J. Embryol. exp. Morph., Vol. 12, Part 3, pp. 391-405, September 1964Printed in Great Britain

Comportement en culture in vitro des £bauchesdentaires de rongeurs pr£lev6es aux stades

de pr6diff6renciation

par M. POURTOIS1

Universite Libre de Bruxelles, Laboratoire d"Embryologiede la Faculte de Medecine

AVEC DEUX PLANCHES

Dfts 1936, Glasstone a montre que des bourgeons dentaires de Mammiferes,preleves a des stades precoces, peuvent modeler in vitro toutes les cuspides et lessillons de la dent adulte, c'est a dire les details caracteristiques de leur morpho-logie definitive.

Parallelement a ces capacites de morphodifferenciation, les etudes du memeauteur mettent en evidence des aptitudes de differentiation cytologique sus-ceptibles de realiser la croissance des odontoblastes et la formation de la dentinein vitro, ainsi que la production d'email en greffe chorio-allantoidienne.

Suivant les precisions encore recemment apportees par Glasstone (1963), laplupart de ces proprietes genetiques des bourgeons dentaires sont acquises chezl'embryon de Souris, des l'apparition des bandelettes epitheliales qui donnerontnaissance aux incisives et aux premieres molaires. II faut done reporter avant12 jours, chez cet embryon, la periode preparatoire pendant laquelle des proprietesodontogenes se localisent dans certains secteurs des feuillets bordant la fentestomodeale.

Or, pendant cette periode, l'une des transformations les plus remarquables decette region, est la mise en place des elements anterieurs de la crete neurale dutrijumeau dont on peut etudier la topographie grace aux particularites histo-chimiques de ses cellules (Milaire, 1959; Pourtois, 1961). Leur analyse nous apermis d'etendre a un Mammifere les conclusions que Sellman (1946) avaittirees de ses travaux sur PAxolotl. Nous avons ainsi prete a la crete neurale lerole d'inducteur des lames dentaires et attribue une origine mesectoblastique ala pulpe des dents.

Nos observations comportaient notamment une etude topographique deszones riches en ARN chez l'embryon de Souris, avant la formation des lamesdentaires. II nous est apparu ensuite qu'elles devaient etre completees; d'abord

1 Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Anatomie et d'Embryologie, Faculte de Medecine del'Universite, 97 Rue aux Laines, Bruxelles, Belgique.

392 M. POURTOIS

par l'examen de certains stades qui permettraient de suivre plus exactement lamigration mesectoblastique et la predifferenciation des bourgeons dentaires,ensuite, par une etude experimental dans laquelle ces zones presomptivesseraient cultivees in vitro en partant de stades anterieurs a ceux qui ont ete utilisesprecedemment par Glasstone.

MATERIEL ET TECHNIQUES

Trente-cinq embryons de Souris de 8^ jours a 12 jours et 4 embryons de Rat de11 jours ont fourni 98 explants mis en culture. Les fragments tissulaires, preleves

B

FIG. 1. Representation schematique des divers types de dissections operees surdes embryons ages de moins de 10 jours.

Culture des ebauches dentaires 393

par microdissection dans le liquide de Tyrode, comportaient au depart soit deszones presomptives de bourgeons dentaires superieurs ou inferieurs (Figure 2),soit ces memes zones associees a des fragments de feuillets voisins; epiblastiques,endoblastiques, mesoblastiques ou mesectoblastiques (Figure 1).

Les cultures sont faites en coagulum mince sur lamelle de verre et maintenuesa 37°C. soit en goutte pendante (double lamelle de Maximow, en saliere her-metiquement scellee et saturee de vapeur d'eau), soit en 'roller tube'. Des re-piquages pratiques tous les trois ou quatre jours ont permis d'eliminer un excesde croissance fibroblastique et de maintenir le developpement in vitro de 3 a 24jours selon les cas.

FIG. 2. Representation schematique du type de prelevement effectue a partir de 10^ jours.

Le coagulum est forme de parties egales de Tyrode, de plasma de Coq etd'extrait embryonnaire de Poulet (au lOeme jour), de Rat (au 16eme ou au 19emejour) ou de Souris (au 14eme jour), le broyat de ces embryons etant dime demoitie dans le liquide de Tyrode, agite pendant 20 min., puis centrifuge 20 min.a 3.500 t/m.

Dans le cas des experiences en 'roler tube', la phase liquide comporte: Tyrode,2 vol., serum de cheval, 2 vol., extrait embryonnaire de Rat (16eme jour), 1 vol.La vitesse de rotation des tubes est fixee a environ 7 tours/heure.

De la vitamine A cristallisee (Roche) a ete ajoutee a certaines cultures dans laproportion de 1 mg. pour 10 ml. du broyat embryonnaire dilue.

Les cultures ont ete fkees dans le liquide de Bouin, enrobees a la paraffine,coupees en series et colorees a l'hemalun-eosine.

