Universidad de Oviedo

 

Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias

 

 

“TNFR2, nuevas actividades biológicas y

moduladoras” 

 

 

Lucía Cabal Hierro

Junio 2011

 

 

 

TESIS DOCTORAL

 

 

 

 

 

 

 

 

Universidad de Oviedo

Instituto Universitario de Oncología del Principado

de Asturias  

 

 

“TNFR2, nuevas actividades biológicas y

moduladoras” 

 

 

 

Lucía Cabal Hierro Pedro Sánchez Lazo

Autor/a Director/a

Junio 2011 

 

TESIS DOCTORAL

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ÍNDICE 

   

 

 

 

   

        Índice 

 

ÍNDICE I.  INTRODUCCIÓN  1 

I.1  EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL  1 

I.1.1  ANTECEDENTES HISTÓRICOS  1 I.1.2  PAPEL BIOLÓGICO DEL TNF  1 I.1.3  IMPLICACIÓN DEL TNF EN PROCESOS TUMORALES  3 I.1.4  ESTRUCTURA DEL TNF  4 

I.2  LA SUPERFAMILIA DE RECEPTORES DEL TNF  6 

I.2.1  CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA SUPERFAMILIA TNFR  6 I.2.2  ACTIVIDAD DE LOS RECEPTORES DE LA SUPERFAMILIA TNFR  7 I.2.3  PROTEÍNAS ADAPTADORAS TRAF  8 

I.2.3.1  TRAF1  10 I.2.3.2  TRAF2  11 I.2.3.3  TRAF3  11 

I.3  LOS RECEPTORES DEL TNF: TNFR1 Y TNFR2  12 

I.3.1  EL TNFR1  13 

I.3.1.1  SEÑALIZACIÓN DESENCADENADA POR EL TNFR1  13 I.3.1.2  FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA DEL TNFR1  15 

I.3.2  EL TNFR2  15 

I.3.2.1  SEÑALIZACIÓN DESENCADENADA POR EL TNFR2  17 I.3.2.2  FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA DEL TNFR2  18 

I.4  EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS TNFRs  20 

I.4.1  MUERTE CELULAR  20 

I.4.1.1  APOPTOSIS  20 

I.4.1.1.1  LAS CASPASAS  21 I.4.1.1.2  VÍAS DE ACTIVACIÓN DE LA APOPTOSIS  22 

I.4.1.2  NECROSIS PROGRAMADA O NECROPTOSIS  24 

I.4.2  PROLIFERACIÓN CELULAR  25 

I.4.2.1  EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL NF‐κB  25 

I.4.2.1.1  ACTIVACIÓN DE NF‐κB  26 I.4.2.1.2  IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE NF‐κB  28 

I.4.2.2  EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL AP‐1  29 

I.4.2.2.1  ACTIVACIÓN DE LAS MAPKs  29 I.4.2.2.2  JNK Y AP‐1  29 I.4.2.2.3  ACTIVACION DE JNK POR TNFRs  30 I.4.2.2.4  IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE AP‐1  32 

Índice 

 

 

I.5  REGULACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN DE LOS TNFRs  32 

I.5.1  LA UBIQUITINACIÓN  33 

I.5.1.1.1  LAS PROTEINAS IAP  34 I.5.1.1.2  ENZIMAS DESUBIQUITINANTES  35 

I.5.2  INTERCONEXIÓN ENTRE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE LOS TNFRs  36 I.5.3  PROCESAMIENTO DE LOS  TNFRs  37 

II.  OBJETIVOS  39 III.  MATERIALES  41 

III.1  LINEAS CELULARES Y CONDICIONES DE CULTIVO  41 

III.1.1  LÍNEAS CELULARES  41 III.1.2  MANTENIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES  41 

III.2  OLIGONUCLEÓTIDOS  42 III.3  ANTICUERPOS  43 III.4  PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN  44 III.5  OTROS MATERIALES  47 

IV.  MÉTODOS  49 

IV.1  EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO Y RNA  49 

IV.1.1  EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO  49 IV.1.2  EXTRACCIÓN DE RNA Y TRANSCRIPCIÓN REVERSA.  49 IV.1.3  ANÁLISIS  PCR  49 

IV.2  CONSTRUCCIÓN DE VARIANTES DEL RECEPTOR RANK‐TNFR2  50 

IV.2.1  REACCIONES DE AMPLIFICACIÓN  50 IV.2.2  VARIANTES DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2  51 

IV.3  GENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES TRANSFECTANTES ESTABLES  53 IV.4  OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA PLASMÍDICO  55 

IV.4.1  TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli CON DNA PLASMÍDICO  55 IV.4.2  PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO  55 

IV.5  TRANSFECCIÓN TRANSITORIA DE CÉLULAS EUCARIOTAS  56 IV.6  ANÁLISIS WESTERN‐BLOT  56 

IV.6.1  PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS CELULARES TOTALES  56 IV.6.2  ELECTROFORESIS Y ELECTROTRANSFERENCIA  57 IV.6.3  INCUBACIÓN CON LOS ANTICUERPOS  57 IV.6.4  ESCANEADO POR INFRARROJOS  58 IV.6.5  REVELADO Y REDETECCIÓN DE LAS MEMBRANAS (STRIPPING)  58 

IV.7  ENSAYO DE UNIÓN IN VITRO (PULL DOWN)  58 

IV.7.1  PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN A GST  58 IV.7.2  ENSAYO DE UNIÓN IN VITRO  59 

IV.8  ENSAYO DE CO‐INMUNOPRECIPITACIÓN  60 

        Índice 

 

IV.9  ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE NF‐κB  60 IV.10  FOSFORILACIÓN DE c‐JUN  61 IV.11  CUANTIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN CELULAR HIPODIPLOIDE  62 IV.12  INMUNOCITOQUÍMICA  62 IV.13  ESTUDIOS DE LOCALIZACIÓN EN SUPERFICIE  63 IV.14  TRATAMIENTOS CON CITOQUINAS  64 

IV.14.1  ESTUDIO DE LA VIABILIDAD CELULAR  64 IV.14.2  ESTUDIO DE LOS NIVELES DE MUERTE CELULAR  64 

IV.15  ANÁLISIS DEL PERFIL DE FOSFORILACIÓN  65 

V.  RESULTADOS  67 

V.1  PAPEL DE LAS PROTEÍNAS ADAPTADORAS TRAF EN LA SEÑALIZACIÓN DEL TNFR2  67 

V.1.1  ANÁLISIS DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF CON EL TNFR2  67 

V.1.1.1  ESTUDIO IN VITRO DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF CON EL TNFR2  67 V.1.1.2  ESTUDIO IN VIVO DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF CON EL TNFR2  69 

V.1.2  EFECTO DE LAS PROTEÍNAS TRAF EN LA SEÑALIZACIÓN DEL TNFR2  72 

V.1.2.1  ACTIVACIÓN DE NF‐κB  72 V.1.2.2  ACTIVACIÓN DE  c‐JUN QUINASA (JNK)  75 

V.1.3  ANÁLISIS DE LA DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF  76 

V.2  ANÁLISIS FUNCIONAL DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2.  80 

V.2.1  UNIÓN CON LAS PROTEÍNAS TRAF  81 V.2.2  ACTIVACIÓN DE NF‐кB.  82 V.2.3  ACTIVACIÓN DE JNK.  82 V.2.4  INDUCCIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2.  83 V.2.5  EFECTO DE RANK‐TNFR2 EN LA APOPTOSIS INDUCIDA POR TNFR1.  84 V.2.6  LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DEL RECEPTOR RANK‐TNFR2.  86 

V.3  IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DEL TNFR2 RESPONSABLE DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2    89 

V.3.1  LA INDUCCIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 POR TNFR2 ES INDEPENDIENTE DE SU UNIÓN AL RECEPTOR  89 

V.3.2  IDENTIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS RESPONSABLES DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 POR EL TNFR2  91 

V.3.3  EFECTO DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 SOBRE LA CAPACIDAD DE ACTIVACIÓN DE NF‐κB POR EL TNFR2  93 

V.4  INTERACCIÓN FUNCIONAL ENTRE EL  TNFR1 Y  EL TNFR2  97 

V.4.1  LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 INDUCIDA POR EL TNFR2 AFECTA A LA ACTIVACIÓN DE NF‐кB POR EL TNFR1  97 

V.4.2  LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 INDUCIDA POR EL TNFR2 AUMENTA LA CAPACIDAD APOPTÓTICA DEL TNFR1.  100 

V.5  ESTUDIO FUNCIONAL DE LAS REGIONES DEL TNFR2 RESPONSABLES DE LA ACTIVACIÓN DE JNK    103 

V.6  GENERACIÓN Y ESTUDIO DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN ESTABLE Y PERMANENTE DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2  107 

Índice 

 

 

V.6.1  GENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES TRANSFECTANTES ESTABLES DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL  107 

V.6.2  EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA ACTIVACIÓN DE TNFR1 Y TNFR2 (RANK‐TNFR2)  113 

VI.  DISCUSIÓN  121 VII.  CONCLUSIONES  140 VIII.  BIBLIOGRAFÍA  141 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ABREVIATURAS 

Abreviaturas 

i 

 

ABREVIATURAS 

7‐AAD      7‐amino‐actinomicina D 

αMEM      Medio mínimo esencial α 

ADAM      Disentegrina y metaloproteasa 

AP‐1      Proteína activadora 1 

APAF‐1      Factor activador de proteasas apoptóticas 

ASK      Quinasa estimulante de la señal apoptótica      

ATCC      Colección americana de cultivos  

ATP      Adenosín trifosfato 

BAFF      Factor activador de células B 

Bax      Proteína X asociada a Bcl‐2 

Bcl‐2      Proto‐oncogén de linfoma de células B 

Bid                                      Proteína agonista de muerte con dominio de interacción BH3 

BIR      Repetición IAP de Baculovirus 

BKO      Bloqueo de la interacción 

BSA      Seroalbúmina bovina 

CD40L      Ligando de CD40 

cDNA      DNA complementario 

Células NK      Células Natural Killer 

CoIP      Análisis de coinmunoprecipitación 

CRD      Dominio rico en cisteínas 

crmA      Producto del virus Cowpox modificador de la respuesta a citoquinas A 

CYLD      Cylindromatosis 

DAPI      4´,6‐diamino‐2‐fenilindol 

DISC      Complejo de señalización inductor de muerte 

DcR      Receptor señuelo 

DD      Dominio de muerte 

dNTPs      Desoxirribonucleótidos trifosfato 

DIABLO      Proteína de unión directa a IAP con bajo pI 

DNA      Ácido desoxirribonucleico 

DMEM      Medio EAGLE modificado por Dulbecco 

DTT      Ditiotreitol 

Ec      Extracelular 

ECL      Quimioluminiscencia enzimática 

EDTA      Ácido etilendiaminotetracético 

ERK      Proteína quinasa regulada extracelularmente 

Abreviaturas 

ii 

 

FADD      Proteína asociada al dominio de muerte de Fas 

FBSi      Suero fetal bovino inactivado 

FHC      Cadena pesada de ferritina 

FPLC      Cromatografía líquida rápida de proteínas  

GAPDH      Gliceraldehído 3‐fosfato deshidrogenasa 

GFP      Proteína verde fluorescente 

GP2      Línea de empaquetamiento viral derivada de la línea HEK 

GST      Glutatión S‐transferasa 

HEPES      Ácido N‐2‐Hidroxietilpiperacina‐N'‐2'‐Etanesulfónico 

IAP      Proteína inhibidora de apoptosis 

IκB      Proteína inhibidora de NF‐κB 

Ic      Intracelular 

Ig      Inmunoglobulina 

IKK      Quinasa de IκB 

IL      Interleuquina 

IP      Ioduro de propidio 

IPTG      Isopropil‐β‐D‐1‐tiogalactopiranósido 

IRES      Sitio interno de entrada al ribosoma 

JNK      Quinasa del extremo amino de c‐Jun 

kDa      Kilodalton 

Kb      Kilobase 

LB      Medio de cultivo lisogénico 

LPS      Lipopolisacárido 

mTNF      Forma transmembrana del TNF 

MAPK      Protéina quinasa activada por mitógenos 

MKK      Quinasa de MAPK 

MKKK      Quinasa de MKK 

Mn‐SOD      Mn++ Superóxidop Dismutasa 

MoMuLV      Virus de la leucemia murina de Moloney 

NEMO      Modulador esencial de NF‐κB   

NF‐κB      Factor nuclear κB 

NIK      Quinasa inductora de NF‐κB  

NP‐40      Nonidet P‐40 

p80TRAK      Quinasa asociada al receptor p80 del TNF 

PAGE      Electroforesis en gel de acrilamida 

pb      Pares de bases 

PBS      Tampón fosfato salino 

Abreviaturas 

iii 

 

PCR      Reacción en cadena de la polimerasa 

PE      Ficoeritrina 

PEI      Polietilenimina 

PLAD      Dominio de asociación previa a la unión del ligando 

PMSF      Fenil‐Metil‐Sulfonil‐Fluoruro 

PSA      Persulfato amónico 

PVDF      Polifluoruro de vinilideno 

RANK      Receptor activador de NF‐κB 

RANKL      Ligando de RANK 

RIP      Proteína inhibidora del receptor 

RNA      Ácido ribonucleico 

rpm      Revoluciones por minuto 

RPMI      Medio Roswell Park Memorial Institute 

RT      Transcripción reversa 

SDS      Dodecilsulfato sódico 

SIDA      Síndrome de la inmunodeficinecia adquirida 

TACE      Enzima conversor del TNF  

TAE      Tris acetato EDTA 

TBS      Tampón tris salino 

TBS‐T      Tampón tris salino con 0,1% de Tween 20 

TEMED      N,N,N,N‐tetrametilendiamina 

TIM      Motivo de interacción con proteínas TRAF 

TLR      Receptor Toll‐like 

Tm      Temperatura de fusión 

TNF      Factor de necrosis tumoral 

TNFm      Factor de necrosis tumoral de origen murino 

TNFR      Receptor del TNF 

TNFRSF      Superfamilia de receptores del TNF 

TNFSF      Superfamilia del TNF 

TRADD      Proteína con dominio de muerte asociada al TNFR1 

TRAF       Proteína con dominio de muerte asociada al TNFR1 

TRAPS      Síndrome periódico asociado al TNFR 

TWEAK      Inductor débil de apoptosis relacionado con el TNF 

SMAC        Segundo activador de caspasas derivado de la mitocondria 

sTNF      Forma soluble del TNF 

Ubc      Ubiquitina C 

VEGF      Factor de crecimiento del endotelio vascular 

Abreviaturas 

iv 

 

VSVg      Proteína de la envoltura viral del virus de la estomatitis vesicular 

WB      Análisis Western‐Blot 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

INTRODUCCIÓN 

   

 

 

 

 

   

Introducción 

1 

 

I. INTRODUCCIÓN 

I.1 EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL 

I.1.1 ANTECEDENTES HISTÓRICOS 

En 1868, el científico alemán P. Bruns observó que, en ocasiones, pacientes con cáncer 

que atravesaban un proceso severo de  infección bacteriana, experimentaban una regresión e 

incluso una eliminación del  tumor  (Bruns, 1868). Estas  constataciones, desencadenaron una 

serie de  investigaciones que  llevaron a WB. Coley a emplear con éxito extractos bacterianos 

(conocidos  como  “toxinas  de  Coley”)  en  el  tratamiento  de  diversos  tumores  (Coley,  1891). 

Posteriormente,  en  1943,  MJ  Shear  aisló  de  extractos  bacterianos  el  denominado 

lipopolisacárido (LPS), demostrando que era el responsable de la regresión tumoral  observada 

en  situaciones  de  infección  bacteriana  (Shear,  1943).  Años más  tarde,  en  1952,  GH  Algire 

concluyó  que  el  LPS  inducía  procesos  de  necrosis  con  hemorragia  tumoral  debida  a 

hipotensión  sistémica,  colapso  de  la  vascularización  tumoral,  anoxia  y  finalmente  muerte 

celular (Algire et al, 1952). WE O´Malley, en 1962, determinó que los efectos desencadenados 

por  el  LPS  no  eran  directos,  sino mediados  por  la  inducción  de  un  factor  del  suero  que 

denominaron “factor necrotizante tumoral”, siendo renombrado posteriormente como factor 

de necrosis tumoral (TNF, del inglés Tumor Necrosis Factor) (O'Malley, 1962). 

Consecuentemente,  la  posibilidad  de  aplicación  del  TNF  como  agente  antitumoral 

originó  una  profunda  investigación  que  permitió  su  identificación  molecular  mediante  su 

purificación, caracterización y posterior clonación (Beutler & Cerami, 1986; Pennica et al, 1985; 

Shirai et al, 1985; Wang et al, 1985). 

Aunque  inicialmente  el  TNF  fue  identificado  por  sus  propiedades  antitumorales, 

actualmente  se conoce  su  implicación  tanto en el  inicio, como en el desarrollo y metástasis 

tumoral así como en distintas enfermedades autoinmunes. 

I.1.2 PAPEL BIOLÓGICO DEL TNF 

Numerosos  estudios  han  puesto  de  manifiesto  la  implicación  del  TNF  tanto  en  la 

proliferación como en la función de las células NK (del inglés Natural Killer), de las células T y B, 

de  los  macrófagos  y  de  las  células  dendríticas,  controlando  de  esta  manera  la  respuesta 

Introducción 

2 

 

inmune a distintos niveles y estando, por tanto, implicado tanto en la inmunidad innata como 

en  la  adaptativa  y en  los procesos de desarrollo del  sistema  inmune  (Aggarwal et  al, 2002; 

Locksley et al, 2001). El TNF desempeña un papel crucial tanto en el desarrollo de los órganos 

linfoides  secundarios  como  en  los  procesos  inflamatorios,  así  como  en  la  regulación  del 

sistema  inmune, modulando  tanto procesos apoptóticos como  fenómenos de proliferación y 

diferenciación(Aggarwal et al, 2002). Todo ello  lleva a considerar al TNF como una citoquina 

altamente pleiotrópica que desempeña un papel  clave en  los procesos  inflamatorios que  se 

originan como consecuencia de una infección o de un daño a nivel tisular. 

A  pesar  de  que  clásicamente  se  ha  considerado  a  la  inflamación  una  reacción 

protectora  del  organismo  frente  a  heridas  e  infecciones,  son  numerosos  los  estudios  que 

apuntan  a  la  misma  como  base  de  varias  enfermedades.  De  esta  manera,  se  ha  podido 

comprobar  que  en  numerosas  enfermedades  en  cuyo  origen  se  encuentra  un  proceso 

inflamatorio  o  inmune,  el  TNF  parece mediar  un  papel  clave.  Tal  es  el  caso  de  la Diabetes 

mellitus  tipo  II, donde el TNF  interfiere con  los mecanismos de señalización desencadenados 

por la insulina (Emanuelli et al, 2001) o del SIDA (Síndrome de la Inmuno Deficiencia Adquirida) 

donde el TNF estimula  la expresión   de  la proteína VIH‐1 en células  infectadas  (Badley et al, 

1997; de Oliveira Pinto et al, 2002). 

 

Figura I‐1: Papel fisiológico del TNF. El TNF se encuentra implicado en diversas enfermedades inmunes e inflamatorias, siendo también capaz de desencadenar procesos fisiológos tan dispares como la hematopoyesis y la reabsorción ósea. Todo ello pone de manifiesto el carácter dual de esta citoquina, siendo capaz de inducir procesos de muerte o proliferación celular en función del tipo celular y del entorno biológico. 

TNF

Implicación en diversas enfermedades Implicación en distintos procesos celulares

Diabetes mellitus tipo II

SIDA

Artritis reumatoide

Enfermedad de Crohn

Esclerosis múltiple

Psoriasis

Lupus sistémico eritromatoso

Arterioesclerosis

Osteoporosis

Respuesta inmune

Hematopoyesis

Morfogénesis

Shock séptico

Rechazo a trasplantes

Replicación viral

Reabsorción ósea

Carácter dual

Muerte celular vs Proliferación celular

Desarrollo embrionarioReparación tisular

Introducción 

3 

 

Sin  embargo,  el  TNF  no  se  encuentra  implicado  únicamente  en  el  desarrollo  de 

distintas  enfermedades  sino  que  también  desempeña  un  papel  fundamental  en  diversos 

procesos  fisiológicos,  contribuyendo  tanto  al  crecimiento  como  al desarrollo del organismo, 

poniendo de manifiesto su marcada dualidad al ser capaz de  inducir respuestas celulares tan 

distintas y opuestas como la muerte y la supervivencia celular. 

I.1.3 IMPLICACIÓN DEL TNF EN PROCESOS TUMORALES 

La acumulación sucesiva de mutaciones génicas supone  la base para  la  formación de 

un cáncer, considerándose que su éxito y desarrollo dependen de  la adquisición de una serie 

de  rasgos  fisiológicos  comunes  característicos  (Hanahan  &  Weinberg,  2000;  Hanahan  & 

Weinberg, 2011) entre  los que el desarrollo de un proceso  inflamatorio ha  ido  adquiriendo 

importancia como rasgo identificativo de todo proceso tumoral (Mantovani, 2009; Mantovani 

et al, 2008). El TNF actúa como mediador clave entre  los procesos  inflamatorios y el cáncer,  

siendo  rasgo  común  de  numerosos  tumores  la  producción  constitutiva  de  TNF  desde  el 

microambiente tumoral.  

Aunque  el  TNF  fue  inicialmente  identificado  por  sus  propiedades  antitumorales 

posicionándose como posible herramienta para el tratamiento del cáncer, su uso como tal es 

limitado  debido  a  su  toxicidad  sistémica  (Feinberg  et  al,  1988).  Es  por  ello  que  numerosos 

estudios se han centrado en el desarrollo de nuevas estrategias que eviten este perfil tóxico. 

En este contexto, se ha podido comprobar que la inhibición de las metaloproteasas de matriz 

reduce  la toxicidad propia del TNF  (Van Roy et al, 2007; Wielockx et al, 2001), si bien el TNF 

puede emplearse con éxito en el tratamiento de sarcomas de tejidos blandos de extremidades 

al  administrarse  de  manera  local  mediante  perfusión,  evitando  así  sus  efectos  sistémicos 

(Eggermont et al, 2003; Grunhagen et al, 2006). 

Por  otro  lado,  y  remarcando  el  carácter  dual  de  esta  citoquina,  el  TNF  facilita  el 

desarrollo  tumoral  al  regular  la  proliferación  y  la  supervivencia  de  las  células  neoplásicas 

(Balkwill, 2009; Sethi et al, 2008). De esta manera, se encuentra implicado en diversas fases del 

desarrollo  de  ciertos  tipos  tumorales,  principalmente  por medio  de  la  activación  del  factor 

transcripcional NF‐κB (del inglés Nuclear Factor‐kappa B), implicado en procesos inflamatorios 

que  promueven  la  proliferación  tumoral  (Hsu  et  al,  2001;  Shishodia  &  Aggarwal,  2004),  y 

también mediante  la  inducción de  factores angiogénicos como  IL‐8    (interleuquina 8) y VEGF 

(del  inglés Vascular Endothelial Growth Factor) (Johnston et al, 2009). Así, el TNF favorece  la 

expansión de numerosos tipos de tumores, los cuales aparecen indicados en la Tabla I‐1. 

Introducción 

4 

 

Tabla I‐1: Tumores donde el TNF promueve la proliferación celular. 

El TNF se encuentra también implicado en la inducción de la invasividad y angiogénesis 

de  distintos  tumores  y  del  fenotipo  transformado  invasivo  de  células mamarias  epiteliales 

(Montesano  et  al,  2005).  Además,  desempeña  un  papel  importante  en  la  regulación  de  la 

angiogénesis en gliomas y en tumores de vejiga (Nabors et al, 2003), así como en el desarrollo 

tumoral en la mucosa gástrica (Oguma et al, 2008)  y en células endoteliales cerebrales (Wang 

et al, 2011). El TNF interviene también en los procesos de metástasis tumoral sirviendo como 

marcador metastásico en el caso de tumores nasofaríngeos (Lu et al, 2011).  

Debido  al  papel  que  el  TNF  desempeña  en  el  desarrollo  de  diversas  enfermedades 

autoinmunes y en procesos  tumorales, numerosos estudios se han centrado en el desarrollo 

de posibles  inhibidores de  esta  citoquina  tales  como  anticuerpos  específicos  contra  el  TNF, 

receptores  solubles  e  inhibidores  de  la  expresión  del  TNF,  así  como  inhibidores    de  su 

oligomerización y señalización. De todos ellos,  los más eficaces y con cierta aplicación clínica 

son el Infliximab (Baert et al, 1999), el Etanercept (Mease et al, 2000); (Moreland et al, 1997) y 

la Thalidomida (Moreira et al, 1993);(Attal et al, 2006), si bien todos presentan ciertos efectos 

secundarios que dificultan su utilización. 

I.1.4 ESTRUCTURA DEL TNF 

El TNF se sintetiza inicialmente como una proteína transmembrana (mTNF) de 26 kDa 

formada por 233 aminoácidos donde los 76 primeros constituyen el péptido de localización en 

membrana.  Se  trata  de  una  proteína  de membrana  tipo  II,  en  la  que  el  extremo  amino  se 

localiza  hacia  el  citosol  y  el  extremo  carboxilo  hacia  el  espacio  extracelular  siendo  éste  el 

responsable de su acción biológica (Kriegler et al, 1988; Pennica et al, 1984). 

Tipo de tumor  Referencia Tipo de tumor Referencia 

Linfoma de células B (Digel et al, 1989) Carcinoma de pulmón (Kalthoff et al, 1993)

Linfoma de células T 

escamosas 

(Giri & Aggarwal, 1998) Cáncer pancreático (Schmiegel et al, 1993)

Leucemia megacariobástica  (Liu et al, 1998) Carcinoma de ovario (Wu et al, 1993)

Leucemia de células T adultas  (Tsukasaki et al, 2001) Cáncer de epitelio 

cervical 

(Woodworth et al, 

1995) 

Leucemia linfocítica crónica  (Duncombe et al, 1989) Glioblastoma (Aggarwal et al, 1996)

Leucemia linfocítica aguda  (Elbaz & Mahmoud, 

1994) 

Neuroblastoma (Goillot et al, 1992)

Carcinoma de mama (Montesano et al, 2005)

Introducción 

5 

 

 El mTNF puede  ser procesado por una metaloproteasa específica denominada TACE 

(del inglés TNF‐Alpha‐Converting Enzyme o enzima conversor del TNF) o ADAM17 (del inglés A 

Disintegrin And Metalloproteinase 17), proteína  indispensable para el correcto desarrollo en 

mamíferos  y  que  se  encuentra  implicada  también  en  el  procesamiento  de  otras  proteínas 

entre  las que se encuentran  los propios  receptores del TNF  (Black et al, 1997; Buckley et al, 

2005; Garton et al, 2003; Lammich et al, 1999; Moss et al, 1997; Peschon et al, 1998a; Reddy et 

al, 2000). TACE  juega un papel importante en la regulación  de la capacidad citotóxica del TNF, 

puesto que su inhibición suprime la citotoxicidad del TNF en células mieloides (Horiuchi et al, 

2007). La acción de TACE  sobre el mTNF a nivel de  sus  residuos Ala‐66 y Val‐67 origina una 

forma  soluble  del  ligando  (sTNF)  de  17  kDa  biológicamente  activa  (Black  et  al,  1997).  En 

condiciones naturales, las isoformas sTNF y mTNF coexisten de forma mono, di o trimérica en 

un equilibrio donde la forma trimérica es la biológicamente activa.   

El  análisis  de  distintos mutantes  puntuales  del  TNF  permitió  la  identificación  de  los 

sitios concretos del TNF responsables de su actividad biológica y por tanto, de  la  interacción 

con sus receptores. Así, los residuos Arg‐32, Leu‐36, Ser‐86 y Ala‐84 del TNF se localizan juntos 

en  la estructura cuaternaria de  la molécula quedando  localizados en  la base de  la misma y a 

cada  lado del surco que separa a cada uno de  los monómeros en  la estructura  trimérica del 

TNF,  estando  directamente  implicados  en  la  interacción  del  TNF  con  sus  receptores  (Van 

Ostade et al, 1991).  

Si  bien  el  TNF  ejerce  sus  efectos  biológicos  a  través  de  su  interacción  con  los 

receptores  TNFR1  y  TNFR2  (del  inglés  Tumor  Necrosis  Factor  Receptor  1  y  2),  el  sTNF 

únicamente  activa  de manera  eficaz  al  TNFR1 mientras  que  el mTNF  es  capaz  de  activar 

eficazmente a ambos  receptores  (Grell et al, 1995; Grell et al, 1998b). Por otra parte,  se ha 

sugerido    que  el mTNF,  además  de  actuar  como  ligando,  puede  actuar  como  receptor  en  

contactos  célula‐célula  en  los  que  desencadena  una  señalización  reversa    que  tiene 

consecuencias en procesos proliferativos y de supervivencia celular mediante la activación del 

factor transcripcional NF‐κB (Allie et al, 2008; Oikonomou et al, 2006; Zhang et al, 2008). 

El  TNF  experimenta  una  serie  de  modificaciones  post‐traducionales  entre  las  que 

destacan  su  palmitoilación  entre  sus  regiones  transmembrana  e  intracelular  (Utsumi  et  al, 

2001)  y  la  fosforilación  en  residuos de  serina de  su  region  intracelular  (Pocsik  et  al,  1995), 

siendo  ambas  modificaciones  importantes  para  la  regulación  de  los  efectos  biológicos 

mediados por el ligando.  

Introducción 

6 

 

I.2 LA SUPERFAMILIA DE RECEPTORES DEL TNF 

El estudio y caracterización del TNF ha propiciado  la  indentificación de  la mayor de  las 

familias de citoquinas conocida hasta el momento, denominada TNFSF  (del  inglés TNF Super 

Family),  compuesta  actualmente  por  19 miembros  (ver  Figura  I‐2  que  ejercen  sus  efectos 

biológicos por medio de su interacción con diversos receptores de membrana que se engloban 

a  su  vez    en  la  familia  TNFRSF  (del  inglés  TNF  receptor  Super  Family),  constituida  por  28 

receptores  distintos,  si  bien  se  desconoce  el  ligando  de  alguno  de  ellos  (Bigda  et  al,  1994; 

Tansey & Szymkowski, 2009; Wiens & Glenney, 2011). 

I.2.1 CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA SUPERFAMILIA TNFR 

Las proteínas pertenecientes a esta  familia de  receptores  se caracterizan por poseer 

entre  1  y  6  dominios  ricos  en  cisteínas  (CRD,  del  inglés  Cystein Rich Domain)  en  su  región 

extracelular,  los cuales median su unión a sus respectivos  ligandos  (Bodmer et al, 2002). Por 

otro  lado,  las diferencias existentes en sus regiones  intracelulares permiten diferenciar entre 

tres tipos distintos de receptores: 

♦ Receptores  de  muerte:  caracterizados  por  poseer  en  su  región  intracelular  el 

denominado  dominio  de  muerte  ó  DD  (del  inglés  Death  Domain)  mediante  el  cual 

interaccionan con diversas proteínas adaptadoras que también presentan DD. Estos receptores 

son capaces de desencadenar un proceso apoptótico que se ve inhibido tras la delección de su 

DD (Itoh & Nagata, 1993; Tartaglia et al, 1993). Dentro de este grupo se incluye al TNFR1, uno 

de los dos receptores del TNF. 

♦ Receptores carentes de DD en su región intracelular: en ellos la transducción de la 

señal depende de  la previa unión de proteínas adaptadoras TRAF  (del  inglés Tumor necrosis 

factor Receptor Associated Factor) a la región citoplasmática del receptor a través de motivos 

denominados TIM (del  inglés TRAF  Interacting Motif). Dentro de este grupo se encuentran el 

TNFR2 (objeto de estudio del presente trabajo) y RANK (Receptor Activador de NF‐κB). 

♦ Receptores  señuelo:  carecen  de  región  citoplasmática  o  ésta  se  encuentra 

truncada, por lo que no pueden transducir señal alguna. En este grupo se incluye, entre otros, 

a DcR3 (del inglés Decoy Receptor 3). 

Introducción 

7 

 

 

Figura I‐2 : Las superfamilias TNF y TNFR. Representación de las interacciones ligando‐receptor entre los diversos miembros de ambas familias. En  la parte  izquierda de  la figura aparecen representados  los denominados receptores de muerte, caracterizados por presentar en  su  región  intracelular el denominado dominio de muerte (indicado  como  DD)  y mediante  el  cual  son  capaces  de  desencadenar  un  proceso  apoptótico  por medio  de  la activación de las caspasas. A continuación, aparecen representados los receptores carentes de dominio de muerte y cuya  señalización  depende de  su  unión,  por medio  de  su  dominio  TIM,  con  proteínas  adaptadoras  TRAF. Dicha interacción  conlleva  la  activación  de  diversas  quinasas  y  del  factor  transcripcional  NF‐κB. Mediante  recuadros negros  se  resalta a TNFR2, objeto de estudio del presente  trabajo, y a TNFR1 y RANK,  los  cuales  serán  también mencionados (adaptado de www.sabiosciences.com). 

I.2.2 ACTIVIDAD DE LOS RECEPTORES DE LA SUPERFAMILIA TNFR 

Los  TNFRs  carecen  de  actividad  enzimática  propia  por  lo  que  su  capacidad  para 

transducir  la  señal  al  interior  celular  depende  de  su  capacidad  de  asociación  con  diversas 

proteínas adaptadoras (Bigda et al, 1994).  

Dentro de estas proteínas adaptadoras pueden distinguirse dos grupos. El primero de 

ellos lo constituyen proteínas adaptadoras con DD, tales como TRADD (del inglés TNF Receptor 

Associated Death Domain)  y  FADD  (del  inglés,  Fas Associated  protein with Death Domain), 

implicadas en la señalización desencadenada por los receptores de muerte, como el TNFR1. El 

segundo grupo de proteínas adaptadoras son las proteínas TRAF, capaces de interaccionar con 

los TNFRs de manera directa  (a  través de  los dominios TIM) o  indirecta  (por medio de otras 

proteínas TRAF o de otras proteínas adaptadoras) (Dempsey et al, 2003). 

Introducción 

8 

 

La  interacción  de  proteínas  adaptadoras  con  los  TNFRs  conlleva  la  formación  de 

diversos  complejos  proteícos  capaces  de  desencadenar  diversas  rutas  de  señalización  que 

conllevan  la activación de vías de proliferación celular, mediante  la activación de  los factores 

de  transcripción NF‐κB  y AP‐1  (del  inglés Activator Protein‐1),  así  como   de muerte  celular, 

tanto mediante procesos de apoptosis como de necroptosis, debido a la activación o inhibición 

de las caspasas respectivamente (ver apdo. I.4). De esta manera, en función del tipo celular y 

el contexto en el que se encuentre,  la activación de un receptor concreto de  la superfamilia 

TNFR  puede  desencadenar  respuestas  celulares  tan  dispares  como  la  supervivencia  o  la 

muerte celular. 

 

Figura  I‐3  : Vías de  señalización desencadenadas por  los  TNFRs.  La  interacción de  las proteínas de  la sueprfamilia  TNF  con  sus  respectivos  receptores  propicia,  al  carecer  éstos  de  actividad  enzimática  propia,  su interacción con diversas proteínas adaptadoras (entre las que destacan las proteínas TRAFs, TRADD y FADD), lo que supone  la  formación  de  un  complejo  de  señalización  que  desencadena  la  activación  de  diversas  rutas  de transducción de señales. Dichas rutas conllevan, por un lado, la activación de los factores de transcripción NF‐κB y AP‐1,  que  desencadenan  respuestas  biológicas  de  supervivencia  y  proliferación  celular.  Por  otro  lado,  pueden desencadenar  la  activación  o  inhibición  de  las  caspasas  lo  que  conduce  a  la muerte  celular  bien mediante  un proceso de apoptosis o de necroptosis respectivamente. 

I.2.3 PROTEÍNAS ADAPTADORAS TRAF 

Las proteínas TRAF   fueron  inicialmente  identificadas por su capacidad de  interacción 

con  distintos  TNFRs,  siendo  capaces  de  regularlos  (Bradley &  Pober,  2001).  Se  trata  de  un 

grupo  de  proteínas  de  anclaje,  estructuralmente  similares,  que  conectan  los  TNFRs  con 

moléculas implicadas en diversas vías de señalización. Las proteínas TRAF también controlan la 

localización subcelular de los complejos ligando‐receptor y modulan la extensión y duración de 

TNFs

TNFRs

Proteínas adaptadoras

TRAF

TRADD

FADDFormación complejo de señalización

Activación de caspasas Inhibición de caspasas Activación AP-1 y NF-κB

Apoptosis Necrosis Supervivencia y proliferación celular

Introducción 

9 

 

la respuesta celular por medio del control de la degradación de proteínas clave implicadas en 

la señalización de los TNFRs (Locksley et al, 2001). 

En  humanos  y  otros  mamíferos  la  familia  TRAF  está  constituida  por  7  miembros 

distintos, siendo su rasgo característico la presencia en su extremo carboxilo del denominado 

dominio TRAF, en donde pueden distinguirse un subdominio carboxilo‐terminal (TRAF‐C) y un 

subdominio amino‐terminal (TRAF‐N) con distinta funcionalidad biológica. El subdominio TRAF‐

C media  la  interacción  de  las  proteínas  TRAF  con  los  TNFRs  así  como  con  otras  proteínas 

adaptadoras, al igual que el  subdominio TRAF‐N que también permite la asociación entre sí de 

las proteínas TRAF de manera trimérica (Chung et al, 2002). 

A excepción de TRAF1, las proteínas TRAF presentan en su extremo amino un dominio 

RING  (del  inglés Really  Interesting New Gen).   La delección de este dominio RING en TRAF2, 

TRAF5 o TRAF6 conlleva la generación de dominantes negativos de los mismos, lo que sugiere 

que este dominio resulta crítico para  la activación de   NF‐κB ó AP‐1(Hsu et al, 1996; Natoli et 

al, 1997), al  igual que una serie de dedos de zinc  localizados entre  los dominios RING y TRAF 

(Dadgostar & Cheng, 1998).  

Aunque  TRAF7  no  presenta  un  dominio  TRAF,  se  incluye  dentro  de  la  familia  TRAF 

puesto que presenta un dominio RING así como diversos dominios de dedos de zinc similares a 

los presentes en el resto de proteínas TRAF y participa en el control de  la señalización de  los 

TNFRs al igual que el resto de proteínas de esta familia. 

La interacción de las proteínas TRAF con los receptores de la superfamilia TNFRs tiene 

lugar a través de motivos de secuencia definida en el receptor. En concreto, TRAF6 regula  la 

actividad de  los TNFRs  interaccionando específicamente con el dominio PxExx presente en  la 

región  intracelular  del  receptor,  siendo  x  cualquier  aminoácido  y  donde  el  último  residuo 

puede ser tanto un aminoácido aromático como ácido (Ye et al, 2002). Por el contrario, en el 

caso de TRAF1, TRAF2, TRAF3 y TRAF5 existen dos motivos conocidos de  interacción con  los 

receptores:  el  dominio  mayoritario  presenta  una  secuencia  (P/S/A/T)x(Q/E)E,  estando  el 

minoritario  representado  por  la  secuencia  PxQxxD  (Chung  et  al,  2002).  TRAF4  parece 

interaccionar  y  regular  a NGFR  (del  inglés Nerve Growth  Factor Receptor)  aunque  su  papel 

exacto no se encuentra esclarecido del todo (Ye et al, 1999), mientras que TRAF7 interacciona 

con TLR2 (del inglés Toll‐Like Receptor 2) estando implicado en la activación de NF‐κB (Yoshida 

et al, 2005) . 

Dentro de la familia TRAF, tanto TRAF1, como TRAF2 y TRAF3 se encuentran implicadas 

en la señalización desencadenada por el TNF. 

Introducción 

10 

 

 

Figura I‐4 : Las proteínas adaptadoras TRAF.  En mamíferos, la familia de proteínas TRAF está consituída por 7 miembros. En ellos puede distinguirse en su extremo amino el dominio RING  (amarillo), pieza  fundamental para  la  señalización de  estas proteínas. Otro  rasgo  característico  es  la presencia de una  serie de dedos de  zinc (morado)  implicados  también en su capacidad de activación de AP‐1 y NF‐κB. Sin embargo, su característica más determinante es  la presencia del denominado dominio TRAF en su extremo carboxilo. En él puede distinguirse un subdominio TRAF‐N  (rojo),  implicado en  la  interacción con otras proteínas TRAF así como con diversas proteínas adaptadoras, al igual que el subdominio TRAF‐C (verde) implicado también en la interacción con los TNFRs. Un caso aparte  lo  constituyen  TRAF1,  que  carece  de  dominio  RING,  y  TRAF7,  que  carece  de  dominio  TRAF  pero  está igualmente implicado en la regulación de la señalización de los TNFRs.  

I.2.3.1 TRAF1 

A diferencia del resto de proteínas TRAF, TRAF1 carece del dominio RING N‐terminal 

presente en otros miembros de la familia. 

TRAF1  fue  inicialmente  identificada  por  su  capacidad  de  interacción  con  el  TNFR2 

(Rothe et al, 1994), pudiendo interaccionar con los TNFRs tanto directa como indirectamente, 

dependiendo en este último caso de la interacción de TRADD  ó TRAF2 con los receptores (Hsu 

et al, 1995; Rothe et al, 1994). Sin embargo, sus funciones bioquímicas y celulares no están del 

todo caracterizadas.  

La  función  principal  de  TRAF1  parece  ser  su  capacidad  de  suprimir  la  apoptosis 

mediada por el TNF. Diversos estudios apuntan que TRAF1 puede ser procesada por la caspasa 

8, originando una forma procesada de TRAF1 (denominada TRAF1‐c) capaz de inducir procesos 

de apoptosis (Leo et al, 2001) y de bloquear la activación de NF‐κB  (Henkler et al, 2003). Por 

otro lado, aunque TRAF1 no es capaz de activar a NF‐κB  por sí misma, se encuentra implicada 

en la regulación de NF‐κB  por medio de la formación de heterodímeros con TRAF2, si bien su 

papel resulta contradictorio. Así, existen estudios que apuntan tanto a su capacidad inhibidora 

(Carpentier & Beyaert,  1999)  como  activadora,  pudiendo modular  también  la  capacidad  de 

TRAF2 de mediar la activación de JNK (del inglés c‐Jun N‐terminal Kinase) (Arron et al, 2002).  

TRAF2

TRAF3

TRAF4

TRAF5

TRAF6

TRAF1

TRAF7

Dominio RING Dedos de Zinc Dominio TRAF-N Dominio TRAF-C

SeñalizaciónInteracción

TRAFsInteracción

TNFRsInteracción

proteínas adaptadoras

Introducción 

11 

 

I.2.3.2 TRAF2 

Junto con TRAF1, TRAF2 fue uno de  los primeros miembros de  la familia TRAF en ser 

identificado (Rothe et al, 1994) siendo capaz de interaccionar tanto con el TNFR1 (a través de 

TRADD)  como  con  el  TNFR2  (interaccionando  directamente  a  través  del  motivo  TIM  del 

receptor). TRAF2 desempeña un papel fundamental en la señalización desencadenada por los 

TNFRs  al  ser  capaz de  activar  tanto  a NF‐κB  como  a AP‐1,  siendo  fundamental para  ambas 

actividades su dominio RING (Takeuchi et al, 1996). Este dominio RING es el que le proporciona 

también propiedades de E3 ubiquitin‐ligasa, siendo capaz de  inducir  la síntesis de cadenas de 

poliubiquitina tipo K‐63, desempeñando un papel fundamental tanto en la activación de NF‐κB  

como de JNK (Habelhah et al, 2004). Por otro lado, TRAF2 interacciona con las proteínas cIAP1 

y cIAP2 (del inglés Inhibitor of Apoptosis Protein 1 y 2) estando implicado en la regulación de la 

señalización  de  los  receptores  de  la  superfamilia  TNFR  por  medio  de  procesos  de 

ubiquitinación (ver apdo. I.5.1). 

