso
Diluciones 10-l- lo-' APE 0.1%
Agar Oxford Agar McC - S Agar XLD
35°C x 48 hrs 35°C x 24 hrs
Recuentos bacterianos
Listería monocytogenes
En el cuadro 1 se presentan los recuentos bacterianos obtenidos para L.
monocytogenes, en él se puede observar el efecto de las condiciones de almacenaje sobre la
concentración bacteriana con el pasar de los días.
'La concentración bacteriana disminuye esto debido al efecto combinado de la
temperatura y los días de incubación, sin embargo la disminución en la concentración no es
significativa porque en el día 12 se obtienen recuentos superiores a lo6 bacterias por gramo
de queso.
Cuadro 1: Recuentos bacterianos de Listeria monocytogenes en queso de cabra inoculado y
mantenido en refrigeración por 12 días.
Tiempo Concentración (UFC/g) Desviación Promedio
(días) Estándar Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Escherichia coli 0157:H7
Los resultados obtenidos con E. col¡ 0157:H7 se presentan en el cuadro 2, en el que
podemos observar el comportamiento bacteriano en el queso de cabra en un período de 12
días de almacenamiento a temperatura de refrigeración.
La concentración bacteriana disminuye desde el inicio de la incubación hasta el tercer
día, para luego mantenerse estable por seis días y posteriormente desciende sus niveles en
más de un logaritmo cuando se hace el análisis al doceavo día.
Cuadro 2: Recuentos bacterianos de Escherichia col¡ 0157:H7 en queso de cabra inoculado y
mantenido en refrigeración por 12 días.
Tiempo Concentración (UFC/g) Desviación Promedio
(días) Estándar Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Salmonella sp.
Los recuentos obtenidos para esta bacteria se presentan a continuación en el cuadro
3, en este es posible observar el comportamiento de la misma en el queso de cabra sometido
a las condiciones de almacenamiento establecidas.
Se puede observar la disminución constante de la concentración bacteriana con el
pasar de los días, pasando de un alto inóculo inicial (lo7) a una baja concentración de
bacterias al día doce (lo2), disminuyendo así en 5 logaritmos.
Cuadro 3: Recuentos bacterianos de Salmonda sp. en queso de cabra inoculado y mantenido
en refrigeración por 12 días.
Tiempo Concentración (UFC/g) Desviación Promedio
{d ías) Estándar Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
En el gráfico 1 se observa el comportamiento de las tres bacterias almacenadas bajo
las mismas condiciones. En él se puede notar el comportamiento diferente de estas, L.
monocytogenes y E. col¡ 0157:H7 son resistentes a las condiciones ensayadas y su
concentración baja poco con respecto al inóculo inicial, en cambio Salmonella sp. se muestra
menos resistente a las condiciones de almacenamiento escogidas ya que su concentración
disminuye en gran medida.
Gráfico 1: Comportamiento de Listeria monocytogenes, Escherichia col¡ 0157:H7 y Salmonella
sp. inoculadas en queso de cabra durante su vida de almacenaje.
O 3 6 9 12
Tiempo (días)
Las condiciones de almacenamiento para este estudio, fueron definidas con el fin de
semejar lo más posible el almacenamiento a que estaría expuesto el queso de cabra en los
comercios o en los hogares de los consumidores, con el fin de generar resultados que
reflejen el comportamiento de Listeria monocytogenes, Escherichia coli 0157: H7 y
Salmonella sp. en el escenario más probable de consumo ya que el tiempo de 12 días refleja
la vida útil del queso y la temperatura de 4 - 5 "C representa la temperatura promedio a que
se mantienen las cámaras de enfriamiento en los comercios o las ~efrigeradoras en los
hogares de los consumidores.
L. monocytogenes ha sido aislada de una gran variedad de productos lácteos. Niveles
de L. monocytogenes tan altos como lo7 UFC/g se han encontrado en algunos quesos
naturalmente contaminados (Farber y Peterkin, 1991).
En el presente estudio se observó que L. monocytogenes resistió las condiciones de
almacenamiento elegidas, por lo que puede representar un riesgo para el consumidor en
caso de que el queso se contamine en forma natural con la bacteria.
Sin embargo, era de esperar que la concentración bacteriana aumentara con el
tiempo al ser una bacteria psicotrófa, tgl como ha sido demostrado en estudios similares
previos realizados por varios investigadores (Genigeorgis et al, 1991; Back et d, 1993; Uhlich
et al, 2006). Lo que si queda demostrado es su capacidad de supervivencia, al final del
periodo de incubación se obtienen concentraciones altas de la bacteria (lo6).
La supervivencia y crecimiento a temperaturas de refrigeración (2 - 4°C) de L.
monocytogenes es uno de los factores que hacen dificil el control de este patógeno, lo cual
es de gran importancia debido a que la refrigeración de productos es uno de los métodos
más utilizados para alargar la vida media de los alimentos.