Pour permettre de situer l'etat de developpement des feuillets mis en culture,nous avons pratique sur des embryons homologues, preleves dans les memesportees, des coupes seriees, sagittales, frontales ou transversales qui ont etecolorees soit a l'hemalun-eosine, apres fixation au Bouin, soit au vert de methyle-pyronine, apres fixation au Serra. Le stade de maturation des embryons a etecalcule a partir de l'apparition du bouchon vaginal.

394 M. POURTOIS

OBSERVATIONS PERSONNELLES

Une breve description prealable des zones dentaires presomptives et desfeuiUets cellulaires adjacents est indispensable a la comprehension des resultatsobtenus en culture. Aussi avons-nous divise ce chapitre en deux rubriques:croissance in situ du 9eme au 13eme jour d'abord, comportement in vitro deszones dentaires ensuite.

Developpement in situ des zones dentaires presomptives chez Vembryon de Souris

Apres huit jours de developpement, une coupe transversale pratiquee dans laportion cephalique de l'embryon de Souris, au niveau du rhombencephale,permet d'observer la jeune crete neurale du trijumeau dont les cellules fortementbasophiles, en voie de migration dorso-ventrale sont bien mises en evidence parla coloration a la pyronine (Milaire, 1959). II est interessant de noter que lemateriel mesectoblastique abonde dans les bourgeons mandibulaires et maxil-laires des le debut de leur formation tandis que les cellules du mesenchymebanal de beaucoup moins basophiles, sont relativement rares aux memesendroits.

A 9\ jours, l'ebauche du ganglion de Gasser est deja bien visible dans la partiedorsale de la crete neurale du trijumeau. En avant, la crete se termine dans lapartie stomodeale des bourgeons mandibulaires et maxillaires, de sorte que, encoupe transversale, on peut observer son intense basophilie, dans le secteurinfero-interne du mesenchyme du bourgeon maxillaire, et dans la partie supero-interne de celui du bourgeon mandibulaire (Planche 1, Fig. A). Cette fractionmaxillo-mandibullaire du feuillet mesectoblastique est la plus riche en ARN aproximite des vaisseaux nourriciers issus de la branche anterieure de la carotideet du premier arc aortique. Entre ces vaisseaux et Pepiblaste stomodeal, se con-stitue ainsi un amas de cellules reperables par leur grande affi nite pour la pyronineet destinees a fournir le materiel des pulpes dentaires (Pourtois, 1961). Au mememoment, mais dans la profondeur du bourgeon mandibulaire et en dehors deTare aortique, le materiel presomptif du cartilage de Meckel, issu lui aussi de lacrete neurale (Milaire, 1959) commence egalement a s'individualiser et se re-marque aisement par sa basophilie intense. Au meme stade, les cellules dePepiblaste stomodeal contiennent de volumineux nucleoles riches en ARN.

A 10 jours, la jonction ventrale des bourgeons mandibulaires ebauche leplancher buccal tandis que la fermeture laterale de la fente stomodeale s'operepar la jonction maxillo-mandibulaire. Le secteur buccal est ainsi clairementdelimite des ce 11 erne jour.

A 10£ jours, les lames dentaires commencent leur cyto-differenciation, lescellules cubiques de leurfeuillet profond ont deja elabore en partie l'ergastoplasmebasal qui donnera aux pre-adamantoblastes leur basophilie et leur aspect allonge(Planche 1, Fig. B). II est facile de reperer l'emplacement de ces ebauches a

Culture des ebauches dentaires 395

l'examen in toto, grace a la richesse du lit vasculaire sur lequel elles reposent, etque Ton apercoit par transparence.

En effet, les arcs aortiques ont ete remplaces a ce stade par un reseau de capil-laires peripheriques qui s'elargissent sous le mesenchyme odontogene. Cedernier qui etait encore en continuite au stade precedent, avec les autres branchesde la crete neurale, s'est maintenant condense et individualise de telle sorte que,dans les bourgeons mandibulaires, les deux colonnes de cellules basophiles quiconstituent le precartilage de Meckel et le mesenchyme odontogene, apparaissentnettement separees.

A l l jours, un sillon longitudinal deprime la surface stomodeale de chaquelame dentaire dont l'epaisseur s'est legerement accrue par rapport au stadeprecedent (Planche 1, Fig. C).

A 12 jours, chacune des quatre lames dentaires a constitue une bandeletteposterieure destinee a former les deux premieres molaires, et une bandeletteanterieure, germe de l'incisive. Premier signe de morphodifferenciation, cesebauches presentent deja une asymetrie par rapport au plan parasagittal: labandelette des molaires est plus epaisse du cote interne (lingual) tandis quel'ebauche de l'incisive est plus developpee du cote antero-externe (labial). Cesdifferents bourgeons epiblastiques sont constitues par cinq ou six assisses cellu-laires. Les couches peripheriques, destinees a former le le reticulum stellaire,sont encore aplaties, mais la couche profonde a deja acquis une richesse consider-able en ARN et pris l'allure palissadique typique d'un epithelium adamantin(Planche 1, Fig. D).