I.2.3.3 TRAF3 

TRAF3  fue  inicialmente  identificado  por  su  capacidad  de  interacción  con  CD40.  Sin 

embargo, a pesar de sus similtudes con otras proteínas TRAF, no es capaz de activar a NF‐κB o 

JNK (Kwon et al, 1999), siendo sus motivos de dedos de zinc  los que contribuyen a esta falta 

de actividad, actuando por ello TRAF3 como inhibidor de la actividad de los TNFRs (Liao et al, 

2004).   De  hecho,  la  sustitución  de  estos  dominios  por  el  primer  dedo  de  zinc  y  parte  del 

segundo de TRAF5 es suficiente para convertir a TRAF3 en un activador tanto de NF‐κB como 

de JNK (Dadgostar & Cheng, 1998)  

A  diferencia del resto de proteínas TRAF, TRAF3 no se localiza preferentemente en la 

fracción celular  insoluble,  lo cual explica  sus diferencias en  su capacidad de activación de  la 

señalización  de  los  TNFRs  en  comparación  con  otras  proteínas  TRAF.  De  hecho,  su 

miristoilación,  lo que fuerza su  localización en membrana, convierte a TRAF3 en activador de 

JNK (Dadgostar & Cheng, 2000). 

TRAF3  es  capaz  de  interaccionar  con  diversas  proteínas  adaptadoras  como  TRAF2, 

cIAP1  y  cIAP2  lo  que  induce  su  degradación.  Esta  redución  en  los  niveles  intracelulares  de 

TRAF3 desempeña un papel fundamental en la capacidad de activación de NF‐κB por los TNFRs 

(ver apdo I.4.2.1.1). 

Introducción 

12 

 

I.3 LOS RECEPTORES DEL TNF: TNFR1 Y TNFR2 

El TNFR1 y el TNFR2 son  los dos receptores conocidos para el TNF, siendo diferentes 

tanto  en  su  patrón  de  expresión  como  en  su  estructura,  señalización  y  función.  Ambos 

receptores  son  proteínas  transmembrana  tipo  I,  localizándose  su  extremo  amino  hacia  el 

espacio extracelular y su extremo carboxilo hacia el citosol. Si bien presentan cierta similitud 

en su región extracelular, son completamente distintos en cuanto a la estructura de su región 

intracelular se refiere. 

En su región extracelular destaca  la presencia de 4 CDRs  implicados en  la  interacción 

con el TNF y en donde CDR2 y CDR3   son  los responsables de  la interacción física con el TNF, 

mientras  que  CDR1  (también  denominado  PLAD,  del  inglés  Pre‐Ligand  binding  Assembly 

Domain)  favorece  la  formación  de  complejos  triméricos  del  receptor,  siendo  también 

necesario  para  la  interacción  con  el  ligando  (Chan  et  al,  2000).  Respecto  a  su  región 

intracelular, mientras que el TNFR1 presenta un DD, el TNFR2 carece de él, pero en cambio 

incluye dominios TIMs. 

Tanto  los  ratones  knock‐out  (KO)  para  el  TNFR1  como  para  el  TNFR2  son 

fenotípicamente normales. Esto  indica que ninguno de  los dos receptores, y en consecuencia 

tampoco  el  TNF,  son  necesarios  para  el  desarrollo  y  homeostasis  en  condiciones  normales 

(Peschon  et  al,  1998b).  Sin  embargo,  el  estudio  de  estos  ratones  demostró  que  ambos 

receptores son necesarios para el desarrollo de  la  inflamación a nivel pulmonar dependiente 

de células T, estando también implicados en el desarrollo del daño pulmonar durante procesos 

de  pnemonía  pneumocística.  Por  otro  lado,  la  formación  de  capilares  sanguíneos  y  los 

procesos de angiogénesis se encuentran  intesificados en  los ratones KO de TNFR1 y reducida 

en el caso de los ratones KO de TNFR2 (Luo et al, 2006). 

Como ya se ha comentado anteriormente, el TNF se encuentra  implicado en diversas 

enfermedades  inmunes y en el desarrollo del cáncer. En este sentido, diversos polimorfismos 

identificados en el gen del TNF, así como en los genes de sus receptores, se han asociado con 

una mayor  incidencia de determinados  tipos de  tumores  (Gupta et al, 2008; Yapijakis et al, 

2009), así  como de diversas enfermedades autoinmunes  (Sashio et al, 2002; Waschke et al, 

2005). Es por ello que el desarrollo de terapias de bloqueo de esta citoquina se ha convertido 

en  fuente  de  numerosas  investigaciones  mediante  el  empleo  de  anticuerpos  anti‐TNF  o 

similares. Sin embargo, esta terapia de bloqueo del TNF inhibe tanto al TNFR1 como al TNFR2, 

originando  importantes efectos secundarios debido a  los efectos opuestos que en ocasiones 

desencadena la inhibición de ambos receptores (Feldmann, 2002).  

Introducción 

13 

 

Paralelamente,  estudios  recientes  han  identificado  al  factor  de  crecimiento 

progranulina  (PGRN)  como  un  nuevo  ligando  del  TNFR1  y  del  TNFR2  que  interacciona 

directamente  con  ambos  receptores  actuando  como  antagonista  del  TNF,  alterando  la 

interacción  de  dicha  citoquina  con  los  receptores.  De  hecho,  PGRN  presenta  una  mayor 

afinidad por el TNFR1 y el TNFR2 que el propio TNF (Liu, 2011; Tang et al, 2011). 

I.3.1  EL TNFR1 

El  TNFR1  es  una  proteína  que  se  expresa  en  la mayor  parte  de  los  tipos  celulares, 

siendo  activada  tanto  por  el   mTNF  como  por  el  sTNF  (Grell  et  al,  1995).  Se  trata  de  una 

proteína de 434 aminoácidos, estando sus regiones extracelular, transmembrana e intracelular 

constituidas por 190, 23 y 221 aminoácidos respectivamente. La región extracellular del TNFR1 

se caracteriza por presentar 4 CRDs, mientras que en su región intracelular  presenta un DD de 

81 aminoácidos cerca de su extremo carboxilo (Tartaglia et al, 1993). 

I.3.1.1 SEÑALIZACIÓN DESENCADENADA POR EL TNFR1 

En función del tipo celular  y las condiciones microambientales, la activación del TNFR1 

puede resultar en la inducción de la supervivencia celular, la apoptosis o la necroptosis, lo que 

refleja  la existencia de una  red compleja de  regulación  tras  la activación del  receptor y que 

determina la consecución de respuestas celulares bien distintas. En concreto, los mecanismos 

celulares  de  ubiquitinición  (ver  apdo.  I.5)  y  la  activación  de  las  caspasas  juegan  un  papel 

principal a la hora de determinar la respuesta celular desencadenada por el TNFR1. 

La  interacción  del  TNFR1  con  el  TNF  conlleva  la  formación  consecutiva  de  dos 

complejos distintos de  señalización.  El primero de  ellos  (Complejo  I)  regula  la  expresión de 

proteínas antiapoptóticas que previenen la muerte celular, mientras que el segundo (Complejo 

II) desencadena un proceso de muerte celular  tras la internalización del receptor (Micheau & 

Tschopp, 2003). 

Tras  la  interacción  con  el  TNF,  la  proteína  adaptadora  TRADD  interacciona  con  el 

TNFR1 a través de su DD  reclutando a su vez a diversas proteínas implicadas en la señalización 

del receptor, tales como TRAF2, cIAP1 y 2 y RIP1 (del inglés Receptor Inhibitor Protein 1).  Este 

complejo  (Complejo  I) unido a  la membrana,  inicia rápidamente diversas vías de señalización 

que  conllevan  la  activación  de  NF‐κB  y  AP‐1  (Chen  et  al,  2008)  (ver  apdo.  I.4.2).  Una  vez 

activado, el TNFR1 sufre un proceso de internalización mediante endocitosis que conlleva una 

alteración en la conformación del receptor y una variación en las proteínas que interaccionan 

Introducción 

14 

 

con  él.  En  estas  condiciones,  RIP1  puede  ser  desubiquitinado  por  CYLD  (del  inglés 

CYLinDromatosis) (Hitomi et al, 2008) y reclutado, junto con su quinasa específica RIP3, en un 

complejo molecular que  incluye a TRADD, FADD y a  la procaspasa 8  (Complejo  II o DISC, del 

inglés Death‐Inducing Signaling Complex) (Micheau & Tschopp, 2003) en donde la procaspasa 

8  inactiva  a  RIP1  y  RIP3 mediante  un  procesamiento  proteolítico  iniciándose  así  la  cascada 

apoptótica de activación de caspasas  (He et al, 2009)  (ver apdo.  I.4.1.1). La  inhibición de  las 

cIAPs  previene  también  la  ubiquitinación  de  RIP1,  favoreciéndose  así  la  formación  del 

Complejo II  y, por lo tanto, favoreciendo la activación de caspasa 8 (Bertrand et al, 2008).  

  

Figura  I‐5: Señalización desencadenada por el TNFR1. Tras  la activación del receptor por su  interacción con  el  TNF  tiene  lugar  la  formación  consecutiva de dos  complejos distintos de  señalización.  El primero de  ellos (Complejo  I,  localizado a nivel de membrana) supone  la  interacción del receptor con una serie de proteínas  tales como TRAF2, TRAF3, cIAP1, cIAP2 y RIP1 que conlleva la activación tanto de JNK como de NF‐κB, siendo necesario en  este  último  caso  la  ubiquitinación  de  TRAF2  y  de  RIP1  (ubiquitinación  tipo  K‐63).  Tras  la  internalización  del receptor, se forma el segundo complejo (Complejo II o DISC) en donde se produce la interacción de las proteínas del complejo I con FADD y la procaspasa 8, así como con RIP3. La procaspasa 8 procesa a RIP1 y RIP3 y desencadena un proceso de apoptosis. Sin embargo, en condiciones en  las que  las caspasas  se encuentran  inhibidas, RIP1 y RIP3 experimentan  una  fosforilación  que  supone  la  formación  del  denominado  necroptosoma,  responsable  de  la inducción de un proceso de necrosis programada. 

Cuando la caspasa 8 se encuentra delecionada o inhibida por crmA (del inglés Cytokine 

Response Modifier A) o agentes farmacológicos, el Complejo II es incapaz de desencadenar  la 

apoptosis, pero sí de activar un proceso de necroptosis, aunque no en todos los tipos celulares 

(Holler et al, 2000; Vercammen et al, 1998a). En este contexto de inhibición de caspasas, RIP1 

TNF

TNFR1TRADD

cIAP1 y cIAP2

TRAF2

TRAF3

RIP1

RIP3

TNF

TNFR1TRADD

cIAP1 y cIAP2

TRAF2-K63 RIP1-K63

TRAF3

RIP1/TRAF2-K63

Activación MEKK1 Activación complejo IKK Acumulación de NIK

ACTIVACIÓN AP-1 ACTIVACIÓN NF-κB

TRADD

cIAP1 y cIAP2

RIP1TRAF2

TRADD

cIAP1 y cIAP2

RIP1

TRAF2

FADD

Procaspasa 8

Caspasa 8

APOPTOSIS

Inhibición de las caspasas

RIP3

TRADD

cIAP1 y cIAP2

RIP1

TRAF2

FADD

PNECROPTOSIS

COMPLEJO ICOMPLEJO II

(DISC)

NECROPTOSOMA

Introducción 

15 

 

y  RIP3  se  fosforilan  formando  un  complejo  denominado  necroptosoma  en  el  que  también 

parecen  estar  presentes  FADD  y  TRADD  y  que  inicia  los  mecanismos  efectores  de  la 

necroptosis (Cho et al, 2009; Vandenabeele et al) (ver apdo. I.4.1.2). 

I.3.1.2 FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA DEL TNFR1 

Los  ratones  KO  de  TNFR1,  a  pesar  de  ser  fenotípicamente  normales  desarrollan 

defectos en los folículos primarios de células B y de células dendríticas, indicando un papel del 

receptor en  la estructura  y  funcionamiento de  los órganos  linfoides  (Pasparakis et al, 1996; 

Pasparakis et al, 2000). El TNFR1 también se encuentra implicado en la defensa del organismo 

contra  distintos microorganismos,  en  la  inducción  y mantenimiento  de  distintas  patologías 

inmunes  y  en  la  toxicidad  desencadenada  por  el  TNF  (Akassoglou  et  al,  2003;  Kollias  et  al, 

1999; Peschon et al, 1998b) 

Mutaciones  en  el  TNFR1  que  afectan  a  su  correcto  procesamiento  han  sido 

identificadas  como  la base para el desarrollo de TRAPS  (del  inglés Tumor necrosis Receptor‐

Associated Periodic Syndrome) (McDermott et al, 1999). El TNFR1 es el mediador (mediante la 

activación de NF‐κB y JNK) del crecimiento tumoral en diversas  líneas celulares de mama tras 

el tratamiento con TNF (Rivas et al, 2008). 

I.3.2 EL TNFR2 

El TNFR2 es el segundo de  los  receptores conocidos para el TNF, siendo únicamente 

activado de manera eficaz por el mTNF (Grell et al, 1995).  

Figura  I‐6: Representación esquemática del TNFR2. El TNFR2 está  consituido por 439 aminoácidos,  los 

230 primeros constituyen la región extracelular (en negro) donde destaca la presencia de 4 CRDs (en rojo). La región transmembrana del receptor está constituída por 30 aminoácidos (en amarillo) mientras que la región intracelular está constituida por los restantes 174 aminoácidos (en gris). El TNFR2 incluye en su extremo carboxilo dos sitios de interacción con TRAF2. El primero de ellos comprende las posiciones 402‐405 del receptor (en malva), mientras que el segundo sitio de  interacción  implica a  los últimos 15 residuos del receptor, si bien  la mutación específica de  las posiciones 425‐427  (en azul) es  suficiente para bloquear  la  interacción del  receptor  con TRAF2 a  través de esta región. 

El  TNFR2  está  constituido  por  439  aminoácidos,  donde  los  235  primeros  residuos 

forman su región extracelular, pudiéndose distinguir 4 CDRs implicados en la interacción con el 

Región extracelular Región intracelular

266439

402-SKEE-405

425-KPL-427235

Región transmembrana

CRD1 CRD2 CRD3 CRD4

Introducción 

16 

 

ligando. La región  transmembrana del  receptor está consituída por 30 aminoácidos mientras 

que la región intracelular está formada  por  174 aminoácidos (figura I‐XII). 

Su  interacción  con  el  mTNF  fuerza  su  trimerización  y  su  consecuente  interacción 

directa con TRAF2 así como indirecta con diversas proteínas como TRAF1, cIAP1 y cIAP2 (Rothe 

et al, 1995a; Rothe et al, 1994). TRAF2, por  lo tanto, ejerce un papel clave en  la señalización 

del receptor (Rothe et al, 1995b). La unión de esta proteína con el receptor se produce a través 

de dos regiones distintas del receptor. La primera de ellas está localizada entre las posiciones 

402‐SKEE‐405 del TNFR2 mientras que  la segunda comprende  los últimos 15 aminoácidos de 

su extremo  carboxilo,  si bien  la mutación puntual de  los  residuos 425‐KPL‐427 es  suficiente 

para anular esta interacción (Rodriguez et al, 2011).  

 

Figura I‐7: Análisis de conservación de secuencia del TNFR2. Se muestra el alineamiento de las secuencias aminoacídidas del TNFR2 en distintas especies. Se observa como existen diversas regiones altamente conservadas (residuos sombreados en negro, representando un porcentaje de identidad del 100%) entre las que se encuentran ambas  regiones de unión del  receptor con TRAF2  (módulos 402‐405 y 425‐439). Se muestra además  los  residuos con un porcentaje de identidad mayor del 80% (sombreados en gris oscuro) así como mayor del 60% (sombreados en gris claro). 

El análisis de conservación de secuencia del TNFR2 demostró la existencia de diversas 

regiones  altamente  conservadas  en  el  receptor,  entre  ellas  las  implicadas  en  la  unión  con 

TRAF2. El análisis funcional de estas secuencias evidenció que la región comprendida entre las 

266

285

I II29

1

321

338

379

III

402

425

439

405

Introducción 

17 

 

posiciones 343‐379  (indicada como módulo  III en  la Figura  I‐7)  se encuentra  implicada en  la 

señalización del receptor (Rodriguez, 2006). 

I.3.2.1 SEÑALIZACIÓN DESENCADENADA POR EL TNFR2 

La activación del TNFR2 induce principalmente la activación de genes implicados en la 

proliferación y supervivencia celular. La  unión del TNFR2 con TRAF2 conlleva la activación de 

NF‐κB al  inducir  la acumulación de NIK (del  inglés NF‐κB Inductor Kinase) y  la degradación de 

IκBα (del inglés Inhibitor of NF‐κB α) (Marchetti et al, 2004; Rauert et al, 2010). TRAF2 es capaz 

de  interaccionar y activar al complejo  IKK (del  inglés  IκB Kinase)  induciendo  la fosforilación y 

degradación de IκBα. Por otro lado, la interacción de TRAF2 con el receptor implica también el 

reclutamiento de cIAP1, cIAP2   y  finalmente de TRAF3 al receptor,  lo que resulta en el en el  

procesamiento de p100 (Hauer et al, 2005) (ver apdo. I.4.2.1.1).  

 

 

Figura  I‐8: Señalización desencadenada por el TNFR2. La  interacción del TNFR2 con el mTNF provoca  la trimerización  y  activación del  receptor.  La  señalización que  el  TNFR2  es  capaz de desencadenar depende de  su previa unión a  la proteína adaptadora TRAF2. Ello conlleva  la formación de un complejo de señalización en donde también se encuentran  incluídas  las proteínas TRAF3, cIAP1 y cIAP2. Este complejo desencadena  la activación del factor transcripcional NF‐κB mediante la activación del complejo IKK y de la acumulación de NIK, activando a NF‐ κB tanto por la vía clásica como por la alternativa. Paralelamente, la interacción del receptor con TRAF2 activa a JNK lo que conlleva la activación de AP‐1. Cabe destacar que podría existir una activación de esta quinasa independiente de TRAF2, si bien se desconocen las proteínas implicadas en el proceso así como la región del receptor responsable de ello. Por otro  lado, el TNFR2 es capaz de  inducir  la degradación de TRAF2 regulando sus niveles y por tanto  la propia señalización del receptor. 

mTNF

TNFR2

TRAF2

cIAP1 y cIAP2

TRAF3

IKKγ (NEMO)

IKKβ

IKKα

IKKα IKKα

NIK

Activación complejo IKK

Activación NIK

ACTIVACIÓN NF-κB

JNK

ACTIVACIÓN AP-1

Introducción 

18 

 

Paralelamente,  tras su  interacción con TRAF2, el TNFR2   puede activar  la  ruta de  las 

MAPKs  (del  inglés  Mitogen  Activated  Protein  Kinases)  que  en  último  término  implica  la 

activación del  factor de  transcripción AP‐1  vía  JNK  (ver  apdo.  I.4.2.2). Además, el TNFR2  es 

capaz de inducir la degradación de TRAF2 lo que ejerce un efecto regulador sobre la actividad 

del receptor. Resultados de nuestro  laboratorio    indican que  la región comprendida entre  los 

aminoácidos  343‐378  del  TNFR2  se  encuentra  implicada  en  ambas  actividades  (Rodriguez, 

2006),  si bien  se desconocen  las proteínas  intermediarias  implicadas,  así  como  los  residuos 

concretos del receptor responsables de ello. 

A pesar de no presentar un DD en su región intracelular, la activación del TNFR2 puede 

originar en ciertas condiciones procesos de muerte celular. Ello es debido a su capacidad de 

inducir la degradación de TRAF2, incrementando de esta manera la citotoxicidad mediada por 

el  TNFR1  (Fotin‐Mleczek  et  al,  2002).  Sin  embargo,  en  diversos  tipos  celulares  se  ha 

comprobado  la capacidad del  receptor de  inducir un proceso de muerte celular en donde el 

TNFR1 no se encuentra implicado (Depuydt et al, 2005).  

I.3.2.2 FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA DEL TNFR2 

A diferencia del TNFR1, el TNFR2 presenta una expresión más restringida, limitándose 

a  tipos  celulares  específicos  como  los oligodendrocitos  (Dopp  et  al,  2002),  las  células de  la 

microglía, los astrocitos (Yang et al, 2002), ciertas subpoblaciones de células T (incluyendo a los 

linfocitos  T  CD4+  CD8+)  (Ware  et  al,  1991),  los  miocitos  cardiacos  (Irwin  et  al,  1999),  los 

timocitos  (Grell  et  al,  1998a),  las  células  endoteliales  y  las  células madre  mesenquimales 

humanas (Choi et al, 2005; Faustman & Davis, 2010).  

A  pesar  de  ser  fenotípicamente  normales,  el  estudio  de  los  ratones  KO  del  TNFR2 

sugiere  la  implicación  del  receptor  en  la  regulación  de  la  respuesta  inflamatoria  a  nivel 

pulmonar  (Pasparakis  et  al,  1996)  así  como  en  el  desarrollo  de  lesiones  neurovasculares 

mediadas por el TNF en modelos de malaria experimental (Stoelcker et al, 2002).  

El  TNFR2  resulta  necesario  para  la  diferenciación  inducida  por  antígeno  y  la 

supervivencia de las células T (Kim et al, 2006; Kim & Teh, 2001). También media la regulación 

de diversas moléculas de adhesión como ICAM‐1 y Selectina‐E en células endoteliales, siendo 

por  tanto  necesario  para  la  interacción  entre  los  leucocitos  y  las  células  endoteliales, 

desempeñando  un  papel  fundamental  en  los  procesos  de  inflamación  implicados  en  el 

desarrollo de  la angiogénesis  (Chandrasekharan et al, 2007). Además, el TNFR2 se encuentra 

implicado  en  los  procesos  de  angiostasis  de  una manera  dependiente  de  la  síntesis  de NO 

Introducción 

19 

 

(Zhao  et  al,  2007). Por otro  lado,  el  TNFR2 desencadena  la migración de  células  epiteliares 

intestinales  y de  las  células de  Langerhans  (Corredor et  al, 2003; Takayama et  al, 1999)  así 

como la proliferación de miofibroblastos (Theiss et al, 2005) y la angiogénesis (Pan et al, 2002), 

incrementándose su expresión de manera significativa en células de carcinoma renal, lo que se 

correlaciona con una mayor agresividad del tumor (Al‐Lamki et al, 2010). 

Paralelamente,  el  TNFR2  se  encuentra  implicado  en  diversas  enfermedades 

autoinmunes desempeñando bien un papel protector o estando implicado en el desarrollo de 

las mismas.  

Enfermedad Papel de la activación de TNFR2  Referencia 

Diabetes tipo I 

Destrucción selectiva de células T autorreactivas y 

patógenas. Regeneración pancreática. (Ban et al, 2008) 

Esclerosis múltiple y desórdenes 

en la desmielinización 

Proliferación de precursores de oligodendrocitos para 

reparar la desmielinización. 

(McCoy & Tansey, 

2008) 

Neurodegeneración 

Protección frente la citotoxicidad del glutamato en el 

córtex cerebral. (Marchetti et al, 2004) 

Encefalitis viral Reparación del cerebro estriado.  (Rodriguez et al, 2009) 

Isquemia retinal Neuroprotección.  (Fontaine et al, 2002) 

Fallo cardiaco 

Protección de las células cardiacas frente a la muerte 

tras un infarto.  (Monden et al, 2007) 

Tabla  I‐2:  Efectos protectores del TNFR2 en diversas enfermedades  [adaptado de  (Faustman & Davis, 2010)]. 

En  cuanto  al  papel  del  TNFR2  en  el  desarrollo  de  enfermedades,  se  conoce  su 

implicación  en  la  artritis  reumatoide  familiar  (Dieude  et  al,  2002),  la  enfermedad de Crohn 

(Holtmann et al, 2002), el lupus sistémico eritromatoso (Komata et al, 1999), la colitis ulcerosa 

(Pierik et al, 2004) y el escleroderma (Ishikawa et al, 2002), entre otras.  Cabe destacar, que el 

efecto  perjudicial  del  TNFR2  en  todas  ellas  se  debe  a  polimorfimos  en  el  gen  TNFR2    que 

alteran  su  secuencia  aminoacídica,  principalmente  originando  un  cambio  de  metionina  a 

arginina en  la posición 176 del receptor. Como consecuencia de ello, se produce un aumento 

en los niveles solubles del receptor tanto en suero como en otros fluidos biológicos. De hecho, 

elevados  niveles  del  TNFR2  en  sangre  son  considerados  como  marcadores  predictivos  de 

tumores así como de diversas enfermedades inflamatorias (Goto et al, 2006; Zekri et al, 2008) 

Introducción 

20 

 

Por  tanto,  las  señales  desencadenadas  por  el  TNFR2  pueden  desempeñar  un  papel 

protector  en  diversos  desórdenes  del  organismo,  así  como  desencadenar  alteraciones  que 

suponen la base o se encuentran implicadas en el desarrollo de diversas enfermedades. Todos 

estos  datos  refuerzan  la  necesidad  de  establecer  de  manera  precisa  la  señalización  del 

receptor.  

El hecho de que el TNFR2 únicamente sea activado por  la  forma  transmembrana del 

TNF (que también activa al TNFR1) ha dificultado el estudio y caracterización de la señalización 

desencadenada por el receptor. Es por ello que para su estudio se ha recurrido a estrategias 

como  la  sobreexpresión,  que  fuerza  la  agrupación  del  receptor  en  la  membrana  celular, 

logrando así activarlo. Sin embargo, la situación óptima de estudio del TNFR2 será aquella que 

permita  la caracterización del receptor en unas condiciones en  las que se  logre su activación 

simulándose  al máximo  las  condiciones  in  vivo    y  de  una manera  independiente  al  TNFR1, 

pudiéndose estudiar  tanto  la  señalización del TNFR2  como  la  interconexión existente  con el 

TNFR1. 

I.4  EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS TNFRs 

La  señalización  desencadenada  por  los  TNFRs  depende  tanto  de  su  interacción  con 

diversas proteínas adaptadoras como de la posterior activación de proteín‐quinasas efectoras 

que  pertenecen  principalmente  al  subgrupo  de  serin‐treonin  quinasas.Todo  ello  conlleva  la 

activación  de  distintas  vías  de  señalización  que  suponen  la  consecución  de  procesos  de 

proliferación  celular  así  como  de  procesos  de  muerte  celular  mediante  apoptosis.  

Recientemente, diversos estudios han apuntado también hacia la inducción de un proceso de 

necrosis programada o necroptosis tras la activación de los TNFRs (Degterev et al, 2005). 

I.4.1 MUERTE CELULAR 

I.4.1.1 APOPTOSIS 

El término apoptosis fue acuñado por primera vez en 1972 por Kerr (Kerr et al, 1972) 

para  distinguir  un  proceso  de muerte  celular  con morfología  característica  y  regulada  por 

mecanismos  endógenos.  Actualmente  se  conocen  tanto  los  mecanismos  como  los 

intermediaros  implicados  en  su  activación,  en  donde  las  caspasas  desempeñan  un  papel 

esencial  como  elementos  iniciadores  en  respuesta  a  una  gran  variedad  de  señales  tanto 

Introducción 

21 

 

fisiológicas  como  inducidas  por  elementos  patógenos  o  dañinos  para  la  célula  (Danial  & 

Korsmeyer, 2004; Hotchkiss et al, 2009).  

La apoptosis es un proceso de muerte celular reversible hasta que alcanza un punto de 

no  retorno  con  la activación masiva de  las  caspasas  (Cohen, 1997),  la pérdida del potencial 

mitocondrial  (Green  &  Kroemer,  1998),  la  permeabilización  de  la membrana mitocondrial 

externa  (Green  &  Kroemer,  2004)  y  la  exposición  de  la  fosfatidil  serina  de  la membrana 

plasmática  al  espacio  extracelular.  Se  encuentra  altamente  regulado  para  una  correcta 

homeostasis del organismo y en equilibrio con los procesos de proliferación celular. De  hecho, 

deficiencias en el proceso de apoptosis pueden conllevar la formación de tumores (Thompson, 

1995). 

I.4.1.1.1 LAS CASPASAS 

Las caspasas son una familia de cistein proteasas que hidrolizan enlaces peptídicos tras 

un  residuo  de  ácido  aspártico  (Johnson &  Kornbluth,  2008;  Kumar,  2007).  Son  sintetizadas 

como precursores  inactivos, con prodominios N‐terminal y C‐terminal con actividad proteasa 

que  originan  una  subunidad  pequeña  y  grande  de  12  y  20  KDa,  respectivamente,  que  se 

acoplan  como  un  heterotetrámero  activo  con  dos  copias  de  cada  subunidad  (Wang  et  al, 

2005).   

Existen  dos  tipos  de  caspasas:  las  caspasas  iniciadoras  (caspasas  2,  8,  9  y  10)  y  las 

caspasas efectoras  (caspasas 3, 6 y 7). Las caspasas  iniciadoras 8 y 10 están  implicadas en  la 

denominada vía extrínseca de la apoptosis, mientras que la caspasa 9 actúa en la denomianda 

vía  intrínseca.  Su  activación  conlleva  la proteólisis  y  consecuente  activación de  las  caspasas 

efectoras,  las  cuales  se  encuentran  implicadas  en  el  procesamiento  de  proteínas  celulares 

específicas  responsables de  los cambios morfológicos característicos del proceso apoptótico, 

tales  como  el  redondeamiento  celular,  la  reducción  del  volumen  celular  o  pyknosis,  la 

retracción  de  pseudópodos,  la  condensación  de  la  cromatina  y  la  fragmentación  nuclear  o 

karyorrhexis (Taatjes et al, 2008).  

El tipo de caspasa iniciadora y efectora que se procesa y activa en cada caso depende 

del  tipo  de  estímulo  pro‐apoptótico  que  experimenta  la  célula.  Así,  la  activación  de  los 

receptores  de  muerte  conlleva  en  primer  término  la  activación  de  la  caspasa  8  y 

posteriormente de las caspasas 3, 6 y 7 (Srinivasula et al, 1996), mientras que en el caso de los 

tratamientos con agentes citotóxicos, se activa la caspasa 9 (Andersson et al, 2000). 

Introducción 

22 

 

Si  bien  las  caspasas  han  sido  consideradas  durante  largo  tiempo  como  moléculas 

implicadas en procesos de apoptosis, se ha comprobado también su  implicación en procesos 

de proliferación e inflamación, tales como la regulación del ciclo celular y la activación de NF‐

κB (Hashimoto et al, 2011; Leverrier et al, 2010). 

I.4.1.1.2 VÍAS DE ACTIVACIÓN DE LA APOPTOSIS 

Existen 2 vías principales de activación de apoptosis denominadas vía  intrínseca y vía 

extrínseca. 

La vía intrínseca de la apoptosis, también denominada vía mitocondrial, se inicia a raíz 

de un estrés celular o del efecto de diversos agentes químicos, entre  los que se  incluyen  las 

sustancias  antitumorales.  Se  caracteriza  principalmente  por  la  pérdida  de  potencial  en  la 

membrana mitocondrial,  lo  que  origina  una  remodelación  en  su  estructura  que  conlleva  la 

liberación de diversos factores apoptogénicos entre los que se incuyen activadores de caspasas 

como  el  citocromo  c  y    SMAC  (del  inglés  Second  Mitochondria‐derived  Activator  of 

Caspases)/DIABLO (del inglés Direct IAP‐Binding protein with LOw pI ) (Scorrano et al, 2002)  en 

un proceso regulado por proteínas Bax (del inglés BCL2‐Associated X protein) (Jurgensmeier et 

al, 1998), si bien  la inducción y progresión de la apoptosis se encuentra controlada y regulada 

por otros factores como    las proteínas de  la familia Bcl2 (del  inglés B‐Cell Lymphoma 2) y  las 

proteínas IAPs. 

El  citocomo  c  inicia  la  vía  intrínseca  de  apoptosis mediante  su  interacción  con  la 

proteína citosólica de 140 KDa Apaf1  (del  inglés Apoptosis Protease‐Activating Factor 1). De 

esta  manera  se  constituye  un  complejo  oligomérico  en  el  que  también  se  incluye  a  la 

procaspasa 9  formando una estructura denominada apoptosoma en un proceso dependiente 

de ATP (Li et al, 1997) (ver Figura I‐9).La formación del apoptosoma supone el paso inicial para 

la posterior activación de la caspasa 9 y, consecuentemente, de la caspasa 3, lo que conlleva el 

procesamiento  de  proteínas  celulares  específicas,  promoviendo  de  esta  manera  cambios 

morfológicos  y  una  posterior  destrucción  de  la  célula.  Se  considera  la  constitución  del 

apoptosoma como el punto de no retorno en la activación de la vía intrínseca de la apoptosis 

(Kroemer et al, 2009). 

La vía extrínseca de activación de  la apoptosis se desencadenada tras  la unión   de  la 

proteína adaptadora FADD a receptores transmembrana que presentan un dominio de muerte 

DD  en  su  región  intracelular.  FADD  interacciona  a  su  vez  con  la  procaspasa  8  formando  el 

complejo denominado DISC  (del  inglés Death‐Inducing Signaling Complex)  (Keller et al, 2009; 

Introducción 

23 

 

Scott  et  al,  2009).  Una  vez  que  la  procaspasa  8  es  reclutada  al  complejo  es  activada  por 

autoprocesamiento  proteolítico  (Pop  et  al,  2007),  estando  implicado  en  su  estabilización  la 

proteína Cullin 3 ubiquitin 3  ligasa (Jin et al, 2009). De esta manera,  la caspasa 8 es activada, 

siendo capaz de procesar a las caspasas efectoras  3 y 7 (Chang et al, 2003). 

 Paralelamente, la caspasa 8 induce el procesamiento de Bid a tBid, proteína que, junto 

con Bax, actúa a nivel de la membrana mitocondrial, produciendo la liberación del citocromo c 

y conectando así las vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis. En este punto, la mitocondria 

desempeña un papel importante en la conexión de ambas vías por la liberación de la proteína 

Smac/DIABLO,  capaz  de  inhibir  a  las  proteínas  cIAP,  proteínas  inhibidoras  de  la  apoptosis 

(Maas et al, 2010). 

  

Figura I‐9 : Vías apoptóticas. Existen dos vías de activación de la apoptosis. El estrés celular y los agentes químicos inducen cambios en la mitocrondria que promueven la liberación de proteínas tales como el citocromo c y Smac/DIABLO. El citocromo c es capaz de asociarse con las proteínas citosólicas Apaf‐1 y procaspasa 9 consituyendo una estructura denominada apoptosoma que supone la activación de la caspasa 9, capaz de procesar y activar a la caspasa 3 iniciando la apoptosis (vía intrínseca). Por otro lado, la activación por los TNFs de los TNFRs con DD en su región  intracelular  supone  la  interacción de FADD y  la procaspasa 8 con el  receptor. Esta  interacción  conlleva el procesamiento  y  activación de  la  caspasa  8,  capaz de procesar  y  activar  a  las  caspasas  3  y  7,  iniciándose  así  la apoptosis de manera extrínseca. Aunque se trata de dos vías independientes, existe cierta interconexión funcional entre ellas a  raíz de la activación de la caspasa 8. La caspasa 8 es capaz de actuar sobre Bid originando una forma procesada  (tBid)  que  junto  con  Bax  actúa  a  nivel mitocondrial  induciendo  la  liberación  del  citocromo  c  y  de Smac/DIABLO. Otro nivel de conexión surge a raíz de Smac/DIABLO, proteína capaz de inhibir a las proteínas cIAP, que son a su vez inhibidores las caspasas.  

Mitocondria

Estrés celular

Agentes químicosTNFs

TNFRs

FADD

Procaspasa 8

Caspasa 8

Bid tBid

Bax

Citocromo c

Procaspasa 7

Caspasa 7

Smac/DIABLO

cIAP1 y cIAP2

Apaf-1Procaspasa 9

Apoptosoma

Caspasa 9

Caspasa 3

Procaspasa 3

A. VÍA EXTRÍNSECA B. VÍA INTRÍNSECA

Introducción 

24 

 

I.4.1.2 NECROSIS PROGRAMADA O NECROPTOSIS 

En 1988 Laster y colaboradores observaron que distintas  líneas celulares estimuladas 

con  el mismo  estímulo  (TNF)  podían manifestar  un  fenotipo  típico  de muerte  celular  por 

apoptosis  o  bien  adoptar  una  morfología  donde  no  se  observaba  desintegración  nuclear 

(Laster  et  al,  1988).  Ello  originó  una  investigación  que  supuso  la  introducción  del  término 

necroptosis para referirse a una  forma regulada de muerte celular por necrosis  inducida por 

los TNFRs (Degterev et al, 2005), observándose que numerosas vías de señalización así como 

diversos  procesos  metabólicos  se  encuentran  implicados  en  la  inducción  de  este  tipo  de 

muerte celular.  

A diferencia de  la apoptosis,  las células que experimentan un proceso de muerte por 

necrosis  se  caracterizan  por  presentar  un  citoplasma  traslúcido,  orgánulos  hinchados, 

dilatación  de  la membrana  nuclear,  condensación  de  la  cromatina  en  cúmulos  irregulares, 

aumento  del  volumen  celular  y  rotura  de  la  membrana  plasmática.  Las  células  no  se 

fragmentan  en  corpúsculos  y  el    núcleo  permanece  intacto,  pudiendo  agregarse  entre  sí  y 

acumularse  en  tejidos  necróticos  (Festjens  et  al,  2006).  La  necrosis  puede  desarrollarse  de 

manera controlada  tanto durante el desarrollo embrionario  (como ocurre  con el control del 

crecimiento  longitudinal  de  los  huesos,  controlado  por  los  condrocitos)  como  durante  la 

homeostasis de los tejidos adultos (por ejemplo, en las células epiteliales intestinales).  

La necroptosis puede producirse tras  la  interacción de diversos  ligandos de  la  familia 

del  TNF  con  sus  respectivos  receptores;  tal  es  el  caso  de  CD95  (Vercammen  et  al,  1998b), 

TNFR1 y TNFR2 (Chan et al, 2003; Vercammen et al, 1998a), siendo necesario para ello que las 

caspasas se encuentren inhibidas (Festjens et al, 2006).  En estas condiciones, se constituye un 

complejo  de  señalización  formado  por  FADD  junto  con  las  quinasas  RIP1  y  RIP3  que 

desempeñan un papel fundamental en la capacidad de los TNFRs de desencadenar un proceso 

necropoptótico.  Este  complejo  de  señalización,  denominado  necroptosoma,  estimula  la 

glucogenolisis y la glutaminolisis celular (Bouche et al, 2004; Van Herreweghe et al, 2002) a la 

vez que activa a las calpaínas y a la fosfolipasa A2 citosólica. Su activación conlleva la liberación 

de  hidrolasas  citotóxicas  al  citosol  desde  los  lisosomas  así  como  la  generación  de  especies 

reactivas  de  oxígeno  (ROS)  por  la  cadena  respiratoria  mitocondrial,  lo  que  resulta  en  la 

permeabilización de  las membranas mitocondriales y  la  traslocación de proteínas citotóxicas 

hacia el citosol (Kim et al, 2007; Yamashima & Oikawa, 2009). 

Introducción 

25 

 

 

Figura I‐10: La necroptosis o necrosis programada. En condiciones en las que las caspasas se encuentran inhibidas, la activación de los TNFRs favorece la formación de un complejo denominado necroptosoma constituido principalmente por FADD, RIP1 y RIP3. El necroptosoma es capaz de desencadenar diversas vías de señalización que conllevan  la estimulación de  rutas metabólicas,  la activación de  las calpaínas y de  la  fosfolipasa A2 citosólica, así como la producción de ROS. Todo ello conlleva la permeabilización de la membrana mitocondrial y la consecuente liberación de proteínas citotóxicas que desencadenan un proceso de muerte celular con características necróticas. 

I.4.2 PROLIFERACIÓN CELULAR 

I.4.2.1 EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL NF‐κB 

El  factor de  transcripción NF‐κB  fue  inicialmente  identificado como un  factor nuclear 

capaz  de  interaccionar  con  un  elemento  intensificador  del  gen  de  la  cadena  κ  de  las 

inmunoglobulinas,  consierándose  exclusivo  de  las  células  B  (Sen  &  Baltimore,  1986). 

Posteriormente  se demostró  su expresión ubicua  (Li & Verma, 2002), estando  implicado en 

enfermedades como  la artritis reumatoide,  la diabetes y el cáncer,  todas ellas asociadas con 

una desregulación en la función de NF‐κB (Courtois & Gilmore, 2006; Karin, 2006). 

NF‐κB es un factor dimérico que puede estar constituido por 5 miembros distintos: NF‐

κB1  (p50  y  su  precursor  p105), NF‐κB2  (p52  y  su  precursor  p100),  RelA  (p65),  cRel  y  RelB. 

Todos  ellos  se  caracterizan  por  presentar  el  denominado  “dominio  homólogo  a  Rel”  en  su 

región N‐terminal, que media su localización nuclear y su  interacción con el DNA, así como su 

dimerización  (Bonizzi &  Karin,  2004).  Además,  tanto  RelA  como  c‐Rel  y  RelB  presentan  un 

dominio activador necesario para  su  capacidad  reguladora de  la  transcripción génica. p50  y 

TNFs

TNFRs

FADD

RIP1RIP3

En condiciones deinhibición de caspasas

Necrosoma

Estimulación rutas metabólicas Activación fosfolipasa A2 citosólica Generación ROSActivación calpaínas

Permeabilización membrana mitocondrial

Liberación proteínas citotóxicas

Introducción 

26 

 

p52 (formas procesadas de p105 y p100 respectivamente) carecen de él, pudiendo, por tanto, 

reprimir la transcripción génica cuando no se encuentran asociados a ellos (Hayden & Ghosh, 

2008). Mientras  que  RelB  generalmente  forma  heterodímeros  con  p100  (Dobrzanski  et  al, 

1995),  así  como  con  su  forma  procesada  p52  (Senftleben  et  al,  2001),  RelA  y  c‐Rel 

preferentemente interaccionan con p50 (Karin & Ben‐Neriah, 2000).  

En  ausencia  de  estimulación,  los  dímeros  de  NF‐κB  se  encuentran  retenidos  en  el 

citoplasma  por  proteínas  inhibidoras  de  NF‐κB  (IκBs)  (Hayden  &  Ghosh,  2008),  quedando 

enmascarada su señal de localización nuclear. Las proteínas IκBs se caracterizan por presentar 

múltiples  dominios  tipo  ankirina  que  median  su  interacción  con  los  dímeros  de  NF‐κB, 

interfiriendo de esta manera en  su  traslocación nuclear. Los extremos C‐terminal de p105 y 

p100 (precursores de p50 y p52 respectivamente) también presentan este tipo de dominios, lo 

que  les  permite  actuar  de manera  similar  a  las  IκBs,  reteniendo  al  dímero  de NF‐κB  en  el 

citoplasma (Liou et al, 1992). 