Entre los reseworios de E. col¡ 0157: H7 tenemos al ganado bovino y a otros
rumiantes (Caprioli et al, 2005). Es por esto que este patógeno es considerado como de alto
riesgo en este tipo de productos, ya que con frecuencia se aKta de leche cruda, crecen o
toleran los rangos de bajas temperaturas y de acidez propios del queso y algunos otros
productos lácteos fermentados y son capaces de persistir por varios meses durante el
proceso de maduración del queso.
Este estudio demuestra que E. cok 0157:H7 es capaz de sobrevivir a las condiciones
experimentales establecidas, por lo que representa un peligro potencial para el consumidor,
debido a la baja dosis infecciosa asociada a las infecciones causadas por esta bacteria.
Los resultados obtenidos no concuerdan completamente con estudios previos en
quesos, en los que se demuestra la capacidad de esta bacteria para sobrevivir y además
muitiolcarse a' bajas temperaturas (Gonthkr et d, 2001; Lekkas et al, 2006). Sin embargo,
Richefi y colaboradores (2000) reportan sobrevivencia, pero no reportan crecimiento de este
microorganismo en productos que se mantienen a 4 QC, Kasrazadeh y Gmigeolrgis (1995)
demostraron que la temperatura mínima de crecimiento para E. col¡ 0157:H7 en queso
fresco es de 10°C. También Govaris y colaboradores (2001) reportaron la sobrevivencia de
esta bacteria incluso a 29C en tres tipos diferentes de quesos griegos, por lo que la
contaminación post -manufactura de este p i . k t o con- esta b&et.ia debe set. evitada.
En el caso de Salmonella, su temperatura óptima de crecimiento es de 20 - 4S°C,
aunque puede crecer a bajas temperaturas como las de refrigeración (Roberts, 2002).
De acuerdo a los haHazgos de este estubi, Satmonetta sp. fue la bacteria menos
resistente a las condiciones de almacenamiento escogidas. No obstante, es importante
resaltar que la concentración al doceavo día (1,7x10~ ufc/g) es considerada todavía riesgosa
de ser consumida por humanos, esto debido a que Salmonella sp. puede tener una baja
dosis infectante.
En un estudio reatizado por Tamagrrini y cotdmradores (2004), Salmonella
typhimurium se inhibió durante el almacenamiento a 5 y 15°C; sin embargo, fue capaz de
sobrevivir por periodos extensos, los conteos a4 final det experimento fueron attos, indicando
que la contaminación con una concentración bacteriana elevada representa un riesgo
potencial para la salud.
La disminución de la concentración para las tres bacterias estudiadas puede deberse a
una combinación de factores capaces de afectar el crecimiento microbiano.
Primero, et crecimiento bacteriano de las bacterias mesófilas se puede ver afectado
por la temperatura de refrigeración, principalmente por la sensibilidad a bajas temperaturas
que presentan las ~eaccciones catatizadas pw enzimas. Las enzimas son- proteínas o
asociaciones de proteínas y otras moléculas orgánicas o inorgánicas que actúan catalizando
tos procesos químicos que se dan en bs seres vivos. Actúan facilitando las transformaciones
quimicas; acelerando considerablemente las reacciones y disminuyendo la energía de
activación que muchas reacciones requieren. E l almacenamiento a 5 QC retrasa el
crecimiento bacteriano porque las enzimas no tienen la temperatura óptima para funcionar
adecuadamente (Prescott et d, 2003). La mayoría de tas bacterias pueden crecer en un
amplio rango de temperatura. 'Sin embargo, sólo presentan un estrecho rango de
crecimiento óptimo. Este rango está- detimitado pw una temperatura minima de crecimiento
y una máxima. Por debajo de la mínima la multiplicación se deteriora. Se sabe que la síntesis
proteka es tm proceso muy sensible a bajas temperaturas (Cruz y i-termosilla, 2006).
Segundo, dentro de la flora normal de la leche que se utiliza para la fabricación del
queso se encuentran las bacterias acido Iácticas, que tienen la capacidad de producir
baderiocinas. Las bacteriocinas s o n compuestos antibacterianos proteináceos, constituyen
un grupo heterólogo de péptidos; en general estos son péptidos catiónicos que poseen
propiedades hidrofótiicas o anfifíticas y en la mayoría- de los casos actúan s&e la membrana
bacteriana (Savadogo et al, 2006). Ciertas bacteriocinas producidas por bacterias ácido
lá£ticas inMben a una gran variedad de patógem aiimentarios, incluyendo a BacHtus cereus,
Clostridim perfringm, Listeria monocytogems y Stuphyfocmcus aweus (Lewus e-t al, 1991).
La producción de sustancias antimicrobianas por parte de la microflora del queso puede
contribuir con la disminución en et rtthwv de E. cofi 0157:H7 ( M a k et af, 2001).
Un gran número de bacteriocinas han sido aisladas y caracterizadas a partir de
bacterias ácido Iácticas y algunas son considerados agentes antimicrobianos debido a su
potenciat como presewantes de d t m t o s y su efecto antagonista c a r a impoftantes
agentes patógenos. Las bacteriocinas más importantes son nisina, diplococcina, acidofilina,
bulgarican, heíveticinas, Iactacinas y ptantarieinas. fsavadogo et d, 2006).