Au stades suivants, l'ectomesenchyme odontogene sous jacent verra decroitrela basophilie qui l'avait caracterise jusque la et qui ne reapparaitra plus avant ladifferentiation des odontoblastes. Dans notre etude precedente (Pourtois, 1961),nous avions note cette chute de basophilie a partir du 16eme jour. II nous estapparu ensuite qu'elle peut se manifester plus precocement, vers le 14eme jour.

Developpement in vitro des zones presomptives et des rudiments de bourgeonsdentaires

Nous classerons sous cette rubrique les experiences de culture en fonction del'age des embryons dont furent preleves les explants. Pour chaque lot de memeorigine, seuls seront decrits les resultats offrant un interet particulier; les pro-liferations banales du mesenchyme ou les involutions degeneratives qui furentla destinee de plusieurs explants seront done eliminees de la presentation.

La plupart des explants ont ete preleves chez des embryons de Souris. Ceuxqui proviennent d'embryons de Rat seront mentionnes en cours d'expose.

Explants prownant d'embryons de S^ jours

Ces explants sont constitues d'ebauches completes de bourgeons mandibulaireset maxillaires associes a la crete neurale correspondante (Figure la). Leur

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culture, effectuee en saliere, a l'aide d'extrait embryonnaire de Poulet, a echouea la suite de la necrose totale de l'explant dans la plupart des cas. Un seul deceux-ci a prolifere sous la forme d'un epithelium cubique simple associe a quelquescellules de mesenchyme banal.

Explants provenant d'embryons de 9\ jours

Une premiere serie de ces explants est constitute de segments stomodeaux debourgeons mandibulaires (Figure lb). Leur culture en saliere a l'aide d'extraitembryonnaire de Poulet, n'a donne naissance a aucune croissance caracteristiquede materiel dentigere. Nous avons constate dans deux cas, la formation d'unepithelium de type malpighien dont les cellules superficielles avaient subi uneevolution keratinique.

Un deuxieme lot d'explants preleves a 9\ jours est constitue de bourgeonsmandibulaires complets, comportant un fragment d'endoblaste provenant del'orifice pharyngien (Figure lc). Ces cultures—soit en salieres, a l'extrait em-bryonnaire de Poulet, soit en 'roller tubes', en presence d'extrait embryonnairede Rat—montrent, dans la majorite des cas, une croissance rapide du mesenchymeet l'enveloppement de l'epiblaste sous la forme d'un petit kyste central. Apres7 jours de culture, un bourgeonnement localise de l'epiblaste comparable a celui

EXPLICATION DES PLANCHES

PLANCHE 1

FIG. A. Embryon de Souris de 9£ jours, fixe au Serra, colore au vert de methyle-pyronine.Coupe transversale au niveau du Rhombocephale (r) du ganglion de Gasser (g) et desbourgeons maxillaires (max), et mandibulaires (man). La figure montre la continuite dumateriel mesectoblastique de l'ebauche gasserienne au mesenchyme odontogene (mo) d'unepart et d'autre part, l'intense basophilie de ce dernier a proximite du premier arc aortique(a). (Gr.xlOO.)

FIG. B. Embryon de Souris de 10£ jours, fixe au Serra, colore au vert de methyle-pyronine.Coupe transversale au niveau de la fente stomodeale. Bourgeon maxillaire en haut et adroite, bourgeon mandibulaire en bas et a gauche. Les lames dentaires commencent aapparaitre (1), le mesenchyme odontogene (mo) s'est condense et separe du cartillage deMeckel(m). (G.xlOO.)

FIG. C. Embryon de Souris de 11 jours, fixe au Serra, colore au vert de methyle-pyronine.Coupe transversale au niveau de la fente stomodeale. Bourgeon maxillaire en haut, bourgeonmandibulaire en bas. Epaississement des lames dentaires et formation des sillons stomo-deaux. (Gr.xlOO.)

FIG. D. Embryon de Souris de 12 jours, fixe au Serra, colore au vert de methyle-pyronine.Coupe transversale au niveau de la cavite buccale. La coupe passe au niveau de la premieremolaire inferieure, du precartillage de Meckel (m) et de l'ebauche de Masseter (ma).(Gr. x 100.)

FIG. E. Culture pendant 7 jours d'un bourgeon mandibulaire complet preleve a 9\ jours chezun embryon de Souris. Formation d'un bourgeon dentaire simple (bd). Experience ensaliere. Extrait embryonnaire de Poulet. Coloration: hemalun-eosine. (Gr.xlOO).

FIG. F. Culture pendant 3 jours d'un explant preleve a 10^ jours chez un embryon de Souris.Formation d'un bourgeon incisif (bi) et d'un bourgeon molaire (bm). Condensationrelativement faible du mesenchyme odontogene. Experience en saliere. Extrait embryon-naire de Souris. Coloration: hemalun-eosine. (Gr.xlOO.)