I.4.2.1.1 ACTIVACIÓN DE NF‐κB 

Numerosos estímulos pueden activar a NF‐κB  (Bonizzi & Karin, 2004),  induciendo  su 

translocación  nuclear.  Existen  dos  vías  de  activación  de  NF‐κB  que  se  distinguen  por  la 

naturaleza del estímulo  iniciador,  las proteínas  intermediarias y por  las proteínas que forman  

los dímeros. Se trata de las vía clásica y alternativa. 

La vía clásica de activación de NF‐κB es la ruta principal y más estudiada de activación 

de NF‐κB, implicando principalmente a heterodímeros consituidos por RelA:p50 y c‐Rel:p50. Se 

centra  en  la  activación  de  la  quinasa  trimérica  IκB  (IKK),  complejo  compuesto  por  las 

subunidades catalíticas  IKKα e  IKKβ y de  la subunidad reguladora  IKKγ  (también denominada 

NEMO, del inglés NF‐κB Essential MOdulator) (Karin & Ben‐Neriah, 2000).  

En  ausencia  de  estimulación,  los  dímeros  NF‐κB  se  encuentran  retenidos  en  el 

citoplasma debido a su interacción con la proteína inhibidora IκBα que enmascara la secuencia 

de localización nuclear de RelA/c‐Rel y que presenta  una señal de exportación nuclear (Huang 

et al, 2000). 

La activación de la vía clásica de NF‐κB por los TNFRs depende de su previa interacción 

con  las  proteínas  adaptadoras  RIP1  ó  TRAF2/6  las  cuales,  tras  la  trimerización  de  los 

receptores, activan al complejo IKK (Ea et al, 2006; Wu et al, 2006). IKK fosforila   IκBα en sus 

residuos  de  serina  32  y  36  lo  que  conlleva  su  posterior  ubiquitinación  y  consecuente 

degradación por el proteasoma 26S. De esta manera, queda expuesta  la señal de  localización 

nuclear de RelA lo que induce la traslocación nuclear de los dímeros RelA:p50.  

Introducción 

27 

 

La vía alternativa de activación de NF‐κB fue descrita por primera vez en el año 2001 

(Senftleben et al, 2001), siendo activada en  respuesta a un grupo muy concreto de  ligandos 

entre los que se encuentran CD40L (ligando de CD40), BAFF (del inglés B‐cell activating factor), 

RANKL  (del  inglés  receptor  activator  of NF‐κB  ligand),  TWEAK  (del  inglés  TNF‐related weak 

inducer of apoptosis) y TNF (Claudio et al, 2002; Coope et al, 2002; Novack et al, 2003; Rauert 

et al, 2010; Saitoh et al, 2003).  

  

Figura I‐11: Activación del factor transcripcional NF‐κB. Tras la interacción de los TNFs con sus respectivos ligandos, NF‐κB puede ser activado por dos vías distintas. En la primera de ellas (denominada vía clásica) tiene lugar, de manera dependiente de TRAF2,  la activación del  complejo de quinasas  IKK,  las  cuales  fosforilan a  la proteína inhibidora  IκBα  induciendo su degradación y  favoreciendo  la  traslocación al núcleo de  los dímeros p50/RelA. Por otro  lado,  en  la  vía  alternativa  se  encuentra  implicada  la  quinasa NIK,  la  cual,  en  ausencia  de  estimulación  es rápidamente degradada de manera dependiente de  su  interacción  con un  complejo  formado por TRAF3, TRAF2, cIAP1 y cIAP2.  Tras la llegada de un estímulo, TRAF3 es degradado lo que propicia la acumulación citosólica de NIK y la  consecuente  activación  de  la  quinasa  IKKα,  la  cual  es  capaz  de  inducir  el  procesamiento  parcial  de  p100 favoreciendo así  la  traslocación  al núcleo de  los dímeros p50/RelB. Por otro  lado, NIK puede activar  también al complejo  IKK  lo  que  supone  una  interconexión  entre  ambas  vías  de  activación.  Paralelamente,  RIP1  también conecta ambas vías al ser capaz de activar al complejo  IKK activando  la vía clásica pero a  la vez  inhibiendo  la vía alternativa al ser capaz de alterar  los niveles  intracelulares de TRAF2. Una vez en el núcleo,  los dímeros de NF‐κB interaccionan con elementos κB presentes en los promotores de númerosos genes, favoreciendo así la expresión de genes inmunoreguladores, inflamatorios, antiapoptóticos y genes proliferativos así como de reguladores negativos de NF‐κB.  

En la activación de esta ruta, la quinasa NIK fosforila y activa a IKKα (Xiao et al, 2001). 

La  fosforilación  de  p100  por  IKKα  origina  su  poliubiquitinación  y  posterior  degradación 

(Senftleben et al, 2001). Sin embargo, debido a la presencia de una señal específica de parada 

A. VÍA CLÁSICA B. VÍA ALTERNATIVA

RelAp50

IκBα

RelAp50

IκBα

IKKγ (NEMO)

IKKβ

IKKα

IKKα IKKα

NIK

RelB

P100

RelB

P52

TRANSLOCACIÓN AL NÚCLEO

Interacción con elementos κB

Genes inmunoreguladores e inflamatorios

Genes antiapoptóticos Genes proliferativos Genes reguladores negativos de NF-κB

cIAP1 y cIAP2

TRAF2

TRAF3

NIK

Ub K-48NIK

Degradación

TRAF3

.RelAp50

IκBα

P

Ub K-48

Degradación

TNFs

TNFRs

RIP1

Introducción 

28 

 

de  la  degradación,  la  molécula  poliubiquitinada  de  p100  experimenta  únicamente  una 

degradación  parcial.  Todo  ello  resulta  en  la  liberación  de  p52  unido  a  RelB,  quedando  así 

expuesta su señal de localización nuclear y produciéndose su translocación al núcleo (Amir et 

al, 2004). 

NIK  es  una  proteína  inestable  que  en  ausencia  de  estimulación  es  rápidamente 

degradada  (Liao G, 2004). En estas condiciones,  la proteína TRAF3 actúa como anclaje entre 

NIK y el complejo formado por las proteínas cIAP1/cIAP2/TRAF2, estando implicados en dicha 

interacción los dominios TRAF de TRAF3 y de TRAF2 (Vallabhapurapu et al, 2008). La activación 

de  ciertos  TNFRs  conlleva  su  interacción  con  TRAF3  y  su  posterior  degradación  de manera 

dependiente de cIAP1, cIAP2  y TRAF2 (Vallabhapurapu et al, 2008). En este contexto NIK no es 

procesado y se acumula en el citoplasma, siendo capaz de activar a IKKα, iniciándose así la vía 

alternativa de activación de NF‐κB. 

Tras  largos  periodos  de  estimulación,  NIK  es  capaz  de  activar  al  complejo  IKK, 

promoviendo  por  tanto,  la  activación  de  la  vía  clásica  y  estableciendo  una  conexión  entre 

ambas vías de activación de NF‐κB (Zarnegar et al, 2008). Por otro lado, la proteína RIP1 actúa 

también como  interconector entre  las vías clásica y alternativa. Ello es debido a que RIP1 es 

ubiquitinado por cIAP1 y cIAP2  (Lin et al, 2010), favoreciendo así su  interacción con NEMO y 

posicionándose como un robusto activador del complejo IKK en la vía clásica de activación de 

NF‐κB (Ea et al, 2006). Por el contrario, RIP1 actúa también como inhibidor de la vía alternativa 

de NF‐κB al inhibir parcialmente a TRAF2 (Kim et al, 2010).  

I.4.2.1.2 IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE NF‐κB 

NF‐κB es un  factor de  transcripción de expresión ubicua que puede ser activado por  

múltiples  tipos de estímulos que causan estrés celular e  inflamación. Como consecuencia de 

ello,  activa  la  transcripción  de  más  de  200  genes  entre  los  que  se  incluyen  citoquinas 

inflamatorias (TNF,  IL‐1,  IL‐6), quimioquinas (IL‐8), factores angiogénicos (metaloproteasas de 

matriz, ciclooxigenasa 2), moléculas de adhesión (ICAM‐I) y proteínas anti‐apoptóticas (cIAP1 y 

2) (Aggarwal & Gehlot, 2009).  

Las proteínas anti‐apoptóticas inducidas por NF‐κB son las principales responsables de 

la  habilidad  de  las  células  neoplásicas  para  resistir  los mecanismos  de  resistencia  tumoral 

basados  en  la  apoptosis,  mientras  que  las  quimioquinas  y  los  factores  promueven  el 

reclutamiento de células inflamatorias así como la angiogénesis,  lo que propicia la formación y 

progresión tumoral así como los procesos de metástasis (Karin, 2006). Por lo tanto, gran parte 

de  los  genes  inducidos  por  NF‐κB  se  encuentran  implicados  en  la  transformación, 

Introducción 

29 

 

supervivencia,  proliferación  y  metástasis  tumoral  así  como  en  la  quimiorresistencia  de  la 

mayor parte de las células tumorales.  

La  activación  constitutiva  de  NF‐κB  resulta  clave  para  el  desarrollo  de  diversos 

tumores, como el  linfoma de células B grandes, el mieloma múltiple,  la  leucemia mielogénica 

crónica y el cáncer de mama. Además, NF‐κB puede antagonizar  los efectos citotóxicos de las 

drogas  quimioterapeúticas,  promoviendo  así  la  resistencia  tumoral.  De  hecho,  agentes 

inhibidores de NF‐κB, como  los  inhibidores del proteasoma, se emplean de manera rutinaria 

en el tratamiento del mieloma múltiple y parecen tener un efecto beneficioso en el caso del 

tratamiento de los linfomas y del cáncer de próstata y de pulmón (Orlowski & Baldwin, 2002). 

I.4.2.2 EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL AP‐1 

I.4.2.2.1 ACTIVACIÓN DE LAS MAPKs 

Las  MAPKs  son  enzimas  conservados  evolutivamente  que  conectan  receptores 

localizados  en  la  superficie  celular  con  dianas  reguladoras  críticas  a  nivel  celular, 

desempeñando un papel principal en  la  regulación de múltiples procesos celulares entre  los 

que se incluye la proliferación, la diferenciación celular y la apoptosis.  

En mamíferos, las MAPKs pueden clasificarse en tres subfamilias distintas: las quinasas 

del extremo N‐terminal de Jun (JNK), las quinasas p38 y las quinasas dependientes de señales 

extracelulares  (ERKs)  (Davis,  2000;  Johnson  &  Lapadat,  2002). Mientras  que  las    ERKs  son 

principalmente  activadas  por  factores  de  crecimiento  (Hill  et  al,  1994),  las  citoquinas 

proinflamatorias y las situaciones de estrés celular activan a p38 y a JNK (Chang & Karin, 2001).  

En  situaciones  de  estrés  o  en  respuesta  a  factores  de  crecimiento  y  citoquinas  las 

MAPKs  experimentan  un  proceso  de  fosforilación  tanto  en  residuos  de  treonina  como  de 

tirosina de su dominio catalítico por quinasas específicas denominadas MKK (del inglés MAPK  

Kinase). Estas MKK son a su vez activadas por las denominadas MKKK (del inglés MAPK Kinase 

Kinase)  (Chang & Karin, 2001). Una vez activadas,  las MAPKs  fosforilan diversos sustratos de 

manera específica en  residuos de serina y  treonina. Entre sus dianas se encuentran diversas 

quinasas  así  como  múltiples  factores  de  transcripción,  lo  que  conlleva  la  activación  de 

numerosas vías de señalización.  

I.4.2.2.2 JNK Y AP‐1 

Las proteínas JNK (JNK1, JNK2 y JNK3) son activadas por MKK4 y MKK7 en respuesta a 

diversos  estímulos.  Dependiendo  del  tipo  celular  y  del  estímulo,  son  varias  las  MKKKs 

Introducción 

30 

 

implicadas en la fosforilación y consecuente activación de MKK4 y MKK7 (Davis, 1995), siendo 

ASK1 (del inglés Apoptosis Signal‐regulating Kinase 1) y TAK1 (del inglés Transforming growth 

factor  β–Activated  Kinase  1)  las  MKKKs  implicadas  en  la  activación  de  JNK  por  el  TNF 

(Matsuzawa  et  al,  2002;  Tobiume  et  al,  2001). Una  vez  activada,  JNK  se  trasloca  al  núcleo 

donde fosforila a c‐Jun (miembro de  la familia de proteínas Jun y elemento del dímero AP‐1) 

en su extremo N‐terminal en sus residuos de serina 63 y 73. Esta fosforilación de c‐Jun conlleva 

la activación del dímero AP‐1 y su consecuente  interacción con elementos AP‐1 presentes en 

los promotores de numerosos genes, regulando así su expresión (Wagner, 2001). 

AP‐1  es  un  factor  de  transcripción  dimérico  constituido  por  proteínas  de  diversas 

familias cuyo denominador común es  la presencia   de un dominio de cremallera de  leucina, 

necesario para su  interacción con el DNA. Dentro de estas  familias se  incluye a  las proteínas 

Jun (c‐Jun, JunB y JunD), Fos (c‐Fos, FosB, Fra1 y Fra2), ATF (ATD2, B‐ATF, JDP‐1 y JDP‐2) y Maf 

(cMaf, MafB, MafA, Maf  G‐F‐K),  siendo  las  proteínas  Jun  y  Fos  las mayoritarias  y  cJun  el 

activador  de  transcripción  más  potente  (Ryseck  &  Bravo,  1991),  estando  su  actividad  

transcripcional atenuada, y en ocasiones antagonizada, por  JunB  (Schutte et al, 1989). Cada 

una de estas proteínas se expresa y regula de manera diferente, lo que implica que cada tipo 

celular presenta un amplio rango de posibles dímeros AP‐1 con distintas  funciones  (Wagner, 

2001).  

Las distintas proteínas JNK difieren en su afinidad por c‐Jun, una de cuyas principales 

funciones  es  la  regulación  del  ciclo  celular,  ya  que  puede  inducir  la  transcripción  tanto  de 

reguladores positivos (como la ciclina D1) como negativos (como p53) del mismo (Bakiri et al, 

2000; Schreiber et al, 1999). Por ello, en función de la naturaleza del estímulo recibido y de la  

intensidad  y  duración  de  la  activación  de  JNK,  la  respuesta  celular  puede  ser muy  variada, 

yendo desde  la  inducción de  la  apoptosis hasta el  aumento de  la  supervivencia  celular  y  la 

alteración de  la proliferación (Bakiri et al, 2000; Sabapathy et al, 2004; Sabapathy & Wagner, 

2004; Tournier et al, 2000).  

I.4.2.2.3 ACTIVACION DE JNK POR TNFRs 

Puesto  que  los  TNFRs  carecen  de  actividad  enzimática  propia,  la  activación  de  las 

MAPKs depende de  la  interacción con dichos   receptores de diversas proteínas adaptadoras, 

siendo  las  proteínas  TRAF  y  las  MKKKs  los  componentes  esenciales  implicados.  TRAF2 

interacciona con los TNFRs formando un complejo en el que se encuentran incluídos, además 

de TRAF3,  cIAP1  y  cIAP2, MEKK1, MKK4, Ubc13 e  IKKγ.  La  traslocación  al  citoplasma de  los 

complejos TRAF2‐MEKK1 depende de  la actividad de cIAP1 y cIAP2, siendo TRAF3 degradado 

Introducción 

31 

 

(Matsuzawa  et  al,  2008),  De  esta  manera,  MEKK1  experimenta  una  autofosforilación  y 

consecuente  activación  que  conlleva  la  fosforilación  y  activación  de  JNK  (Matsuzawa  et  al, 

2008). 

El estudio de la activación de JNK tras el tratamiento con TNF permitió identificar dos 

fases  de  activación  de  la quinasa.  En  una  fase  inicial  (a  los  30 minutos  del  tratamiento)  se 

registra un aumento  transitorio de  la actividad de  JNK,  seguido de una  fase más estable de 

activación  que  dura  horas.  Ambas  fases  contribuyen  a  la  activación  de  la  expresión  génica 

inducida por  el  TNF de manera que  la  fase  temprana  se  corresponde  con una  situación de 

supervivencia celular, mientras que la fase más tardía (entre una y seis horas) se relaciona con 

una situación de muerte celular (Ventura et al, 2006). 

  

Figura I‐12: Curso temporal de la activación de JNK por los TNFRs. Inicialmente, tras la interacción TNF‐TNFR, TRAF2 es reclutado al receptor, lo que desencadena la formación de un complejo de señalización en el que se encuentran  IKKγ,  cIAP1,  cIAP2,  TRAF3  y  MEKK.  La  actividad  E3  ligasa  de  cIAP1  y  cIAP2  conlleva  tanto  la ubiquitinación de TRAF2 como de TRAF3, lo que origina la liberación al citosol del complejo TRAF2‐MEKK, en donde MEKK es activada, activando a JNK. Una vez activada, JNK se trasloca al núcleo donde actúa sobre la proteína c‐Jun del dímero AP‐1, promoviendo su interacción con elementos AP‐1 presentes en los promotores de múltiples genes, promoviendo la proliferación y supervivencia celular. Por el contrario, la producción de ROS desencadenada tras el tratamiento con TNF conlleva  la activación prolongada de  JNK de una manera  independiente de TRAF2. En estas condiciones, JNK inhibe a cFLIP, activandose la caspasa 8 y promoviendo la apoptosis. 

La activación temporal de JNK depende de la interacción de TRAF2 con el receptor y la 

consecuente  interacción  de  las MKKS.  Por  el  contrario,  la  activación  prolongada  de  JNK  es 

independiente de dicha proteína adaptadora, produciéndose la degradación de cFLIP, inhibidor 

ApoptosisAP-1

cJunP

AP-1

cJun

Interacción con elementos AP-1

ROS

cFLIP

Caspasa8

Bid

tBID

TNFs

TNFRs

TNFs

TNFRsTRAF2TNFs

TNFRscIAP1 y cIAP2

TRAF2

TRAF3

IKKγ

MEKK

TRAF2MEKK

P

JNK

TNFs

TNFRs

JNK

Proliferación Supervivencia

A. FASE TEMPRANA B. FASE TARDÍA

Introducción 

32 

 

de la caspasa 8 (Chang et al, 2006). De esta manera, la activación prolongada de JNK induce el 

procesamiento de Bid, originándose  la  forma  activa  tBid.  tBid  activa  a Bax  lo que  induce  la 

liberación de citocromo c y Smac/DIABLO desde la mitocondria (Madesh et al, 2002). 

I.4.2.2.4 IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE AP‐1 

Las  proteínas  Fos  y  Jun  fueron  inicialmente  identificadas  como  las  oncoproteínas 

virales  v‐Fos  y  v‐Jun  en  el  virus  de  osteosarcoma  Finkel‐Biskis‐Jinkis  y  en  el  virus  aviar  de 

sarcoma  17  respectivamente  (Curran  et  al,  1982;  Maki  et  al,  1987;  Vogt,  2002).  La  

identificación de  sus equivalentes celulares  llevó a  la correlación entre  la  sobreexpresión de 

proteínas AP‐1 y un efecto positivo en la transformación celular (Angel & Karin, 1991).  

Diversos miembros de AP‐1  (c‐Fos, FosB y  cJun) pueden  transformar eficientemente 

células en cultivo al presentar potentes dominios activadores de la transcripción (Jochum et al, 

2001). Por el contrario, el resto de miembros de AP‐1, carentes de dichos dominios, tienen una 

nula (junB y junD) o baja (Fra1 y Fra2) capacidad transformante (Bergers et al, 1995; Vandel et 

al, 1995). Mientras que c‐Jun ejerce un papel oncogénico a nivel celular,  JunB y D  funcionan 

como genes supresores de tumores (Chiu et al, 1989; Passegue et al, 2001; Pfarr et al, 1994) de 

ahí  que  la  activación  de  AP‐1  pueda  desempeñar  un  papel  tanto  oncogénico  como  anti‐

oncogénico.  

I.5 REGULACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN DE LOS TNFRs 

El  TNF  es  capaz  de  actuar  a  nivel  celular  desencadenando  dos  respuestas  bien 

distintas. Por un lado es capaz de desencadenar procesos de proliferación celular mediante la 

activación de NF‐κB y de  JNK, mientras que por otro puede causar  la muerte celular por un 

proceso de apoptosis o necroptosis. Esto implica la existencia de mecanismos muy precisos de 

regulación que relacionen  las diversas vías de señalización y conlleven  la consecución de una 

respuesta celular concreta. El hecho de que la acción de estas citoquinas desencadene un tipo 

de respuesta celular u otra depende tanto del tipo celular como de la duración del estímulo, si 

bien  ciertas  condiciones  celulares  favorecen  la  proliferación  celular  o  la  consecución  de  un 

proceso  de muerte  celular.    En  este  aspecto,  destacan  los  procesos  de  fosforilación  y  de 

ubiquitinación. Paralelamente,  las propias vías de señalización desencadenadas por  los TNFRs 

regulan  la actividad de éstos,  si bien el procesamiento de  los  receptores originando  formas 

Introducción 

33 

 

solubles de los mismos actúa como un mecanismo alternativo de regulación de la señalización 

de los TNFRs. 

I.5.1 LA UBIQUITINACIÓN 

La ubiquitinación es un  fenómeno  inducible y  reversible  implicado en prácticamente 

todos  los  procesos  celulares  (Pickart &  Eddins,  2004).    Se  trata  de  una  reacción  secuencial 

catalizada por un enzima activador de ubiquitina (E1), un enzima conjugador de ubiquitina (E2 

o Ubc) y una ligasa de ubiquitina (E3). El mecanismo que conlleva la activación de la molécula 

de ubiquitina y su posterior  ligación a  la molécula sustrato (Hershko & Ciechanover, 1998) se 

encuentra representado en la Figura I‐13. 

 

 

Figura I‐13: El proceso de ubiquitinación. Las proteínas son marcadas con moléculas de ubiquitina en una reacción secuencial dependiente de ATP en la que se ven implicados 3 tipos de enzimas distintos. En el primer paso se produce  la unión de  la ubiquitina al centro activo del enzima E1,  lo que conlleva  la formación de una unión de tipo tiol‐éster entre la glicina C‐terminal de la ubiquitina y la cisteína del centro activo del enzima. Posteriormente,  la ubiquitina  activada  es  transferida  a un  residuo de  cisteína  del  sitio  activo  del  enzima  E2 mediante un nuevo enlace tiol‐éster. Finalmente el enzima E3 une de manera covalente la molécula de ubiquitina a un residuo de lisina de la proteína sustrato quedando ésta monoubiquitinada (modificación activadora de la proteína). La proteína diana puede  experimentar  ciclos  sucesivos  de  ubiquitinación  quedando  así  poliubiquitinada  tanto  de  manera  lineal (modificación  activadora)  como  ramificada  (mediante  la  interacción  de  las  ubiquitinas  entre  sí  a  través  de  sus residuos de lisina 48 o 63, tratándose de modificaciones proteolíticas o activadoras respectivamente). 

En  la  señalización  desencadenada  por  los  TNFRs  los  procesos  de  ubiquitinación 

desempeñan un papel esencial en cuanto a su regulación se refiere, tanto mediante procesos 

de degradación (ubiquitinación tipo K‐48) como de activación (ubiquitinación tipo K‐63). Cabe 

destacar que  las  E3  ligasas que  actúan  en  esta  regulación  se  caracterizan por presentar un 

Introducción 

34 

 

dominio RING  responsable de su actividad E3‐ligasa en combinación con diversos elementos 

E2.  Las E3  ligasas más estudiadas, en  el  contexto de  la  señalización desencadenada por  los 

TNFRs,  son las proteínas cIAP1 y cIAP2. 

I.5.1.1.1 LAS PROTEINAS IAP 

Las proteínas IAP son metaloproteasas inicialmente identificadas en baculovirus por su 

capacidad de inhibir la muerte de células infectadas,  al ser capaces de impedir la activación de 

las  caspasas  (Duckett  et  al,  1996); Miller,  1999)  debido  a  la  presencia  de  3  dominios  BIR 

característicos (del  inglés Baculovirus IAP Repeat) que median su unión directa a  las caspasas 

(Deveraux et al, 1997). Las proteínas cIAP1 y cIAP2 presentan un dominio RING, siendo capaces 

de  actuar  como  E3‐ligasas  y  encontrándose  implicadas  en  la  activación  del  factor  de 

transcripción  NF‐κB,  al  mediar  la  ubiquitinación  de  diversas  proteínas  intermediarias 

(Vallabhapurapu  et  al,  2008),  y  en  la  regulación  de  la  apoptosis,  al  estar  implicadas  en  la 

degradación de las caspasas (Riedl & Shi, 2004) (ver apdos. I.4.1.1 y I.4.2.1).  

El papel de cIAP1 y cIAP2 en la regulación de la señalización de los TNFRs se encuentra 

estrechamente  relacionado  con  las  proteínas  TRAF,  principalmente  con  TRAF2  (con  la  que 

interaccionar de manera directa) y con TRAF3 (por medio de su interacción con TRAF2). 

Como  ya  se  ha  mencionado  anteriormente,  en  ausencia  de  estimulación  TRAF3 

interacciona con NIK inhibiéndolo. En este contexto, cIAP1 y 2 son las E3 ligasas responsables 

de  la  ubiquitinación  de  tipo  K48  de  NIK  de  una manera  dependiente  de  TRAF2.  De  esta 

manera, el complejo formado por cIAP1, cIAP2, TRAF2 y TRAF3 es el encargado de degradar a 

NIK, manteniendo sus niveles constitutivos bajos e inhibiendo la activación de la vía alternativa 

(Varfolomeev et al, 2007; Vince et al, 2007). En este  sentido,  la proteína adaptadora TRAF3 

parece desempeñar un papel clave en la regulación de los TNFRs al promover la ubiquitinación 

y degradación de NIK (Liao G, 2004), actuando como supresor tanto de la vía clásica como de la 

alternativa.  

Debido a la presencia de un dominio RING en su estructura, las proteínas TRAF podrían 

también actuar como E3‐ligasas, si bien esta capacidad únicamente ha podido ser demostrada 

para TRAF2 y para TRAF6 (Deng et al, 2000; Shi & Kehrl, 2003). TRAF2 es capaz de interaccionar 

con cIAP1 y cIAP2 lo que conlleva su degradación por el proteasoma (Wu et al, 2005). Por otro 

lado,  se ha descrito que A20  es  capaz de  inducir  también  la degradación de  TRAF2 de una 

manera dependiente de los lisosomas bajo unas condiciones de muerte celular inducida por el 

TNF. De esta manera, TRAF2 sería degradado  tanto de manera dependiente del proteasoma 

Introducción 

35 

 

como de  los  lisosomas (Li et al, 2009) siendo necesaria su  interacción con cIAP1 y cIAP2 para 

poder llevar a cabo procesos de ubiquitinación. 

Cabe destacar que TRAF2  también puede autoubiquitinarse, gracias a  la actividad E3 

ligasa asociada a su dominio RING, con cadenas de ubiquitina tipo K‐48 lo que confiere a TRAF2 

un  papel  único  siendo  capaz  de  ubiquitinarse  a  sí  mismo  y  estando  implicado  en  la 

ubiquitinación  de  distintos  sustratos,  tanto  activándolos  (ubiquitinación  tipo  K‐63)  como 

marcándolos para su degradación por el proteasoma (ubiquitinación tipo K‐48). 

Por  tanto,  los niveles de TRAF2 determinan en gran parte  la  respuesta celular de  los 

TNFRs, ya que en presencia de TRAF2 se desencadena tanto  la activación de NF‐κB como de 

JNK  así  como  la  inhibición  de  las  caspasas,  debido  a  su  interacción  con  cIAP1  y  cIAP2, 

induciendo  todo  ello  la  proliferación  y  supervivencia  celular.  Por  el  contrario,  cuando  los 

niveles  intracelulares de TRAF2 son bajos se  inhibe  tanto NF‐κB como  JNK promoviéndose  la 

apoptosis por medio de la activación de las caspasas. 

Por otro  lado,  la capacidad del TNFR2   de  inducir  la degradación de TRAF2 se refleja 

tanto en su capacidad de activar a NF‐κB como de  inducir procesos de muerte celular. Así, el 

TNFR2 es capaz de  inducir  la degradación de TRAF2,  lo que  inhibe su capacidad de activación 

de NF‐κB influyendo además en la señalización del TNFR1 aumentando su capacidad citotóxica 

(Rodriguez, 2006). 

I.5.1.1.2 ENZIMAS DESUBIQUITINANTES 

De la misma manera que se conocen las vías de activación de NF‐κB, se ha descrito la 

capacidad  de  ciertas  proteínas  de  regularlo  negativamente,  controlando  así  sus  niveles  de 

activación. Entre ellas  se  incluye a A20 y a CYLD,   que  inhiben  la activación de  las  IKKs y de 

NEMO respectivamente mediante su actividad deubiquitinasa (Kovalenko et al, 2003; Wertz et 

al, 2004). 

La  acción  de  A20  y  CYLD  sobre  la  vía  de  NF‐κB  inhibe  su  activación  y 

consecuentemente la transcripción de los genes controlados por dicho factor de transcripción, 

implicados principalmente en la proliferación y supervivencia celular (Sacco et al, 2010). CYLD 

actúa como un mecanismo inhibidor constitutivo de NF‐κB en ausencia de estimulación, siendo 

también capaz de inhibir la activación de JNK (Reiley et al, 2004). Por otro lado, A20 se induce y 

activa como consecuencia de un mecanismo de regulación negativa de  la actividad de NF‐κB 

(Sun, 2008; Sun, 2010). La inhibición de ambas proteínas se correlaciona con un aumento de la 

Introducción 

36 

 

proliferación y  supervivencia celular por  la activación constitutiva de NF‐κB, promoviendo  la 

formación de tumores  (Alameda et al, 2010; Kato et al, 2009). 

I.5.2 INTERCONEXIÓN ENTRE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE LOS TNFRs 

Si  bien  la  activación  de  NF‐κB  conlleva  la  transcripción  de  genes  proliferativos  e 

inflamatorios, los efectos del TNF en supervivencia se encuentran también relacionados con la 

activación  temporal de  JNK, que  induce  la expresión de genes  implicados en  la proliferación 

celular (Ventura et al, 2004). La constatación de la capacidad de JNK de activarse siguiendo un 

curso  temporal  ha  demostrado  su  contribución  tanto  a  la  supervivencia  como  a  la muerte 

celular  (Varfolomeev & Ashkenazi, 2004). Durante  la  fase  temprana de activación de  JNK, su 

activación  conjunta  con  NF‐κB  ejerce  una  acción  combinada  en  la  expresión  de  genes 

antiapoptóticos (Lamb et al, 2003). La fase tardía de activación de JNK se encuentra mediada 

por  la  producción  de  radicales  libres  de  oxígeno  (Kamata  et  al,  2005;  Sakon  et  al,  2003; 

Tobiume et  al, 2001), estando  su activación  regulada por NF‐κB, al  inhibir  la producción de 

radicales  libres  de  oxígeno  (Kamata  et  al,  2005).  De  esta manera,  la  capacidad  de  JNK  de 

inducir  un  proceso  de muerte  celular  como  consecuencia  de  la  activación  de  los  TNFRs  se 

produce únicamente en condiciones en las que se encuentra inhibida la activación de  NF‐κB. 

Por otro lado, la activación de NF‐κB induce la expresión de proteínas como las cIAPs, 

(Wang  et  al,  1998)  que  inhiben  la  activación  de  las  caspasas promoviendo  la  supervivencia 

celular.  Sin  embargo,  la  activación  de  este  factor  transcripcional  conlleva  también  la 

transcripción de  genes  implicados  en  su  regulación, de manera que NF‐κB no  se mantenga 

activo constantemente, tal es el caso de IκBα (Zhou et al, 2003) y de TRAF1 (Wang et al, 1998) 

que  regulan  su actividad  inhibiéndola. Además,  la  inhibición de  síntesis de nuevas proteínas 

bloquea  la  activación  de  NF‐κB,  lo  que  desencadena  procesos  de  muerte  celular  tras  el 

tratamiento con TNF (Van Antwerp et al, 1996). En función de que las caspasas se encuentren 

inhibidas o no, se desarrollará un proceso de muerte celular por apoptosis o por necroptosis. 

Así, NF‐κB aparece  como  controlador  central de  la activación de  los TNFRs  siendo  capaz de 

inhibir  la  apoptosis mediante  la  inhibición de  las  caspasas  y de  la producción de    radicales 

libres de oxígeno que inducen una activación prolongada de JNK.  

Introducción 

37 

 

 

Figura  I‐14:  Interconexión entre  las vías de  señalización de  los TNFRs.  La  interacción de TRAF2  con el receptor activa  tanto a AP‐1, por  la previa activación de  JNK,  como a NF‐κB,  lo que  conlleva  la  transcripción de genes implicados en la supervivencia celular. Además, la activación de NF‐κB supone la transcripción de reguladores negativos  de  su  actividad,  tales  como  TRAF1  o  IκBα,  así  como  de  cIAP1  y  cIAP2,  que  inhiben  a  las  caspasas impidiendo  la  activación  de  la  apoptosis.  Además,  la  activación  de  NF‐κB  inhibe  la  producción  de  ROS  tras  el tratamiento del TNF. Sin embargo, en unas condiciones en las que se produzca una inhibición de NF‐κB, la activación de JNK conlleva la consecución de la apoptosis tras la activación de las caspasas, lo que desemboca en un proceso de muerte celular. 

I.5.3 PROCESAMIENTO DE LOS  TNFRs 

Al  igual  que  ocurre  con  el  TNF,  sus  receptores  son  inicialmente  sintetizados  como 

proteínas  de  anclaje  a membrana,  pudiendo  ser  posteriormente  procesados  dando  lugar  a 

formas  solubles  de  los mismos.  Tanto  el  TNFR1  como  el  TNFR2  son  procesados  por  TACE, 

siendo  liberados  al  torrente  sanguíneo  (Wajant  et  al,  2003).  En  su  forma  soluble,  estos 

receptores  siguen  presentando  la misma  afinidad  por  su  ligando  que  los  correspondientes 

receptores  transmembrana,  actuando  como  inhibidores  de  la  señalización  del  TNF  y 

constituyéndose como un mecanismo de  regulación negativa desencadenando  la  finalización 

de  la señalización del TNF (Xanthoulea et al, 2004);(van Mierlo et al, 2008). Por otra parte, el 

proteasoma regula negativamente los niveles de receptores solubles generados, demostrando 

la existencia de una vía alternativa de procesamiento de los mismos (Levine et al, 2005). 

 Los  niveles  de  las  formas  solubles  de  los  receptores  aparecen  incrementados  en 

distintas enfermedades, así como tras la estimulación con TNF. Por otro lado, su presencia en 

TNF

TNFRTRAF2

ACTIVACIÓN NF-κBACTIVACIÓN AP-1

Supervivencia

Activación reguladores Negativos

(TRAF1, IκBα)

cIAP1 y cIAP2

ROS

JNK JNK

Caspasas

ACTIVACIÓN APOPTOSIS

Muerte celular

TNF

TNFR

Introducción 

38 

 

sangre está siendo estudiada como posible marcador predictivo de diversos tipos de tumores 

(Tesarova et al, 2000; Zekri et al, 2008). 

 

   

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

OBJETIVOS

Objetivos 

39 

 

II. OBJETIVOS 

Debido a que el TNFR2 es activado únicamente por el mTNF, que  también activa al 

TNFR1,  la  mayoría  de  estudios  centrados  en  el  conocimiento  y  caracterización  de  los 

receptores del TNF se han centrado en el TNFR1. De esta manera, mientras que la señalización 

desencadenada por el TNFR1 ha sido ampliamente estudiada, no puede decirse  lo mismo en 

cuanto al TNFR2 se refiere. 

Por ello, en el presente trabajo nos hemos centrado en el estudio del TNFR2, intentado 

caracterizar  las  regiones del  receptor  implicadas en  las distintas vías de  señalización que es 

capaz de  iniciar, su relación con diversas proteínas TRAF y su  interconexión con el TNFR1. En 

concreto, nos hemos planteado los siguientes objetivos: 

 

♦ Estudiar del  efecto de las proteínas TRAF sobre la actividad biológica del TNFR2. 

♦ Analizar el receptor quimérico RANK‐TNFR2 funcionalmente y de manera comparada al 

TNFR2. 

♦ Identificar  los  residuos  del  TNFR2  responsables  de  su  capacidad  de  inducir  la 

degradación de la proteína TRAF2. 

♦ Estudiar  el  efecto  de  la  degradación  de  TRAF2  en  la modulación  de  la  señalización 

desencadenada por el TNFR1. 

♦ Identificar los residuos del TNFR2 implicados en la activación de JNK. 

♦ Generar un sistema celular de expresión estable del receptor quimérico RANK‐TNFR2.  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MATERIALES

Materiales 

41 

 

III. MATERIALES 

III.1 LINEAS CELULARES Y CONDICIONES DE CULTIVO 

III.1.1 LÍNEAS CELULARES 

La  línea celular de  riñón embrionario humano HEK293  (ATCC CRL‐1573) es una  línea 

epitelial  transformada  con el  adenovirus de  tipo V  y  fue  suministrada por  la American  type 

culture collection (ATCC). 

 La  línea  celular  L929  deriva  de  una  línea  de  fibroblasto murino  (ATCC  CCL‐1)  y  fue 

proporcionada por el Dr. Bryant G. Darnay (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Tx).  

La línea celular RAW 264.7 (ATCC TIB‐71) deriva de macrófagos murinos transformados 

de ratones BALB/c y fue suministrada por la ATCC. 

La  línea  celular  GP2  es  una  línea  de  empaquetamiento  de  partículas  retrovirales 

derivada de  la  línea celular HEK293. En ella se encuentran  integrados de manera estable  los 

genes  gag  (codifica  una  proteína  estructural)  y  pol  (codifica  la  transcriptasa  inversa)  del 

MoMuLV (del inglés Moloney Murine Leukemia Virus), esenciales para el empaquetamiento de 

partículas virales.  

III.1.2 MANTENIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES 

Las células RAW264.7, HEK293 y GP2 se crecen en medio DMEM (del inglés Dulbecco's 

Modified Eagle Medium, de Lonza) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (Lonza) 

inactivado por calor a 56 °C durante 60 minutos (FBSi), 1% de L‐Glutamina (Sigma‐Aldrich), 1% 

de aminoácidos no esenciales  (GE Healthcare), 0,13 M de NaHCO3  (Sigma‐Aldrich), penicilina 

(100 U/ml) y estreptomicina (0,1 U/ml) (ambas suministradas por Sigma‐Aldrich). 

Las células L929 se mantienen en medio RPMI1640 (del inglés Roswell Park Memorial 

Institute  medium,  de  GIBCO)  suplementado  con  10%  (v/v)    FBSi,  penicilina  (100  U/ml)  y 

estreptomicina  (0,1 U/ml).  Para  la  selección  y  crecimiento de  líneas  transfectantes  estables 

L929 se empleó el mismo medio RPMI 1640 suplementado con 4 µg/ml de puromicina (Sigma‐

Aldrich).  

Todas  las  líneas celulares se mantienen en placas de cultivo de plástico de 10 cm de 

diámetro con 10 ml de medio a 37 °C y en atmósfera humidificada conteniendo 5% de CO2. 

Materiales 

42 

 

III.2 OLIGONUCLEÓTIDOS 

En  la  Tabla  III‐1  se  relacionan  los  oligonucleótidos  utilizados  en  el  presente  trabajo 

(todos ellos suministrados por  Sigma‐Aldrich). 

NOMBRE  SECUENCIA 5´‐3  SENTIDO  DIANA  POSICIÓN (PB) 

COMENTARIO 

MR15  gagcaccgaagaggcggccgcgccccttgg Directo TNFR2 (AAA) 

1260‐1290  Mutación puntual 

MR16  ccaaggggcgcggccgcctcttcggtgctc Reverso TNFR2 (AAA) 

1260‐1290  Mutación puntual 

LU4  agctgtcgacatgggagacacagattcc Directo TNFR2 (Δ365‐378)

1142‐1167  Sitio Sal I

LU5  agctgtcgacgttcacgatgcaggtgacattgac Reverso TNFR2 (Δ365‐378) 

1069‐1092  Sitio Sal I

LU9  agctgtcgacgctggcccgggcctcccc Reverso TNFR2 (343) 

1009‐1026  Sitio Sal I

LU10  agctgtcgacaatgtcacctgcatcgtg Directo TNFR2 (Δ424‐356) 

1072‐1089  Sitio Sal I

LU11  agctgtcgacgccagctccacaatg Directo TNFR2 (379) 

1135‐1155  Sitio Sal I

LU14  agctgtcgacggaagaatctgagctcccggtgct Reverso TNFR2 (Δ350‐378) 

1024‐1047  Sitio Sal I

LU19  tctgaccacgccgcacagtgctcctcc Directo TNFR2 (HAA) 

1105‐1131  Mutación puntual 

LU20  ggaggagcactgtgcggcgtggtcaga Reverso TNFR2 (HAA) 

1105‐1131  Mutación puntual 

LU21  tcacagtgcgccgcccaagccagc Directo TNFR2 (CAA) 

1117‐1140  Mutación puntual 

LU22  gctggcttgggcggcgcactgtga Reverso TNFR2 (CAA) 

1117‐1140  Mutación puntual 

LU23  cagcaccggggccgcagattcttccc Directo TNFR2 (AAD) 

1023‐1048  Mutación puntual 

LU24  gggcagaatctgcggccccggtgctg Reverso TNFR2 (AAD) 

1023‐1048  Mutación puntual 

LU25  gagctcagatgctgcccctggtggc Directo TNFR2 (DAA) 

1032‐1056  Mutación puntual 

LU26  gccaccaggggcagcatctgagctc Reverso TNFR2 (DAA) 

1056‐1032  Mutación puntual 

LU34  ctagggatccaccgggagctcagattct Directo TNFR2 (Δ343‐378) 

1027‐1043  Sitio BamHI

LU27  agctgtcgacttattgggaggagcactgtgagctg Reverso TNFR2 (Δ343‐378) 

1146‐1167  Sitio Sal I precedido de una señal de 

STOP RetropMXf  agcttacgtaacggtgggaggtctataaa Directo pCMV1 874‐893  Sitio SnaBIRetropMXr  agcttacgtaccaggagaggcactggggag Reverso pCMV1 1082‐1101  Sitio SnaBI

Materiales 

43 

 

pBabef  cctaagcctccgcctcctctt Directo pBABE 1137‐1157  SecuenciaciónpBaber  cggccttattccaagcggctt Reverso pBABE 1413‐1433  SecuenciaciónD‐GFP  gcaagggcgaggagctgttc Directo GFP 21‐40   R‐GFP  gtggctgttgtagttgtact Reverso GFP 441‐461   

mTNFR1‐D  tgctgatggggatacatccatc Directo TNFR1 murino 

53‐74   

mTNFR1‐R  ggattgtcacggtgccgttgaag Reverso TNFR1 murino 

447‐469   

pCMV2  tattaggacaaggctggtgggcac Reverso pCMV1 1115‐1135  SecuenciaciónBGHrev  tagaaggcacagtcgagg Reverso pCDNA

3 Secuenciación

OligodT  aagcagtggtaacaacgcagagtac(30t)n RT  LK5  cagaagactgtggatgg Directo GAPDHLK6  accctgttgctgtagcc Reverso GAPDH

Tabla III‐1: Relación de oligonucleótidos empleados en el desarrollo del presente trabajo. Se detallan  los oligonucleótidos utilizados, especificándose tanto su secuencia 5´‐3´ como su orientación,  indicándose, en el caso del  TNFR2,  la  mutación  puntual  o  deleción  interna  que  introducen  en  el  receptor.  En  la  secuencia  de  los oligonucleótidos se destaca en rojo los cambios de base responsables de la introducción de una mutación puntual en el receptor, mientras que en verde se hace referencia a las bases que codifican para un sitio de reconocimiento por un enzima de restricción concreto, el cual se indica en la columna “Comentario”.  