Tercero, la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos se relaciona
íntimamente con los factores intrínsecos del alimento, tales como la composición y las
características propias del mismo. Dentro de estos se encuentran et ptl, la actividad de agua,
el potencial de oxido reducción, la cantidad de nutrientes y sistemas antimicrobianos
presentes. Determinar tas cw&er~ticas CM queso de cabra fptt, contenido de grasa, Aw,
etc.) las cuales pueden influenciar sobre el comportamiento de los patógenos, no es uno de
k s objetivos de este estudio, sin embargo es posible que estos sean respomabtes de las
diferencias encontradas en cuanto a las concentraciones finales de estas bacterias.
Cuarto, es importante ~ e c o ~ d w que la k h e de cabra posee ciertos %idos grasos
como el caprílico, capróico y cáprico; Nair y colaboradores (2005) reportan un efecto
mtibacteriano del &ido capríiieo Sobre bacterias patbknas causantes de mastitis. El efecto
antimicrobiano observado fue atribuido parcialmente a la corta longitud de la cadena de
carbonos que caracteriza a este kidv, tas propiedades antimicrobianas de tos ácidos grasos
disminuyen al aumentar la longitud de su cadena. Si bien el mecanismo de acción exacto del
ácido caprílico no es conocido, una teoria sugiere que como tus monoglicéridos son
surfactantes no iónicos, éstos son capaces de penetrar e incorporarse en la membrana
plasmática bacteriana, &er& así ta p m e a b i a d de la mKma (N& et af, 2005).
Si este compuesto presmta esta característica antimicrobiana frente a patógenos
productores de mastitis en el ganado, es posible que también tenga una acción similar sobre
otro tipo de microorganismos, iticMif5 las bacterias andtlizadas en et presente estudio.
L. monocytogenes, E. col¡ 0157:H7 y Salmonella sp. fueron resistentes a las
condiciones de almacenamiento y poseen diferentes factores y características que les
permiten adaptcirse para s&e\tittir a estimubs adwsos, entre eHos tas bajas temperaturas.
Esto es de gran importancia, debido a que uno de los principales métodos para conservar
atimentos utilizados en la industria es el ahacenamiento a temperaturas de refrigeración.
Los patógenos investigados pueden llegar a la leche que será utilizada como materia
prima de diferentes formas: directamente a partir del animal productor, por contacto de
este Msumo con supetfiiies contaminadas donde estos micrmrganismos se encuentren
formando biofilms; también es posible la contaminación a partir de los manipuladores
humanos, Wc. Si es m este punto det proceso donbe- se da la contaminación, por medio de la
pasteurización es posible eliminar a las bacterias ya que estas son sensibles a este paso.
La contaminación t*bién puede darse en momentos posteriores a la pasteurización
de la leche, debido a la gran cantidad pasos que conlleva el proceso de creación del queso,
especialmente m d caso de4 queso producido de forma aftesa-nd. Por esto es necesario
aplicar las Buenas Prácticas de Manufactura y realizar una sanitización adecuada del
ambiente de producción, abemá-s de evitar que materia prima entre en contacto con el
producto terminado porque se puede dar una contaminación cruzada que tendrá como
consecuencia el poner en riesgo la s a M de los conswriidores.
CAP~TULO VI: CONCLUSIONES
1. Listeria monocytogenes y Escherichia coli 0157:H7 son resistentes a las condiciones
de almacenamiento escogidas. Salmonella sp. es el microorganismo más susceptible
de los tres en estudio.
2. El comportamiento de estos patógenos es definido por las características de cada
bacteria y este se puede ver modificado por los factores intrínsecos del alimento en
el que se encuentran, en este caso el queso de cabra.
3. La resistencia observada de estas bacterias a las condiciones de almacenamiento
escogidas representa un riesgo eventual para el consumidor.
4. Los integrantes d6 da industria alimentaria tienen la responsabilidad de producir
alimentos seguros para el consumidor, esto se puede lograr controlando los puntos
potenciales de contaminación en el campo, durante el procesamiento y manipulación
del producto, así como utilizando más de un método de conservación.
1. Se recomienda que posteriores estudios analicen las características propias del queso
de cabra, ya que en estas puede radicar la explicación de las diferencias en el
comportamiento de los patógenos estudiados.
2. Se debe prestar atención especial en la prevención de la contaminación cruzada entre
la materia prima sin ningún tratamiento y el producto final listo para consumo
humano, porque el primero puede ser fuente de patógenos.
3. La implementación de Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Buenas Prácticas de
Manufactura (BPM) en todos los eslabones de la cadena de producción alimentaria,
desde la finca lechera, manufactura, almacenamiento, transporte, venta al público,
etc.
4. La implementación de un sistema de seguridad alimentaria basado en los principios
HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), donde se realice un enfoque
sistemático para identificar y controlar peligros, en otras palabras que se identifique .
que puede causar problemas y la manera de prevenir estos.
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