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M. POURTOIS (Facing page 396)

J. Einbryol. exp. Morph.Vol. 12, Part 3

PLANCHE 2

M. POURTOIS{Facing page 397)

Culture des ebauches dentaires 397

(Tune lame dentaire du 13eme jour, a ete constate dans plusieurs cas (Planche 1,Fig. E), ce qui correspond a une vitesse de developpement d'environ 40 % parrapport a la vitesse de croissance in vivo.

Dans un troisieme lot preleve a 9\ jours, les explants se composent des bour-geons maxillaires et mandibulaires associes a un fragment de la crete neuraleadjacente (Figure la). Apres 8 jours de culture en coagulum a l'extrait embry-onnaire de Poulet, l'un des explants a forme un bourgeon equivalent a ceuxqu'on observe a 13 jours chez l'embryon normal, il a egalement donne naissancea des fragments de cartilage de Meckel. Des explants disseques selon les troismanieres decrites ci-dessus, mais preleves a partir d'embryons de Rat de 10 joursdont les ebauches maxillo-mandibulaires avaient atteint un stade semblable acelles des embryons de Souris de 9\ jours, ont ete cultives sur coagulum a l'extraitembryonnaire de Rat. Les resultats obtenus sont entierement comparables aceux qui viennent d'etre decrits pour la Souris.

Explants provenant d'embryons de 10% jours

Ces explants, preleves selon la ligne indiquee dans la Figure 2, contiennentPebauche de la lame dentaire et le mesenchyme condense sous-jacent. Us ont ete

PLANCHE 2

FIG. G. Culture pendant 5 jours d'un explant preleve a 10^ jours chez un embryon de Souris.Formation d'une cupule adamantine. Le noyau des cellules reticulaires est anormalementvolumineux. La papille pulpaire est anormalement petite. Experience en saliere. Extraitembryonnaire de Souris. Coloration: hemalun-eosine. (Gr. x 300.)

FIG. H. Culture pendant 14 jours d'un explant preleve a 10^ jours chez un embryon de Souris.Formation d'un derive epiblastique fortement deforme par la croissance d'un nodulekeratinique (n). Les levres adamantines (1) n'ont pas enveloppe le materiel pulpaire.Experience en saliere. Extrait embryonnaire de Souris. Coloration: hemalun-eosine.(Gr. x 100.)

FIG. I. Culture pendant 17 jours d'explant preleve a 10^ jours chez un embryon de Souris.Formation d'un derive adamantoblastique fortement altere. Bien qu'il existe, en bas et agauche de la figure, des preadamantoblastes et une ebauche de papille pulpaire (p), lamajeure partie de Pexplant forme un kyste (k) et des cordons epitheliaux de typemalpighien (c). Experience en saliere. Extrait embryonnaire de Souris. Coloration:hemalun-eosine. (Gr. x 100.)

FIG. J. Culture pendant 6 jours d'un explant preleve a l l jours chez un embryon de Souris.Formation epitheliale rappelant la forme d'un bourgeon incisif jusque dans les cretes etreplis presents sur la face convexe. La differentiation histologique a neanmoins echoue etla papille pulpaire (p) s'est necrosee. Experience en saliere. Extrait embryonnaire dePoulet. Coloration: hemalun-eosine. (Gr. x 100.)

FIG. K. Culture pendant 14 jours d'un explant preleve a l l jours chez un embryon de Souris.Formation epitheliale ayant la forme d'un organe adamantin de molaire et la structured'un epithelium malpighien. Experience en roller-tube. Extrait embryonnaire de Rat.Coloration: hemalun-eosine. (Gr. x 100.)

FIG. L. Culture pendant 15 jours d'un explant preleve a 12 jours chez un embryon de Souris.Formation d'un bourgeon dentaire associe a une nodule keratinique (n). (a) adamanto-blastes. (p) pulpe. (r) reticulum stellaire. Experience en saliere. Extrait embryonnaire dePoulet. Coloration: hemalun-eosine. (Gr. x 100.)

398 M. POURTOIS

cultives en saliere, dans du coagulum a l'extrait embryonnaire de Souris. Lescultures ont ete arretees a 3 jours, 5 jours et 17 jours.

Apres trois jours, nous avons observe dans un explant deux proliferationsepiblastiques localisees dont la forme et l'emplacement permettent le diagnosticd'un bourgeon incisif et d'un bourgeon molaire analogues a ceux que Ton ren-contre chez un embryon de Souris a 12| jours (Planche 1, Fig. F). La vitesse dudeveloppement de ces ebauches correspond done approximativement aux •§• de lavitesse normale.

Apres cinq jours, une tendance a former un organe adamantin en cloche s'estmanifested nettement dans deux explants, ce qui correspond a une vitesse dedeveloppement equivalent a 60 % de la normale. Toutefois, la differentiation deleur reticulum stellaire et leur pulpe presente des anomalies. Dans l'ebauche dereticulum stellaire les noyaux des cellules sont demeures volumineux alors qu'ilsdiminuent de volume dans les conditions normales. Quant a la papille pulpaire,elle est plus petite que normalement, ses cellules ont un volume reduit et Ton ytrouve quelques pyenoses (Planche 2, Fig. G).