III.3 ANTICUERPOS 

Los anticuerpos empleados en el presente trabajo se muestran en la Tabla III‐2:  

ANTICUERPO  CASA COMERCIAL (REFERENCIA)  APLICACIÓN  DILUCIÓN 

TNFR1  Santa Cruz Biotechnology WESTERN 

IF IP 

1:1.000 1:100 

TRAF1  Santa Cruz Biotechnology WESTERN IP  1:5.000 TRAF2  Santa Cruz Biotechnology (C‐20) WESTERN IP  1:5.000 TRAF3  Santa Cruz Biotechnology (H‐20) WESTERN, IP  1:5.000 GFP  Santa Cruz Biotechnology (sc‐8334) WESTERN  1:5.000 

C‐MYC  Santa Cruz Biotechnology (sc‐40) WESTERN  1:1.000 

FLAG  Sigma‐Aldrich (F3165)  WESTERN IF 

1:5.000 1:100 

Β‐ACTINA  Sigma‐Aldrich (A5441) WESTERN  1:10.000C‐JUN‐PHOS (SER73)  Cell Signaling WESTERN  1:5.000 

HA  Roche IP 0,4 μg/μlRANK  Imgenex. Cedido por el Dr. Bryant G. 

Darnay  (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Tx). 

WESTERN  1:5.000 

IgG DE CONEJO  Sigma‐Aldrich (A2074) WESTERN  1:5.000 IgG DE RATÓN  Cell Signalling WESTERN  1:5.000 

IRDYE 800CWGOAT ANTI‐MOUSE IGG 

Li‐cor Biotechnologies (926‐32210) WESTERN  1:15.000

IRDYE 600LT GOAT ANTI‐RABBIT IgG 

Li‐cor Biotechnologies (926‐68021) WESTERN  1:15.000

ALEXA FLUOR® 633 GOAT ANTI‐MOUSE IgG (H+L)

Invitrogen (A2105) IF 1:1.000 

Materiales 

44 

 

ANTI‐IgG DE CONEJO TRUE BLOT ULTRA 

eBioscience (18‐8817) WESTERN  1:2.500 

Tabla  III‐2:  Relación  de  anticuerpos  empleados.  Se  representan  los  diversos  anticuerpos  utilizados, indicándose tanto la casa comercial de procedencia y el número de referencia, como la aplicación y dilución de cada uno.  Cada  una  de  las  distintas  siglas  hace  referencia  a  las  aplicaciones  de  cada  anticuerpo  (WESTERN:  Análisis Western‐Blot, IP: Inmunoprecipitación, IF: Inmunofluorescencia) 

III.4 PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN 

En  la Tabla  III‐3 se  relacionan  los plásmidos empleados en el desarrollo del presente 

tabajo. Todos ellos  incluyen un gen de  resistencia a ampicilina, a excepción de pEGFP‐F que 

presenta un gen de resistencia a kanamicina.  

PLÁSMIDO  CODIFICA  CEDIDO POR 

pEGFP‐F Proteína verde fluorescente fusionada con la secuencia de 

farnesilación de p21Ras. Utilizado como marcador de transfección. 

Dr. David S. Ucker, University of 

Illinois. Chicago. 

pNFКB‐LUC Luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor con 

elementos de respuesta кB. 

Dr. David S. Ucker, University of 

Illinois. Chicago. 

pRL‐TK 

Luciferasa de Renilla bajo el control del promotor del gen timidina quinasa del virus del herpes HSV‐TK. Este plásmido expresa de manera constitutiva la luciferasa de Renilla, por lo 

que se utiliza como control interno de la eficiencia de la transfección. 

Promega. 

pCDNA3B‐HA‐JNK  Quinasa JNK marcada con el epítopo HA 

Dra. Pilar de la Peña, 

Universidad de Oviedo 

pCDNA3‐CRMA  Proteína inhibidora de la apoptosis CRMA Dr. David S. Ucker,

University of Illinois, Chicago 

pCMV1‐FLAG Vector control de los ensayos de señalización. Posee la secuencia pre‐protripsina, que dirige la proteína codificada a la membrana 

celular y el epítopo FLAG en su extremo amino. Sigma‐Aldrich. 

pCDNA3‐HTNFR1  TNFR1 humano. 

Dr. Bharat B. Aggarwal, 

MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pCMV1‐ FLAG ‐HTNFR2  TNFR2 humano. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pCMV1‐FLAG‐TNFR2‐SKAA 

TNFR2 humano donde el sitio clásico de interacción con las proteínas adaptadoras TRAF se encuentra mutado 

específicamente 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pCMV1‐FLAG‐TNFR2‐BKO 

TNFR2 humano donde ambos sitios de interacción con las proteínas adaptadoras TRAF se encuentran mutados 

específicamente 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

Materiales 

45 

 

pCMV1‐ FLAG ‐TNFR2‐Δ379 

Receptor TNFR2 donde la región intracelular se encuentra delecionada a partir del aminoácido 379. 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pCMV1‐ FLAG ‐TNFR2‐Δ424 

Receptor TNFR2 donde la región intracelular se encuentra delecionada a partir del aminoácido 424. 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pCMV1‐ FLAG ‐TNFR2‐Δ386‐414 

Receptor TNFR2 donde la región intracelular presenta una deleción entre las posiciones 386 y 414. 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pCMV1‐ FLAG ‐TNFR2‐Δ343 

Receptor TNFR2 donde la región intracelular se encuentra delecionada a partir del aminoácido 343. 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pCMV1‐FLAG‐TNFR2‐SKAA 

Receptor TNFR2 que presenta mutada la secuencia 402‐SKEE‐405 a 402‐SKAA‐405. 

Generado previamente en el 

laboratorio. pCMV1‐FLAG‐TNFR2‐SKAA‐

AAA 

Receptor TNFR2 que presenta mutadas las secuencias 402‐SKEE‐405 y 425‐KPL‐427 a 402‐SKAA‐405 y 425‐AAA‐427 

respectivamente. 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2 

Receptor quimérico de las regiones extracelular y transmembrana de RANK y la región intracelular completa del 

TNFR2. 

Generado previamente en el 

laboratorio. pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2‐

SKAA 

Receptor quimérico de las regiones extracelular y transmembrana de RANK y la región intracelular del TNFR2 con la 

mutación puntual 402‐SKEE‐405. 

Generado previamente en el 

laboratorio. 

pGEX‐KG Vector control de los ensayos de interacción in vitro. Codifica la 

proteina  GST. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pGEX‐Δ379 Proteína GST junto con la región intracelular del TNFR2 

delecionada a partir del aminoácido 379. Generado en el laboratorio. 

pGEX‐Δ424 Proteína GST junto con la región intracelular del TNFR2 

delecionada a partir del aminoácido 424. Generado en ellaboratorio. 

pGEX‐Δ386‐414 Proteína GST junto con la región intracelular del TNFR2 con una 

deleción interna entre los aminoácidos 386 y 414. Generado en el laboratorio. 

pGEX‐Δ343 Proteína GST junto con la región intracelular del TNFR2 

delecionada a partir del aminoácido 343. Generado en el laboratorio. 

pBABE‐PURO‐IRES‐GFP 

Proteína GFP fusionada a la secuencia IRES junto con el gen de resistencia a puromicina. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pBABE‐PURO‐IRES‐GFP‐RANKEC 

Región extracelular RANK y GFP fusionados a la secuencia IRES junto con el gen de resistencia a puromicina. 

Generado previamente en el 

laboratorio. pBABE‐PURO‐IRES‐GFP‐RANK‐

TNFR2 

Receptor quimérico RANK‐TNFR2 y GFP fusionados a la secuencia IRES junto con el gen de resistencia a puromicina. 

Generado previamente en el 

laboratorio. pBABE‐PURO‐IRES‐GFP‐RANK‐TNFR2‐Δ379 

Receptor quimérico RANK‐TNFR2‐Δ379 y GFP fusionados a la secuencia IRES junto con el gen de resistencia a puromicina 

Generado previamente en el 

laboratorio. pBABE‐PURO‐IRES‐GFP RANK‐TNFR2‐Δ403 

Receptor quimérico RANK‐TNFR2‐Δ403 y GFP fusionados a la secuencia IRES junto con el gen de resistencia a puromicina 

Generado previamente en el 

laboratorio. pBABE‐PURO‐ Receptor quimérico RANK‐ TNFR2‐Δ343 y GFP fusionados a la  Generado 

Materiales 

46 

 

IRES‐GFP RANK‐TNFR2‐Δ343 

secuencia IRES junto con el gen de resistencia a puromicina previamente en el laboratorio. 

pCDNA3.1‐TRAF1‐CMYC 

Proteína TRAF1 marcada en su extremo carboxilo con el epítopo Myc. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pRK‐MYC‐TRAF2 Proteína TRAF2 marcada en su extremo amino con el epítopo 

Myc. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pCDNA3.1‐TRAF3  Proteína TRAF3. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas. 

pCR3‐ FLAG ‐TRAF1  Proteína TRAF1. Presenta el epítopo FLAG en su extremo amino. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 

pCR3‐ FLAG ‐TRAF2  Proteína TRAF2. Presenta el epítopo FLAG en su extremo amino. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 

pCR3‐ FLAG ‐TRAF3  Proteína TRAF3. Presenta el epítopo FLAG en su extremo amino. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 

pCR3‐ FLAG ‐TRAF6  Proteína TRAF6. Presenta el epítopo FLAG en su extremo amino. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 

pRK‐MYC‐TRAF5 Proteína TRAF5 marcada en su extremo amino con el epítopo 

Myc. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 

pVSV‐G  Proteína de la envoltura viral del virus de la estomatitis vesicular. 

Dr. Bryant Darnay,MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 

Tabla  III‐3: Relación de plásmidos empleados en el desarrollo del presente trabajo. Se representan  los plásmidos  utilizados,  indicándose  el  nombre  con  el  que  se  denomina  a  cada  uno,  añadiéndose  una  breve descripción de los mismos así como un comentario sobre su procedencia. 

 

Materiales 

47 

 

 Figura III‐1: Representación esquemática de los receptores empleados en el presente trabajo. En la parte 

superior  de  la  figura  se  representa  al  TNFR1,  donde  TNFR1ec  hace  referencia    a  las  regiones  extracelular  y transmembrana del receptor (en negro), mientras que TNFR1ic se refiere a su región intracelular (en blanco). En el mismo se representa también el DD del receptor (en gris). A continuación se representa el TNFR2, donde TNFR2ec se refiere a sus regiones extracelular y transmembrana (en negro) y TNFR2ic hace referencia a su región intracelular (en blanco).  La  región  sombreada en  gris  y marcada  como  (III)  representa  la  región 343‐378,  con  alto  grado de conservación  entre  distintas  especies  e  implicada  en  la  señalización  del  receptor.  Debajo  se  representan  los receptores  TNFR2  analizados  con  diversas  deleciones  o  mutaciones  puntuales  de  su  región  intracelular.  A continuación  se  representa  al  receptor  quimérico RANK‐TNFR2,  donde RANKec  (en  negro)  hace  referencia  a  las regiones extracelular y  transmembrana de RANK. Los números  junto a  la  representación de cada  receptor hacen referencia a los aminoácidos incluidos de las regiones extracelular y transmembrana de los respectivos receptores, a las  regiones  intracelulares de  cada uno de  los  receptores, así  como a  las posiciones en  las que  se han  realizado deleciones de la región intracelular del TNFR2, haciéndose referencia al primer y al último aminoácido presentes en la misma. En la nomeclatura de los receptores especificada a la izquierda de la figura, los números hacen referencia a los residuos delecionados. En la parte inferior de la figura se representa el receptor quimérico RANK‐TNFR2‐SKAA a partir del cual se han generado  la mayoría de los nuevos receptores analizados en el presente trabajo. En todos los  receptores  TNFR2  y RANK‐TNFR2  representados  se  indica  la  secuencia de ambos  sitios de unión  con  TRAF2, marcándose en gris cuando ésta coincide con la original (SKEE y KPL) y en negro cuando se encuentra mutada (SKAA y AAA). 

III.5 OTROS MATERIALES 

El material  fungible de cultivos celulares es de Falcon  (pipetas  serológicas, placas de 

cultivo de 10cm de diámetro y de 6 y 12 pocillos, rascadores…). 

Los reactivos químicos generales (NaCl, Glicina, EDTA, cristal violeta, SDS…), así como 

los antibióticos, fueron adquiridos a SIGMA.  

TNFR2ec (1‐266)  TNFR2ic (267‐439)

TNFR2266

439SKEE KPLI III343 378

TNFR1

TNFR1ec (1‐266)  TNFR1ic (267‐439)

213434I I DD

TNFR2‐SKAA266

439SKAA KPLI III

TNFR2‐BKO266

439SKAA AAAI III

RANK‐TNFR2

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPL

343 378III

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ379

TNFR2‐Δ343

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐SKAA

266423SKEE

266378

266342

266

439KPL385 415

266439SKEE KPL

III

III

III

III

RANK‐TNFR2‐SKAA241

439SKAA KPLI III

Materiales 

48 

 

Para  las reacciones de amplificación y posterior generación de nuevos receptores, se 

empleó  la  polimerasa  Kapa‐Hifi,  de  Cultek.  Para  las  reacciones  de mutagénesis  puntual  se 

utilizó  la polimerasa Pfu Turbo de Stratagene, mientras que en  los análisis de amplificación y 

comprobación de  expresión  tanto en DNA  genómico  como en RNA,  se utilizó  la polimerasa 

GoTaq, de Promega. Los enzimas de restricción empleados fueron proporcionados por Takara, 

mientras que la T4 DNA ligasa es de Fermentas.

 Para el desarrollo de  las electroforesis de DNA,  la agarosa  fue suministrada por USB 

Corporation,  el  bromuro  de  etidio  por  Sigma  y  el  TAE  por  Invitrogen,  al  igual  que  los 

marcadores  de  refencia  λ DNA/HindIII  y  escalera  de  100  pb  empleados  para  determinar  el 

tamaño de los fragmentos de DNA. 

En  los análisis Western‐Blot se empleó acrilamida/bisacrilamida de Bio‐Rad y TEMED 

(N,N,N,N‐tetrametilendiamina)  y  PSA  (persulfato  amónico)  de  Sigma,  mientras  que  los 

marcadores de  referencia preteñidos utilizados para determinar  el  tamaño de  las proteínas 

fueron proporcionados por Invitrogen (BenchMark prestained protein ladder). Las membranas 

de  PVDF  empleadas  para  la  transferencia  fueron  suministrados  por Millipore  (Immobilon‐P 

transfer membrane para los análisis Western por quimioluminiscencia e Immobilon‐FL transfer 

membrane para  los análisis Western por  infrarrojos). El  sistema de quimioluminiscencia ECL 

fue proporcionado por GE Healthcare, mientras que  las películas empleadas para el revelado, 

así como las disoluciones de revelado y fijación, fueron suministradas por Sigma 

El  ioduro  de  propidio  y  la  RNAasa  empleados  en  los  análisis  de  citometría  de  flujo 

fueron proporcionados por Sigma y Roche respectivamente. Para el estudio de marcadores de 

muerte celular se empleó el AnexinaV‐PE Apoptosis Detection Kit I de BD. Para  los análisis de 

luciferasa  se utilizó  el Dual‐LuciferaseTM Reporter Assay  System de Promega.  La proteína de 

fusión GST‐c‐Jun fue proporcionada por Cell Signaling. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MÉTODOS

Métodos 

49 

 

IV. MÉTODOS 

IV.1 EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO Y RNA 

IV.1.1 EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO 

Las células sembradas en una placa de 10 centímetros de diámetro se  lavan con PBS, 

se recogen en 4,5 ml de tampón de lisis (10 mM Tris‐HCl pH8, 5 mM EDTA, 10 mM NaCl) y se 

añade 50 µg de Proteinasa K junto con 10% SDS, dejándose toda la noche en agitación a 37 °C. 

Posteriormente,  se  añaden  2,5 ml  5 M NaCl  y  se  agita  y  centrifuga  durante  15 minutos  a 

13.000  rpm. Al sobrenadante  recogido se  le añaden 5,6 ml de  isopropanol. Se centrifuga 20 

minutos a 13.000  rpm a 4  °C, eliminándose posteriormente el sobrenadante. El DNA se  lava 

dos  veces  con  1 ml  de  etanol  al  70%  y  se  resuspende  en  un  volumen  de  30  µl  de  H2O, 

conservándose posteriormente a ‐20 °C. 

IV.1.2 EXTRACCIÓN DE RNA Y TRANSCRIPCIÓN REVERSA. 

El  RNA  de  las  células  sembradas  en  placas  de  10  cm  de  diámetro  se  extrae  con  el 

reactivo TRI‐REAGENT,  siguiendo  las especificaciones de  la  casa  comercial.  La  concentración 

del RNA se determina midiendo su absorbancia a 260 nm.  

Para  la  realización  de  la  transcripción  reversa  (RT)  se  utiliza  el  enzima  MLV 

Transcriptasa Reversa. En un volumen total de 12 µl se mezclan 2 µg de ARN junto con 1 µl de

oligo dT, se incuba durante 5 minutos a 65 °C y posteriormente en hielo durante 3 minutos. A 

continuación se añaden 4 µl   de First Strand Buffer, 2 µl de DTT  (0,1 M) y 1 µl de dNTPs  (10 

mM). Se incuba 2 minutos a 37 °C, se añade 1 µl de la transcriptasa reversa y se incuba durante 

50 minutos a 37 °C. Finalmente, se inactiva el enzima a 70 °C durante 15 minutos. 

IV.1.3 ANÁLISIS  PCR 

Para  amplificar  una  región  específica  del  cDNA  o  de  DNA  genómico mediante  PCR 

(Reacción  en  cadena  de  la  polimerasa)  (Mullis  et  al,  1986),  se  diseñan  oligonucleótidos 

complementarios  a  las  secuencias  flanqueantes  de  la  región  de  interés.  Para  realizar  a  la 

Métodos 

50 

 

amplificación se utiliza el enzima Go‐Taq polimerasa, siguiendo las instrucciones del fabricante, 

y los oligonucleótidos que se detallan en el apartado III.2. 

Las condiciones de la reacción de RT‐PCR son las siguientes: 

SEGMENTO  N° DE CICLOS  TEMPERATURA  TIEMPO 1  1  95°C  1 minuto 2  30  Tm  1 minuto 

72°C  1 minutos /kb de longitud del plásmidos 

Tabla IV‐1: Parámetros de la reacción de RT‐PCR. 

La  Tm  (temperatura  de  fusión)  varía  en  función  de  la  pareja  de  oligonucleótidos 

empleada en cada caso. De esta manera:  

• LK5 y LK6 (amplificación de GAPDH): 55 °C. 

• RetropMXf y RetropMXr (amplificación de los receptores RANK‐TNFR2): 60 °C. 

• D‐GFP y R‐GFP (amplificación de la proteína verde fluorescente GFP): 66 °C. 

• mTNFR1‐D y mTNFR1‐R (amplificación del TNFR1): 62 °C. 

 

El producto de  la PCR se comprueba en un gel de agarosa al 1% en TAE utilizándose 

como  marcadores  del tamaño de los fragmentos de DNA los marcadores comerciales λ

DNA/HindIII y escalera de 100 pb.  

IV.2 CONSTRUCCIÓN DE VARIANTES DEL RECEPTOR RANK‐TNFR2 

IV.2.1 REACCIONES DE AMPLIFICACIÓN 

A  lo  largo  del  presente  trabajo  se  generaron  nuevos  receptores  RANK‐TNFR2  con 

diversas deleciones internas o mutaciones puntuales en su región intracelular.  

La amplificación de una región concreta del receptor se realizó por PCR con el enzima 

Kapa‐HiFi  polimerasa  siguiendo  las  especificaciones  del  fabricante.  La  reacción  de 

amplificación  se  llevó  a  cabo  en  un  termociclador  (GeneAmp  PCR  System2400,  de  Applied 

Biosystems)  según las siguientes condiciones: 

SEGMENTO  N° DE CICLOS  TEMPERATURA  TIEMPO 1  1  95°C  30 segundos  2 

 35 

95°C  30 segundos 55°C  1 minuto 68°C  30 segundos /kb de longitud del plásmidos 

3  1  72°C  10 minutos 

Tabla IV‐2: Parámetros de la reacción de PCR. 

Métodos 

51 

 

Para la generación de receptores RANK‐TNFR2 con mutaciones puntuales en su región 

intracelular  se  utilizó  el  sistema  Quick  Change  Site  Directed  Mutagenesis  Kit.  En  este 

procedimiento, se utiliza un vector de DNA de doble cadena (dsDNA) con el inserto de interés y 

dos  oligonucleótidos  complementarios  que  contienen  la  mutación  deseada.  Estos 

oligonucleótidos se diseñan en base a las siguientes consideraciones: 

♦ Deben  ser  totalmente  complementarios  entre  sí  y  contener  la  mutación 

deseada  localizada  en  la  mitad  del  oligonucleótido,  flanqueada  por  10‐25 

bases de secuencia correcta por ambos lados. 

♦ Deben tener un contenido mínimo de GC del 40% y una Tm ≥ 78 ºC. 

♦ Deben ser purificados por FPLC o PAGE. 

Se lleva a cabo una reacción de PCR en un termociclador (GeneAmp PCR System2400, 

de Applied Biosystems) utilizando la DNA polimerasa Pfu Turbo, siguiendo las instrucciones del 

fabricante  y según las siguientes condiciones: 

SEGMENTO  N° DE CICLOS  TEMPERATURA  TIEMPO 1  1  95°C  30 segundos  2 

 18 

95°C  30 segundos 55°C  1 minuto 55°C  1 minutos /kb de longitud del plásmidos 

Tabla IV‐3: Parámetros de amplificación de la reacción de mutagénesis puntual. 

El producto de  la amplificación es  tratado  con el enzima DpnI, que  sólo  reconoce el 

DNA  en  estado  metilado  o  hemimetilado  y,  por  lo  tanto,  digiere  el  DNA  parental, 

seleccionándose  de  este modo  el DNA  que  ha  incorporado  la mutación.  El  producto  de  la 

digestión se transforma directamente en una cepa bacteriana competente XL‐Blue. 

IV.2.2 VARIANTES DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2 

En  el  desarrollo  del  presente  trabajo  se  ha  llevado  a  cabo  la  construcción  de  las 

siguientes variantes del   receptor quimérico RANK‐TNFR2   (representadas esquemáticamente 

en la Figura IV‐1): 

RECEPTOR  MOLDE  OLIGONUCLEÓTIDOS  COMENTARIO RANK‐TNFR2‐Δ343‐

378 pCMV1‐FLAG‐RANK‐TNFR2  LU9 y LU11  Receptor con una deleción interna 

comprendida entre los aminoácidos 343 y 378. 

RANK‐TNFR2‐BKO  pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐SKAA  MR15 y MR16 

Receptor con mutaciones puntuales de ambos sitios de interacción con TRAF2 en el receptor (de 402‐SKEE‐405 y 425‐KPL‐427 a 402‐SKAA‐

405 y 425‐KPL‐427 respectivamente). RANK‐TNFR2‐BKO‐

Δ343‐378: pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐BKO  LU9 y LU11  Receptor con una deleción interna 

comprendida entre los aminoácidos 343 y 378. RANK‐TNFR2‐BKO‐

Δ365‐379: pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐BKO  LU4 y LU5  Receptor con una deleción interna 

comprendida entre los aminoácidos 365‐379. 

Métodos 

52 

 

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ344‐356 

pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐BKO  LU9 y LU10  Receptor con una deleción interna 

comprendida entre los aminoácidos 344 y 356. RANK‐TNFR2‐BKO‐

Δ350‐378 pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐BKO  LU11 y LU14  Receptor con una deleción interna 

comprendida entre los aminoácidos 350 y 378. 

RANK‐TNFR2‐343‐379 

pCDNA3‐FLAG‐RANKec  LU11 y LU14 

Receptor en donde la región intracelular se encuentra constituida únicamente por los residuos comprendidos entre las posiciones 

343 y 378 del receptor. 

RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD 

pCMV1‐FLAG ‐RANK‐TNFR2‐

BKO LU23 y LU24 

Receptor con dos residuos de serina del módulo 343‐378 mutados (de 345‐SSD‐347 a 345‐AAD‐347). Este receptor presenta también mutados ambos sitios de unión con TRAF2. 

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA 

pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2‐

BKO LU25 y LU26 

Receptor con dos residuos de serina del módulo 343‐378 mutados (de 347‐DSS‐349 a 347‐DAA‐349). Este receptor presenta también mutados ambos sitios de unión con TRAF2. 

RANK‐TNFR2‐BKO‐HAA 

pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2‐

BKO LU19 y LU20 

Receptor con dos residuos de serina del módulo 343‐378 mutados (de 372‐HSS‐374 a 372‐HAA‐374). Este receptor presenta también mutados ambos sitios de unión con TRAF2. 

RANK‐TNFR2‐BKO‐CAA 

pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2‐

BKO LU21 y LU22 

Receptor con dos residuos de serina del módulo 343‐378 mutados (de 376‐CSS‐378 a 376‐CAA‐378). Este receptor presenta también mutados ambos sitios de unión con TRAF2. 

RANK‐TNFR2‐AAD  pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2  LU23 y LU24  Receptor con dos residuos de serina mutados 

378 (de 345‐SSD‐347 a 345‐AAD‐347). 

RANK‐TNFR2‐DAA  pCMV1‐ FLAG ‐RANK‐TNFR2  LU25 y LU26  Receptor con dos residuos de serina mutados 

(de 347‐DSS‐349 a 347‐DAA‐349). 

Tabla IV‐4: Detalle de los receptores generados en el presente trabajo. Se indican los distintos receptores RANK‐TNFR2 generados, así como el molde y los oligonucleótidos empleados en las correspondientes reacciones de amplificación. Se comenta también la región delecionada o los aminoácidos mutados en cada caso. 

 

Todas  las  construcciones  fueron  comprobadas  en  el  servicio  de  secuenciación  de  la 

Universidad de Oviedo. 

Métodos 

53 

 

 Figura  IV‐1:  Representación  esquemática  de  los  receptores  quiméricos  generados  en  el  presente 

trabajo.  La  representación  de  los  receptores  es  como  en  la  Figura  III‐1.  En  la  parte  superior  se  representa  el receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  indicándose  las  regiones  extracelular  y  transmembrana  de  RANK,  la  región intracelular de TNFR2 así como el módulo conservado existente entre las posiciones 343‐379 del receptor y los dos sitios  de  interacción  del  receptor  con  la  proteína  adaptadora  TRAF2. A  continuación  se  representan  los  nuevos receptores  quiméricos  generados,  indicándose  tanto  las  deleciones  internas  realizadas  como  las  mutaciones puntuales de residuos concretos del receptor.  

IV.3 GENERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES TRANSFECTANTES ESTABLES 

Para  la  generación  de  líneas  celulares  que  expresan  de manera  estable  el  receptor 

quimérico RANK‐TNFR2 o alguna de sus variantes, los receptores quiméricos del TNFR2 fueron 

clonados  en  el  vector  pBABE‐puro‐IRES‐GFP.  Este  vector  presenta  una  secuencia  IRES  (del 

inglés  Internal Ribosome Entry Site) entre el sitio múltiple de clonación  (donde se  insertaron 

los receptores quiméricos RANK‐TNFR2) y  la secuencia de GFP,  la cual se encuentra   seguida 

del  gen  de  resistencia  a  puromicina.  La  secuencia  IRES  permite  que  ambas  proteínas  (el 

receptor y  la proteína GFP)  se  sinteticen de manera  independiente, mientras que el gen de 

resistencia  a  puromicina  permite  la  selección  en  cultivo  de  las  células  que  han  resultado 

infectadas.  En  la  Figura  IV‐2  se  representa  el  plásmido  pBABE‐puro.  En  nuestro  caso,  los 

receptores quiméricos RANK‐TNFR2 fueron clonados en el sitio SnaBI del vector. 

RANK‐ TNFR2

RANKec (1‐241)  TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPLII III

342 379

241439SKEE KPLRANK‐TNFR2‐Δ343‐378 342 379

241439SKAA AAA342 379

RANK‐ TNFR2‐BKO241

439SKAA AAA

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐379

241439SKAA AAA

364379RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ365‐378

RANK‐ TNFR2‐BKO‐Δ343‐355241

439SKAA AAA342 356

241439SKAA AAA349 379RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ350‐378

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD241

439SKAA AAAAAD

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA241

439SKAA AAADAA

241RANK‐TNFR2‐343‐378 343 378

RANK‐ TNFR2‐AAD241

439SKEE KPL

AAD

RANK‐ TNFR2‐DAA241

439SKEE KPL

DAA

III

III

III

III

III

III

RANK‐ TNFR2‐BKO‐HAA241

439SKAA AAAHAA

III

RANK‐ TNFR2‐BKO‐HAA241

439SKAA AAACAA

III

III

III

Métodos 

54 

 

 Figura  IV‐2:  Representación  del  plásmido  pBABE‐puro‐IRES‐GFP.  Se  representa  la  secuencia  del  vector 

pBABE‐puro‐IRES‐GFP, donde destaca el sitio múltiple de clonación así como las posiciones de la secuencia IRES (en azul), del gen de  la proteína verde  fluorescente GFP y  los genes de  resistencia a puromicina y ampicilina(flechas rojas). En verde se resalta el sitio de restricción del enzima SnaBI, en donde fueron clonados los distintos receptores quiméricos. 

Para  el  proceso  de  generación  de  líneas  celulares  transfectantes  estables  de  los 

receptores de interés, se sigue un proceso de producción de partículas retrovirales con las que 

infectar posteriormente a  la  línea celular de  interés. La  línea celular de empaquetamiento de 

partículas  virales GP2  presenta  integrados  de manera  estable  en  su  genoma  los  genes  que 

codifican para las proteínas gag y pol del MoMuLV. Ambas proteínas son necesarias para una 

correcta replicación viral y formación de las partículas virales.  

Las  células  GP2  se  siembran  en  placas  de  6  pocillos  a  una  densidad  de  0,6  x  105 

células/pocillo. A  las 24 horas,  las células se transfectan con el reactivo Fugene, siguiendo  las 

instrucciones del fabricante, con 3 µg del plásmido de interés así como con 1 µg del plásmido 

codificante de VSVg (proteína de la envoltura viral del virus de la estomatitis vesicular) en 1 ml 

de medio  αMEM.  Veinticuatro  horas  después  de  la  transfección  se  añaden  2 ml  de medio 

αMEM, así como otros 2 ml de medio por pocillo 24 horas más tarde. Cuarenta y ocho horas 

después de la transfección se comprueba su eficacia observando la fluorescencia de las células 

GP2  mediante  un  microscopio  de  fluorescencia.  Setenta  y  dos  horas  después  de  la 

transfección, se recoge el medio de cada pocillo, se centrifuga 5 minutos a 2.000 rpm y se filtra 

mediante  un  filtro  de  45  μm  para  eliminar  posibles  restos  celulares.  El  filtrado  con  las 

partículas retrovirales se añade, junto con 12 ml de medio completo y 10 µg/ml de Polibreno 

filtrado, a un Flask p75 en donde se encuentran en crecimiento las células L929. Setenta y dos 

Métodos 

55 

 

horas  después  de  realizar  la  infección,  se  comprueba  su  eficacia  en  un  microscopio  de 

fluorescencia.  

A continuación, se  inicia el proceso de selección de  las células  infectadas mediante  la 

adición  al medio  de  cultivo  de  4  µg/ml  de  puromicina.  Posteriormente,  se  comprueba  la 

eficacia  de  la  selección  tanto  por  citometría,  cuantificando  el  porcentaje  de  células  verdes, 

como por análisis Western estudiando la expresión de la proteína GFP y del receptor quimérico 

de interés. Para el estudio del porcentaje de células verdes, las células L929 se recogen y lavan 

dos veces con PBS, determinándose directamente mediante citometría de flujo el porcentaje 

de células positivas para la proteína GFP. 

Por  otro  lado,  mediante  RT‐PCR  se  comprueba  la  inserción  del  receptor  y  de  la 

proteína GFP en el DNA genómico así como la expresión del receptor mediante el estudio del 

cDNA. 

Las líneas celulares transfectantes estables se mantienen en crecimiento en medio con 

antibiótico  asegurándose  la  continua  selección de  las  células  resistentes  y que presentan el 

receptor de interés integrado en su genoma. 

IV.4 OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA PLASMÍDICO 

IV.4.1 TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli CON DNA PLASMÍDICO 

Se  preparan  las  células  competentes  según  el método  desarrollado  por  V.  Simanis 

(Sambrook et al., 1989) y se congelan a ‐80 °C. Las cepas de E.coli utilizadas fueron  XL‐Blue y 

Bl‐21  (estas  últimas  para  la  transformación  de  las  construcciones  fusionadas  a  GST).  Para 

realizar la transformación, se añaden 4 μg de DNA plasmídico a 100 μl de células competentes 

recién descongeladas en hielo y se mantienen en hielo 30 minutos. A continuación se someten 

a  un  choque  térmico  de  90  segundos  a  42  °C  seguidos  de  otros  90  segundos  en  hielo.  Se 

añaden 0,3 ml de medio LB (0,5 % extracto de levadura, 1% triptona, 1% NaCl) y se incuban 45 

minutos a 37 °C. Finalmente, las bacterias transformadas se extienden sobre placas de medio 

sólido LB selectivo [Ampicilina (20 μg/ml) o Kanamicina (10 μg/ml), según el plásmido]. 

IV.4.2 PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO 

El  DNA  plasmídico  se  prepara  mediante  el  sistema  comercial  de  purificación  de 

plásmidos  Nucleobond  AX  según  las  instrucciones  del  fabricante.  El  DNA  obtenido  se 

comprueba en geles de agarosa y se cuantifica midiendo su absorbancia a 260 nm. 

Métodos 

56 

 

De manera rutinaria,  la comprobación de  los nuevos plásmidos construidos se realizó 

en pequeños volúmenes siguiendo el método de  lisis alcalina de Sambrook  (Sambrook et al., 

1989). 

IV.5 TRANSFECCIÓN TRANSITORIA DE CÉLULAS EUCARIOTAS 

Para subcultivar las células, éstas se separan de las placas mediante tripsinización y se 

siembran a distintas diluciones. El número de  células  se determina mediante el uso de una 

cámara de Neubauer. Las células HEK293 se cultivan a una densidad de 3,5 x 105 células/pocillo 

en placas de 6 pocillos para alcanzar una confluencia del 60% a  las 24 horas y se transfectan 

utilizando  el  policatión  polietilenimina  (PEI)  siguiendo  las  instrucciones  del  fabricante.  Los 

complejos de transfección se preparan mezclando 2,5 μg de DNA con 4,25 μg de PEI pH 7,5 en 

200 μl de medio DMEM suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales.  

La mezcla  se deja de 15 a 30 minutos a  temperatura ambiente y posteriormente  se 

añade a  las células en 1 ml de DMEM suplementado con 1 % de aminoácidos no esenciales y 

10% (v/v) de FBSi (medio de transfección), incubándose de 10 a 12 horas a 37 °C, tras las cuales 

se retira  la mezcla de transfección y se añaden 2 ml de medio de transfección. Las células se 

incuban durante otras 12 horas para permitir la expresión de las proteínas transfectadas.  

En el caso de  la  transfección de células HEK293 en placas de 10 cm de diámetro,  se 

transfectan 8 μg de DNA con 8 μg de PEI pH 7,5 en 800 μl de medio DMEM suplementado con 

1% de aminoácidos no esenciales. Tras incubar entre 15 y 30 minutos a temperatura ambiente, 

se añade a las células en 4 ml de medio de transfección procediéndose igual que en el caso de 

placas  de  6  pocillo  y  reemplazándose  éste  a  las  10  o  12  horas  por  8  ml  de  medio  de 

transfección. 

IV.6 ANÁLISIS WESTERN‐BLOT  

IV.6.1 PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS CELULARES TOTALES 

Las  células  HEK293  se  recogen  de  las  placas  de  cultivo  mediante  resuspensión, 

mientras que las células L929 y RAW 264.7 se recogen mediante rascado. Las células se lavan 

con PBS y se resuspenden en buffer de lisis (20 mM Tris‐HCl pH 7,4, 250 mM NaCl, 1% Tritón X‐

100, 1 mM DTT, 1 mM ortovanadato sódico, 2 µg/ml aprotinina, 2 µg/ml leupeptina, 25 mM β‐

glicerolfosato). Se incuban durante 30 minutos en hielo y posteriormente se centrifugan a 4 °C 

Métodos 

57 

 

a 13.000 rpm durante 15 minutos. La cantidad total de proteína se determina según el método 

Bradford. A cantidades equivalentes de proteína de cada una de las muestras a analizar (20 µg 

en el caso de las células HEK293 y 100 µg en el caso de las células L929) se les añade tampón 

de  carga  Laemmli 1x  (62,5 mM Tris‐HCl pH 6,8, 2%  SDS, 10%  glicerol, 50 mM DTT, 2,5%  β‐

mercaptoetanol y 0,01% azul de bromofenol) y se hierven 5 minutos a 95°C. 

IV.6.2 ELECTROFORESIS Y ELECTROTRANSFERENCIA 

La  electroforesis  se  realizó  de  acuerdo  con  el  protocolo  propuesto  por  Laemmli 

(Laemmli, 1970). Los extractos celulares totales se separan en un gel de poliacrilamida al 10% 

en un tampón que contiene 24,8 mM Tris base, 190 mM glicina y 0,1% SDS.   

Las proteínas separadas tras la electroforesis se transfieren a membranas de PVDF en 

un  tampón  que  contiene  24,8 mM  Tris,  192 mM  glicina  y  20% metanol  (v/v)utilizando  un 

sistema de transferencia húmeda. La transferencia se realiza durante 1 hora a 100 V. 

IV.6.3 INCUBACIÓN CON LOS ANTICUERPOS 

Tras la electrotransferencia, las membranas se incuban 1 hora en agitación en TBS (20 

mM Tris‐HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) en el caso del análisis Western por  infrarrojos o en TBS‐T 

[TBS‐Tween 20 0,1% (v/v)] en el caso del análisis Western por quimioluminiscencia, con leche 

desnatada en polvo al 5% o BSA al 0,25% (p/v). Seguidamente, las membranas se incuban con 

el anticuerpo primario correspondiente diluido en TBS‐T, con o sin  leche desnatada en polvo al 

5% (p/v) o BSA al 5% (según las instrucciones del proveedor), durante toda la noche a 4 °C en 

agitación. 

Posteriormente,  se  realizan  tres  lavados  de  5 minutos  con  TBS‐T  y  se  procede  a  la 

incubación  con  el  anticuerpo  secundario.  Los  anticuerpos  secundarios  marcados  con 

peroxidasa (anti‐IgG de conejo o anti‐IgG de ratón) se utilizan en una dilución 1:10.000 en TBS‐

T  suplementado  con  leche en polvo al 5%  (p/v).  Los anticuerpos  secundarios marcados  con 

fluoróforos  (anti‐IgG  de  conejo  o  anti‐IgG  de  ratón)  se  diluyen  1:15.000    en  TBS‐T 

suplementado con  leche en polvo al 5% (p/v). En ambos casos,  las membranas se  incuban en 

agitación durante 1 hora  (incubación en oscuridad en el caso de  los anticuerpos secundarios 

marcados con fluoróforos). Tras 3 lavados iguales a los anteriores más un lavado adicional de 

15 minutos se procede a revelar o a escanear el análisis Western. 

Métodos 

58 

 

IV.6.4 ESCANEADO POR INFRARROJOS 

Las membranas  incubadas con  los anticuerpos secundarios marcados con  fluoróforos 

se  escanean  mediante  el  sistema    Odyssey®  Infrared  Imaging  System  de  detección  de 

infrarrojos. De esta manera,  la señal emitida por  los anticuerpos secundarios  (marcados con 

fluoróforos con longitudes de onda de emisión de 680 ó 800 nm) es captada por el detector y 

transmitida al  software que permite  la  captación  simultánea de  la  señal emitida por ambos 

anticuerpos, pudiéndose diferenciar la señal debida a cada uno de ellos (rojo ó verde para las 

emisiones de 680 y 800 nm respectivamente). 

IV.6.5 REVELADO Y REDETECCIÓN DE LAS MEMBRANAS (STRIPPING) 

Para revelar el análisis Western mediante quimioluminiscencia se utiliza el sistema ECL 

de  GE  Healthcare  que  se  basa  en  la  oxidación  enzimática  del  luminol  por  la  peroxidasa 

conjugada con el anticuerpo. 

Las membranas se bañan durante 1 minuto en una mezcla que contiene  luminol y se 

exponen a una película fotográfica Kodak X‐OMAT LS durante el tiempo necesario, realizando 

posteriormente  el  revelado  y  fijado  de  las  mismas  con  las  soluciones  Kodak  fixer  and 

developer. 

La  detección  quimioluminiscente  permite  que,  posteriormente  al  revelado  de  la 

membrana,  se  puedan  eliminar  los  anticuerpos  unidos  a  ella  mediante  una  técnica 

denominada stripping. De esta manera es posible un análisis posterior de la misma membrana 

con un anticuerpo primario diferente al inicial. Para realizar la redetección, las membranas se 

lavan abundantemente en TBS‐T, tras  lo cual se  incuban con el tampón de stripping  (60 mM 

Tris‐HCl   pH 6,7, 2% SDS    (p/v), 100 mM β‐Mercaptoetanol) en un baño a 55 °C en agitación 

durante 30 minutos. Tras  lavar de nuevo abundantemente en TBS‐T,  las membranas pueden 

ser de nuevo bloqueadas e incubadas con los anticuerpos de interés, procediendo de acuerdo 

al protocolo previamente descrito.

IV.7 ENSAYO DE UNIÓN IN VITRO (PULL DOWN) 

IV.7.1 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN A GST 

Para obtener  las proteínas de  fusión a GST del TNFR2 y de diversas deleciones de su 

región intracelular (ver apartado III.4), se transforman células competentes de la cepa de E.coli 

BL21 con el plásmido pGEX de interés. A partir de una colonia aislada, se crece un preinóculo 

Métodos 

59 

 

en 100 ml de medio LB con 2% glucosa. Este cultivo se  incuba durante 2 horas a 37  °C y se 

induce con 0,1 mM IPTG, incubándose a temperatura ambiente durante 4 horas en agitación. 

Se  recogen  las  células  en  alícuotas  de  10 ml  por  centrifugación  a  4.000  rpm  durante  10 

minutos. Cada alícuota se resuspende en 1 ml de tampón de lisis de E.coli (20 mM Tris pH 7,4, 

200 mM NaCl, 0,5% NP‐40,  10% glicerol,  1 mM DTT y una mezcla de inhibidores de proteasas 

o PIMIX). Se añade    lisozima 1%  (v/v) para  facilitar  la  lisis celular y se  incuba 30 minutos en 

hielo.  

A  continuación,  las  muestras  se  lisan  en  un  sonicador  (BRANSON  Digital  Sonifier) 

durante un  tiempo  total de 90 segundos, en pulsos de 10 segundos espaciados 10 segundos 

con una amplitud del 50% y con un  límite de temperatura de 35  °C. Seguidamente, el  lisado 

resultante  se  centrifuga  a  13.000  rpm  a  4  °C  durante  30 minutos  para  eliminar  el material 

particulado.  Al  sobrenadante  se  le  añaden  20  μl  de  una  matriz  de  Glutation‐Sepharose 

equilibrada en  tampón de  lisis de E.coli  y  se  incuba en  rotación  a 4  °C durante  al menos 2 

horas, centrifugándose posteriormente a 1.500 rpm durante 5 minutos. El precipitado se lava 2 

veces con 1 ml de  tampón de  lisis de E.coli y a continuación, otras dos veces con 500 μl de 

tampón de lavado (20 mM HEPES pH 7,4,  25 mM NaCl, 1 mM DTT).  

IV.7.2 ENSAYO DE UNIÓN IN VITRO  

Las células HEK293  son  inicialmente  transfectadas, en placas de 10 cm de diámetro, 

con el plásmido  codificante de  la proteína adaptadora TRAF de  interés. Se  recogen a  las 48 

horas y se centrifuga a 5.000 rpm durante 5 minutos. El pellet celular se resuspende en 1 ml de 

tampón de  lisis  (20 mM Tris‐HCl pH 7,4, 250 mM NaCl, 1% Tritón X‐100, 1 mM DTT, 1 mM 

ortovanadato  sódico,  2  µg/ml  aprotinina,  2  µg/ml  leupeptina,  25 mM  β‐glicerolfosato).  Se 

incuba  30 minutos  en  hielo  y  se  centrifuga  a  13.000  rpm  durante  15 minutos  a  4  °C.  El 

sobrenadante se incuba con 40 µl de proteína GST equilibrada en PBS durante 1 hora a 4 °C en 

agitación.  Posteriormente,  se  centrifuga  2  minutos  a  4  °C  a  5.000  rpm  y  se  recoge  el 

sobrenadante  guardándose  20  µl  para  la  comprobación  de  la  expresión  de  la  proteína 

adaptadora TRAF de interés. 

Para  la realización del ensayo de unión, a  las proteínas de  fusión a GST previamente 

purificadas  (apartado  IV.7.1)  se  les  añaden  los  extractos  lisados  de  células  HEK293    que 

sobreexpresan  la proteína  adaptadora de  interés.  Se dejan  las muestras  en  rotación  a  4  °C 

durante al menos 4 horas. Se  lava 4 veces con tampón de  lisis y 2 veces más con tampón de 

lavado (20 mM HEPES pH 7,4, 25 mM NaCl, 1 mM DTT). Tras el último lavado  se resuspenden 

Métodos 

60 

 

en  35  μl  de  tampón  de  carga  y  se  estudia mediante  análisis Western  la  expresión  de  las 

proteínas adaptadoras. 

IV.8 ENSAYO DE CO‐INMUNOPRECIPITACIÓN  

Las  células HEK293,  sembradas  en  placas  de  6  pocillos,  se  transfectan  con  1  μg  de 

pCMV1‐FLAG‐RANK‐TNFR2  ó  sus  variantes  y  0,5  µg  del  plásmido  codificante  de  la  proteína 

adaptadora TRAF de interés, empleándose el vector pCMV1‐FLAG como control.  

Después de 24 horas, las células se recogen y se incuban en 200 μl de tampón de lisis 

(20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM EDTA, 1 % Tritón X‐100, 1 μg/μl leupeptina, 

1 μg/μl aprotinina, 2 mM ortovanadato sódico) en hielo durante 15 minutos y se centrifugan 

30 minutos a 13.000 rpm a 4 °C. El sobrenadante recuperado se fracciona en dos alícuotas, una 

de  20  μl,    donde  se  comprueba  mediante  un  análisis Western  tanto  la  expresión  de  los 

receptores  como  de  las  proteínas  adaptadoras  correspondientes  a  cada  caso  (extractos 

totales),    y  otra  alícuota  de  160  μl.  Esta  alícuota  se  incuba  durante  1  hora  con  1  μg  del 

anticuerpo  anti‐FLAG,  para  inmunoprecipitar  el  receptor,  y  posteriormente  con  20  μl  de 

proteína G‐Sepharose durante toda  la noche a 4 °C en agitación. Al día siguiente, se realizan 

tres lavados con tampón de lisis y un lavado con tampón de baja concentración salina (20 mM 

Tris  pH 8, 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 μg/μl leupeptina, 1 μg/μl aprotinina, 2 mM ortovanadato 

sódico).  El  immunoprecipitado  se  resuspende  en  tampón  de  carga  Laemmli  1x  y  se  analiza 

mediante un análisis Western para detectar  la  interacción  con  las proteínas adaptadoras de 

interés. 

IV.9 ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE NF‐κB 

La  activación de NF‐κB  se determina mediante un  ensayo de medición de  actividad 

luciferasa.  Las  células  HEK293,  sembradas  en  placas  de  6  pocillos,  se  transfectan  con  el 

plásmido  que  codifica  el  receptor  de  interés,  en  las  cantidades  indicadas  para  cada 

experimento,  junto  con  0,2  µg  de  pHIV‐luc  (que  codifica  la  luciferasa  de  luciérnaga  bajo  el 

control de un promotor que contiene dos elementos de  respuesta a  κB), 0,05 µg de pRL‐TK 

(que  codifica  la  luciferasa  de  Renilla  expresada  de  manera  constitutiva),  manteniéndose 

siempre constantes las cantidades totales de DNA con el vector control pCMV1‐FLAG. 

Métodos 

61 

 

Para medir  ambas  luciferasas  se  utilizó  el  kit  comercial  Dual‐LuciferaseTM  Reporter 

Assay System según  las  instrucciones del fabricante. La bioluminiscencia se determinó con un 

luminómetro (Turner Designs TD 20/20, Sunnyvale). 

Ambas  luciferasas  tienen distintos sustratos,  lo que hace posible discriminar entre  la 

bioluminiscencia debida a  la  luciferasa de  luciérnaga  (debida a  la activación de NF‐κB) y a  la 

luciferasa de Renilla (plásmido control interno de la eficacia de la transfección). Los niveles de 

activación de NF‐κB registrados se normalizarán frente a la luciferasa de Renilla. En las gráficas 

de  activación  se  considera  como  la  unidad  la  activación  obtenida  en  la  situación  control 

(transfección  con  el  plásmido  pCMV1‐FLAG).  En  el  resto  de  condiciones,  los  datos  se 

representan como veces de activación sobre la situación control. 

IV.10 FOSFORILACIÓN DE c‐JUN 

Las  células HEK 293,  sembradas en placas de 6 pocillos,  se  transfectan  con 1 µg del 

plásmido HA‐JNK que codifica  la proteína quinasa  JNK marcada con el epítopo HA,  junto con 

los  plásmidos  de  expresión  de  interés  y  en  las  cantidades  indicadas  en  cada  caso, 

manteniéndose siempre constante la cantidad total de DNA transfectada con el vector control 

pCMV1‐FLAG. A las 36 horas, las células se recogen y se resuspenden en 200 µl de tampón de 

lisis (20 mM Tris‐HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Tritón X‐100, 2,5 mM pirofosfato 

sódico,  β‐glicerofosfato 1 mM, 1 mM ortovanadato  sódico, 1µg/ml  leupeptina, 1mM PMSF), 

incubándose en hielo durante 5 minutos,  tras  los cuales  se centrifugan a 4  °C a 13.000  rpm 

durante 15 minutos. Se cuantifica  la cantidad  total de proteína presente en cada uno de  los 

lisados  celulares  mediante  el  método  Bradford  y  cantidades  iguales  de  proteína  de  cada 

muestra se incuban durante 4 horas en agitación a 4 °C con 1 µg del anticuerpo anti‐HA, con el 

fin de inmunoprecipitar la proteína JNK. Los inmunocomplejos formados se incuban con 20 µl 

de proteína G unida a una matriz de Sepharose, durante  toda  la noche en agitación a 4  °C. 

Posteriormente, se centrifugan 2 minutos a 4 °C a 5.000 rpm y se  lavan  las muestras 2 veces 

con  tampón  de  lisis  y  otras  dos  con  tampón  quinasa  (25 mM  Tris‐HCl    pH  7,5,  5 mM  β‐

glicerofosfato, 2 mM DTT, 0,1 mM ortovanadato sódico, 10 mM MgCl2).  

A  continuación,  se  resuspenden  las  muestras  en  40  µl  de  tampón  quinasa 

suplementado con 200 µM ATP y 1 µg de GST‐c‐Jun. La reacción se incuba a 30 °C durante 30 

minutos y se detiene con la adición de 40 µl de tampón de carga Laemmli 3x. Las muestras se 

analizan mediante un análisis Western utilizando el anticuerpo primario anti‐c‐jun‐fosforilado 

(Serina 73). 

Métodos 

62 

 

IV.11 CUANTIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN CELULAR HIPODIPLOIDE 

Como  consecuencia  del  proceso  apoptótico,  se  digiere  el  DNA,  lo  que  supone  la 

aparición  de  una  población  celular  con  menos  DNA  que  las  células  diploides  normales, 

denominada población hipodiploide  (sub G0/G1). Mediante el análisis del  contenido de DNA 

celular teñido con yoduro de propidio (IP) en un citómetro de flujo se puede cuantificar esta 

población. 

Las  células HEK293  se  transfectan  con 0,2 µg del plásmido pEGFP‐F, que permite  la 

selección de  las  células  transfectadas,  junto  con  los  receptores de  interés en  las  cantidades 

indicadas  en  cada  caso,  manteniéndose  siempre  constante  la  cantidad  total  de  DNA 

transfectado  con  el  vector  control  pCMV1‐FLAG.  Las  células  se  recogen  a  las  36  horas,  se 

centrifugan  a  1.200  rpm  durante  5  minutos  y  se  lavan  dos  veces  con  1  ml  de  PBS.  A 

continuación  se  resuspenden  en  1  ml  de  etanol  al  70%  a  ‐20  °C  añadido  gota  a  gota, 

manteniéndose  las muestras  toda  la noche  a  ‐20  °C  con  el  fin de permeabilizar  las  células. 

Seguidamente, las células se lavan dos veces con 1 ml PBS y se resuspenden en 400 µl de PBS 

con 5 µg/ml de  IP y 100 µg/ml de RNAsa. Las muestras se dejan 15 minutos en oscuridad a 

temperatura ambiente. 

La señal del IP se analiza en un citómetro de flujo (Cytomics FC500, Beckman Coulter) y 

se cuantifica la población sub G0/G1 utilizando el programa informático WinMDI 2.9 

Seleccionando  únicamente  aquéllas  células  que  son  positivas  para  la  fluorescencia 

emitida por el marcador EGFP‐F  (células  transfectadas),  se asume que  las células que hayan 

adquirido el plásmido codificante de esta proteína también habrán incorporado el plásmido de 

interés.  

IV.12 INMUNOCITOQUÍMICA 

Las células HEK293 se siembras en placas de 6 pocillos con cubres polilisinizados. Tras 

24  horas  las  células  se  transfectan,  tal  y  como  se  describe  en  el  apartado  IV.5,  con  los 

plásmidos indicados en cada caso. Treinta y seis horas después de la transfección, se lavan las 

células  con  PBS  y  se  fijan  durante  25 minutos  con  4%  paraformaldehído  en  PBS.  Tras  dos 

lavados con PBS, las células se incuban durante 10 minutos con NH4Cl y 10 minutos con glicina 

para  reducir  la autofluorescencia. Las células  se permeabilizan durante 5 minutos con 0,1 % 

Tritón X‐100 en PBS.  En el caso de las células L929 se procede de igual manera excepto en el 

paso de la permabilización. 

Métodos 

63 

 

Posteriormente, se bloquean  las células durante una hora con PBS suplementado con 

2,5 % de suero de caballo (y con 1% Triton X‐100 en el caso de las células L929, permitiendo su 

permeabilización). A continuación,  los cubres se pasan a portas en una cámara húmeda y se 

incuban con el anticuerpo primario correspondiente (anti‐FLAG ó anti‐TNFR1) en una dilución 

1:100 en medio de bloqueo. Posteriormente, se incuba durante otra hora en oscuridad con el 

anticuerpo secundario específico (Alexa633‐anti‐mouse) en una dilución 1:1.000 (en el caso de 

las  células HEK293) o  1:100  (en  el  caso de  las  células  L929)  en medio de  bloqueo.  Tras un 

nuevo lavado con PBS, se incuba durante 5 minutos con el colorante DAPI (agente intercalante 

de unión al DNA), para teñir los núcleos. Los cubres se lavan con agua antes de montarlos en 

portas con medio de montaje. 

IV.13 ESTUDIOS DE LOCALIZACIÓN EN SUPERFICIE 

Para  el  estudio  de  la  localización  en  superficie  de  los  receptores marcados  con  el 

epítopo FLAG, las células HEK293 se transfectan con 1 µg de los receptores indicados en cada 

caso.  Treinta  y  seis  horas  después  las  células  se  recogen  y  lavan  dos  veces  con  PBS  para 

posteriormente  bloquearse  durante  1  hora  con  100  µl  del  anticuerpo  anti  IgG  de  ratón 

(dilución 1:100) en 0,5% BSA en PBS. De esta manera se bloquean  las posibles  interacciones 

inespecíficas  que  pudiera  reconocer  posteriormente  el  anticuerpo  secundario marcado  con 

fluoróforo. A continuación, las células se lavan dos veces con PBS y se incuban durante 1 hora 

con 100 µl del anticuerpo anti‐FLAG (dilución 1:100) en 0,5% de BSA en PBS. Posteriormente, 

las células se  lavan dos veces con PBS y se  incuban en 100 µl de anticuerpo secundario Alexa 

Fluor® 633 goat anti‐mouse IgG (H+L) (dilución 1:1000) en 0,5% BSA en PBS durante 1 hora en 

oscuridad. Finalmente, las células se lavan dos veces con PBS y se determina el porcentaje de 

células positivas mediante citometría de flujo. 

En el  caso de  las  líneas  celulares  L929 que expresan de manera estable  los diversos 

receptores quiméricos RANK‐TNFR2, se procede de igual manera que en el caso de las células 

HEK293 previamente descritas. 

En  todos  los  casos,  las  células  se  analizaron mediante  citometría de  flujo  (Cytomics 

FC500, Beckman Coulter). Los datos obtenidos se analizaron mediante el programa informático 

WinMDI 2.9. 

Métodos 

64 

 

IV.14 TRATAMIENTOS CON CITOQUINAS 

IV.14.1 ESTUDIO DE LA VIABILIDAD CELULAR  

Las células L929 se siembran en placas de 12 pocillos y al alcanzar una confluencia del 

80%, se tratan con 5 ng/ml de RANKL (ligando de RANK, proporcionado por Bryant G. Darnay, 

MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas), con 5 ng/ml de TNF murino (TNFm, producido 

en el laboratorio) ó con ambas citoquinas durante los tiempos indicados en casa caso.  

Las células se lavan con 1 ml de PBS y se fijan con 500 μl de una solución de fijado que 

contiene 30% etanol   y 20% ácido acético durante 15 minutos. Posteriormente, se  tiñen con 

una disolución al 0,4% de cristal violeta en 20% etanol durante 15 minutos. Cada pocillo se lava 

con 1 ml H2O y se deja secar toda la noche. Posteriormente, las placas se destiñen durante 20 

minutos en agitación con 500 µl de una solución de desteñido que contiene 40% etanol y 10% 

ácido  acético.  Para  cuantificar  la  intensidad  del  colorante  en  cada  condición,  se  mide  la 

absorbancia  de  cada  muestra  a  580  nm  pudiéndose  así  determinar  el  efecto  de  cada 

tratamiento sobre la viabilidad de las células. 

El  cristal  violeta  tiene  la  propiedad  de  unirse  al  DNA,  de  esta  manera,  en  unas 

condiciones en las que los tratamientos induzcan muerte celular la tinción menos intensa.  

IV.14.2 ESTUDIO DE LOS NIVELES DE MUERTE CELULAR 

Las células L929 se siembran en placas de 6 pocillos y cuando alcanzan una confluencia 

del 80% se tratan con 5 ng/ml de RANKL, con 5 ng/ml TNFm ó con ambas citoquinas durante 

los tiempos indicados en cada caso. Las células se recogen y se lavan 2 veces con PBS. Para la 

determinación del porcentaje de células apoptóticas, se empleó el kit AnnexinV PE Apoptosis 

detection Kit  I,  siguiéndose  las  instrucciones del  fabricante. Posteriormente  se determina  el 

porcentaje de células positivas para Anexina V y para 7ADD mediante un citómetro de  flujo 

(Cytomics FC500, Beckman Coulter), analizándose los datos mediante el programa informático 

WinMDI 2.9. 

La  Anexina  V  reconoce  los  lípidos  de  fosfatidilserina,  los  cuales  en  una membrana 

intacta  se  encuentran  orientados  hacia  el  interior  celular.  Por  el  contrario,  éstos  quedan 

expuestos durante un proceso de apoptosis, pudiendo ser  reconocidos por  la Anexina V. De 

esta  manera,  la  Anexina  V  sirve  de  indicador  de  apoptosis  en  combinación  con  otros 

marcadores  como  el  7‐AAD  (del  inglés  7‐Amino‐ActinomycinD).  El  7‐AAD  es  un  compuesto 

químico  fluoróforo capaz de  interaccionar con el DNA que, al no ser permeable, únicamente 

Métodos 

65 

 

interacciona  con  el  DNA  cuando  las membranas  celulares  se  hayan  fragmentadas.  De  esta 

manera, en combinación con  la anexinaV sirve como  indicador de  los procesos de apoptosis 

tardía.  Por  el  contrario,  el marcaje  celular  único  con  7‐ADD  actúa  como  indicador  de  un 

proceso de necrosis celular. 

IV.15 ANÁLISIS DEL PERFIL DE FOSFORILACIÓN 

La  secuencia  aminoacídica  del  TNFR2  fue  analizada  con  el  programa  de  algoritmos 

NetPhos  (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)  (Blom  et  al,  1999)  que  produce 

prediciones sobre posibles sitios de fosforilación de serinas, treoninas y tirosinas presentes en 

proteínas eucariotas. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RESULTADOS

        Resultados 

67 

 

V. RESULTADOS 

V.1 PAPEL DE LAS PROTEÍNAS ADAPTADORAS TRAF EN LA SEÑALIZACIÓN 

DEL TNFR2 

Como  ya  se ha mencionado,  los  receptores de  la  superfamilia TNFR  se  caracterizan por 

carecer de actividad catalítica y depender de  la  interacción con proteínas  intermediarias para 

poder desencadenar diversas vías de señalización. 

El  TNFR2,  que  carece  de DD  en  su  región  intracelular,  requiere  la  unión  con  proteínas 

adaptadoras  TRAF  para  iniciar  su  señalización.  En  concreto,  la  mayor  parte  de  la  acción 

biológica del TNFR2 depende de su unión con TRAF2 (Rothe et al, 1995b), si bien tanto TRAF1 

como  TRAF3  pueden  influir  en  la  señalización  del  receptor,  aunque  los  datos  bibliográficos 

existentes  al  respecto  son  escasos  y,  en  ocasiones,  contradictorios  (Arron  et  al,  2002; 

Carpentier & Beyaert, 1999). 

Por ello, nos planteamos  inicialmente el estudio de  la unión de diversas proteínas TRAF 

con el TNFR2 y analizar el efecto funcional de las mismas. 

V.1.1 ANÁLISIS DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF CON EL TNFR2 

V.1.1.1 ESTUDIO IN VITRO DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF CON EL TNFR2 

Como  primer  paso  para  el  estudio  de  la  unión  de  las  proteínas  TRAF  con  el  TNFR2 

realizamos  ensayos  de  unión  vitro  ó  “pull  down”  de  la  proteína  de  fusión GST‐TNFR2,  que 

contiene la región intracelular del receptor, con extractos  de células HEK293 transfectadas con 

los plásmidos codificantes de distintas proteínas TRAF.  

Como  control  positivo  de  los  ensayos,  analizamos  una  proteína  de  fusión  GST‐RANK 

(región intracelular de RANK fusionada a la proteína GST), puesto que se ha descrito que RANK 

es capaz de unir todas las proteínas de la familia TRAF, a excepción de TRAF4 y TRAF7 (Darnay 

et al, 1998). Como control negativo, analizamos  la proteína GST.   El resultado del ensayo de 

unión se analizó mediante un análisis Western. 

Como  se  observa  en  la  Figura  V‐1,  GST‐RANK  se  une  con  todas  las  proteínas  TRAF 

analizadas,  mientras que GST‐TNFR2 se une únicamente con TRAF1, TRAF2 y TRAF3. 

 

Resultados 

68 

 

 

Figura  V‐1:  Análisis  de  la  unión  in  vitro  del  TNFR2  con  distintas  proteínas  TRAF.  A)  Representación esquemática de las distintas proteínas GST analizadas. En la proteína GST‐TNFR2 se muestran los sitios de unión de TRAF2 (SKEE y KPL respectivamente) presentes en el receptor, así como el Módulo III, implicado en la señalización del receptor. B) Análisis  de la unión in vitro con distintas proteínas TRAF. Las células HEK293 se transfectaron con 4 µg del plásmido codificante de la proteína TRAF de interés marcada con el epítopo FLAG (TRAF1, TRAF2, TRAF3 y TRAF6) ó c‐myc  (TRAF5). Tras 36 horas,  las células se recogieron,se    lisaron y  los extractos celulares se  incubaron con  las  proteínas  de  fusión  GST  previamente  purificadas  y  unidas  a  una  matriz  de  Glutation‐Sepharose.  Los complejos  resultantes  se  analizaron  mediante  análisis  Western  con  los  anticuerpos  anti‐FLAG  ó  anti‐c‐myc.  También se comprobó mediante análisis Western la expresión de las proteínas TRAF (indicado como “Extracto”).  

 Los primeros estudios funcionales del TNFR2 pusieron de manifiesto la unión del receptor 

con las proteínas TRAF por medio de sus aminoácidos 402‐SKEE‐405 (secuencia conocida como 

sitio clásico de unión de las proteínas TRAF con el TNFR2). Posteriormente, se ha identificado 

un nuevo sitio de unión  de TRAF2 con el TNFR2 (Grech et al, 2005; Rodriguez et al, 2011). En 

nuestro  laboratorio, se ha demostrado que  los últimos 15 residuos del extremo carboxilo del 

receptor (y en particular  los residuos 425 KPL 427) se encuentran  implicados en  la unión con  

TRAF2. 

Puesto  que  la  proteína  de  fusión GST‐TNFR2  analizada  en  la  Figura V‐1presenta  ambos 

sitios  de  unión  con  TRAF2  e  interacciona  con  TRAF1,  TRAF2  y  TRAF3,  nos  propusimos 

identificar la región del receptor por la que se produce su unión con dichas proteínas TRAF.  

Para  ello,  realizamos  nuevos  ensayos  de  unión  in  vitro  de  TRAF1,  TRAF2  y  TRAF3  con 

proteínas GST‐TNFR2  que  presentan  ambos  (GST‐TNFR2),  uno  (GST‐TNFR2‐Δ386‐414  y GST‐

TNFR2‐Δ424) o ninguno (GST‐TNFR2‐Δ379 y GST‐TNFR2‐Δ343) de los 2 sitios descritos de unión 

266

439SKEE KPLGST‐TNFR2

241 616GST‐RANK

GST

A

BPull‐down TRAF1 

Extracto  GST     GST‐RANK 

GST‐TNFR2

Pull‐down TRAF2

Pull‐down TRAF3 

Pull‐down TRAF5

Pull‐down TRAF6 

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

III

        Resultados 

69 

 

con TRAF2. En la Figura V‐2 se muestran los resultados obtenidos, que demuestran que TRAF2 

interacciona con el TNFR2 a través de los dos sitios mientras que TRAF1 y TRAF3 interaccionan 

únicamente con el sitio clásico.  

 

Figura V‐2: Análisis de unión  in  vitro de TRAF1, TRAF2  y TRAF3  con distintas  regiones del TNFR2. A) Representación  esquemática  de  las  proteínas  de  fusión GST‐TNFR2  analizadas.  La  representación  de  la  región intracelular de los receptores es como en la Figura III‐1. Se analizaron proteínas de fusión con distintas deleciones de  la región  intracelular del TNFR2. Entre ellas se  incluyen deleciones carentes del primer sitio de unión a TRAF2 (GST‐TNFR2‐Δ386‐414) ó del segundo sitio de unión a TRAF2 (GST‐TNFR2‐Δ424) así como carentes de ambos sitios (GST‐TNFR2‐Δ379 y GST‐TNFR2‐Δ343). El sitio clásico de unión a TRAF se representa como SKEE y el segundo como KPL. B) Resultado del análisis de unión. Las células HEK293 se transfectaron con 4 µg del plásmido codificante de la proteína  TRAF  de  interés marcada  con  el  epítopo  FLAG.  Tras  36  horas,  las  células  se  recogieron  y  lisaron  y  los extractos se incubaron con las proteínas de fusión GST previamente purificadas y unidas a una matriz de Glutation‐Sepharose.  Los  complejos  resultantes  se  sometieron  a  un  análisis Western  (anti‐FLAG).  También  se  comprobó mediante análisis Western la expresión de las proteínas TRAF (indicado como “Extracto”).  

V.1.1.2 ESTUDIO IN VIVO DE LA UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF CON EL TNFR2 

Paralelamente al estudio de la unión in vitro entre las proteínas de fusión GST‐TNFR2 y las 

proteínas TRAF, realizamos estudios de unión in vivo de las mismas con receptores TNFR2 que 

presentan en  su  región  intracelular  las mismas deleciones que  las analizadas en el apartado 

anterior. Para ello, las células HEK293 se transfectaron con los plásmidos codificantes de cada 

uno  de  los  receptores  así  como  con  el  plásmido  codificante  de  la  proteína  adaptadora  de 

interés. Tras 24 horas,  las células se recogieron y se realizaron    inmunoprecipitaciones de  los 

266

439SKEE KPLGST‐TNFR2

GST

378GST‐TNFR2‐Δ379

266

423SKEEGST‐TNFR2‐Δ424

266

342GST‐TNFR2‐Δ343

266

266

439KPLGST‐TNFR2‐Δ386‐414

387 415

A

B

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

Pull‐down TRAF1 

Pull‐down TRAF2 

Pull‐down TRAF3 

III

III

III

III

Resultados 

70 

 

receptores  con  el  anticuerpo  anti‐FLAG.  Los  inmunoprecipitados  se  sometieron  a  análisis 

Western para identificar las distintas proteínas TRAF presentes. 

 

Figura V‐3:  Estudio de  la unión  in  vivo del  TNFR2  y diversas deleciones de  su  región  intracelular  con  las proteínas TRAF1, TRAF2 y TRAF3. A) Representación esquemática de los receptores analizados. Se representan los distintos receptores como se detalla en  la Figura III‐1. Los receptores analizados carecen del primer (TNFR2‐Δ386‐414), del segundo (TNFR2‐Δ424) o bien de ambos (TNFR2‐Δ379 y TNFR2‐Δ343) sitios de unión a TRAF2.  B) C) y D) Análisis de  la  interacción  in vivo. Las células HEK293 se  transfectaron con 1 µg de  los plásmidos codificantes de cada uno de los receptores indicados, así como  pCMV1‐FLAG como control, y con 0,5 µg de pTRAF1 (B), pTRAF2 (C) ó pTRAF3 (D). Tras 24 horas, las células se recogieron y se lisaron, llevándose a cabo una inmunoprecipitación con el anticuerpo anti‐FLAG seguida de un análisis Western con el anticuerpo específico de cada proteína TRAF (paneles superiores). Se muestra también  la expresión de  los diversos receptores analizados (paneles  intermedios) y de  las proteínas TRAF (paneles inferiores). 

Los  resultados confirman  los obtenidos  in vitro    (ver Figura V‐2), pero además muestran 

que, al contrario de  lo observado en el análisis    in vitro, TRAF1 y TRAF3   se unen al receptor  

TNFR2-Δ386‐414, en el que el sitio clásico de unión con TRAF2 se encuentra delecionado.  

TNFR2

TNFR2ec (1‐266)  TNFR2ic (267‐439)

266439SKEE KPL

TNFR2‐Δ379266

378

TNFR2‐Δ386‐414266

439KPL385 415

TNFR2‐Δ424266

423SKEE

266342TNFR2‐Δ343

A

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF1

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF2

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF3

WB anti‐TRAF3

WB antiTRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB antiTRAF1

B

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

82,5 KDa

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

82,5 KDa

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

82,5 KDa

C

D

64,2 KDa

64,2 KDa

TNFR2 TNFR2‐Δ379

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ343Control

64,2 KDa

TNFR2 TNFR2‐Δ379

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ343

TNFR2 TNFR2‐Δ379

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ343Control

CoIPTRAF1 CoIPTRAF2

CoIPTRAF3

Control

III

III

III

III

Receptor(WB anti‐FLAG)

Receptor(WB anti‐FLAG)

        Resultados 

71 

 

 

Figura  V‐4:  Análisis  de  la  unión  de  las  proteínas  TRAF1,  TRAF2  y  TRAF3  con  TNFR2,  TNFR2‐SKAA  Y TNFR2‐BKO. A) Representación esquemática de los receptores TNFR2 analizados. La representación es como en la Figura  III‐1. Los sitios de unión con TRAF2 aparecen en gris cuando se corresponden con  las secuencias originales (402‐SKEE‐405 y 425‐KPL‐427) y en negro cuando han sido mutados (402‐SKAA‐405 y 425‐AAA‐427). B) Análisis de la unión con las proteínas TRAF. Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de los plásmidos codificantes de los receptores ó con pCMV1‐FLAG, como control, así como con 0,5 µg de los plásmidos codificantes de TRAF1, TRAF2 ó TRAF3. Tras 24 horas,  las células se recogieron y  lisaron,  llevándose a cabo una  inmunoprecipitación del receptor con el anticuerpo anti‐FLAG seguida de un análisis Western de los inmunoprecipitados con el anticuerpo específico de  cada  proteína  TRAF  (paneles  superiores).  También  se  analizó  la  expresión  de  los  receptores  (paneles intermedios) y de las proteínas TRAF (paneles inferiores). 

El análisis funcional de la región intracelular del TNFR2 puso de manifiesto que la mutación 

de  los residuos aminoacídicos 425‐KPL‐427 a 425‐AAA‐427, así como de 402‐SKEE‐405 a 402‐

SKAA‐405  (sitio clásico de unión de TRAF2) bloquea por completo  la unión del  receptor con 

TRAF2    (Rodriguez et al, 2011).   Para comprobar si  la mutación de estos aminoácidos afecta 

también  la unión  con TRAF1  y TRAF3,  las  células HEK293  fueron  transfectadas  con pTNFR2, 

pTNFR2‐SKAA  (sitio clásico de unión de TRAF mutado) ó pTNFR2‐BKO  (ambos sitios de unión 

de TRAF mutados y denominado BKO del  inglés, Binding Knock‐Out), así  como  con pTRAF1, 

pTRAF2  ó  pTRAF3.  Tras  24  horas  se  llevó  a  cabo  la  inmunoprecipitación  del  receptor  y  un 

posterior análisis Western  de los inmunoprecipitados para  detectar  las proteínas TRAF.  

Como se observa en la Figura V‐4, la mutación de los residuos del receptor 402‐SKEE‐405 a 

402‐SKAA‐405  (TNFR2‐SKAA) no  inhibe  la unión del  receptor con TRAF1, TRAF2 ó TRAF3    (si 

A

TNFR2‐BKO

266

439SKAA AAA

TNFR2266

439SKEE KPL

TNFR2ec (1‐266) TNFR2ic (267‐439)

TNFR2‐SKAA

266

439SKAA KPL

B

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF1

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF2

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF3

WB anti‐TRAF1

Receptor(WB anti‐FLAG )

WB anti‐TRAF2

WB anti‐TRAF3

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

TNFR2‐BKO

TNFR2‐SKAA

TNFR2Control TNFR2‐BKO

TNFR2‐SKAA

TNFR2Control

TNFR2‐BKO

TNFR2‐SKAA

TNFR2Control

CoIPTRAF1 CoIPTRAF2

CoIPTRAF3

III

III

III

Receptor(WB anti‐FLAG )

Receptor(WB anti‐FLAG )

Resultados 

72 

 

bien  la  intensidad de  la  señal es menor que en el caso del  receptor completo). Únicamente 

cuando se encuentran también mutados los aminoácidos 425‐KPL‐427 a 425‐AAA‐427 (TNFR2‐

BKO) se consigue inhibir por completo la unión del receptor con las proteínas TRAF.  

V.1.2 EFECTO DE LAS PROTEÍNAS TRAF EN LA SEÑALIZACIÓN DEL TNFR2 

Una vez demostrada la unión de diversas proteínas TRAF con el TNFR2 nos planteamos el 

estudio del efecto que dichas proteínas TRAF ejercen sobre la señalización desencadenada por 

el TNFR2. Concretamente, hemos estudiado  la capacidad del receptor para activar a NF‐кB y a 

JNK en presencia de TRAF1, TRAF2 ó TRAF3. 

V.1.2.1 ACTIVACIÓN DE NF‐κB  

Para  estudiar  el  efecto  de  las  proteínas  TRAF  en  la  activación  de NF‐кB  nos  centramos 

inicialmente en el efecto que  la expresión de TRAF1, TRAF2 y TRAF3 tiene sobre  la capacidad 

del TNFR2 de activar a   NF‐кB. Posteriormente, analizamos el efecto de cada proteína TRAF 

sobre la capacidad de activación de NF‐кB por distintas regiones del receptor.  

Para  analizar  el  efecto  de  las  proteínas  TRAF  en  la  activación  de NF‐κB  por  TNFR2,  las 

células  HEK293  se  transfectaron  con  pTNFR2  ó  con  pTNFR1  (como  control  positivo  de  la 

activación de NF‐κB) y con  los plásmidos codificantes de cada una de  las proteínas TRAF, así 

como con pNF‐кB‐luc, que codifica  la  luciferasa de  luciérnaga bajo el control de promotores 

con elementos кB y con pRL‐TK, que codifica la luciferasa de Renilla, de expresión  constitutiva 

y que actúa, por tanto, como control de la eficacia de la transfección, midiéndose la actividad 

luciferasa de los extractos celulares. En el caso de la expresión del TNFR1, las células también 

se transfectaron con pCRMA que codifica la proteína  CrmA inhibidora de la apoptosis.   

En la Figura V‐5 se observa que la expresión de TRAF1  y TRAF3 ejerce un efecto inhibitorio 

sobre  la capacidad de activación de NF‐кB por el TNFR2,   y que únicamente TRAF1 afecta de 

manera negativa a la actividad del TNFR1.  Por el contrario, la expresión de TRAF2  induce un 

incremento en  la activación de NF‐кB por TNFR2, sin que afecte a  la actividad del TNFR1. La 

mera sobreexpresión  de TRAF2 en ausencia del receptor supone una cierta activación de NF‐

кB, sin que TRAF1 y TRAF3 por sí mismos ejerzan algún tipo de efecto en la actividad del factor 

de transcripción. 

Por otro lado, se observa que al expresarse TNFR2 los niveles intracelulares de TRAF2, son 

menores  que  en  la  condición  control,  debido  a  la  degradación  de  TRAF2  inducida  por  el 

receptor.  

        Resultados 

73 

 

 

Figura V‐5: Efecto de  la expresión de proteínas TRAF en  la activación de NF‐кB por el TNFR1 y el TNFR2. A) Efecto sobre  la señalización del TNFR1. Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de pTNFR1 ó pCMV1‐FLAG, como control, así como con 0,5 µg de  los plásmidos codificantes de TRAF1, TRAF2 ó TRAF3  junto con 0,05 µg de pRL‐TK y 0,4 µg de pNF‐кB‐luc. A las 36 horas las células se recogieron, se lisaron y se determinó la actividad NF‐кB en  los  extractos  como  se  describe  en Métodos. B)  Efecto  sobre  la  señalización  del  TNFR2.  Las  células HEK293 fueron transfectadas con 0,5 µg de pTNFR2 ó pCMV1‐FLAG, procediéndose de igual manera que en (A). En ambos casos se comprobó mediante análisis Western  la expresión de  los receptores y de cada una de las proteínas TRAF expresadas, así como los controles de carga de la electroforesis.  

A continuación, procedimos a estudiar el efecto de  las distintas proteínas TRAF sobre    la 

activación de NF‐кB  dirigida por distintas regiones del TNFR2. Para ello, las células HEK293 se 

transfectaron con plásmidos codificantes de   receptores con distintas deleciones de  la región 

intracelular del receptor, incluyendo receptores carentes de uno de los dos sitios de unión con 

TRAF2 (TNFR2‐Δ386‐414 ó TNFR2‐Δ424) ó de ambos (TNFR2‐Δ379 ó TNFR2‐Δ343), así como de 

las proteínas TRAF y delos plásmidos de expresión de luciferasa. 

Como se observa en la Figura V‐6, los receptores TNFR2‐Δ386‐414 y TNFR2‐Δ424, carentes 

del primer y segundo sitio de unión con  las proteínas TRAF respectivamente, son capaces de 

activar a NF‐кB aunque con menos  intensidad que el receptor completo. Por el contrario,  los 

receptores  TNFR2‐Δ379  y  TNFR2‐Δ343,  carentes  de  ambos  sitios  de  unión  con  TRAF,  son 

incapaces de activar a dicho factor de transcripción. Al igual que lo observado en la Figura V‐5 , 

la expresión de TRAF1 produce un efecto inhibitorio sobre la activación de NF‐кB por el TNFR2. 

Este efecto se mantiene en el caso de los receptores TNFR2‐Δ386‐414 y TNFR2‐Δ424, carentes 

del primer y segundo sitio de unión con TRAF2  respectivamente  (Figura V‐6‐B). De  la misma 

manera,  la expresión de TRAF2 potencia la activación de NF‐кB por el TNFR2, así como por los 

receptores  truncados  TNFR2‐Δ386‐414  y  TNFR2‐Δ424.  (Figura  V‐6‐C).  Además,  se  observa 

Veces d

e activación

A

Control TNFR1

‐ TRAF1 TRAF2 TRAF3 ‐ TRAF1 TRAF2 TRAF3

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

WB anti‐TRAF1

WB anti‐βactina

WB anti‐TRAF3

WB anti‐TRAF2

WB anti‐TNFR164,2 KDa

B

Veces d

e activación

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

WB anti‐TRAF1

WB anti‐βactina

WB anti‐TRAF3

WB anti‐TRAF2

ReceptorWB anti‐FLAG 

Control TNFR2

‐ TRAF1 TRAF2 TRAF3 ‐ TRAF1 TRAF2 TRAF3

14

12

10

8

6

4

2

0

7

6

5

4

3

2

1

0

Control TNFR1 Control TNFR2

NF‐κB

NF‐κB + TRAF1

NF‐κB + TRAF2

NF‐κB + TRAF3

NF‐κB

NF‐κB + TRAF3

NF‐κB + TRAF2

NF‐κB + TRAF1

Resultados 

74 

 

como los niveles intracelulares de TRAF2 son inferiores en el caso de aquellos receptores que 

son capaces de inducir su degradación (receptores que incluyen el módulo 343‐378).  

 

Figura  V‐6:  Efecto  de  las  proteínas  TRAF  en  la  activación  de NF‐кB  por  distintas  regiones  del  TNFR2. A) Representación esquemática de  las deleciones de  la región  intracelular del TNFR2 analizadas. La representación de  los receptores es como en  la Figura III‐1. Efecto de  la expresión de TRAF1 (B), TRAF2 (C) y TRAF3 (D) sobre la capacidad del TNFR2 y sus deleciones de activar a NF‐кB. Las células HEK293 se  transfectaron con 0,5 µg de  los plásmidos codificantes de cada uno de  los receptores representados en (A), ó con pCMV1‐FLAG como control, así como con 0,5 µg de pTRAF1, pTRAF2 ó pTRAF3 junto con 0,05 µg de pRL‐TK y 0,4 µg de pNF‐кB‐luc. A las 36 horas las células se recogieron, se lisaron y se determinó la actividad NF‐кB en los extractos celulares como se describe en Métodos.  Se muestra  la   expresión de  cada uno de  los  receptores  (paneles  superiores)  y de  las proteínas  TRAF (paneles inferiores). 

TNFR2

TNFR2ec (1‐266)  TNFR2ic (267‐439)

266439SKEE KPL

TNFR2‐Δ378266

378

TNFR2‐ Δ386‐414266

439KPL385 415

TNFR2‐Δ424266

423SKEE

266342TNFR2‐Δ343

A

B

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

NF‐кB

NF‐кB + TRAF1

48,8 KDa

64,2 KDa Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐TRAF1/anti‐TRAF2

64,2 KDa

C

NF‐кB

NF‐кB + TRAF2

D

TNFR2 TNFR2‐Δ378

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ343Control

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

NF‐кB

NF‐кB + TRAF3

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

WB anti‐TRAF364,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa ReceptorWB anti‐FLAG

TNFR2 TNFR2‐Δ378

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ343Control

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

7

6

5

4

3

2

1

0

TNFR2 TNFR2‐Δ378

TNFR2‐Δ386‐414

TNFR2‐Δ424

TNFR2‐Δ343Control

48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

Activación NF‐кB

Veces d

e activación

III

III

III

III

        Resultados 

75 

 

Finalmente, si bien  la expresión de TRAF3 ejerce un efecto  inhibitorio sobre  la activación 

de NF‐кB por el  TNFR2 y por TNFR2‐Δ424,  este efecto no se observa en el caso del receptor 

TNFR2‐Δ386‐414 (carente del primer sitio de unión de  las proteínas TRAF), llegándose  incluso 

a apreciar un ligero incremento en la activación de  NF‐кB (Figura V‐6‐D).  

V.1.2.2 ACTIVACIÓN DE  c‐JUN QUINASA (JNK) 

Para estudiar el efecto de la expresión de las proteínas TRAF en la capacidad del TNFR2 de 

activar a JNK,  las células HEK293 se transfectaron con pTNFR2, así como con el plásmido HA‐

JNK, que codifica la proteína JNK marcada con el epítopo HA, y con los plásmidos codificantes 

de cada una de las proteínas TRAF.  Tras su expresión, se inmunoprecipitó la proteína JNK con 

el anticuerpo anti‐HA y posteriormente se ensayó la actividad quinasa del inmunoprecipitado, 

determinando la  fosforilación de c‐Jun.  

 Figura V‐7: Efecto de  las proteínas TRAF sobre  la activación de  JNK por   TNFR2. Las células HEK293 se 

transfectaron con 1 μg de pTNFR2, ó pCMV1‐FLAG como control, así como con 0,5 μg de pTRAF1, pTRAF2 ó pTRAF3 y con 1 μg de pHA‐JNK. Tras 36 horas, las células se recogieron y lisaron, se inmunoprecipitó JNK con el anticuerpo anti‐HA y  se ensayó  la actividad  JNK del    inmunoprecipitado,  como  se describe en Métodos  (panel  superior). Se muestra la expresión del receptor y de cada una de las proteínas TRAF. En la parte inferior de la figura se muestra la cuantificación del análisis. 

Como  se  observa  en  la  Figura  V‐7,    tanto  TRAF1  como  TRAF3  ejercen  un  efecto 

inhibitorio  sobre  la capacidad del TNFR2 de activar a  JNK. Por el contrario, TRAF2 ejerce un 

efecto activador. Es interesante constatar que la expresión de cualquiera de las proteínas TRAF 

0

5

10

15

20

25

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

WB anti‐TRAF1

WB anti‐TRAF3

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG )

WB anti‐c‐Jun‐fosforilado(Ser73)

Control TNFR2

‐ TRAF1       TRAF2     TRAF3 ‐ TRAF1       TRAF2      TRAF3

Veces d

e activación

Fosforilación c‐Jun

‐

TRAF1

TRAF2

TRAF3

Control TNFR2

Resultados 

76 

 

en ausencia del  receptor  induce  cierta activación de  JNK,  siendo más notorio en el  caso de 

TRAF2.  Por  otro  lado,  el  análisis  Western  anti‐TRAF2  confirma  que  en  el  caso  de  la 

cotransfección con el TNFR2  los niveles de dicha proteína adaptadora, son  inferiores a  los de 

los  del  control.  Nuevamente,  ello  es  reflejo  de  la  capacidad  del  receptor  de  inducir  la 

degradación de TRAF2. 