Apres 14 jours, le developpement des ebauches est considerable mais leurevolution anormale a altere leur ressemblance avec les bourgeons dentairesformes in situ. On peut toutefois y distinguer encore une formation d'origineepiblastique et, l'ebauche d'une papille pulpaire.

La formation d'origine epiblastique (Planche 2, Fig. H) consiste en un epithe-lium pluristratifie de type malpighien limitant dans la plupart des cas unespherule centrale formee de feuillets concentriques d'aspect keratinique. Lacouche basale de l'epithelium est restee cubique ou aplatie d'un cote de l'organe,tandis qu'elle tend a devenir palissadique de l'autre cote ou elle forme plusieursreplis qui evoquent les levres et le sillon d'un organe adamantin.

Quant a l'abauche pulpaire, elle se reduit a quelques cellules de petite taillereparties entre les levres du derive epiblastique; on n'y decele aucune differenci-ation comparable a celle de la pulpe dentaire normale et Ton y trouve des nom-breuses pyenoses.

Apres 17 jours de culture, nous avons observe la production d'un deriveadamantoblastique tres deforme (Planche 2, Fig. I). On peut y distinguerplusieurs replis d'un epithelium pluristratifie accusant d'un cote une evolutionmalpighienne—mais sans production de feuillets keratinoides—et, de l'autrecote, une transformation kystique. La paroi du kyste est tapissee de plusieursassises cellulaires. Sa couche interne ressemble a un epithelium bronchique parses cellules cylindriques, herissees d'une brosse fibrillaire. La cavite kystiquecontient quelques debris cellulaires. Dans l'autre partie de cet organe fortementaltere, une legere proliferation du mesenchyme dans un repli epiblastique peutetre raisonnablement considered comme un rudiment de pulpe dentaire; la basaleepiblastique a d'ailleurs, au meme niveau, Failure d'un epithelium adamantininterne encore peu differencie. L'explant, ainsi deforme evoque certains detailshistopathologiques des kystes dentigeres, nous y reviendrons dans la discussion.

Culture des ebauches dentaires 399

Explantsprovenantd'embryonsde II jours

Certains de ces explants etaient constitues par des fragments de lames dentaireset de mesenchyme sous-jacent, destines a former soit des molaires, soit desincisives (Figure 2). Us ont ete cultives en coagulum a l'extrait de Poulet et ontabouti, apres 7 jours de culture, a la production de derives adamantins com-parables a ceux qui ont ete obtenus, mais plus lentement, a partir d'explantspreleves | jour plus tot (epithelium malpighien enveloppant les lamelles kerati-niques, cordons epitheliaux de type muqueux). Ajoutons que les derives desparties anterieures destinees aux incisives ont l'allure allongee et incurvee de cesdents, alors que les derives d'origine posterieure sont plus arrondis.

Apres 16 jours de culture dans les memes conditions, les derives adamantinsqui ont ete obtenus ont toujours le meme aspect mais contiennent une inclusionde keratine plus volumineuse. Dans quelques explants, des ebauches de cartilagede Meckel, temoins d'une dissection trop large, sont apparus au voisinage desderives adamantins.

Certains autres explants, preleves a l l jours furent disseques de maniere plusetroite pour ne laisser sous le feuillet epiblastique des lames dentaires qu'unemince couche mono- ou bicellulaire de mesenchyme sous-jacent. La plupart deces explants ont degenere sans donner naissance a des formations significatives.Toutefois, dans l'un d'eux, nous avons observe, apres 6 jours, la croissance d'unsac epiblastique dont la forme evoque curieusement le bourgeon incisif au 15emejour. II s'agit d'une masse piriforme creuse dont le grand axe est fortementallonge et incurve (Planche 2, Fig. J). Sa paroi est formee de trois ou quatreassises cellulaires plus epaisses du cote convexe et plissees a ce niveau de manierea evoquer les cretes epitheliales de la paroi labiale des bourgeons incisifs normaux.Une faible quantite de mesenchyme, d'ailleurs abondamment pycnotique,deprime la base de la pyramide; cette ebauche de papille pulpaire n'atteintcependant que le quart de la longueur totale du derive adamantin dont quelquescellules desquammees occupent la cavite centrale.

Cultive en 'roller tube' en presence d'extrait embryonnaire de Rat, un explantpreleve sur un embryon du meme age (11 jours) montrait, apres 14 jours, underive epiblastique dont la forme est comparable a celle d'un organe adamantinnormal au 17eme jour, mais dont les cellules se seraient anormalement diflferen-ciees en un epithelium de type muqueux (Planche 2, Fig. K). La couche basalede cet epithelium forme deux nets replis comparables au protoconide et au meta-conide d'un bourgeon de molaire; on remarquera toutefois que la depression quiles limite ne contient pratiquement plus de cellules de mesenchyme, celles-ci ontete perdues dans le liquide de lavage au cours des diverses transplantations.