V.1.3 ANÁLISIS DE LA DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS TRAF 

La  degradación  de  TRAF2  por  el  TNFR2  juega  un  papel  importante  en  la  señalización 

desencadenada  por  el  receptor  (Fotin‐Mleczek  et  al,  2002).  A  la  vista  de  los  resultados 

presentados  en  los  apartados  anteriores,  tanto  TRAF1  como  TRAF3  parecen  desempeñar 

también un papel fundamental en la actividad del receptor. Por ello, nos planteamos estudiar 

los  niveles  intracelulares  de  ambas  proteínas  adaptadoras  en  presencia  de  cantidades 

crecientes de TNFR2 y de TNFR1, transfectando  las células HEK293 con cantidades crecientes 

de los plásmidos codificantes de cada receptor, así como de cada proteína TRAF. Inicialmente 

comparamos la capacidad de ambos receptores de degradar a TRAF2.  

 

Figura V‐8: Análisis de  la degradación de TRAF2 en presencia de TNFR1 y TNFR2. Las células HEK293 fueron transfectadas con las cantidades indicadas del plásmido codificante del TNFR1 (A) ó del TNFR2 (B), así como con 0,5 µg  de  pTRAF2.  A  las  36  horas,  se  recogieron  las  células  y  se  analizó  TRAF2  en  los  extractos mediante  análisis Western  (paneles  superiores).  Se muestra  también  la  expresión  de  los  receptores  (paneles  intermedios)  y  los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores). 

  En la Figura V‐8 se puede observar que, el TNFR1, a diferencia del TNFR2, no induce la 

degradación de TRAF2. 

A continuación, estudiamos  la degradación de TRAF1 y TRAF3. Para ello, se transfectaron 

las  células HEK293  con  cantidades  crecientes de  los plásmidos  codificantes del TNFR1 ó del 

TNFR1

μg DNA

TNFR2

64,2 KDa

pCMV1‐FLAG

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina

1       0,05        0,1    0,5       1

64,2 KDa

82,5 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

WB anti‐TRAF2

WB anti‐TNFR1

WB anti‐βactina

μg DNA1          0,05         0,1    0,5        1

pCMV1‐FLAG

TRAF2 TRAF2

A B

        Resultados 

77 

 

TNFR2 así como con pTRAF1 ó pTRAF3, procediendo de igual manera que para el estudio de la 

degradación de TRAF2.  

 

Figura V‐9: Análisis de la degradación de TRAF1 y TRAF3 en presencia del TNFR1 ó del TNFR2. A) Estudio de la degradación  de  TRAF1.  Las  células  HEK293  se  transfectaron  con  las  cantidades  indicadas  de  los  plásmidos codificantes del TNFR1 (izquierda) y del TNFR2 (derecha) así como con 0,5 µg de pTRAF1. Tras 36 horas, las células se recogieron y se determinó TRAF1 en  los extractos celulares mediante un análisis Western (paneles superiores). Se muestra la expresión de los receptores (paneles intermedios) así como los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores). B) Estudio de la degradación de TRAF3. Se procedió como en (A) transfectándose  las células  con  0,5  µg  de  pTRAF3.  Se  determinó  TRAF3    en  los  extractos  celulares  mediante  análisis  Western  (paneles superiores).  Se  muestra  la  expresión  de  los  receptores  (paneles  intermedios)  y  los  controles  de  carga  de  la electroforesis (paneles inferiores). 

En la Figura V‐9 se observa que el TNFR1 no es capaz de inducir la degradación de TRAF1 ni 

de  TRAF3. De  la misma manera,  el  TNFR2  tampoco  es  capaz  de  inducir  la  degradación  de 

TRAF1.  En  cambio,  se  observa  una  disminución  de  los  niveles  de  TRAF3  a medida  que  se 

incrementa la cantidad de receptor.  

De  los  resultados mostrados  en  la  Figura  V‐8  y  en  la  Figura  V‐9  podemos  inferir  que 

mientras que el TNFR1 no es capaz de inducir la degradación de ninguna de las proteínas TRAF 

analizadas, el TNFR2 es capaz de inducir la degradación de TRAF2 y de TRAF3.  

Las proteínas  TRAF  se  caracterizan por  su  capacidad de  formar  homo ó heterotrímeros 

entre sí, estando descrita la interacción de TRAF2 con TRAF1 ó con TRAF3 en el mismo trímero 

A

TNFR1

μg DNA1          0,05         0,1    0,5        1

pCMV1‐FLAG

0,5 μg TRAF1

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

48,8 KDa

64,2 KDa

TNFR1

μg DNA1          0,05         0,1    0,5        1

pCMV1‐FLAG

0,5 μg TRAF3

WB anti‐TRAF1

WB anti‐TNFR1

WB anti‐βactina

WB anti‐TRAF3

WB anti‐TNFR1

WB anti‐βactina

64,2 KDa

48,8 KDa

82,5 KDa

WB anti‐TRAF1

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina

TNFR2

μg DNA1          0,05         0,1    0,5        1

pCMV1‐FLAG

0,5 μg TRAF1

WB anti‐TRAF3

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina

64,2 KDa

48,8 KDa

82,5 KDa

TNFR2

μg DNA1          0,05         0,1    0,5        1

pCMV1‐FLAG

0,5 μg TRAF3

B

Resultados 

78 

 

(He et al, 2004; Zheng et al, 2010). Por tanto, nos propusimos estudiar el efecto de TRAF1 y 

TRAF3 en la degradación de TRAF2 por el TNFR2. Para ello, las células HEK293 se transfectaron 

con  los plásmidos codificantes de TRAF2 y del TNFR2 así como con cantidades crecientes de 

pTRAF1 ó pTRAF3. 

 

   Figura V‐10: Análisis de  la degradación de TRAF2 en presencia de TRAF1 ó TRAF3. Las células HEK293 fueron transfectadas con 1 µg de pTNFR2 ,ó de pCMV1‐FLAG como control, así como con 0,5 µg de pTRAF2 y con cantidades crecientes de pTRAF1 (A) ó pTRAF3 (B). Tras 36 horas se recogieron las células, determinándose TRAF2 en los extractos celulares mediante análisis Western. Se muestra la expresión del receptor, de TRAF1 y TRAF3 y los controles de carga de la electroforesis . 

En la   Figura V‐10 se observa que  la capacidad del TNFR2 de  inducir  la degradación 

de TRAF2 se reduce a medida que aumenta la cantidad de TRAF1. Sin embargo, la presencia de 

TRAF3 no parece tener ningún efecto sobre la capacidad del receptor de degradar a TRAF2. 

Puesto  que  TRAF1  parece  tener  un  efecto  inhibitorio  sobre  la  capacidad  del  TNFR2  de 

degradar a TRAF2, nuestro siguiente paso se centró en estudiar si dicha actividad depende de 

la unión de TRAF1 con el TNFR2. Para ello, las células HEK293 se transfectaron con  pTRAF2 y 

con el plásmido codificante de TNFR2‐BKO,  receptor  incapaz de unir  las proteínas TRAF  (ver 

Figura  V‐4),  así  como  con  cantidades  crecientes  de  pTRAF1,  analizándose  los  niveles 

intracelulares de TRAF2 en cada una de las condiciones.  

Como  se  observa  en  la  Figura  V‐11,  la  expresión  de  TRAF1  sigue  ejerciendo  un  efecto 

inhibitorio  sobre  la capacidad del  receptor TNFR2‐BKO de degradar a TRAF2 a pesar de que 

este receptor presenta mutados ambos sitios de unión de las proteínas TRAF. Así,  al aumentar 

la cantidad expresada de TRAF1, aumentan los niveles intracelulares de TRAF2 en comparación 

con los niveles detectados en la condición en la que no se expresa TRAF1.  Estos resultados nos 

64,2 KDa

48,8 KDa

82,5 KDa

48,8 KDa

82,5 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa64,2 KDa

WB anti‐TRAF1

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina

WB anti‐TRAF3

WB anti‐βactina

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐TRAF2 WB anti‐TRAF2

μg DNA0,05     0,1      0,5  1

0,5 μg TRAF2

TRAF1

1 μg TNFR21 μg  pCMV1‐FLAG

μg DNA0,05     0,1      0,5  1

0,5 μg TRAF2

TRAF3

1 μg TNFR2

A B

1 μg  pCMV1‐FLAG

        Resultados 

79 

 

indican que  el  efecto de  TRAF1  sobre  la  capacidad del  TNFR2 de  inducir  la degradación de 

TRAF2 es independiente de su unión con el receptor. 

 Figura  V‐11:  Análisis  de  la  degradación  de  TRAF2  por  TNFR2‐BKO  al  expresarse  TRAF1.  A) 

Representación esquemática del receptor TNFR2‐BKO. La representación del receptor es como en  la Figura  III‐1, indicándose  los  sitios  mutados  de  interacción  con  TRAF2  (SKAA  y  AAA  respectivamente).  B)  Análisis  de  la degradación de TRAF2.  Las  células HEK293  fueron  transfectadas  con 1 µg de pRANK‐TNFR2‐BKO ó pCMV1‐FLAG como control, así como con 0,5 µg de pTRAF2 y con cantidades crecientes de pTRAF1. Tras 36 horas, las células se recogieron y  lisaron determinándose TRAF2 en  los extractos celulares mediante análisis Western (panel superior). Se muestra la expresión del receptor y de la proteína TRAF1,así como los controles de carga de la electroforesis. 

 

Como resumen de  los resultados mostrados en el presente apartado, podemos concluir 

que:  

∗ Las  proteínas  TRAF1  y  TRAF3  se  unen  al  TNFR2  por  las mismas  regiones  del 

receptor por las que se produce la unión con TRAF2. 

∗ Tanto TRAF1 como TRAF3 inhiben la capacidad del TNFR2 de activar a NF‐κB y a 

JNK. 

∗ TRAF2 ejerce un efecto potenciador de la capacidad del TNFR2 de activar a NF‐κB 

y a JNK. 

∗ El TNFR2 degrada a TRAF3. 

∗ TRAF1 inhibe la capacidad del TNFR2 de inducir la degradación de TRAF2 siendo 

esta actividad independiente de su unión con el receptor. 

266439SKAA AAATNFR2‐BKO

A

B

μg DNA0,05       0,1        0,5  1

0,5 μg TRAF2

TRAF1

1 μg RANK‐TNFR2‐BKO1 μg pCMV1‐FLAG

WB anti‐TRAF2

Receptor (WB anti‐FLAG)

WB anti‐TRAF1

WB anti‐β‐actina48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

TNFR2 (1‐266) TNFR2ic (267‐439)

III

Resultados 

80 

 

V.2 ANÁLISIS FUNCIONAL DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2. 

Como se ha mencionado, mientras que el mTNF es capaz de activar tanto al TNFR1 como al 

TNFR2, el sTNF únicamente es capaz de activar al TNFR1. Por ello, la ausencia de una forma del 

ligando que  permita  el  estudio  individual del  TNFR2 ha  sido  siempre  el  gran  inconveniente 

para  la  caracterización  funcional  del  receptor.  Los  estudios de  activación  del  TNFR2  se han 

realizado en estrategias basadas en el empleo de muteínas  (formas mutadas del  ligando con 

mayor  afinidad  por  el  TNFR2)  ó  en  la  sobreexpresión  de  los  receptores,  forzando  así  su 

agregación en la membrana celular y su consecuente activación.  

Por ello,   resulta  interesante disponer de un sistema de estudio de ambos receptores del 

TNF  en  donde  éstos  puedan  activarse  de manera  similar  y  sin  necesidad  de  recurrir  a  su 

agregación forzada. En este contexto, nos planteamos la generación de receptores quiméricos 

RANK‐TNFR2  en  donde  las  regiones  extracelular  y  transmembrana  del  TNFR2  fueron 

sustituidas  por  las  regiones  correspondientes  de  RANK,  receptor  perteneciente  a  la 

superfamilia TNFR. 

 La generación de este receptor quimérico RANK‐TNFR2 tiene como fin último la obtención 

de una  línea celular que  lo exprese de manera estable en un contexto en el que se exprese 

TNFR1 pero no RANK. De esta manera se podrá activar de manera independiente ó conjunta al 

TNFR1 (activado con sTNF) y al TNFR2 (activado con RANKL, ligando de RANK).  

 

Figura V‐12: Representaciones esquemáticas de los receptores TNFR2 y RANK‐TNFR2. Se representan el TNFR2  (esquema  superior)  y  el  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  (esquema  inferior).  Los  rectángulos  negros representan a  las  regiones extracelular y  transmembrana de  cada  receptor, en donde  se encuentra  la diferencia entre  ambos  receptores  (266  aminoácidos  en  el  TNFR2  y  241  aminoácidos  en  el  caso  de  RANK‐TNFR2, correspondientes al receptor RANK). La región intracelular de ambos receptores es idéntica y está formada por los residuos comprendidos entre las posiciones 267 y 439 del TNFR2 (rectángulos blancos) en donde destacan los dos sitios de unión con TRAF2 402‐SKEE‐405 y 425‐KPL‐427 (rectángulos grises) y el módulo conservado (III), implicado en la señalización del receptor. 

Previamente,  resulta  necesario  comprobar  que  el  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  se 

comporta  funcionalmente  como  el  TNFR2  silvestre.  En  la  Figura  V‐12  se  representan  de 

manera  esquemática  ambos  receptores,  que  son    iguales  en  su  región  intracelular 

(comprendida entre  los aminoácidos 267 y 439 del TNFR2), diferenciándose en  sus  regiones 

RANK‐TNFR2

241439SKEE KPL

TNFR2

TNFR2ec (1‐266)  TNFR2ic (267‐439)

266439SKEE KPL

RANKec (1‐241) 

III

III

        Resultados 

81 

 

extracelular  y  transmembrana.  En  el  caso  de  RANK‐TNFR2    éstas  corresponden  al  receptor 

RANK, que comprenden los aminoácidos 1 a 241 del mismo. 

La  comparación  funcional  entre  el  TNFR2  y  RANK‐TNFR2  se  ha  llevado  a  cabo 

determinando su capacidad de unir proteínas TRAF,  la activación de  NF‐кB  y de JNK, así como 

estudiando  su  capacidad  de  inducir  la  degradación  de  TRAF2. Hemos  estudiado  también  la 

localización  subcelular del  receptor.  Los  resultados obtenidos  se muestran en  los  siguientes 

apartados. 

V.2.1 UNIÓN CON LAS PROTEÍNAS TRAF 

Como ya se ha mencionado,  la señalización desencadenada por el TNFR2 depende de su 

unión con las proteínas TRAF. Por ello resulta importante constatar que el receptor quimérico 

RANK‐TNFR2 mantiene las propiedades del TNFR2 en relación con su capacidad de unir TRAF2 

así como TRAF1 y TRAF3 (ver Figura V‐5 y Figura V‐7).  

Para ello,  las células HEK293 se transfectaron con  los plásmidos codificantes de TNFR2   ó 

RANK‐TNFR2  así  como  con  los  plásmidos  codificantes  de  TRAF1,  TRAF2  ó  TRAF3.  Tras  su 

expresión, se realizaron ensayos de coinmunoprecipitación para poner de  manifiesto la unión 

del receptor quimérico con las  proteínas TRAF.  . 

 

Figura V‐13. Unión de RANK‐TNFR2 con proteínas TRAF. Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de los plásmidos  codificantes de TNFR2 y RANK‐TNFR2 ó  con pCMV1‐FLAG,  como  control,   así  como  con 0,5 µg de pTRAF1,  pTRAF2  ó  pTRAF3.  Tras  24  horas,  las  células  se  recogieron  y  se  lisaron,  llevándose  a  cabo  una inmunoprecipitación  de  los  receptores  con  el  anticuerpo  anti‐FLAG  seguida  de  un  análisis  Western  del inmunoprecipitado  con  el  anticuerpo  específico  de  cada  proteína  TRAF  (paneles  superiores).  Se  muestra  la expresión  de  las  proteínas  adaptadoras  correspondientes  (paneles  intermedios)  y  de  los  receptores  (paneles inferiores). 

Como  se  observa  en  la  Figura  I‐13,  el  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2,  al  igual  que  el 

TNFR2, es capaz de unir a las proteínas adaptadoras TRAF1, TRAF2 y TRAF3. 

 

Receptor(WB anti‐FLAG)

TNFR2 RANK‐TNFR2

IP anti‐FLAG WB anti‐TRAF

WB anti‐TRAF

Control TNFR2 RANK‐TNFR2

ControlTNFR2 RANK‐TNFR2

Control

IP TRAF1 IP TRAF2 IP TRAF3

65,8 KDa

65,8 KDa65,8 KDa 65,8 KDa

65,8 KDa65,8 KDa

65,8 KDa 65,8 KDa

65,8 KDa

Resultados 

82 

 

V.2.2 ACTIVACIÓN DE NF‐кB. 

Para  el  estudio  de  la  capacidad  de  activación  de  NF‐кB,  las  células  HEK293  fueron 

transfectadas con cantidades crecientes de  los plásmidos codificantes de TNFR2 ó de RANK‐

TNFR2, así como con los plásmidos de expresión pNF‐кB‐luc y pRL‐TK. 

 

Figura V‐14: Activación de   NF‐кB   por RANK‐TNFR2.    Las  células HEK293  se  transfectaron  con  cantidades crecientes de  los plásmidos codificantes del TNFR2 y de RANK‐TNFR2, ó con 1 µg de pCMV1‐FLAG como control, manteniéndose constante la cantidad total de DNA transfectado con pCMV1‐FLAG ó con el plásmido codificante de la región extracelular de RANK (RANKec) como control de  la actividad basal de NF‐кB. Las células se transfectaron además con 0,05 µg de pRL‐TK y con 0,4 µg de pNF‐кB‐luc. A las 36 horas las células se recogieron, se lisaron y se determinó  la  actividad NF‐кB    en  los  extractos  como  se  describe  en Métodos.  Se muestra  la  expresión  de  los receptores de cada una de  las condiciones analizadas (panel superior) y  los controles de carga de  la electroforesis (panel inferior). 

En la Figura V‐14 se muestra que  RANK‐TNFR2 activa a NF‐кB de manera similar al TNFR2. 

Al igual que ocurre con el TNFR2, se observa que al aumentar la expresión de RANK‐TNFR2, su 

capacidad  de  activación  de  NF‐кB  disminuye  (ver  Figura  V‐8).  Este  comportamiento  se  ha 

atribuido a la capacidad del receptor de inducir la degradación de TRAF2 (ver Figura V‐16).  

V.2.3 ACTIVACIÓN DE JNK. 

Para el estudio de  la capacidad del receptor quimérico RANK‐TNFR2 de activar a  JNK  

las células HEK293 fueron transfectadas con cantidades crecientes de pRANK‐TNFR2 así como 

Receptor(WB anti‐FLAG)

Veces d

e activación

pCMV1‐FLAG

RANKec TNFR2 RANK‐TNFR2

µg DNA1            1          0,05          0,1          0,5          1           0,05        0,1           0,5            1

3,5

3,0

2,5

1,5

1,0

0,50

2,0

4,0

4,5

5,0

WB anti‐β‐actina48,8 KDa

64,2 KDa

48,8 KDa

Activación NF‐κB

        Resultados 

83 

 

con  pHA‐JNK.  Tras  la  expresión  de  las  proteínas  se  realizó  una  inmunoprecipitación  con  el 

anticuerpo anti‐HA analizándose posteriormente la actividad quinasa del inmunoprecipitado. .  

 

Figura V‐15: Activación de JNK por el receptor RANK‐TNFR2. Las células HEK293 fueron transfectadas con las  cantidades  indicadas  de  pTNFR2  ó  pRANK‐TNFR2,  así  como  con  1  µg  del  plásmido  codificante  de  HA‐JNK, manteniéndose siempre constantes  las cantidades de DNA con el vector control pCMV1‐FLAG. Tras 36 horas,  las células  se  recogieron  y  lisaron,  inmunoprecipitándose  JNK  con  el  anticuerpo  anti‐HA.  La  actividad  JNK  del inmunoprecipitado se determinó como se describe en Métodos (izquierda, panel superior) y su cuantificación a  la derecha. Se muestra también la expresión de los receptores (izquierda, panel inferior).  

En la Figura V‐15 se observa cómo la capacidad de activar a JNK aumenta en función de la 

cantidad    de  RANK‐TNFR2  expresada,  hasta  niveles  equiparables  a  los  del  receptor  TNFR2 

silvestre. 

V.2.4 INDUCCIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2. 

Puesto  que  el  TNFR2  induce  la  degradación  de  TRAF2,  regulando  así  su  capacidad  de 

activación  de  NF‐κB,  resulta  clave  comprobar  en  la  caracterización  funcional  del  receptor 

quimérico  RANK‐TNFR2  su  capacidad  para  inducir  la  degradación  de  dicha  proteína 

adaptadora. Para ello,  las células HEK293  fueron  transfectadas con cantidades crecientes de 

los plásmidos codificantes de TNFR2 ó de RANK‐TNFR2  así como con el plásmido que codifica 

TRAF2.  Tras  su  expresión,  se  determinó  TRAF2  en  los  extractos  celulares mediante  análisis 

Western.  

En la Figura V‐16 se muestra que el receptor quimérico RANK‐TNFR2 es capaz de inducir la 

degradación  de  TRAF2,  lo  que  explica  los  resultados  de  activación  de NF‐кB  obtenidos  (ver 

Figura V‐14).  

 

48,8 KDa

64,2 KDaReceptor(WB anti‐FLAG)

WBanti‐c‐Jun‐fosforilado(Ser73)

RANK‐TNFR2

μg DNA1          1  0,05       0,1         0,5             1  

pCMV1‐FLAG

TNFR2

Veces d

e activación

Fosforilación c‐Jun

c‐JunFosforilado (Ser‐73)

RANK‐TNFR2

μg DNA1          1  0,05       0,1         0,5         1  

pCMV1‐FLAG

TNFR2

0

12

10

8

6

4

2

Resultados 

84 

 

 

Figura V‐16: Análisis de la degradación de TRAF2. Las células HEK293 fueron transfectadas con las cantidades indicadas de pTNFR2 ó pRANK‐TNFR2, así como con 0,5 µg del plásmido codificante de TRAF2, manteniéndose  la cantidad de DNA constante con pCMV1‐FLAG. A las 36 horas se analizó la expresión de TRAF2 mediante un análisis Western (panel superior). Se muestra la expresión  de los receptores (panel intermedio) y los controles de carga de la electroforesis.  

V.2.5 EFECTO DE RANK‐TNFR2 EN LA APOPTOSIS INDUCIDA POR TNFR1. 

A diferencia de otros  receptores de  la  superfamilia TNFR, el TNFR2  carece de DD en  su 

región  intracelular, siendo, por tanto,  incapaz de desencadenar un proceso apoptótico por sí 

mismo. Sin embargo, se ha comprobado que es capaz de incrementar la capacidad apoptótica 

del TNFR1 (Fotin‐Mleczek et al, 2002; Rodriguez et al, 2011). Por ello, nos propusimos  estudiar 

si  el  receptor RANK‐TNFR2 puede o no   desencadenar un proceso de muerte  celular por  sí 

mismo o si puede cooperar con el TNFR1, incrementando la capacidad citotóxica de éste. Para 

ello,  inicialmente  se  observo  la  morfología  de    poblaciones  celulares  que  expresan  estos 

receptores  individualmente  o  la  combinación  de  ambos.  Posteriormente,  se  determinó  el 

porcentaje de células hipodiploides en estas poblaciones celulares. 

Como se observa en la Figura V‐17, mientras que el TNFR1 induce un cambio morfológico 

celular típico de un proceso apoptótico, ni TNFR2 ni RANK‐TNFR2 inducen cambio alguno en la 

morfología celular. Sin embargo, la expresión conjunta del TNFR1 y el TNFR2 ó  del TNFR1 y el 

RANK‐TNFR2  produce  un  aumento  del  número  de  células  apoptóticas.  Seguidamente,  las 

células  se  recogieron,  lavaron  y  tiñeron  con  ioduro  de  propidio,  determinándose mediante 

citometría de flujo  el  porcentaje de células hipodiploides. En la Figura V‐18 se observa que ni 

el TNFR2 ni RANK‐TNFR2,  pueden  desencadenar un proceso de muerte celular en las células 

HEK293. Sin embargo, cuando ambos receptores se expresan conjuntamente con el TNFR1, se 

observa un aumento considerable de la capacidad citotóxica del TNFR1. 

 

 

TNFR2 RANK‐TNFR2

64,2 KDa

48,8 KDa

pCMV1‐FLAG

WB anti‐TRAF2

WB anti‐FLAG(anti‐receptor)

WB anti‐βactina

μg DNA1          0,05        0,1    0,5     1    0,05     0,1      0,5      1  

64,2 KDa

82,5 KDa

        Resultados 

85 

 

 

Figura V‐17: Observación microscópica del efecto de  la expresión de TNFR1, TNFR2 ó RANK‐TNFR2 en    las células HEK293. Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de pTNFR1, pTNFR2 ó pRANK‐TNFR2 así como con 0,2 µg de pEGFP para poder visualizar  las células transfectadas. Tras 36 horas se observó  la morfología celular en un microscopio de fluorescencia. 

 

Figura V‐18: Cuantificación de  la apoptosis inducida por TNFR1, TNFR2, RANK‐TNFR2 ó su combinanción en células HEK293. Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de pTNFR1, pTNFR2 ó pRANK‐TNFR2 así como con 1 µg de pTNFR1 junto con 1 µg de pTNFR2 ó pRANK‐TNFR2. También se transfectaron las células con 0,2 µg de pEGF‐P como marcador de  transfección.  Tras  36 horas,  las  células de  recogieron  y  se  cuantificó  la población  sub G0/G1 (población hipodiploide), seleccionándose únicamente  las células positivas para la fluorescencia verde emitida por la GFP. Se representa en el eje de abscisas  la  intensidad de  la  fluorescencia del  ioduro de propidio. Las ventanas mostradas  (M1) seleccionan  las poblaciones sub G0/G1. Se  indica asimismo el porcentaje de células hipodiploides obtenido en cada caso. 

Control 1 μg TNFR1 1 μg TNFR2

1 μg RANK‐TNFR2 1 μg  TNFR1 + 1 μg TNFR2 1 μg TNFR1 + 1 μg RANK‐TNFR2

14,16% 31,87% 9,34%

10,41% 57,80%62,87%

Control 1 μg pTNFR1 1 μg pTNFR2

1 μg pRANK‐TNFR2 1 μg  pTNFR1 + 1 μg pTNFR2 1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2

Resultados 

86 

 

V.2.6 LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DEL RECEPTOR RANK‐TNFR2. 

Como  último  paso  en  el  estudio  de  la  funcionalidad  del  receptor  RANK‐TNFR2  nos 

centramos  en  el  análisis  de  su  localización  subcelular.  Para  ello,  las  células HEK293  fueron 

transfectadas con los plásmidos codificantes del TNFR2 y de RANK‐TNFR2, así como de RANKec 

y  TNFR1,  conjuntamente  con  pE‐GFP.  Tras  36  horas,  las  células  se  lavaron,  fijaron  y 

permeabilizaron,  realizándose  un  ensayo  de  inmunocitoquímica;  visualizándose  mediante 

microscopía confocal la localización del receptor. 

Como se muestra en la Figura V‐19, los receptores TNFR2 y RANK‐TNFR2 se expresan en la 

membrana celular aunque  se observa una localización mayoritaria de ambos receptores  en el 

interior  celular. Por el  contrario, TNFR1 no  se observa en membrana,  siendo  su  localización 

intracelular  distinta  a  la  observada  en  el  caso  del  TNFR2  y  de  RANK‐  Para  verificar  los 

resultados de localización celular y comprobar que realmente el TNFR2 y el receptor quimérico 

RANK‐TNFR2  se  expresan  en  la membrana  celular  analizamos mediante  citometría  de  flujo  

células HEK293  transfectadas con  los plásmidos codificantes de cada  receptor y con pE‐GFP. 

Para  ello,  las  células  se  recogieron  36  horas  después  de  la  transfección  incubándose,  sin 

permeabilizarlas, con el anticuerpo primario anti‐FLAG y con el anticuerpo secundario anti‐IgG 

de ratón conjugado con el colorante Alexa 633. Se analizó tanto  la señal debida a  la proteína 

verde  fluorescente GFP  (detectada en el canal FL1) como  la  señal emitida por el anticuerpo 

secundario fluorescente Alexa633 (detectado en el canal FL4). Puesto que se trata de células 

no  permeabilizadas,  la  señal  obtenida  se  deberá  a  la  localización  en  membrana  de  los 

receptores. 

A pesar de que los ensayos de inmunofluorescencia no nos permiten visualizar de manera 

clara la localización en membrana de los receptores, en la Figura V‐20 se muestra que el TNFR2 

y  RANK‐TNFR2  se  expresan  en  la  superficie  celular  de  prácticamente  todas  las  células 

analizadas  (cuadrante Q1 en el  caso de  las  células  transfectadas únicamente  con pTNFR2 ó 

pRANK‐TNFR2). Además, los resultados obtenidos en el caso de la co‐transfección de pTNFR2 y 

pRANK‐TNFR2 con pE‐GFP nos permiten determinar que prácticamente  todas  las células han 

incorporado ambos plásmidos (cuadrante Q2 en las células transfectadas con el receptor y con 

la  proteína  verde  fluorescente  GFP).  Estos  resultandos  verifican  la  alta  eficiencia  de  los 

procesos de transfección realizados.  

 

 

        Resultados 

87 

 

 Figura  V‐19:  Estudios  de  localización  celular.  Las  células  HEK293  se  transfectaron  con  1  µg  de  pRANKec, 

pTNFR1, pTNFR2 ó pRANK‐TNFR2, así como con pCMV1‐FLAG, como control,  junto con 0,2 µg de p‐E‐GFP. Tras 36 horas, las células de recogieron y se llevó a cabo un ensayo de inmunocitoquímica. Se estudió la localización de la proteína verde fluorescente GFP (en verde) y la de los distintos receptores, empleando el  anticuerpo primario  anti‐FLAG, en el  caso   de  los  receptores RANKec, TNFR2 y RANK‐TNFR2, ó el   anticuerpo anti‐TNFR1, y el anticuerpo secundario   anti  IgG de  ratón conjugado con el colorante  fluorescente Alexa633  (rojo). Para visualizar el DNA  se realizó una tinción con el colorante DAPI (azul).  

Control

RANKec

TNFR1

TNFR2

RANK‐TNFR2

GFP+ DAPI Receptor+ DAPI Solapamiento

Resultados 

88 

 

 

Figura V‐20: Estudio citométrico de la expresión en membrana del TNFR2 y de RANK‐TNFR2. Las células HEK293 se transfectaron con 1 μg de pTNFR2, pRANK‐TNFR2 ó pCMV1‐FLAG, como control, y con o sin 0,2 μg de pE‐GFPDNA. Tras 36 horas, se recogieron  las células y, sin permeabilizarlas, se  incubaron con el anticuerpo anti‐FLAG (anti‐receptor)  y  con  el  anticuerpo  secundario  anti  IgG  de  ratón  conjugado  al  colorante  fluorescente  Alexa633. Mediante citometría de flujo se determinó el porcentaje de células positivas para dicho anticuerpo fluorescente así como el porcentaje de células positivas para éste y también para GFP. 

Con  todos  los  resultados  mostrados  hasta  el  momento,  podemos  establecer  que  el 

receptor  silvestre  TNFR2  y  el  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  se  comportan  de manera 

equiparable en cuanto a su capacidad de:  

∗ Unir a las proteínas TRAF1, TRAF2 y TRAF3. 

∗ Activación de  NF‐кB.  

∗ Activación de JNK 

∗ Inducir la degradación de TRAF2. 

∗ No desencadenar un proceso de muerte celular por sí mismo. 

∗ Aumentar la capacidad apoptótica del TNFR1. 

∗ Localización subcelular y expresión en membrana. 

pudiendo, por  tanto, extrapolarse  todos  los  resultados  funcionales  relacionados con el 

receptor quimérico RANK‐TNFR2 al receptor TNFR2 silvestre.  

 

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

CONTROL TNFR2 RANK‐TNFR2

TNFR2 + GFP RANK‐TNFR2 + GFP

Q1: 3,53 Q2: 88,54 Q3: 0,54 Q4: 7,39

Q1: 2.37 Q2: 90.56 Q3: 0.20 Q4: 6.86 

Q1: 8,65 Q2: 0,04 Q3: 91,30 Q4: 0,02

Q1: 97,08 Q2: 1,00 Q3: 1,92 Q4: 0,00

Q1: 89,90 Q2: 0,04 Q3: 10,07 Q4: 0,00

        Resultados 

89 

 

Por ello, en el estudio de la caracterización de la señalización del receptor que se presenta 

en los siguientes apartados se han empleado en todo momento receptores quiméricos RANK‐

TNFR2. 

V.3 IDENTIFICACIÓN  DE  LA  REGIÓN  DEL  TNFR2  RESPONSABLE  DE  LA 

DEGRADACIÓN DE TRAF2 

El TNFR2 es capaz de  inducir  la degradación de TRAF2 (ver Figura V‐8). Este fenómeno se 

encuentra directamente relacionado con la capacidad de señalización del receptor, puesto que 

la degradación de TRAF2 se correlaciona con una disminución de  la capacidad del TNFR2 de 

activación  de  NF‐κB  así  como  con  un  aumento  del  potencial  citotóxico  del  TNFR1  cuando 

ambos receptores son activados  (Rodriguez et al, 2011). 

Estudios previos de nuestro laboratorio  han identificado a la región comprendida entre los 

aminoácidos 343 y 379 como responsable de la capacidad del TNFR2 de inducir la degradación 

de TRAF2  (Rodriguez, 2006). Con estos antecedentes, nuestros estudios  se han  centrado en 

determinar los aminoácidos concretos del receptor responsables de dicha actividad.  

V.3.1 LA INDUCCIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 POR TNFR2 ES INDEPENDIENTE DE 

SU UNIÓN AL RECEPTOR 

Puesto  que  nuestros  estudios  previos  vinculaban  la  capacidad  de  degradación  de 

TRAF2 con los aminoácidos comprendidos entre las posiciones 343‐378 del receptor, región no 

implicada en la unión  de las proteínas TRAF al receptor (ver Figura I‐IV), decidimos estudiar la 

inducción de  la degradación de  TRAF2 por  el  receptor RANK‐TNFR2‐BKO,  en  el que  los dos 

sitios de  interacción  con TRAF2 han  sido anulados mediante mutaciones puntuales  (de 402‐

SKEE‐405 a 402‐SKAA‐405 y de 425‐KPL‐427 a 425‐AAA‐427 respectivamente). 

En  la Figura V‐21 se observa que el receptor RANK‐TNFR2‐BKO mantiene  la capacidad de 

inducir  la degradación de  la proteína adaptadora TRAF2, aunque es  incapaz de unirse a ella 

(ver Figura V‐4).   

Resultados 

90 

 

 

Figura V‐21:  Inducción de  la degradación de  TRAF2 por  el  receptor RANK‐TNFR2‐BKO. A) Representación esquemática del receptor quimérico RANK‐TNFR2‐BKO.La representación de  los receptores es como en  la Figura III‐1. Se  indican  las secuencias de  los sitios de unión de TRAF2 mutados (SKAA y AAA) así como  la  localización del módulo III. B) Degradación de TRAF2.  Las células HEK293 se transfectaron con las cantidades indicadas de pRANK‐TNFR2,  pRANK‐TNFR2‐BKO  ó  pCMV1‐FLAG,  como  control,  manteniéndose  constante  la  cantidad  de  DNA  con pCMV1‐FLAG,  junto  con 0,5 µg de pTRAF2. Tras 36 horas,  se determinó en  los extractos  celulares  los niveles de TRAF2 mediante  análisis Western  (panel  superior).  Se muestra  también  la  expresión  de  los  receptores  (panel intermedio) y los controles de carga de la electroforesis (panel inferior). 

Para constatar que  la degradación de TRAF2 por el TNFR2 es  independiente de  la unión 

entre el receptor y dicha proteína adaptadora y confirmar así mismo que la región 343‐378 del 

receptor es la responsable de dicha actividad, generamos dos nuevos receptores denominados 

RANK‐TNFR2‐Δ343‐378  Y  RANK‐TNFR2‐BKO-Δ343‐378.  El  receptor  RANK‐TNFR2‐Δ343‐378 

presenta  los dos sitios de unión a TRAF2  intactos pero  incluye una deleción  interna entre  las 

posiciones 343 y 379. El receptor RANK‐TNFR2‐BKO-Δ343‐378, presenta esta misma deleción 

pero, además, contiene mutaciones puntuales en  los dos sitios de unión a TRAF2 (402‐SKAA‐

405 y 425‐AAA‐427). En ellos  se analizó  su  capacidad de unir TRAF2 así  como de  inducir  su 

degradación. 

Como se observa en  la Figura V‐22, únicamente el  receptor RANK‐TNFR2‐Δ343‐378  (que 

presenta intactos los dos  sitios de unión) es capaz de interaccionar con TRAF2 mientras que el 

receptor RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐378 (que tiene ambos sitios de unión de TRAF2 mutados) ha 

perdido  la capacidad de unir TRAF2. Por otra parte, ninguno de  los dos receptores  induce  la 

degradación de TRAF2. 

 

RANK‐ TNFR2‐BKO241

439SKAA AAAIII343 379

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2‐BKO

0,05  0,1  0,5  1 1  μg DNA1 

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina48,8 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

RANK‐ TNFR2241

439SKEE KPLIIII

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)A

B

        Resultados 

91 

 

 

Figura V‐22: Análisis  funcional de  los  receptores RANK‐TNFR2‐Δ343‐378  y RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐378. A) Representación esquemática de  los receptores. La representación de  los receptores es como en  la Figura III‐1. B) Análisis  de  la  unión  con  TRAF2.  Las  células HEK293  fueron  transfectadas  con  1  µg  de  pRANK‐TNFR2‐Δ343‐379 (izquierda),  pRANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐379  (derecha),  pRANK‐TNFR2  ó  pCMV1‐FLAG  (control)  junto  con  0,5  µg pTRAF2. Tras 24 horas, se realizaron ensayos de coinmunoprecipitación de los receptores y TRAF2 en los extractos celulares (paneles superiores). Se muestra también la expresión de cada receptor (paneles intermedios) y de TRAF2 (paneles inferiores). C) Análisis de la degradación de TRAF2. Las células HEK293 se transfectaron con las cantidades indicadas de  los plásmidos codificantes de cada  receptor, manteniéndose siempre constante  la cantidad  total de DNA con pCMV1‐FLAG, así como con 0,5 µg de pTRAF2. Tras 36 horas, se determinó en  los extractos celulares  los niveles  de  TRAF2  mediante  análisis  Western  (paneles  superiores).  Se  muestra  también  la  expresión  de  los receptores  (paneles intermedios) y los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores). 

 

V.3.2 IDENTIFICACIÓN  DE  LOS  AMINOÁCIDOS  RESPONSABLES  DE  LA  DEGRADACIÓN  DE 

TRAF2 POR EL TNFR2 

A  la  vista  de  los  resultados  obtenidos,  nos  propusimos  identificar  los  aminoácidos 

concretos de la región 343‐378 responsables de la inducción de la degradación de TRAF2. 

Al estudiar  la  secuencia aminoacídica de  la  región 343‐378 del TNFR2  (36 aminoácidos), 

destaca  la  existencia de un  total de  11  aminoácidos de  serina que,  además,  se  encuentran 

agrupados en tándem. Dada la relevancia del papel de las fosforilaciones en la funcionalidad y 

señalización  celular,  nos  planteamos  la  posibilidad  de  que  alguno  de  estos  residuos 

aminoacídicos de serina  estuviese implicado en la degradación de TRAF2. En la Figura V‐23 se 

muestran  los  resultados  del  análisis  del  perfil  de  fosforilación  de  la  secuencia  343‐378  del 

TNFR2 realizado con el programa de algoritmos NethPhos. 

241439SKEE KPL342 379RANK‐TNFR2‐Δ343‐378‐ III

241439SKAA AAA342 379RANK‐TNFR2‐BKO‐

Δ343‐378III

A

B

CRANK‐TNFR2‐Δ343‐378

pCMV1‐FLAG

IP anti‐FLAGWB anti‐TRAF2

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐378

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐Δ343‐378

μg DNA 1      1    0,05        0,1       0,5         1  

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

65,8 KDa

65,8 KDa WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina

65,8 KDa

65,8 KDa

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐378

μg DNA1     1        0,05      0,1        0,5      1  

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPLIII

343 379

48,8 KDa48,8 KDa

Resultados 

92 

 

 

Figura V‐23: Análisis del perfil de  fosforilación de  la  región 343‐378 del TNFR2. En  la parte  superior de  la figura se muestra  la secuencia de aminoácidos de  la región 343‐378 del TNFR2, donde  los aminoácidos de serina aparecen  marcados  con  asteriscos.  Mediante  el  programa  de  análisis  de  perfiles  de  fosforilación  de  serinas, treoninas y tirosinas NetPhos se analizó la región del TNFR2 comprendida entre los aminoácidos 343 y 378 donde se incluyen  11  aminoácidos  de  serina.  Este  análisis  proporciona  predicciones  de  fosforilación  de  cada  uno  de  los aminoácidos susceptibles dentro de su entorno aminoacídico con un mayor o menor score. 

El  análisis muestra  que  de  los  11  residuos  aminoacídicos  de  serina  que  se  localizan  en 

dicha  secuencia,  7  de  ellos  presentan  una  alta  probabilidad  de  ser  fosforilados.  Por  ello, 

decidimos generar, a partir del receptor RANK‐TNFR2‐BKO, una serie de nuevos receptores con 

distintas  deleciones  del  módulo  343‐378  en  donde  analizar  su  capacidad  de  inducir  la 

degradación de TRAF2. El análisis de  la degradación de TRAF2 en presencia de  los receptores 

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ365‐378,  RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐355  y  RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ350‐378  nos 

llevó  a  identificar  a  la  región  comprendida  entre  las posiciones  343‐349 del  receptor  como 

responsable de la inducción de la degradación de TRAF2. 

Cabe  destacar  que  en  esta  región  343‐349  del  TNFR2  se  localizan  2  parejas  de  serinas 

identificadas  como  susceptibles  de  experimentar  un  proceso  de  fosforilación. 

Consecuentemente,  generamos  dos  nuevos  receptores  en  donde  ambas  parejas  de  serinas 

presentes  en  el  extremo  amino  del Módulo  III  (345‐346,  348‐349)  fueron mutadas.  Estos 

receptores  también  presentan  mutados  los  dos  sitios  de  unión  a  TRAF2.  Los  resultados 

obtenidos al analizar  la capacidad de estos receptores de  inducir  la degradación de TRAF2 se 

muestran en la Figura V‐24. 

Como se observa en  la Figura V‐24,  la mutación puntual de cualquiera de  las parejas de 

serinas 345‐346 ó 348‐349 anula la capacidad del receptor de inducir la degradación de TRAF2. 

Podemos, por tanto, destacar que ambas parejas de serinas son necesarias para  la  inducción 

de la degradación de TRAF2 por el TNFR2. 

 

TGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQ

** **                               ***  **    **Serine position Context Score Prediction

345 ASTGSSDSS 0.831 *S*346 STGSSDSSP 0.803 *S*348 GSSDSSPGG 0.917 *S*349 SSDSSPGGH 0.994 *S*367 VNVCCSSSDH 0.934 *S*368 NVCCSSSDHS 0.063369 VCCSSSDHSS 0.145372 SSDHSSQCS 0.978 *S*373 SDHSSQCSS 0.689 *S*376 SSQCSSQAS 0.022377 SQCSSQASS 0.183

        Resultados 

93 

 

 

Figura V‐24: Estudio de  la degradación de TRAF2 por  los receptores RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD y RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA. A) Representación esquemática de  los  receptores analizados. La  representación de  los  receptores es como en  la Figura  III‐1. Se  indican  las mutaciones puntuales en  los sitios de unión a TRAF y  las mutaciones en  las serinas de la región 343‐349 (345‐SSD‐347 y 347‐DSS‐349 respectivamente). B) Análisis de la degradación de TRAF2 porRANK‐TNFR2‐BKO‐AAD. Las células HEK293 fueron transfectadas con las cantidades indicadas de pRANK‐TNFR2‐BKO‐AAD, con 1 µg pRANK‐TNFR2 ó pCMV1‐FLAG  (control), manteniéndose constante la cantidad total de DNA con pCMV1‐FLAG, y 0,5 µg de pTRAF2. Tras 36 horas, se analizó los niveles de TRAF2 en los extractos celulares mediante análisis Western  (panel  superior).  Se muestra  también  la  expresión  de  los  receptores  (panel  intermedio)  y  los controles de carga de  la electroforesis  (panel  inferior). C) Análisis de  la degradación de TRAF2 por RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA. Las células HEK293 fueron transfectadas con las cantidades indicadas de pRANK‐TNFR2‐BKO‐DAA, con 1 µg pRANK‐TNFR2 ó pCMV1‐FLAG  (control) y 0,5 µg p de pTRAF2, procediéndose igual que en (B). 

V.3.3 EFECTO DE LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 SOBRE LA CAPACIDAD DE ACTIVACIÓN DE 

NF‐κB POR EL TNFR2 

Teniendo  en  cuenta  que  al  aumentar  la  cantidad  expresada  de  TNFR2  disminuye  su 

capacidad de activación de NF‐кB,  lo que se  interpreta como consecuencia de  la degradación 

de  TRAF2,  (Figura V‐14  y  Figura V‐16),  nos  planteamos  estudiar  la  activación  de NF‐кB  por 

receptores mutados incapaces de inducir la degradación de TRAF2.  

Así,  analizamos  inicialmente  la  activación  de  NF‐кB  por  el  receptor  RANK‐TNFR2‐BKO 

(incapaz de  interaccionar con TRAF2 pero sí de degradarlo, ver Figura V‐21), de RANK‐TNFR2‐

Δ343‐379 (con ambos sitios de unión a  TRAF2 intactos pero incapaz de degradarlo, ver Figura 

V‐22) y de RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐379 (con ambos sitios de unión a TRAF2 mutados e incapaz 

de degradarlo, ver Figura V‐22). 

Posteriormente,  hemos  estudiado  la  activación  de  NF‐кB  por  RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD  y 

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA  (incapaces de unir TRAF2 ni de degradarlo, ver Figura V‐24), y por  los 

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD241

439SKAA AAAIII

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

RANK‐TNFR2241

439SKEE KPL

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA241

439SKAA AAAIII

A

B

48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

RANK‐TNFR2

pCMV1FLAG

RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD

0,05  0,1   0,5  1 1 μg DNA 1 

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina 48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

RANK‐TNFR2

pCMV1FLAG

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA

0,05  0,1   0,5  1 1 1 

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐βactina

III

AAD

DAA

C

μg DNA

Resultados 

94 

 

receptores RANK‐TNFR2‐AAD y RANK‐TNFR2‐DAA  (con los sitios de unión a TRAF intactos pero 

con  las serinas  identificadas como  responsables de  la  inducción de  la degradación de TRAF2 

mutadas). 

En  la  Figura  V‐25  se  representan  de  manera  esquemática  los  distintos  receptores 

analizados  indicándose,  a  modo  de  resumen,  tanto  su  capacidad  de  unión    como  de 

degradación de TRAF2. 

 

Figura V‐25: Representación esquemática de  los receptores analizados. La representación de  los receptores es como en la Figura III‐1. Se indica a la derecha la capacidad (+) ó incapacidad (‐) de cada receptor de unir TRAF2 y de inducir su degradación.  

Los  resultados  obtenidos  se muestran  en  la  Figura  V‐26  y  en  la  Figura  V‐27,  donde  se 

observa que  los receptores que no unen TRAF2  (RANK‐TNFR2‐BKO, RANK‐TNFR2‐ BKO‐AAD y 

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA) no  son  capaces de activar a NF‐κB.   Por el  contrario,  los  receptores 

RANK‐TNFR2‐AAD y RANK‐TNFR2‐DAA, que presentan mutadas  las serinas responsables de  la 

degradación  de  TRAF2  pero  que  tienen  intactos  los  dos  sitios  de  unión  a    TRAF2,  pueden  

activar a NF‐κB. Además, se observa que al aumentar  la cantidad expresada de cada uno de 

estos dos receptores, aumenta también  la activación de NF‐κB, sin que se produzca una fase 

de inhibición con cantidades altas del receptor, como sucede en el caso de RANK‐TNFR2. Esta 

observación corrobora que esta disminución de activación de NF‐κB observada en el receptor 

RANK‐TNFR2 es debida  a su capacidad de inducir la degradación de TRAF2.  

Por otra parte, RANK‐TNFR2‐Δ343‐379 es capaz de activar a NF‐κB de manera dependiente 

de la cantidad de receptor sin que se produzca la fase de inhibición con altas concentraciones 

del  receptor,  lo que  se explica por  su  incapacidad   de  inducir  la degradación de TRAF2  (ver 

Figura  V‐22).  Sin  embargo,  los  niveles  máximos  de  activación  no  llegan  a  alcanzar  los 

mostrados en el  caso de RANK‐TNFR2 ni de  los mutantes RANK‐TNFR2‐ADD y RANK‐TNFR2‐

DAA, para lo que no hay una explicación clara. 

 

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐ TNFR2‐DAA

RANK‐ TNFR2‐AAD

RANK‐TNFR2‐Δ343‐378‐

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐378

241439SKAA AAAIIIAAD

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPL

343 379

III

241439SKAA AAAIIIDAA

241439SKAA AAAIII

241439SKEE KPLIIIAAD

241439SKEE KPLIIIDAA

241439SKEE KPL342 379III

241439SKAA AAA342 379III

Degradación TRAF2Interacción TRAF2

+

‐

‐‐

‐

+

+

+

+

+

‐

‐

‐

‐

‐

‐

        Resultados 

95 

 

 

Figura V‐26: Activación de NF‐κB por diversos receptores derivados de RANK‐TNFR2. Las células HEK293 se transfectaron con las cantidades que se indican de los plásmidos codificantes de los diferentes receptores.  A las 36 horas se determinó la actividad de NF‐κB en los extractos celulares como se describe en Métodos Se muestra la activación originada por el receptor RANK‐TNFR2 (A), por el receptor RANK‐TNFR2‐BKO (B),por el receptor RANK‐TNFR2‐Δ343‐379  (C)  y   por el  receptor RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐379  (D).  Se muestra  también  la expresión de  los receptores (paneles superiores) y los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores).  

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐β‐actina

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

5

4

3

2

1

0

1         0,05            0,1            0,5           1 μg DNA

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

48,8 KDa

65,8 KDa

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

4

3

2

1

0

1        0,5      0,05        0,1       0,5        1 μg DNA

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO

48,8 KDa

65,8 KDa

A B

μg DNA1      0,5        0,05        0,1         0,5  1  

RANK‐TNFR2

65,8 KDa

RANK‐TNFR2‐Δ343‐378pCMV1‐FLAG

Veces d

e activación

Veces d

e activación

μg DNA1      0,5       0,05  0,1          0,5           1  

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐378pCMV1‐FLAG

65,8 KDa

0

1

2

3

4

5

6

5

4

3

2

1

0

6 5

4

3

2

1

0

Activación NF‐кB Activación NF‐кB

C D

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐β‐actina48,8 KDa 48,8 KDa

Resultados 

96 

 

 

Figura V‐27: Activación de NF‐κB por diversos receptores derivados de RANK‐TNFR2. El procedimiento experimental fue como en la Figura V‐26. Se muestra la activación de NF‐κB desencadenada por el receptor RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD  (A),  por  el  receptor  RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA  (B),  por  el  receptor  RANK‐TNFR2‐AAD  (C)  y    por  el receptor RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA (D). Se muestra también  la expresión de  los receptores (paneles superiores) y  los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores).  

 

De los resultados mostrados en el presente apartado podemos concluir que: 

∗ La  inducción de  la degradación de TRAF2 por el TNFR2 es  independiente de  la 

unión de dicha proteína adaptadora al receptor. 

∗ Los  residuos  de  serina  localizados  en  las  posiciones  345‐346  y  348‐349  del 

receptor  son  responsables  de  la  inducción  de  la  degradación  de  TRAF2  por  el 

TNFR2. 

∗ Al  impedirse  la  degradación  de  TRAF2  por  el  TNFR2,  el  receptor muestra  una 

capacidad incrementada de activar a NF‐κB. 

 

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

5

4

3

2

1

0

48,8 KDa

65,8 KDa

1        0,5      0,05        0,1       0,5        1 μg DNA

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐DAA

5

4

3

2

1

0

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

1        0,5      0,05        0,1       0,5        1 μg DNA

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐AAD

48,8 KDa

65,8 KDaReceptor

(WB anti‐FLAG) 

WB anti‐β‐actina

Receptor(WB anti‐FLAG)

WB anti‐β‐actina

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

4

3

2

1

0

1        0,5      0,05        0,1       0,5        1 μg DNA

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA

48,8 KDa

65,8 KDa

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

4

3

2

1

0

1        0,5      0,05        0,1       0,5        1 μg DNA

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD

48,8 KDa

65,8 KDa

A B

C D

        Resultados 

97 

 

 

V.4 INTERACCIÓN FUNCIONAL ENTRE EL  TNFR1 Y  EL TNFR2 

El  TNFR1  y  el  TNFR2  son  los  dos  receptores  conocidos mediadores  de  las  respuestas 

biológicas del TNF. El TNFR2 activa señales de supervivencia y proliferación, no siendo capaz de 

desencadenar, en la mayoría de tipos celulares, procesos de muerte celular. Por el contrario, el 

TNFR1 puede activar vías antiapoptóticas como la activación de MAP quinasas y de NF‐кB y, a 

la vez desencadenar la  muerte celular por apoptosis. 

En este contexto, varios estudios, incluyendo los de  nuestro  laboratorio, apuntan hacia el 

hecho de que el TNFR2 puede influir sobre la señalización del TNFR1 aumentando la capacidad 

apoptótica de éste. El  factor clave en esta  interacción  funcional es  la proteína TRAF2, y más 

concretamente  su  degradación.  Así,  la  inducción  de  la  degradación  de  dicha  proteína 

adaptadora  por  el  TNFR2  supondría  una  potenciación  de  las  respuestas  apoptóticas 

desencadenadas  por  el  TNFR1  (Fotin‐Mleczek  et  al,  2002;  Rodriguez  et  al,  2011),  como 

consecuencia de la falta de activación de NF‐кB, señalización que tanto en el TNFR1 como en el 

TNFR2  depende  de  la  interacción  de  TRAF2  con  los  complejos  de  señalización  de  los 

receptores.  

Con  estos  antecedentes, nos hemos planteado  el  estudio de  esta  interacción  funcional, 

midiendo la activación de NF‐кB y la muerte celular desencadenadas por el TNFR1 en presencia 

de variantes del receptor quimérico RANK‐TNFR2 con capacidad de  inducir  la degradación de 

TRAF2 ó de mutantes del receptor en los que se ha abolido esta actividad.  

V.4.1 LA DEGRADACIÓN DE TRAF2 INDUCIDA POR EL TNFR2 AFECTA A LA ACTIVACIÓN DE 

NF‐кB POR EL TNFR1 

Como  se ha mostrado  en  apartados  anteriores,  a diferencia del  TNFR2,  el  TNFR1 no  es 

capaz  de  inducir  una  degradación  de  TRAF2  (Figura  V‐11).  Puesto  que  ambos  receptores 

requieren  de  su  interacción  con  TRAF2  para  la  activación  de  NF‐кB,  se  puede  poner  de 

manifiesto una importante diferencia entre ambos receptores en la dinámica de la  activación 

de dicho factor transcripcional. Así, en el caso del TNFR2   concentraciones altas del receptor 

son incapaces de activar a NF‐кB, lo que se corresponde con su  capacidad de degradación de 

TRAF2 (Figura V‐16). En cambio, en el caso del  TNFR1 no se induce una degradación de TRAF2, 

lo  que  se  corresponde  con  una  creciente  capacidad  de  activación  de NF‐кB  al  aumentar  la 

cantidad expresada del receptor (ver Figura V‐28).  

Resultados 

98 

 

 

Figura  V‐28:  Activación  de NF‐кB  por  TNFR1.  Las  células  HEK293  se  transfectaron  con  las  cantidades crecientes  indicadas  de  pTNFR1,  ó  con  pCMV1‐FLAG  (control),  manteniéndose  siempre  constante  la  cantidad transfectada de DNA  con pCMV1‐FLAG,  junto  con 0,05 µg de pRL‐TK y 0,4 µg de pNF‐кB‐luc.   A  las 36 horas  se determinó  la actividad de NF‐κB en  los extractos celulares como se describe en Métodos. Se muestra  también  la expresión del receptor (panel superior)  y los controles de carga de la electroforesis (panel inferior).  

 

A  continuación  estudiamos  el  efecto  de  la  degradación  de  TRAF2  por  el  TNFR2  en  la 

activación  de  NF‐кB  cuando  ambos  receptores  se  encuentran  activados.  Para  ello  se  co‐

expresaron en células HEK293 el TNFR1 y  cantidades crecientes del  receptor RANK‐TNFR2 ó 

distintas variantes de éste. En concreto, se co‐expresaron RANK‐TNFR2‐BKO  (que no activa a 

NF‐кB  pero  degrada  a  TRAF2,  Figura V‐26),  RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD  ó  RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA 

[con mutaciones puntuales que impiden la degradación de TRAF2 (Figura V‐24) y que no unen 

TRAF2 ni son capaces de activar a NF‐кB (Figura V‐27)].  

Como se observa en  la Figura V‐29,  la expresión conjunta del TNFR1 y de receptores 

capaces de degradar a TRAF2 (RANK‐TNFR2 y RANK‐TNFR2‐BKO) tiene un efecto negativo en la 

actividad  de NF‐кB  (Figura  V‐29‐B  y  C  respectivamente).  Por  el  contrario,  al  co‐expresar  el 

TNFR1    y  versiones mutadas  de  RANK‐TNFR2  incapaces  tanto  de  unir  como  de  degradar  a 

TRAF2 (RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD y RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA), no se observa el efecto inhibidor de 

NF‐кB por cantidades altas receptor (Figura V‐29‐D y E).  

 

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

NF‐кB

7

6

5

3

2

1

0

4

pCMV1‐FLAG TNFR1

µg DNA1                    0,05                  0,1                    0,5                  1

WB anti‐TNFR1

WB anti‐β‐actina48,8 KDa

65,8 KDa

        Resultados 

99 

 

 

Figura V‐29: Efecto de la co‐expresión de diversos receptores RANK‐TNFR2 y de TNFR1 en la activación de  NF‐кB.  A)  Representación  esquemática  de  los  receptores  RANK‐TNFR2  analizados.  La  representación esquemática es como en  la Figura  III‐1. Se  representan ambos  sitios de  interacción  con TRAF2,  con  sus  residuos originales o mutados, así como las mutaciones puntuales de los residuos de serina implicados en la degradación de TRAF2 (ADD y DAA).   Activación de NF‐кB por TNFR1 y RANK‐TNFR2 (B), TNFR1 y RANK‐TNFR2‐BKO (C), TNFR1 y RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD (D) ó TNFR1 y RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA (E). Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de pTNFR1  junto  con  las  cantidades  indicadas  de  los  plásmidos  codificantes  de  cada  receptor,  manteniéndose constante la cantidad total de DNA transfectado con pCMV1‐FLAG, así como con 0,05 µg de pRL‐TK y 0,4 µg de pNF‐кB‐luc. A las 36 horas se determinó la actividad de NF‐κB en los extractos celulares como se describe en Métodos. Se muestra también la expresión de los receptores  (paneles superiores e intermedios) y los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores).  

A

RANK‐TNFR2241

439SKEE KPL

RANK‐ TNFR2‐BKO 439

241SKAA AAAIII

RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD

241439SKAA AAA

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA SKAA AAA241

439

439DAA

B C

D E 

Veces d

e activación

Activación NF‐кB12

10

8

6

4

2

0

TNFR1

RANK‐TNFR2

0               1                1               1                1                1

0               0            0,0 5          0,1             0,5              1μg DNA

Veces d

e activación

Activación NF‐кB

6

5

4

3

2

10

7

8

Veces d

e activación

Activación NF‐кB6

5

4

3

2

1

0

TNFR1

RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD

0               1                1               1                1                1

0               0            0,0 5          0,1             0,5              1μg DNA

TNFR1

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA

0               1                1               1                1                1

0               0            0,0 5          0,1             0,5              1μg DNA

WB anti‐TNFR1

Receptor(WB anti‐FLAG )

WB anti‐β‐actina48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

Veces d

e activación

Activación NF‐кB10

8

6

4

2

0

TNFR1

RANK‐TNFR2‐BKO

0               1                1               1                1                1

0               0            0,0 5          0,1             0,5              1μg DNA

48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDaWB anti‐TNFR1

Receptor(WB anti‐FLAG )

WB anti‐β‐actina

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

III

III

IIIAAD

III

Resultados 

100 

 

A continuación llevamos a cabo el mismo tipo de estudio pero co‐expresando  TNFR1 con 

receptores RANK‐TNFR2 capaces de unir TRAF2, y por tanto de activar a NF‐кB, pero a  la vez 

incapaces de  inducir  la degradación de dicha proteína adaptadora. Así, se co‐expresaron con 

TNFR1  los  receptores  RANK‐TNFR2‐AAD  y  RANK‐TNFR2‐DAA,  en  los  que  se  han  mutado 

respectivamente  la primera  y  la  segunda pareja de  serinas  implicadas en  la  inducción de  la 

degradación de TRAF2, pero que mantienen  intactos los dos sitios de unión a TRAF2 

 

Figura V‐30: Efecto de la co‐expresión de diversos receptores RANK‐TNFR2 y de TNFR1 en la activación de  NF‐кB.  A)  Representación  esquemática  de  los  receptores  RANK‐TNFR2  analizados.  La  representación esquemática es como en la Figura III‐1. Activación de NF‐кB por TNFR1 y RANK‐TNFR2‐AAD (B) ó RANK‐TNFR2‐DAA (C). Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de pTNFR1  junto con  las cantidades  indicadas de  los plásmidos codificantes de cada receptor manteniéndose constante  la cantidad  total de DNA  transfectado con pCMV1‐FLAG, así como con 0,05 µg de pRL‐TK y 0,4 µg de pNF‐кB‐luc. A  las 36 horas se determinó  la actividad de NF‐κB en  los extractos celulares como se describe en Métodos. Se muestra la expresión de los receptores (paneles superiores e intermedios) y los controles de carga de la electroforesis (paneles inferiores). 

Como  se observa en  la Figura V‐30, al  co‐expresiarse   TNFR1  con variantes del  receptor 

RANK‐TNFR2 incapaces de degradar a TRAF2 no sólo no aparece la fase de inhibición de NF‐κB 

con cantidades altas del receptor, sino que se potencia la activación producida por el TNFR1. 

V.4.2 LA DEGRADACIÓN DE TRAF2  INDUCIDA  POR  EL TNFR2 AUMENTA  LA  CAPACIDAD 

APOPTÓTICA DEL TNFR1. 

Estudios previos de nuestro  laboratorio  y de otros  autores han puesto de manifiesto  la 

capacidad del TNFR2 de potenciar  la apoptosis desencadenada por el TNFR1 (Rodriguez et al, 

2011). Por ello nos planteamos estudiar del papel que la degradación de TRAF2  inducida por el 

RANK‐TNFR2

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPLIIIAAD

241439SKEE KPLIIIDAARANK‐ TNFR2‐DAA

RANK‐ TNFR2‐AAD

241439SKEE KPLI

Veces d

e activación

Veces d

e activación

Activación NF‐κB

NF‐кB

0

10

8

6

4

2

Activación NF‐κB

NF‐кB

2

0

10

8

6

4

TNFR1RANK‐TNFR2‐AAD

0               1                1               1                1                1

0               0            0,0 5          0,1             0,5              1μg DNA

TNFR1RANK‐TNFR2‐DAA

0               1                1               1                1                1

0               0            0,0 5          0,1             0,5              1

WB anti‐TNFR1

Receptor(WB anti‐FLAG )

WB anti‐β‐actina48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

48,8 KDa

65,8 KDa

65,8 KDa

A

B C

III

        Resultados 

101 

 

TNFR2  juega en esta    interacción  funcional. Para ello, determinamos  la muerte celular al co‐

expresarse  TNFR1  y RANK‐TNFR2    ó  variantes  de  este  receptor  con  diferente  capacidad  de 

inducir la degradación deTRAF2.  

 

Figura V‐31: Inducción de apoptosis por TNFR1, RANK‐TNFR2 ó receptores mutantes derivados de RANK‐TNFR2.  A)  Representación  esquemática  de  TNFR2  y  de  los  receptores  derivados  de  TNFR2  analizados.  La representación esquemática es como en la Figura III‐1. B) Determinación del porcentaje de células hipodiploides. Las células HEK 293 se transfectaron con 1 µg de los plásmidos codificantes de cada uno de los receptores indicados ó  pCMV1‐FLAG  (control  negativo),  así  como  con  0,2  µg  d  pE‐GFP.  Tras  36  horas,  las  células  se  recogieron  y  se procesaron para la determinación del ciclo celular por citometría de flujo en las células positivas para GFP, como se describe en Métodos. En el eje de abscisas se representa  la  intensidad de  la  fluorescencia del  ioduro de propidio (canal FL3). El marcador M1 selecciona únicamente  la población sub G0/G1,  indicándose el porcentaje de células hipodiploides en cada caso. 

III

III

4,06% 23,96%

Control TNFR1 RANK‐TNFR25,72% 5,99%

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD

6,02%2,07% 6,99% 7,43%

RANK‐TNFR2‐BKO‐DAA

RANK‐TNFR2‐AAD RANK‐TNFR2‐DAA

A

B

241439SKAA AAADAA

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐ TNFR2‐DAA

RANK‐ TNFR2‐AAD

241439SKAA AAAAAD

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPLI

241439SKAA AAAI

241439SKEE KPLAAD

241439SKEE KPLDAA

III

III

III

III

Resultados 

102 

 

 Figura V‐32: Inducción de apoptosis por TNFR1, RANK‐TNFR2, por co‐expresión de TNFR1 y RANK‐TNFR2 

ó co‐expresión de TNFR1 y receptores mutantes derivados de RANK‐TNFR2. A) Representación esquemática de los receptores analizados. La representación esquemática es como en la Figura III‐1. Se indica también la capacidad de cada receptor de interaccionar y degradar a TRAF2. B) Determinación del porcentaje de células hipodiploides. Las células HEK 293 se transfectaron con los plásmidos codificantes de los receptores que se indican y se procesaron para su análisis como en la Figura V‐31. 

III

III

8,40% 22,95% 5,25%

1 μg pRANK‐TNFR21 μg pTNFR1CONTROL

48,15% 42,68%

1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2‐BKO

25,04%

1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2‐BKO‐ADD

25,37 24,19

1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2‐DAA

23,13%

1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2

1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2‐BKO‐DAA

1 μg pTNFR1 + 1 μg pRANK‐TNFR2‐AAD

A

B

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐ TNFR2‐DAA

RANK‐ TNFR2‐AAD

241439SKAA AAAIAAD

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPLI

241439SKAA AAAIDAA

241439SKAA AAAI

241439SKEE KPLIIIAAD

241439SKEE KPLIIIDAA

Degradación TRAF2Interacción TRAF2

+

‐

‐

‐

+

+

+

+

‐

‐

‐

‐

III

III

        Resultados 

103 

 

Inicialmente  comprobamos  que  dichos  receptores  RANK‐TNFR2  no  son  capaces  de 

desencadenar  por  sí  mismos  un  proceso  apoptótico.  Además,  las  células  HEK293se 

transfectaron con un plásmido codificante de la proteína verde fluorescente GFP que permite 

la selección de las células transfectadas, estudiando en esta población el porcentaje de células 

hipodiploides.    

Como  se  observa  en  la  Figura  V‐31,  ni  el  receptor  RANK‐TNFR2  ni  ninguno  de  los 

mutantes del mismo analizados son capaces de desencadenar la muerte celular por sí mismos, 

lo  que  contrasta  con  la  alta  actividad  apoptótica  del  TNFR1.  A  continuación,  analizamos  la 

muerte celular en células en  las que se co‐expresaron TNFR1 y RANK‐TNFR2 ó algunos de  los 

mutantes derivados de éste. 

 

En Figura V‐32 se observa la capacidad de RANK‐TNFR2 de potenciar la apoptosis inducida 

por  TNFR1  y  que  esta  capacidad  de  potenciación  se  conserva  siempre  que  el  receptor  co‐

expresado con TNFR1 mantenga  la capacidad de degradar a TRAF2,  independientemente de 

que los receptores sean capaces o no de unir TRAF2. 

 

De los resultados mostrados en el presente apartado, podemos concluir que: 

∗ La  degradación  de  TRAF2  por  el  TNFR2  ejerce  un  efecto  inhibitorio  sobre  la 

capacidad  del  TNFR1  de  activar  a  NF‐κB  y,  simultáneamente,  potencia  su 

capacidad citotóxica cuando ambos receptores son expresados conjuntamente. 

∗ Los receptores derivados del TNFR2 incapaces de degradar a TRAF2 no potencian  

el  efecto  citotóxico  del  TNFR1  ni  inhiben  la  activación  de  NF‐κB  cuando  se 

expresan conjuntamente.  

V.5 ESTUDIO FUNCIONAL DE LAS REGIONES DEL TNFR2 RESPONSABLES DE 

LA ACTIVACIÓN DE JNK 

Una de las principales vías de señalización  iniciada por el TNFR2 conduce a la activación de 

JNK.  Estudios  previos  realizados  en  nuestro  laboratorio  han  puesto  de manifiesto  que  gran 

parte de  la capacidad del TNFR2 de activar a  JNK   depende   de su previa unión con TRAF2 a 

través de  los dos  sitios descritos de unión al  receptor. Sin embargo, esta actividad depende 

también    de  los  aminoácidos  comprendidos  entre  las  posiciones  343  y  378  del  receptor 

(Rodriguez, 2006), a través de los cuales no se produce una unión con TRAF2 (ver Figura V‐3). 

Resultados 

104 

 

Por  ello,  nos  propusimos  identificar  los  residuos  concretos  implicados  en  dicha  actividad 

mediante el análisis funcional de variantes del receptor quimérico RANK‐TNFR2 que presentan 

diversas deleciones y mutaciones puntuales en su región intracelular.  

 

Figura V‐33: Estudio de la unión con TRAF2 y de la activación de JNK por RANK‐TNFR2‐BKO y RANK‐TNFR2‐343‐378. A) Representación esquemática de los receptores quiméricos RANK‐TNFR2‐BKO y RANK‐TNFR2‐343‐379.  La representación esquemática es como en  la Figura  III‐1. Se destacan  las secuencias mutadas SKAA y AAA de  los sitios de unión a TRAF2. B) Análisis de la unión con TRAF2. Las células HEK293 se transfectaron con 1 µg de pRANK‐TNFR2‐BKO  (izquierda), pRANK‐TNFR2‐343‐379  (derecha), pRANK‐TNFR2 ó pCVM1‐FLAG, como control,  junto con 0,5  µg  de  pTRAF2.  A  las  24  horas  se  realizaron  ensayos  de  coinmunoprecipitación  del  TNFR2  y  TRAF2  en  los extractos celulares (paneles superiores). Se muestra también la expresión de TRAF2 (paneles intermedios) y de los receptores  (paneles  inferiores).  C)  Activación  de  JNK.  Las  células  HEK293  se  transfectaron  con  los  plásmidos codificantes de  los  receptores  indicados en  (B) y con 1 µg de pHA‐JNK Tras 36 horas,  las células  se  recogieron y lisaron,  inmunoprecipitándose  JNK con el anticuerpo anti‐HA, midiéndose  la actividad  JNK del  inmunoprecipitado como se describe en Métodos.  Se muestra el resultado de los análisis y la cuantificación de los mismos. 

Como  paso  previo  analizamos  la  capacidad  de  activación  de  JNK  y  de  interacción  con 

TRAF2  de  los  receptores  RANK‐TNFR2‐BKO  (presenta mutados  ambos  sitios  de  unión  con 

TRAF2)  y  RANK‐TNFR2‐343‐378  (cuya  región  intracelular  está  formada  únicamente  por  los 

A

RANK‐TNFR2‐BKO241

439SKAA AAAIII

343 379

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

WB anti‐TRAF2

Receptor(WB anti‐FLAG)

IP anti‐FLAG (anti‐receptor)WB anti‐TRAF2

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐TNFR2241

439SKEE KPLIII

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

B

CWB anti‐c‐Jun‐fosforilado

(Ser73)48,8 KDa

0

2

4

6

8

10

RANK‐TNFR2‐343‐378241

378III343

64,2 KDa

64,2 KDa

64,2 KDa

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2343‐378

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2‐BKO

0

5

10

15

20

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2343‐378

48,8 KDa

Veces d

e activación

Fosforilación c‐Jun

Veces d

e activación

Fosforilación c‐Jun

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐TNFR2

pCMV1‐FLAG

RANK‐TNFR2343‐378

        Resultados 

105 

 

aminoácidos comprendidos entre las posiciones 343‐378 del TNFR2). Los resultados obtenidos 

se muestran en la Figura V‐27.) 

Para estudiar  la  interacción  con TRAF2,  las  células HEK293  se  transfectaron  con pRANK‐

TNFR2, p‐RANK‐TNFR2‐BKO  ó pRANK‐TNFR2‐343‐379 junto con pTRAF2 realizándose ensayos 

de coinmunoprecipitación a las 24 horas. Para el estudio de la activación de JNK las células se 

transfectaron con los plásmidos codificantes de cada uno de los receptores, así como con pHA‐

JNK, recogiéndose las células a las 36 horas y analizándose la actividad de JNK  en los extractos 

celulares. 

Como se observa en la Figura V‐33, ninguno de los dos receptores mutados une TRAF2. Sin 

embargo,  ambos mantienen  cierta  capacidad  de  activar  a  JNK  en  comparación  con  RANK‐

TNFR2, poniendo de manifiesto que el receptor tiene dos  regiones implicadas en la activación 

de JNK, una de ellas depende de la unión de TRAF2 y otra (comprendida entre los aminoácidos 

343 y 379) es independiente de dicha unión.  

A  la vista de estos resultados nos propusimos  identificar  los aminoácidos concretos de  la 

región 343‐379 responsables de dicha actividad. 

Puesto que el estudio de  la capacidad de degradación de TRAF2 por el TNFR2 nos  llevó a 

identificar  a  las  serinas  localizadas  en  las  posiciones  345‐346  y  348‐349  del  receptor  como 

responsables de dicha actividad, nos planteamos la posibilidad de que también los residuos de 

serina del módulo 343‐378 estuvieran implicados en la activación de JNK. 

El  análisis  del  perfil  de  fosforilación  realizado  (ver  Figura  V‐23) muestra  que  de  los  11 

residuos  de  serina  que  se  localizan  en  la  región  343‐378,  7  de  ellos  presentan  una  alta 

probabilidad de ser fosforilados. Por ello, decidimos analizar la capacidad de activación de JNK 

de 4 receptores RANK‐TNFR2 en donde se encuentran mutadas una pareja de serinas. De estas 

4 parejas, 3 de ellas  (345‐346, 348‐349 y 372‐373) están constituidas por  residuos de serina 

con una  alta probabilidad de  experimentar una  fosforilación, mientras que  la  cuarta pareja 

(residuos  376‐377)  tiene  una  baja  probabilidad  de  fosforilación.  Cabe  destacar  que  estos 

nuevos  receptores,  además  de  tener mutadas  las  parejas  de  serinas  del módulo  343‐379, 

presentan mutados los dos sitios de unión con TRAF2. De esta manera, se analizó la capacidad 

de  activar  a  JNK  dependiente  de  la  secuencia  343‐378  pero  independiente  de  la  unión  de 

TRAF2 al receptor   

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura V‐34, donde se observa que ninguno de 

los  receptores  en  los  que  se  mutaron  las  serinas  susceptibles  de  fosforilación  perdió  su 

capacidad  de  activación  de  JNK  (independiente  de  TRAF2).  Únicamente  en  el  análisis  del 

Resultados 

106 

 

receptor RANK‐TNFR2‐BKO‐CAA (en el que se mutaron las dos serinas con baja probabilidad de 

fosforilación) se observó una reducción parcial de la activación de JNK 

 

Figura V‐34: Activación de JNK por receptores RANK‐TNFR2‐BKO con mutaciones puntuales en la región 343‐379.  A)  Representación  esquemática  de  los  receptores  RANK‐TNFR2  analizados.  La  representación  de  los receptores es como en la Figura III‐1. Se indican tanto las mutaciones puntuales de los sitios de unión a TRAF2 como de  los residuos del módulo 343‐378. B) Análisis de  la activación de JNK. Las células HEK293 fueron transfectadas con 1  μg de  los plásmidos codificantes de cada uno de  los  receptores  indicados y con 1  μg de pHA‐JNK. Tras 36 horas,  las  células  se  recogieron  y  lisaron,  inmunoprecipitándose  JNK  con  el  anticuerpo  anti‐HA.  Se  ensayó  la actividad  JNK  del  inmunoprecipitado  como  se  describe  en Métodos.  Se muestra  el  análisis  de  actividad  (panel superior) y la expresión de los receptores (panel inferior). C) Cuantificación del ensayo de activación de JNK.   

De los resultados mostrados en este apartado podemos concluir que: 

∗ La activación de JNK por TNFR2  depende de dos  regiones del receptor: una en 

la que  la activación depende de  la unión de TRAF2 y otra  (comprendida entre 

aminoácidos 343 y 378) que es independiente de la unión de TRAF2.  

∗ La  región  343‐378  del  TNFR2  contiene  varios  residuos  de  serina  que  son 

potenciales  sustratos  de  fosforilación  por  proteínas  quinasas.  Sin  embargo, 

ninguno de ellos parece jugar un papel importante en la activación de JNK. 

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAQ

241

RANK‐ TNFR2‐BKO‐CAA

241

439SKAA AAAIII CAA

439SKAA AAAIII AAQ

241

439SKAA AAAIIIDAA

241

439SKAA AAAIIIAAD

A

B

RANK‐TNFR2

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241

439SKEE KPL

343 379

III

WB anti‐c‐Jun‐fosforilado(Ser73)

64,2 KDa

48,8 KDa

WB anti‐FLAG (anti‐receptor) Veces d

e activación

Fosforilación c‐Jun

12

10

8

6

4

2

0

C

        Resultados 

107 

 

V.6 GENERACIÓN  Y  ESTUDIO  DE  UN  SISTEMA  DE  EXPRESIÓN  ESTABLE  Y 

PERMANENTE DEL RECEPTOR QUIMÉRICO RANK‐TNFR2 

V.6.1 GENERACIÓN DE  LÍNEAS  CELULARES TRANSFECTANTES  ESTABLES DEL RECEPTOR 

QUIMÉRICO RANK‐TNFR2: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL 

Como  se  ha  comentado  anteriormente,  el  TNFR2  únicamente  se  activa  por  la  forma 

transmembrana  del  TNF  (mTNF),  que  también  activa  al  TNFR1,  lo  que  complica  el  estudio 

individualizado de la transducción de las señales iniciadas por cada receptor. 

Por  ello,  nos  planteamos  la  generación  del  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2,    (el  cual 

hemos comprobado  es equiparable funcionalmente al TNFR2), y la incorporación de su cDNA 

al DNA genómico de una línea celular de interés. Tras la expresión de este receptor quimérico, 

podremos activarlo selectivamente con RANKL (ligando activador del receptor RANK). Por otra 

parte,  si  las  células  seleccionas  expresan  naturalmente  TNFR1,  éste  podrá  ser  activado  con 

sTNF.  

Teniendo  en  cuenta  que  el  TNFR1  se  expresa  en  la  mayor  parte  de  las  células,  nos 

centramos  en  la  elección  de  una  línea  celular  que  no  expresase  RANK,  de manera  que  el 

tratamiento con RANKL induzca respuestas que sean consecuencia únicamente de la activación 

del receptor RANK‐TNFR2.  

 

Figura  V‐35:  Fosforilación  de  IкBα  tras  el  tratamiento  con  RANKL.  Las  células  L929  y  RAW247.6,  se estimularon  con  las  concentraciones de RANKL   que  se  indican  (de 50 a 600 ng/µl) durante 10 minutos. Tras el tratamiento se midió la cantidad de  IкBα fosforilado en los extractos mediante análisis Western. 

Puesto que los estudios iniciales de identificación del TNF y de sus receptores se llevaron a 

cabo en la línea celular L929 (derivada de  fibroblastos murinos) y, por otra parte, numerosos 

estudios de señalización de los TNFRs se han realizado en las células RAW247.6, exploramos la 

activación de NF‐кB por RANKL en estas líneas celulares. En este caso se midió la fosforilación 

de  IкB‐α  tras el  tratamiento  con el  ligando. Como  se observa en  Figura V‐35, en  las  células 

0        50      100       200     400     600         ng/µl RANKL

Células L929

Células RAW246.7

WB anti‐P‐IкBα64,2 KDa

64,2 KDa WB anti‐P‐IкBα

Resultados 

108 

 

RAW247.6  se observa una  fosforilación basal de  IкB‐α que aumenta  tras el  tratamiento  con 

RANKL,  lo que no ocurre en el caso de las células L929. Este resultado nos indujo a seleccionar 

esta  línea  celular para  la generación de  líneas  celulares  transfectantes estables del  receptor 

quimérico RANK‐TNFR2. 

Una vez elegida  la  línea celular,  se procedió a  la obtención de  líneas que expresaran de 

manera estable diversos  receptores RANK‐TNFR2. En concreto, se generaron 4 nuevas  líneas 

derivadas de L929  en las que se había  insertado de manera estable en su genoma los cDNAs 

codificantes  de  los  receptores  quiméricos  RANK‐TNFR2,  RANK‐TNFR2‐Δ379,  RANK‐TNFR2‐

Δ343 y RANK‐TNFR2‐Δ402. También se obtuvo una  línea celular en  la que se  insertó el cDNA 

codificante de las regiones extracelular y transmembrana de RANK (RANKec), que se usó como 

control negativo en los sucesivos ensayos. 

Para ello, se generaron partículas virales mediante la transfección de las células GP2 con el 

plásmido  de  expresión  retroviral  pBABE  en  el  que  se  encuentran  clonados  los  cDNAs 

codificantes  de  los  receptores  quiméricos  de  interés  contiguos  al  DNA  codificante  de  la 

proteína fluorescente GFP, separados ambos por  la secuencia  IRES, que permite  la expresión 

independiente de cada proteína. Posteriormente, las células L929 fueron infectadas con dichas 

partículas, como se describe en Métodos. Como resultado del proceso de infección y posterior 

selección  con  el  antibiótico  puromicina,  se  observó  un  elevado  número  de  células 

fluorescentes  verificándose  tanto mediante microscopía  de  fluorescencia  como  por  análisis 

citométrico  la  eficacia  del  proceso  de  infección  y  selección.    Los  resultados  obtenidos  se 

muestran en la Figura V‐36. 

Una  vez  aislados  los  clones    se  comprobó    mediante  PCR  la  inserción  de  los  cDNA 

codificantes de la proteína GFP y de los receptores  RANK‐TNFR2 en el DNA genómico de cada 

una de  las nuevas  líneas celulares. También  se comprobó mediante RT‐PCR  la expresión del 

TNFR1, de la proteína GFP y de los receptores quiméricos. La expresión de estos dos últimos se 

analizó también mediante análisis Western. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 

V‐37, en la Figura V‐38 y en la Figura V‐39. 

 

        Resultados 

109 

 

 

Figura V‐36: Comprobación del proceso de selección de clones estables que expresan RANK‐TNFR2 ó sus derivados  por  expresión  de  la  proteína  verde  fluorescente  GFP.    Cada  una  de  las  líneas  celulares  L929  que expresan  de  manera  estable  los  receptores  quiméricos  RANK‐TNFR2  se  visualizaron  mediante  microscopía fluorescente  observándose  un  elevado  porcentaje  de  células  fluorescentes  tras  el  proceso  de  selección  con puromicina. Las células   de cada cultivo se recogieron, se  lavaron con PBS y se determinó mediante citometría de flujo  el  porcentaje  de  células  positivas  para  GFP.  En  el  eje  de  abscisas  (FL1)  se  representa  la  intensidad  de fluorescencia correspondiente a la GFP. Se indica así mismo el porcentaje de células positivas en la ventana M1. 

1,26% 81,54%

95,34% 87,07%

81,37%

86,85%

L929 wt L929 RANKec L929RANK‐TNFR2

L929RANK‐TNFR2‐Δ379 L929 RANK‐TNFR2‐Δ403 L929 RANK‐TNFR2‐Δ343

Resultados 

110 

 

 

Figura V‐37: Análisis de DNA genómico de los clones que han incorporado el cDNA de RANK‐TNFR2. Se extrajo el DNA genómico de las células L929 y de cada una de las líneas en las que se insertó el cDNA codificante de los diferentes  receptores RANK‐TNFR. Mediante PCR  se comprobó  la presencia de  las  secuencias codificantes de GAPDH (1). De GFP (2) y de los  receptores quiméricos RANK‐TNFR2 (3).  

 

Figura V‐38: Análisis mediante RT‐PCR de  la expresión de  los  receptores quiméricos RANK‐TNFR2. Se extrajo el mRNA de las células L929 y de cada una de las líneas celulares en las que se insertó el cDNA codificante de los  diferentes  receptores  RANK‐TNFR2,  realizándose  posteriormente  ensayos  de  retrotranscripción  como  se describe en Métodos.  Se estudió la expresión del TNFR1 (1), de GFP (2), de RANK‐TNFR2 (3) y de RANKec (4).  

 

Figura  V‐39:  Análisis mediante  ensayo Western  de  la  expresión  de  los  diferentes  receptores  RANK‐TNFR2 y de la proteína GFP. Se prepararon  extractos de las células L929 y de cada una de las líneas celulares en las que  se  insertó  el  cDNA  codificante  de  los  diferentes  receptores  RANK‐TNFR2  y    se  estudió mediante  análisis Western   la expresión de los receptores RANK‐TNFR2 (A) y de GFP (B).   