Explants preleves sur des embryons de 12 jours

A partir d'un explant sur quatre de cet age cultive en coagulum a l'extrait em-bryonnaire de Poulet, nous avons obtenu, apres 13 jours, la croissance d'une

400 M. POURTOIS

cloche adamantine pourvue de replis homologues aux protoconide, metaconide,hypoconide et entoconide du premier bourgeon molaire d'un Souriceau de 2jours (Planche 2, Fig. L). Cet organe adamantin enserre une papille pulpairepourvue d'odontoblastes qui ont secrete des rudiments de predentine. II est lui-meme constitue des feuillets habituels: epitheliums adamantins interne etexterne, strate intermediate et reticulum stellaire. En outre, il contient une for-mation anormale que nous avons deja decrite dans les derives adamantinsprecedents; il s'agit d'une spherule constitute de feuillets keratinoides irreguliere-ment concentriques, et entouree de quelques assises cellulaires epitheliales. Cette'perle' keratinique est situee a la base du metaconide, lequel est d'ailleurs, moinsdeveloppe que normalement. Si Ton considere que le resultat atteint ici correspondaux bourgeons dentaires observables deux jours apres la naissance chez le Souri-ceau, on peut apprecier la vitesse de developpement in vitro a partir d'explantspreleves a 12 jours p.c, a 70% de la vitesse normale.

Faisons enfin remarquer que les explants cultives en presence de vitamine Ane se sont pas developpes d'une maniere sensiblement differente de ceux qui ontete traites en son absence.

DISCUSSION

Dans son etude de la cephalogenese chez la Souris, Milaire (1959) a montre queles cellules de la crete neurale du trijumeau peuvent etre distinguees de celles dumesenchyme banal, par leur intense basophilie. Nous avons nous-meme ob-serve (Pourtois, 1961) qu'une partie de ces cellules riches en ARN se dispose dansles bourgeons maxillaires et mandibulaires, sous l'epiblaste destine a fournir leslames dentaires, et suggere que le contact des deux feuillets va de pair avec uneinduction du premier par le second.

Le comportement in vitro des ebauches dentaires prelevees avant 12 joursfournit, en faveur de cette hypothese, un argument d'ordre experimental. IIs'agit de la cytodifferenciation anormale de l'organe adamantin en l'absence dumesenchyme odontogene.

Cet isolement realise dans nos cultures soit par dispersion du mesenchyme odon-togene, soit par necrose de l'ebauche pulpaire, peut intervenir a differentes etapesdu developpement. Nous analyserons ulterieurement les modalites de cettedegenerescence du materiel pulpaire, mais, auparavent, nous voudrions insistersur le fait qu'elle est d'autant plus fatale a Favenir de l'organe adamantin qu'ellelui a ete imposee plus tot. On a vu, en effet, que des explants preleves a %\ jourssont depourvus de toute faculte odontogene, alors que ceux qui, sont prelevesa 9\ jours edifient des bourgeons epiblastiques; des explants de 10| jours devien-nent capables de morphodifferenciation et, a 12 jours, sont en mesure de formerdes ameloblastes normaux.

La presence et la vitalite des cellules mesectoblastiques semblent done indis-pensables a l'acquisition par l'organe adamantin de ses proprietes particulieres.

Culture des ebauches dentaires 401

C'est la un argument qui appuie l'opinion selon laquelle une induction provenantde la crete neurale et se prolongeant de 8 | a 12 jours, influencerait la formation desbourgeons dentaires chez l'embryon de Souris. Cette induction serait notammentindispensable a la differentiation cytologique normale de l'organe adamantin.Sans elle, l'ebauche epiblastique presomptive se differencie anormalement: desnodules keratiniques (Planche 2, Fig. H), des cordons epitheliaux de type mu-queux (Planche 2, Fig. I) et des kystes (Planche 2, Figs. I et J) apparaissent dansles cultures. Chacune de ces formations anormales resulte probablement de laproliferation d'un secteur particulier de l'epiblaste stomodeal preleve lors de ladissection (Figures 1 et 2). C'est ainsi que les nodules keratiniques entoured'un epithelium malpighien derivent vraisemblablement d'un fragment epi-blastique destine a former la gencive in situ. On sait, en effet, que ce feuilletevolue frequemment vers la formation de ces perles cornees, soit en greffe auto-plastique (Huggins, McCarrol et Dahlberg, 1934) soit en culture de tissus(Szabo, 1954; Hay, 1961).

Par contre, des kystes non keratinises, comme celui de la Planche 2, Fig. J, etdes amas cellulaires de type muqueux (Planche 2, Fig. K) peuvent etre considerescomme autant de structures derivant des zones adamantines presomptives elles-memes, car des formations metaplasiques analogues ont ete obtenues, egalementen culture, a partir d'organes adamantins deja differencies, mais isoles ou depour-vus d'une alimentation adequate (Szabo, 1954). De meme, il est frappant detrouver dans la paroi des kystes dentigeres (Gorlin, 1957), des structures ana-logues a celles qui se sont developpees dans nos cultures. Ces ressemblanceshistologiques concernent notamment les epitheliums de type respiratoire (Planche2, Fig. I) et les parois kystiques de type malpighien. Ces structures peuvent doneetre attributes a 1'evolution in vitro de tissus adamantins presomptifs encoreinsuffisemment determines. Des lors, si elles pouvaient etre etudiees sur un plusgrand nombre de cas, les similitudes entre anomalies produites en culture etkystes dentigeres permettraient d'interpreter la pathogenie de ces derniersnotamment comme une alteration des facultes inductrices du mesenchyme odon-togene au moment ou l'epithelium presomptif n'a pas encore acquis une speci-alisation definitive.

Nous avons done observe dans nos cultures des degres variables d'involutiondu mesenchyme odontogene suivant le stade du prelevement. Dans les explantsles plus jeunes, preleves a 9\ jours, c'est la condensation de ce mesenchyme autourdu bourgeon adamantin qui echoue (Planche 1, Figs. E et F). Une partie dumateriel mesectoblastique echappe ainsi au groupe de cellules destinies auxpapilles pulpaires et celles-ci n'atteignent plus que des dimensions reduites(Planche 2, Figs. G, H et I).

Dans les explants plus ages (11 jours), ou la condensation du mesenchymeodontogene a deja commence in situ (Planche 1, Fig. C), il semble que la papillepulpaire puisse se developper davantage. Cependant, meme dans ce cas, l'ebauchepulpaire involue, subissant cette fois une degenerescence necrotique (Planche 2,

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Figs. J et K). II ne parait pas que cette involution puisse s'expliquer par uneaction toxique des materiaux nutritifs. La nature de l'extrait embryonnaire,provenant d'un Oiseau ou d'un Mammifere n'influence pas, en effet, les resultatd'une maniere sensible.

La culture en roller-tubes, ou le brassage gazeux remplace Poxygenation natu-relle, ne maintient pas davantage la vitalite de la papille pulpaire (Planche 2,Fig. K). Des lors, quels motifs pouvons-nous invoquer pour expliquer la con-densation insuffisante du mesenchyme odontogene et l'hypotrophie suivie denecrose de la papille pulpaire in vitro ?

La nature mesectoblastique de ce materiel pulpaire peut en donner une certaineexplication si Ton songe que les cellules derivees du systeme nerveux embryonnaire,tout comme les cellules des cretes neurales, se developpent tres dimcilement invitro dans les conditions ou nous avons opere. II est cependant plus vraisemblableque l'involution in vitro du materiel pulpaire resulte des difficultes d'ordre tro-phique imposees a de tres jeunes explants notamment apres elimination de lacirculation sanguine. Le gradient de basophilie observe au contact des vaisseauxnourriciers semble bien temoigner de l'importance que rev§t deja a ce stade lanutrition sanguine in situ (Planche 1, Figs. A et B).

Quels que soient d'ailleurs la cause et le mecanisme de cette involution, ce quiimporte est que l'elimination du mesectoblaste entraine Pisolement de l'organeadamantin in vitro et l'echec de sa cytodifferenciation.

II en va tout autrement des capacites de morphodifferenciation qui semblentbien appartenir en propre a l'ebauche adamantine et se revelent done plus pre-cocement (du lOeme au 12eme jour). Ces aptitudes se manifestent par la prisede forme specifique de l'ebauche in vitro, meme dans des cas ou, pour les raisonsprecedemment exposees, la cytodifferenciation adamantine a echoue (Planche 2,Figs. JetK). A partirde 11 jours, on peut observer des replisadamantinsnormauxen depit d'une necrose totale de la papille (Planche 2, Fig. K).

Cette independance morphogenetique des deux parties de l'ebauche apparaittoutefois relative, surtout pour des explants preleves precocement. Dans ces cas,on voit bien se former des levres adamantines (Planche 2, Figs. H et I) mais, fautede pouvoir envelopper une masse suffisante de cellules pulpaires, elles ne par-viennent pas a former une cupule veritable. Ceci est en accord avec l'hypotheseenoncee par Butler (1956), d'un role passif de la pulpe, l'organe adamantindirigeant le processus morphogenetique qui conduit a la prise de forme de ladent.

Nous voudrions enfin tenter d'analyser la vitesse du developpement desebauches en culture, a l'aide des quelques observations qui ont permis de comparerla croissance et la maturation in vivo, et in vitro. Nos observations montrent quela vitesse relative du developpement en culture s'accroit en fonction du stade deprelevement. Ainsi, tandis que cette vitesse ne represente que 40 % de la normalepour les explants preleves a 9 | jours, elle oscille entre 60 et 66 % dans les explantspreleves a 10| jours pour atteindre 70% lorsque la dissection intervient a 12

Culture des ebauches dentaires 403

jours. Cette courbe ascendante pourrait traduire un accroissement momentaneet localise des facultes d'assimilation cellulaire, propriete susceptible de donneraux bourgeons dentaires une independance progressive vis a vis des conditionsnutritives. En fait, cette conclusion rejoint celle que nous avons deja formuleeplus haut (cf. p. 402) apres avoir analyse l'echecde la croissance pulpaire dans lesexplants preleves avant 12 jours. Elle correspond egalement aux conclusionsd'une etude histochimique precedente (Pourtois, 1961) ou nous avions indiqueque les reserves de glycogene a la disposition du germe dentaire sont utilisees auniveau de ses centres de croissance.

RESUME

1. Des embryons de Souris et accessoirement de Rat, de 8 | a 12 jours p.c. ontfourni le materiel de cette etude. Les regions destinees a former les bourgeonsdentaires ont ete l'objet d'une description histochimique et d'une etude experi-mentale. L'etude histochimique concerne la repartition de V ARN dans les zonesdentaires presomptives ainsi que dans la crete neurale. Comme etude experimen-tale, nous avons procede a des cultures in vitro de ces memes regions.

2. L'observation de ces zones presomptives confirme que les deux feuillets quiles composent sont l'epiblaste stomodeal d'une part, la partie antero-interne de lacrete neurale du trijumeau d'autre part.

3. Ces feuillets presomptifs entrent en contact mutuel a 8£ jours p.c. chez laSouris, mais il faut attendre le 12eme jour pour que l'ebauche isolee par micro-dissection, soit capable de se developper normalement in vitro.

4. Dans cet intervalle de temps, les germes dentaires acquierent successivementleur capacite de morphodifferenciation puis de de cytodifferenciation.

5. La capacite morphogenetique est l'apanage de l'ebauche adamantine; ellepeut se manifester a partir de 10| jours meme si la differenciation cytologique suitune evolution anormale et si la pulpe subit une degenerescence hypotrophique.

6. La capacite de differenciation cytologique n'est acquise par les bourgeonsdentaires de la Souris qu' a 12 jours. Avant ce stade, l'ebauche adamantine trans-plantee en culture evolue le plus souvent comme un epithelium muqueux oucomme un kyste dentigere, tandis que l'ebauche pulpaire tend a disparaire oua se necroser.

7. Cette degenerescence du materiel destine a la pulpe peut s'expliquer parson appartenance mesectoblastique, ou plus vraisemblablement par une in-suffisance de la fonction d'assimilation in vitro. Intervenant dans la plupart desexplants preleves avant 12 jours, elle realise en fait l'isolement de l'ebauche adam-antine.

8. C'est done lorsque la pulpe involue que la cytodifferenciation de l'organeadamantin echoue. On peut des lors supposer que in situ, le materiel pulpairedetermine, par induction, la croissance et la maturation normales de Torganeadamantin.

404 M. POURTOIS

SUMMARY

The fate of undifferentiated dental rudiments of rodents cultured in vitro

1. This study was based on mouse and, to a lesser extent, rat embryos from 8£to 12 days of age. The presumptive areas which normally form the dental budswere histochemically described and analysed experimentally. The histochemicalstudy concerns RNA distribution patterns in the presumptive dental regions andin the neural crest. The experimental part involves in vitro culture of the sameregions.

2. Observation of the presumptive areas confirms that they are formed by twolayers: the stomodaeal epiblast, and the anterior and medial portion of thetrigeminal neural crest.

3. The two layers are already in contact at 8£ days, but it is not until the 12thday that the isolated primordium is able to develop normally in vitro.

4. During that interval of time, the dental germs acquire their capacity ofmorphodifferentiation, then of cytodifferentiation.

5. Morphogenetic capacity is shown by the primordium of the enamel organand can express itself from 10| days on even if cytological differentiation isabnormal and if the pulp degenerates.

6. The capacity for cytological differentiation appears only at 12 days. Beforethat stage, an explanted ameloblastic primordium usually develops into amucous epithelium or into a dentigerous cyst, whereas the pulp tends todisappear.

7. This degeneration of the pulp material can be explained either by its mesec-dromal origin, or by nutritional insufficiency in vitro. It occurs when the dentalgerms are explanted before the 12th day, and it leads to isolation of the amelo-blastic rudiment.

8. Thus when the pulp degenerates, the cytodifferentiation of the enamelorgan fails. It may consequently be supposed that in situ, the pulp materialinduces growth and maturation of the pre-ameloblasts.

REMERCIEMENTS

Pendant l'elaboration de ce travail, nous avons beneficie des conseils de Monsieur le Pro-fesseur Jacques Mulnard. Nous lui adressons nos plus vifs remerciements.

TRAVAUX CITES

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{Manuscrit regu le 22 Janvier 1964)

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