L929 L929RANKec L929RANK‐TNFR2 L929RANK‐TNFR2‐Δ 379

L929RANK‐TNFR2‐Δ403

L929RANK‐TNFR2‐Δ343

1       2      3 1       2      3 1       2      3 1       2      3 1       2     3 1       2     3

1‐GAPDH.2‐GFP.3‐ Receptor RANK‐TNFR2

L929 L929RANKec L929RANK‐TNFR2 L929RANK‐TNFR2‐Δ 379

L929RANK‐TNFR2‐Δ403

L929RANK‐TNFR2‐Δ343

1       2     3      4  1       2      4 1       2      3 1       2      3 1       2     3 1       2     3

1‐ TNFR1.2‐GFP.3‐ Receptor RANK‐TNFR24‐ Receptor RANKec

48,8 KDa

64,2 KDa

38,6 KDa

38,6 KDa

A B

WB anti‐RANK

WB anti‐GFP

        Resultados 

111 

 

Finalmente,  estudiamos mediante microscopía  confocal  la  localización  subcelular  de  la 

proteína  GFP  y  de  los  receptores  quiméricos.  Los  resultados  obtenidos  se muestran  en  la 

Figura V‐40. 

 

Figura  V‐40:  Estudio  mediante  microscopía  confocal  de  la  localización  subcelular  de  los  receptores quiméricos RANK‐TNFR2.    Las  células  L929    y  las  distintas  líneas  celulares  que  expresan  de manera  estable  las  variantes  del  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  fueron  incubadas  los  clones  que  expresan  de  manera  estable receptores quiméricos RANK‐TNFR2 fueron permeabilizadas, fijadas y posteriormente  incubadas con el anticuerpo primario anti‐FLAG. Como anticuerpo secundario se usó anti  IgG de  ratón marcado con el colorante  fluorescente Alexa633 (rojo). El núcleo celular se tiñó con el colorante DAPI (azul). Se muestran las imágenes obtenidas debida a la  fluorescencia verde de  la proteína GFP  junto con el azul del DAPI  (paneles de  la  izquierda),   y  las debidas a  la fluorescencia roja  del colorante Alexa655 junto con el azul del DAPI (paneles del medio), así como el solapamiento de las dos imágenes anteriores (paneles de la derecha). Se muestran únicamente las imágenes obtenidas en el caso de L929‐RANKec, L929‐RANK‐TNFR2 y L929‐RANK‐TNFR2‐Δ379. 

Como  se  observa  en  la  Figura  V‐40,  tanto  la GFP  como  los  receptores  RANK‐TNFR2  se 

localizan  en  todo  el  citoplasma,  intensificándose  la  señal  a  nivel  nuclear  en  el  caso  de  la 

proteína GFP.   A diferencia de  los estudios de  localización  realizados en  las  células HEK293 

(Figura V‐19) no se observa en ningún caso señal de localización en membrana plasmática. 

GFP+ DAPI Receptor+ DAPI Solapamiento

L929‐RANKec

L929‐RANK‐TNFR2

L929‐RANK‐TNFR2‐Δ379

Resultados 

112 

 

Por ello, para comprobar si los receptores quiméricos RANK‐TNFR2  se expresan a nivel de 

membrana  celular  en  los  clones  de  expresión  estable  seleccionados,  procedimos  al  análisis 

mediante citometría de flujo  de células intactas. 

Para  ello,  las distintas  líneas  celulares  sin permeabilizar  se  incubaron  con  el  anticuerpo 

primario  anti‐FLAG  y  el  anticuerpo  secundario marcado  con  Alexa633,  como  se  detalla  en 

Métodos.  Posteriormente,  se  analizó mediante  citometría  de  flujo  el  porcentaje  de  células 

positivas  emisoras  de  la  fluorescencia  debida  al  anticuerpo  secundario  fluorescente.  Como 

control  se analizaron  las células L929 originales. Los  resultados obtenidos  se muestran en  la 

Figura V‐41. 

  Figura V‐41:  Expresión  en  la  superficie  celular  de  los  receptores  RANK‐TNFR2.  Las  células  L929  y  las 

distintas líneas celulares que expresan de manera estable las  variantes del receptor quimérico RANK‐TNFR2 fueron incubadas,  sin  permeabilización  previa,  con  el  anticuerpo  anti‐FLAG  y  después  con  el  anticuerpo  secundario marcado  con  el  colorante  fluorescente    Alexa633. Mediante  citometría  de  flujo  se  determinó  el  porcentaje  de células positivas  en cada población celular, que se indica en la ventana M1. 

En la Figura V‐41 se observa que, en comparación con la línea L929, las diversas líneas 

generadas  que  expresan  de manera  estable  los  receptores  quiméricos muestran  un  claro 

aumento de la señal debida al anticuerpo secundario. Esto indica que, a pesar de no observar 

localización  en membrana  celular mediante  ensayos  de  inmunocitoquímica,  los  receptores 

quiméricos se expresan en la membrana celular. 

Con todos estos resultados podemos concluir que  las  líneas generadas a partir de  las 

células L929 y descritas a  lo  largo del presente apartado han  integrado de manera estable en 

5,76%

99,92%

94,95% 94,74%

91,13% 93,61%

L929 L929‐RANKec L929‐RANK‐TNFR2

L929 RANK‐TNFR2‐Δ379 L929‐RANK‐TNFR2‐Δ402 L929‐RANK‐TNFR2‐Δ343

        Resultados 

113 

 

su  genoma  los  cDNAs  codificantes  de  los  diversos  receptores  quiméricos  RANK‐TNFR2 

descritos,  así  como  el  de  la  proteína  verde  fluorescente  GFP,  expresándose  ambas 

eficientemente y localizándose en la superficie celular. 

V.6.2 EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA ACTIVACIÓN DE TNFR1 Y TNFR2 (RANK‐TNFR2)  

Para corroborar la interacción funcional entre el TNFR2 y el TNFR1 (ver apartado V.4), nos 

planteamos  la  realización de ensayos  in vivo en  las  líneas derivadas de  las células L929   que 

expresan de manera estable  los receptores RANK‐TNFR2. Para ello  las células se trataron con 

TNF  soluble  (que  activa  al  TNFR1),  con  RANKL  (Ligando  de  RANK,  que  activa  al  receptor 

quimérico RANK‐TNFR2, desencadenando  la  señalización del TNFR2) ó con ambas citoquinas 

(activándose  los  dos  recetores),  estudiándose  la  viabilidad  celular  así  como  distintos 

marcadores de muerte celular.  

Para el estudio de  la viabilidad celular  las distintas  líneas celulares se trataron con RANKL 

(5 ng/ml) ó TNF (5 ng/ml) durante 48 horas. También se llevaron a cabo pretratamientos (entre 

30 minutos y 12 horas)  con RANKL seguidos de un tratamiento conjunto con ambas citoquinas 

durante 48 horas. Posteriormente, se analizó el porcentaje de células vivas mediante  tinción 

de las mismas con cristal violeta, como se describe en Métodos (ver Figura V‐42 y Figura V‐43).  

Podemos destacar que en  todos  los casos el  tratamiento con TNF  (activación de TNFR1) 

durante  48h reduce la viabilidad celular aproximadamente un 30‐40%. Por el contrario y como 

cabe esperar, el  tratamiento  con RANKL  (activación de TNFR2) apenas  tiene efecto  sobre  la 

viabilidad celular. Por otro lado, se observa un  importante incremento en el efecto citotóxico 

del TNF (se llega a una viabilidad del 20%) tras el tratamiento conjunto de RANKL y TNF en el 

caso  de  la  línea  celular  L929‐RANK‐TNFR2  que  expresa  el  receptor  quimérico  con  la  región 

intracelular completa de TNFR2 (Figura V‐42). También como cabía esperar, cuando el receptor 

activado  no  contiene  el módulo  que  induce  la  degradación  de  TRAF2  (RANK‐TNFR2‐Δ343, 

Figura V‐43A) no se potencia el efecto citotóxico del TNF mediado por TNFR1. 

Sin embargo, y en contra de  los resultados obtenidos en  los estudios de sobre‐expresión 

transitoria, cuando el receptor activado mantiene el módulo de degradación de TRAF2  pero ha 

perdido  los  sitios  de  unión  de  TRAF2  (RANK‐TNFR2‐Δ403;  Figura  V‐43‐B)    no  se  observa  la 

potenciación del efecto citotóxico del TNFR1. Estos resultados sugieren que la unión  de TRAF2  

a TNFR2 puede jugar algún papel en  la  inducción de  la degradación de TRAF2, que se soslaya 

en  los  experimentos  de  expresión  transitoria.  Resultados  análogos  se  han  obtenido  en  el 

análisis de la línea L929 que expresa de manera estable el receptor RANK‐TNFR2‐Δ379.  

Resultados 

114 

 

 Figura V‐42: Efecto de  la activación de TNFR1 y/o TNFR2 en  la   viabilidad  celular de  lineas  L929 que 

expresan RANK‐TNFR2 ó sus variantes. Las células derivadas de L929 que expresan de manera estable RANKec (A) ó RANK‐TNFR2  (B)  fueron  tratadas durante  48 horas  con RANKL ó  TNF,  así  como  con  ambas  citoquinas  tras un pretratamiento a distintos tiempos con RANKL. Las células se fijaron, se tiñeron con cristal violeta y se cuantificó el color desarrollado. En cada caso se representa de manera esquemática el receptor RANK‐TNFR2 que se encuentra integrado, una fotografía de las placas tras la tinción con cristal violeta y la cuantificación de la misma. 

241RANKec

Control    RANKL  48h

PretratamientoRANKL (h)0                  0,5                2                  4                   6                   8               10          12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

Control    RANKL 48h

Pretratamiento RANKL (h)0           0,5            2             4              6             8            10            12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

RANK‐TNFR2241

439SKEE KPL

Control    RANKL  48h

PretratamientoRANKL (h)0                  0,5                2                  4                   6                   8                 10       12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

Control    RANKL 48h

Pretratamiento RANKL (h)0           0,5            2             4              6             8             10            12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

A

B

% Células vivas

% Células vivas

RANKec (1‐241)

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

III

        Resultados 

115 

 

 Figura V‐43: Efecto de  la activación de TNFR1 y/o TNFR2 en  la   viabilidad  celular de  líneas  L929 que 

expresan  RANK‐TNFR2  ó  sus  variantes.  Las  células  derivadas  de  L929  que  expresan  de manera  estable  RANK‐TNFR2‐Δ343  (A) ó RANK‐TNFR2‐Δ403 (B) fueron tratadas durante 48 horas con RANKL ó TNF así como con ambas citoquinas tras un pretratamiento a distintos tiempos con RANKL. Las células se fijaron, se tiñeron con cristal violeta y se cuantificó el color desarrollado. En cada caso se representa de manera esquemática el receptor RANK‐TNFR2 que se encuentra  integrado, una fotografía de  las placas tras  la tinción con cristal violeta y  la cuantificación de  la misma.  

A

B

Control    RANKL  48h

PretratamientoRANKL (h)0                  0,5                2                  4                   6                   8                 10       12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

RANK‐TNFR2‐Δ343241

342

Control    RANKL 48h

Pretramiento RANKL (h)0           0,5            2             4              6             8            10            12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

% Células vivas

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐342)

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

RANK‐TNFR2‐Δ403241

402

Control    RANKL  48h

PretratramientoRANKL (h)0                  0,5                2                  4                   6                   8                 10       12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

Control    RANKL 48h

Pretratamiento RANKL (h)0           0,5            2             4              6             8            10            12  

RANKL + TNF 48hTNF 48h

% Células vivas

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐402)

III

Resultados 

116 

 

Paralelamente al análisis de  la viabilidad celular,  llevamos a cabo   el estudio de distintos 

marcadores  de muerte  celular  tras  la  activación  de  los  dos  receptores,  como  se  acaba  de 

describir.  

La Anexina‐V es una proteína que se une específicamente a  la fosfatidilserina, fosfolípido 

de  la cara  interna de  la membrana plasmática que es expuesto en  la cara externa cuando se 

inicia el proceso de apoptosis, siendo un  indicador de procesos de apoptosis  temprana.   Por 

otra parte, la 7‐AAD (7‐Aminoactinomycina D) es un compuesto fluorescente con alta afinidad 

por el DNA que no puede atravesar la membrana plasmática.  El marcaje de las células con este 

compuesto es un  indicador de procesos  tardíos de apoptosis  (de manera  combinada  con  la 

Anexina V) o  de necrosis (marcaje único con 7‐AAD), puesto que solo teñirá el DNA de células 

cuya membrana se encuentre dañada. 

La determinación del porcentaje de células positivas para 7‐AAD y para Anexina‐V se llevó 

a  cabo  mediante  citometría  de  flujo  tras  los  tratamientos  con  TNF  y  RANKL.  Los  datos 

obtenidos se muestran  en las Figuras 1‐44 a 1‐47.  

 Figura V‐44: Análisis de marcadores de muerte celular tras  la activación de TNFR1 y/o TNFR2 en  línea 

celular que expresa RANKec de manera estable. Las células derivadas de L929 que expresan de manera estable RANKec fueron tratadas durante 48 horas con RANKL ó TNF así como con ambas citoquinas tras un pretratamiento de  8  horas  con  RANKL,  Las  células  se  recogieron,  se  lavaron  y  se  determinó   mediante  citometría  de  flujo  el porcentaje de células positivas para Anexina‐V y 7AAD. Se muestran una representación esquemática del receptor (A), los datos obtenidos del análisis citométrico (B) y la cuantificación de los mismos (C). 

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A

7

A

241RANKec

A

B

C

Q1 2,68%Q2 17,45%Q3 74,66%Q4 5,21%

Q1 1,71%Q2 5,29%Q3 91,65%Q4 1,34%

Q1 3,34%Q2 14,62%Q3 44,89%Q4 37,16%

Q1 2,73%Q2 10,96%Q3 52,86%Q4 33,46%

Control RANKL TNF 8h RANKL / RANKL + TNFQ1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Control             48h RANKL         48h TNF              8h RANKL48h RANKL + TNF

Negativas (Q3)Anexina‐V (Q4)

7AAD (Q1)

Anexina‐V + 7AAD (Q2)% Células

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

RANKec (1‐241)

        Resultados 

117 

 

 

Figura V‐45. Análisis de marcadores de muerte celular tras  la activación de TNFR1 y/o TNFR2 en  línea celular  que  expresa  RANK‐TNFR2  de manera  estable.  Las  células  derivadas  de  L929  que  expresan  de manera estable RANK‐TNFR2  fueron  tratadas durante 48 horas con RANKL ó TNF así como con ambas citoquinas  tras un pretratamiento de 8 horas con RANKL., Las células se recogieron,  lavaron y se determinó   mediante citometría de flujo el porcentaje de células positivas para Anexina‐V y 7AAD. Se muestran una  representación esquemática del receptor (A), los datos obtenidos del análisis citométrico (B) y la cuantificación de los mismos (C). 

 Figura V‐46: Análisis de marcadores de muerte celular tras  la activación de TNFR1 y/o TNFR2 en  línea 

celular que expresa RANK‐TNFR2‐Δ343 de manera estable. Las células derivadas de L929 que expresan de manera estable RANK‐TNFR2‐ Δ343 fueron tratadas durante 48 horas con RANKL ó TNF así como con ambas citoquinas tras un pretratamiento de 8 horas con RANKL., Las células se recogieron, lavaron y  se determinó  mediante citometría de flujo el porcentaje de células positivas para Anexina‐V y 7AAD. Se muestran una representación esquemática del receptor (A), los datos obtenidos del análisis citométrico (B) y la cuantificación de los mismos (C). 

RANK‐TNFR2241

439SKEE KPL

Q1 0,96%Q2 4,75%Q3 83,04%Q4 11,25%

Q1 0,91%Q2 2,98%Q3 93,13%Q4 2,95%

Q1 7,33%Q2 11,73%Q3 31,13%Q4 49,80%

Control RANKL TNF

Q1 5,89%Q2 16,15%Q3 9,61%Q4 68,35%

8h RANKL / RANKL + TNF

% Células

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

Control             48h RANKL         48h TNF          8h RANKL48h RANKL + TNF

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

A

B

C

Negativas (Q3)Anexina‐V (Q4)

7AAD (Q1)Anexina‐V + 7AAD (Q2)

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

III

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

RANK‐TNFR2‐Δ343241

342A

B

C

Control RANKL TNF 8h RANKL / RANKL + TNFQ1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

% Células

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

Control             48h RANKL         48h TNF      8h RANKL48h RANKL + TNF

Negativas (Q3)

AnexinaV (Q4)7AAD (Q1)

AnexinaV + 7AAD (Q2)

Q1 0,58%Q2 7,22%Q3 86,33%Q4 5,86%

Q1 0,29%Q2 2,14%Q3 95,88%Q4 1,68%

Q1 3,54%Q2 8,64%Q3 58,88%Q4 28,93%

Q1 4,78%Q2 12,70%Q3 50,07%Q4 32,45%

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐342)

Resultados 

118 

 

 

 

Figura V‐47: Análisis de marcadores de muerte celular tras  la activación de TNFR1 y/o TNFR2 en  línea celular que expresa RANK‐TNFR2‐Δ403 de manera estable. Las células derivadas de L929 que expresan de manera estable RANK‐TNFR2‐Δ403 fueron tratadas durante 48 horas con RANKL ó TNF así como con ambas citoquinas tras un pretratamiento de 8 horas con RANKL., Las células se recogieron,  lavaron y se determinó   mediante citometría de flujo el porcentaje de células positivas para Anexina‐V y 7AAD. Se muestran una representación esquemática del receptor (A), los datos obtenidos del análisis citométrico (B) y la cuantificación de los mismos (C). 

Los  resultados  representados  en  las  figuras  anteriores  confirman  las  observaciones 

realizadas al determinar  la viabilidad celular tras  la activación de TNFR1 y TNFR2. Es decir, se 

observa un incremento en el porcentaje de células apoptóticas (células positivas para Anexina 

V  y  células  positivas  para  ambos  marcadores)  tras  el  tratamiento  conjunto  con  RANKL 

(activación de TNFR2) y TNF  (activación de TNFR1) en  la  línea celular L929‐RANK‐TNFR2 que 

expresa la región intracelular completa del TNFR2, en comparación con los datos obtenidos en 

la condición de tratamiento con TNF sólo. Como cabía esperar, cuando el receptor activado no 

contiene el módulo que  induce  la degradación de TRAF2 (RANK‐TNFR2‐Δ343; ver Figura V‐45 

no se incrementan los marcadores de apoptosis respecto  a los obtenidos con la activación de 

TNFR1. Por el contario, cuando el receptor activado   mantiene el módulo de degradación de 

TRAF2   pero ha perdido  los  sitios de unión de TRAF2  (RANK‐TNFR2‐ ver Figura V‐47)   no  se 

produce la potenciación del efecto citotóxico generado por la activación de TNFR1. 

 

RANK‐TNFR2‐Δ403241

402

A

B

C

Q1 0,58%Q2 7,22%Q3 86,33%Q4 5,86%

Q1 0,29%Q2 2,14%Q3 95,88%Q4 1,68%

Q1 3,54%Q2 8,64%Q3 58,88%Q4 28,93%

Q1 4,78%Q2 12,70%Q3 50,07%Q4 32,45%

Control RANKL TNF 8h RANKL / RANKL + TNFQ1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

Q1 Q2

Q3 Q4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Células

Cuantificación tratamientos RANKL/TNF

Control           48h RANKL        48h TNF         8h RANKL48h RANKL + TNF

Negativas (Q3)

Anexina‐V (Q4)

7AAD (Q1)

Anexin‐V + 7AAD (Q2)

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐402)

III

        Resultados 

119 

 

A partir de los resultados del  presente apartado, podemos concluir que: 

∗ Las  líneas  celulares  generadas  a  partir  de  la  línea  L929    han  incorporado  los 

cDNAs codificantes de los diferentes receptores quiméricos RANK‐TNFR2 y éstos 

se expresan de manera estable  y se localizan en la membrana plasmática. . 

∗ Al activar  con TNF el TNFR1 endógeno de estas  líneas  celulares  se produce un 

efecto citotóxico que puede ser medido por  la pérdida de vialibilidad celular o 

con marcadores de membrana como la anexina V. 

∗ Al  activar  conjuntamente  TNFR1  (con  TNF)  y  TNFR2  (con  RANKL)  en  la    línea 

celular  RANK‐TNFR2  se  produce  un  efecto  potenciador  de  la  citotoxicidad 

originada por el TNFR1. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DISCUSIÓN

Discusión 

121 

 

VI. DISCUSIÓN 

Aunque el estudio y caracterización del TNF  tuvo  lugar durante  la primera mitad del 

siglo XX, no  fue hasta 1990 cuando se  identificaron sus dos receptores, el TNFR1 y el TNFR2 

(Brockhaus et al, 1990). Desde entonces, numerosas vías de investigación se han centrado en 

la  caracterización,  tanto  estructural  como  funcional,  de  ambos  receptores.  Sin  embargo,  la 

capacidad citotóxica del TNFR1, debido a la presencia de un DD en su región intracelular, junto 

con  su mayor  facilidad  de  activación  (mediante  sTNF),  focalizó  el  interés  científico  en  este 

receptor, con el  fin de  identificar  los mecanismos celulares  implicados en  la consecución de 

este proceso de muerte celular, así como de establecer otras vías de señalización iniciadas tras 

la activación del TNFR1. De esta manera, mientras que  la señalización desencadenada por el 

TNFR1  ha  sido  ampliamente  estudiada,  no  pude  decirse  lo mismo  en  cuanto  al  TNFR2  se 

refiere. En  los últimos años, esta  tendencia  se ha  ido  invirtiendo,  ya que  cada  vez  son más 

numerosas las publicaciones referidas al TNFR2. Ello se debe a la constatación de que, si bien 

el  TNFR2  no  parece  ser  capaz de  inducir un proceso  apoptótico por  sí mismo,  es  capaz  de 

potenciar  la  capacidad  citotóxica  del  TNFR1.  Este  hecho,  establece  una  conexión  funcional 

entre  ambos  receptores  que  se  fundamenta  en  la  capacidad  del  TNFR2  de  degradar  a  la 

proteína adaptadora TRAF2 (Fotin‐Mleczek et al, 2002; Rodriguez, 2006; Rodriguez et al, 2011). 

Prácticamente desde la identificación de ambos receptores del TNF quedó constatado 

que la mayor parte de la señalización que el TNFR2 es capaz de desencadenar depende de su 

unión previa con la proteína adaptadora TRAF2 (Rothe et al, 1994). TRAF2 es el miembro mejor 

caracterizado  y  estudiado  de  la  familia  de  proteínas  TRAF,  si  bien  también  existe  cierta 

evidencia acerca del posible papel de TRAF1 y TRAF3 en la señalización de los TNFRs. Con esta 

base y fundamentándonos en el hecho de la ausencia de un estudio concreto del papel de las 

proteínas TRAF en la señalización del TNFR2, nos plantemos caracterizar tanto su unión con el 

receptor como el posible efecto que éstas pudieran tener sobre su actividad biológica. De esta 

manera,  estudiamos  la  unión  de  diversas  proteínas  TRAF  con  el  TNFR2,  detectando  que  el 

receptor es capaz de unir tanto a TRAF1, como a TRAF2 y TRAF3 (ver Figura V‐1 y Figura V‐2). 

Clásicamente,  se  ha  considerado  que  la  unión  del  TNFR2  con  TRAF2,  así  como  con 

TRAF1 y TRAF3, se produce a través de la región del TNFR2 comprendida entre las posiciones 

402‐SKEE‐405 del receptor,  la cual encaja dentro del conocido como motivo clásico de unión 

con proteínas  TRAF de  los  TNFRs  (Park  et  al, 1999). Recientemente,  en nuestro  laboratorio 

hemos  demostrado  la  existencia  de  un  segundo  sitio  de  unión  de  TRAF2  con  el  TNFR2, 

Discusión 

122 

 

localizado  en  los  últimos  15  residuos  del  extremo  carboxilo  del  receptor  (Rodriguez  et  al, 

2011).  La  secuencia  de  este  nuevo  sitio  de  unión  con  TRAF2  no  se  corresponde  con  las 

secuencias consenso de  interacción de  los TNFRs  con  las proteínas TRAF  (Grech et al, 2005; 

Rodriguez et al, 2011). Sin embargo, dicha región coincide con el sitio de interacción del TNFR2 

con  la  serin/treonin  quinasa  Etk,  formando  un  complejo  preexistente  de  manera 

independiente de la interacción del receptor con su ligando  (Pan et al, 2002). Esta interacción 

TNFR2‐Etk induce la migración de células endoteliales, desempeñando un papel importante en 

los procesos de  angiogénesis  inducidos por  el  TNF,  en donde  TRAF2 podría  estar  implicado 

debido a su interacción con el receptor.  

Para  estudiar  la  implicación  funcional  de  este  nuevo  sitio  de  unión  a  TRAF2  en  la 

señalización del TNFR2, analizamos  su capacidad de unión con TRAF1 y TRAF3. En concreto, 

estudiamos  la unión de TRAF1 y TRAF3 con distintas deleciones de  la  región  intracelular del 

TNFR2  carentes  tanto  del  sitio  clásico  de  unión  con  las  proteínas  TRAF  (TNFR2‐Δ386‐414), 

como del extremo carboxilo del receptor (TNFR2‐Δ424) así como de ambas regiones (TNFR2‐

Δ379  y  TNFR2‐Δ343).  En  este  último  aspecto,  nos  interesaba  también  estudiar  la  posible 

implicación en la unión con las proteínas TRAF1 y TRAF3 de la región 343‐378 del receptor, en 

donde  estudios  previos  del  laboratorio  han  ubicado  diversas  actividades  reguladoras  del 

receptor (Rodriguez, 2006). En ninguno de los ensayos realizados observamos unión de TRAF1, 

TRAF2 ó TRAF3 con TNFR2‐Δ379 ó TNFR2‐Δ343, descartando así la posibilidad de nuevos sitios 

de unión de  las proteínas TRAF con el  receptor. Paradójicamente, mientras que mediante el 

estudio de la interacción in vivo e in vitro observamos unión de TRAF2 tanto con TNFR2‐Δ424 

(presenta  el  sitio  clásico  de  unión  con  las  proteínas  TRAF)  como  con  TNFR2‐Δ386‐414 

(presenta  únicamente  el  sitio  de  unión  del  extremo  carboxilo  del  receptor),  y  de  TRAF1  y 

TRAF3  con  TNFR2‐Δ424,  únicamente  observamos  unión  de  TRAF1  y  TRAF3  con  el  extremo 

carboxilo del receptor mediante el estudio de su unión in vivo (ver Figura V‐2 y Figura V‐3).  A 

la  luz de estos resultados cabe plantearse  la naturaleza de  la unión que puede  tener  lugar a 

través de los dos sitios de unión con proteínas TRAF del TNFR2 con TRAF1, TRAF2 y TRAF3.   

Si bien la unión in vivo entre el receptor y la proteína adaptadora de interés se produce 

a nivel celular, ésto no ocurre en los ensayos in vitro, lo que podría evidenciar el hecho de que 

en este tipo de ensayos únicamente pudieran detectarse uniones que no necesiten de cambios 

o modificaciones del receptor que tienen lugar in vivo. En este contexto, podría postularse que 

la unión entre TRAF1, TRAF2 y TRAF3 a través del sitio clásico del TNFR2, al  igual que ocurre 

con la unión de TRAF2 con TNFR2‐Δ386‐414, no requiere de ninguna modificación del receptor 

Discusión 

123 

 

y tiene lugar igualmente en condiciones in vivo como in vitro. Sin embargo, la unión de TRAF1 y 

TRAF3 con el receptor a través de su  extremo carboxilo  puede requerir de unas condiciones 

biológicas que no se  logran en el ensayo  in vitro. Así, podría ser que el receptor experimente 

un cambio conformacional ó algún  tipo de modificación post‐traduccional  tras su activación, 

necesaria para  la unión de TRAF1 y TRAF3 con su extremo carboxilo. Puesto que  la secuencia 

aminoacídica  del  sitio  de  unión  con  proteínas  TRAF  presente  en  el  extremo  carboxilo  del 

TNFR2 no se corresponde con  las secuencias consenso establecidas para  la  interacción de  las 

proteínas TRAF con los receptores de la superfamilia TNFR, puede plantearse la posibilidad de 

que  la  interacción de  las mismas a  través de dicha  región  se produzca de manera  indirecta, 

siendo necesaria la interacción previa del receptor con otra proteína intermediaria. En cuanto 

a  la naturaleza de  la unión entre el TNFR2 y  las proteínas TRAF a  través del  sitio clásico del 

receptor, cabe destacar que si bien  la uniónn con TRAF2 es directa, TRAF1 puede unirse al el 

receptor  tanto  directa  como  indirectamente  a  través  de  TRAF2  (Rothe  et  al,  1994),  si  bien 

TRAF3 únicamente es capaz de unirse al receptor por medio de TRAF2 (He et al, 2004). 

Dentro de  los 15  residuos que  conforman el nuevo  sitio de unión  con  las proteínas 

TRAF  en  el  TNFR2,  la mutación  puntual  de  sus  residuos  425‐KPL‐427  bloquea  la  unión  con 

TRAF2 (Rodriguez et al, 2011). A raíz de los resultados obtenidos, estos 3 aminoácidos también 

se  encuentran  implicados  específicamente  en  la  unión  con  TRAF1  y  TRAF3  puesto  que  su 

mutación puntual bloquea  la unión de ambas proteínas TRAF con el receptor (ver Figura V‐4) 

Por  tanto,  al  analizar  funcionalmente  receptores  en  donde  ambos  sitios  de  unión  con  las 

proteínas  TRAF  se  encuentran  mutados  de  manera  puntual  estaremos  estudiando  la 

señalización  que  éstos  son  capaces  de  desencadenar  de  una manera  independiente  de  su 

unión con dichas proteínas adaptadoras. 

Son  diversos  los  estudios  acerca  del  papel  que  TRAF1  y  TRAF3  desempeñan  en  la 

señalización de los receptores de la superfamilia TNFR, si bien poco se conoce sobre su papel 

concreto  en  la  señalización del  TNFR2.  TRAF1  se  considera  regulador de  la  actividad de  los 

TNFRs debido a su capacidad de formar heterodímeros con TRAF2 (Rothe et al, 1994; Zheng et 

al, 2010), regulando asi la actividad de ésta (Arron et al, 2002; Carpentier & Beyaert, 1999). Por 

otro  lado, TRAF3  induce  la degradación de NIK, actuando por  tanto como  inhibidor de  la vía 

alternativa de NF‐κB (Rauert et al, 2010).  

Cuando TRAF1, TRAF2 y TRAF3 son expresadas de manera conjunta con el TNFR2, se 

observan  comportamientos  similares  de  cada  proteína  adaptadora  sobre  la  capacidad  del 

receptor  tanto de activar a NF‐κB  (ver Figura V‐5) como a  JNK  (ver Figura V‐7). Si bien  tanto 

Discusión 

124 

 

TRAF1  como  TRAF3  inhiben  la  señalización  del  receptor,  la  expresión  de  TRAF2  ejerce  un 

efecto potenciador de la actividad del TNFR2 en ambos aspectos. Esta activación se observa ya 

de por sí en la situación control de transfección única de TRAF2, lo que pone de manifiesto la 

capacidad innata de TRAF2 de activar a NF‐κB y a JNK. El efecto potenciador de TRAF2 sobre la 

actividad del TNFR2 es mucho más drástico en el caso de  la activación de NF‐κB que de JNK, 

jugando en ambos aspectos un papel importante la degradación de TRAF2 por el receptor, tal y 

como se observa en los análisis Western anti‐TRAF2 realizados, en donde se observa como los 

niveles  intracelulares  de  TRAF2  son menores  en  el  caso  del  TNFR2  en  comparación  con  la 

situación control (ver Figura V‐5 y Figura V‐7). De esta manera,  las actividades registradas de 

NF‐κB y de JNK estarían atenuadas por la capacidad del receptor de inducir la degradación de 

TRAF2. En este contexto, juega un papel importante la capacidad del receptor de fosforilar a c‐

Jun por la región 343‐379 del receptor, no implicada en la unión con TRAF2. Por ello, resultaría 

interesante estudiar en que momento tras la activación del receptor se induce la degradación 

de TRAF2 y cómo ésta se correlaciona temporalmente con la capacidad del TNFR2 de activar a 

NF‐κB y a JNK, teniendo en cuenta la activación de JNK por distintas regiones del receptor. Sin 

embargo, para la realización de estos estudios no sería útil la estrategia de sobreexpresión ya 

que no  permite controlar de manera temporal la activación del receptor. La línea celular L929‐

RANK‐TNFR2 se plantea en este contexto como una herramiento útil de estudio para el estudio 

temporal de  la degradación de TRAF2 y de cómo ésta  influye en  la activación de NF‐κB y JNK 

por el receptor.  

A  diferencia  del  resto  de  proteínas  TRAF,  TRAF1  carece  del  dominio  RING  finger 

necesario para  la  inducción de  la señalización por  las proteínas TRAF y cuya deleción es una 

estrategia empleada para el desarrollo de dominantes negativos en el caso de TRAF2, TRAF5 y 

TRAF6  (Hsu  et  al,  1996;  Natoli  et  al,  1997).  Así,  TRAF1  ejerce  un  efecto  inhibitorio  en  la 

capacidad  de  los  TNFRs  de  activar  a NF‐κB  y  a  JNK,  lo  que  se  confirma  al  observarse  que 

ratones deficientes en TRAF1 muestran una respuesta citotóxica exagerada al TNF (Tsitsikov et 

al, 2001). Sin embargo, otros estudios apuntan hacia un papel potenciador de  la actividad de 

NF‐κB por parte de TRAF1 (Arron et al, 2002). Una posible explicación reside en la capacidad de 

TRAF1 de interaccionar con IKKβ, aunque con una menor afinidad que con TRAF2, lo que unido 

al hecho de que TRAF1 es  inducido tras  la activación de NF‐κB por el TNF (Wang et al, 1998), 

presenta a TRAF1 como un regulador de NF‐κB. De esta manera, cuando sus niveles celulares 

son bajos, se potencia la activación de NF‐κB puesto que TRAF1 interaccionar preferentemente 

con  TRAF2.  Sin  embargo,  al  aumentar  sus  niveles  intracelulares  (como  ocurre  durante  los 

Discusión 

125 

 

experimentos de sobreexpresión), es capaz de interaccionar con IKKβ actuando como inhibidor 

al  limitar  la  activación  de  la  quinasa  (Sughra  et  al,  2010)  y  actuando  sobre  ambas  vías  de 

activación de NF‐κB. Otros estudios demuestran que TRAF1 es fosforilada por la serin‐treonin 

quinasa  PKN1,  compitiendo  con  TRAF2  por  la  interacción  con  el  recetor  y  provocando  una 

inhibición parcial de  la activación de NF‐κB y de AP‐1 por el TNFR2  (Kato et al, 2008). Cabe 

destacar que PKN1 es activada por  la caspasa 3 y  también por otras proteasas. Esto sugiere 

una  implicación de PKN1 en  los procesos de apoptosis. Teniendo en cuenta que el TNFR1 es 

capaz de activar a la caspasa 3 y ésta a continuación a PKN‐1, no parece descartable considerar 

la posible  implicación de PKN1 en  la  interconexión entre ambos receptores del TNF. De esta 

manera, el TNFR1 actuaría sobre la señalización del TNFR2 al inhibir su capacidad de activar a 

NF‐κB y a  JNK mediante  la  inducción de  la  fosforilación de TRAF1 por PKN1, mientras que el 

TNFR2 influye sobre la capacidad del TNFR1 de activar a ambos factores de transcripción al ser 

capaz el TNFR2 de degradar a TRAF2. Por tanto, podría llegar a considerarse que entre ambos 

receptores existe una relación de mutua regulación. 

En  el  presente  trabajo  hemos  demostrado  cómo  el  TNFR2  une  TRAF3  e  induce  su 

degradación (ver Figura V‐3 y Figura V‐9). De esta manera, tras  la activación del receptor NIK 

quedaría  libre,  siendo  capaz  de  inducir  el  procesamiento  de  p100.  Sin  embargo,  al 

sobreexpresarse, TRAF3 no es degradado por completo por el receptor (ver Figura V‐5) lo que 

resulta en su acumulación en  la célula. Esta acumulación de TRAF3 supone una  inhibición de 

NIK y una consecuente  inactivación de  la vía alternativa de NF‐κB. Además,  la activación del 

receptor  supone  la  degradación  de  TRAF2  expresado  de  manera  endógena,  inhibiéndose 

también la posible activación que pudiera producirse de la vía clásica. En cuanto a los efectos 

inhibitorios de TRAF3  sobre  la  activación de  JNK, no existen datos  concretos que expliquen 

estos resultados, si bien parece evidente que esta proteína adaptadora se encuentra implicada 

en  la capacidad del receptor de activar a JNK, estando tanto su  localización celular como sus 

dominios  zinc  implicados  en  su  papel  como  inhibidor  de  la  señalización  de  los  TNFRs 

(Dadgostar & Cheng, 2000; Liao et al, 2004). 

La capacidad inhibitoria de TRAF1 y activadora de TRAF2, en cuanto a la activación de 

NF‐κB  se  refiere,  se mantiene  al  analizar  deleciones  del  TNFR2  que  incluyen  en  su  región 

intracelular  únicamente  uno  de  los  dos  sitios  descritos  de  unión  con  las  proteínas  TRAF 

(TNFR2‐Δ424 ó TNFR2‐Δ386‐414), observándose como los niveles intracelulares de TRAF2 son 

menores en el  caso de  los  receptores que presentan el módulo 343‐378,  responsable de  la 

degradación de TRAF2  (ver Figura V‐6). Por el  contrario, mientras que  la  sobreexpresión de 

Discusión 

126 

 

TRAF3  sigue  ejerciendo  un  efecto  inhibitorio  a  través  del  sitio  clásico  de  unión  con  las 

proteínas TRAF (TNFR2‐Δ424), parece no afectar o incluso potenciar la capacidad de activación 

de NF‐κB cuando el receptor únicamente presenta el sitio de unión con las proteínas TRAF de 

su extremo carboxilo (TNFR2‐Δ386‐414) (ver Figura V‐6).  Esto sugiere una acción coordenada 

y  regulada de TRAF3 y el TNFR2 puesto que,  si bien  su efecto conjunto  se  refleja como una 

inhibición de  la capacidad de activación de NF‐κB, el estudio de  la acción  individual de cada 

sitio de unión es distinta,  siendo  inhibidora a  través del  sitio clásico y pudiéndose activar  la 

señalización a través del sitio carboxilo‐terminal. Sin embargo, cómo ocurre esta inteconexión 

y  que  otras  posibles  proteínas  se  encuentran  implicadas  es  algo  que  hasta  el momento  se 

desconoce.  Ello  es  debido  a  que  todos  los  estudios  de  señalización  referidos  al  TNFR2 

únicamente han tenido en cuenta el sitio clásico de unión con las proteínas TRAF, obviando la 

existencia del segundo sitio, el cual hemos demostrado que resulta  importante tanto para  la 

unión con las proteínas TRAF como para la activación de la señalización del receptor. A la vista 

de los resultados de activación de NF‐κB, el TNFR2 solo sería capaz de degradar a TRAF3, y por 

tanto de activar a la vía alternativa, a través de su sitio clásico de unión con las proteínas TRAF 

(puesto que  su  sobreexpresión  impide  la activación de NF‐κB   por el TNFR2) aunque en  los 

análisis Western realizados, no se observan diferencias en  los niveles  intracelulares de TRAF3 

(ver  Figura  V‐7).  El  hecho  de  que  no  se  observe  unión  con  TRAF3  a  través  del  sitio  TRAF 

localizado en el extremo carboxilo del receptor mediante ensayos de interacción in vitro, junto 

con el hecho de que la acumulación de TRAF3 no ejerza un efecto negativo sobre la capacidad 

de esta  región del  receptor   de activar a   NF‐κB   nos hace plantarnos  la posibilidad de que 

ambos hechos se encuentren relacionados. De esta manera, podría postularse la existencia de 

un  mecanismo  alternativo  de  señalización,  no  descrito  hasta  el  momento.  Así,  una 

modificación inicial en el extremo carboxilo del receptor tras su activación podría conllevar su 

interacción con TRAF3, originando una   modificación de ésta. Al sobreexpresarse TRAF3 junto 

con  TNFR2‐Δ386‐414,  la  proteína  adaptadora  (modificada)  no  sería  capaz  de  inducir  la 

degradación de NIK. De esta manera, la acumulación de NIK conllevaría la activación de la vía 

alternativa, activándose  la vía clásica debido a  los niveles endógenos de TRAF2. Por tanto, el 

TNFR2 desencadenaría a través de su sitio clásico de interacción con las proteínas TRAF tanto 

la vía clásica (por su interacción con TRAF2) como alternativa (por su interacción con TRAF3) de 

NF‐κB. De  esta manera,  la  sobreexpresión  de  TRAF2  aumenta  la  capacidad  del  receptor  de 

activar a dicho  factor de  transcripción mientras que  la  sobreexpresión de TRAF3  induce una 

degradación  de  NIK  e  inhibe  la  activación  de  NF‐κB  y  la  acumulación  de  TRAF1  inhibe  al 

Discusión 

127 

 

complejo IKK. Por otro  lado,  la  interacción de TRAF2 y de TRAF1 con el extremo carboxilo del 

receptor desencadenaría los mismo efectos que su interacción con el sitio clásico, pero por el 

contrario,  la  interacción  con  TRAF3  podría  conllevar  una  modificación  de  la  proteína 

adaptadora de manera que su sobreexpresión no conlleve  la degradación de NIK pudiendo el 

receptor seguir activando a NF‐κB. 

Al estudiar el efecto de la sobreexpresión de TRAF1, TRAF2 y TRAF3 sobre la capacidad 

del TNFR1 de activar a NF‐κB, observamos  como  los elevados niveles de TRAF2 y TRAF3 no 

afectan a la señalización del receptor, mientras que TRAF1 inhibe la actividad del receptor (ver 

Figura  V‐5).  Al  igual  que  ocurre  con  el  TNFR2,  TRAF1  puede  ser  fosforilado  por  PKN1, 

inhibiendo  la  capacidad del  receptor de  activar  a NF‐κB. A diferencia de  lo  que ocurre  con 

otros receptores de la superfamilia TNFR, el TNFR1 no es capaz de activar a la vía alternativa, 

por ello la sobreexpresión de TRAF3 no afecta a su señalización, siendo incapaz de degradarlo 

(ver   Figura V‐10).  Por otro  lado,  cabe destacar que  al  contrario de  lo que ocurre  con  el 

TNFR2, la capacidad del TNFR1 de activar a NF‐κB no depende por completo de su interacción 

con TRAF2, pudiendo estar mediada también por RIP1. Por ello, si bien  la sobreexpresión de 

TRAF2  incrementa  la capacidad activadora del  receptor,  los niveles de activación  registrados 

no son tan elevados como en el caso del TNFR2. 

A pesar de que  la señalización del TNFR2 depende prácticamente por completo de su 

interacción con TRAF2, lo que desencadena la activación de NF‐κB y AP‐1, el TNFR2 es también 

capaz de  inducir su degradación, regulándose así  la actividad biológica del receptor. Como ya 

se  ha mencionado,  el  TNFR2  induce  también  la  degradación  de  TRAF3,  lo  que  conlleva  la 

activación de la vía alternativa de NF‐κB. Por el contrario, la expresión del receptor no afecta a 

los niveles intracelulares de TRAF1 (ver Figura V‐9). Sin embargo, se observa una inhibición de 

la capacidad del  receptor de  inducir  la degradación de TRAF2 al sobreexpresarse TRAF1  (ver 

  Figura  V‐10),  de  una manera  que  parece  no  ser  dependiente  de  la  interacción  de 

TRAF1 con el receptor puesto que TNFR2‐BKO que no es capaz de interaccionar con TRAF1 (ver 

Figura V‐4), ve reducida su capacidad de degradación de TRAF2 cuando se sobreexpresa TRAF1 

(  Figura V‐10). Puesto que TRAF1 y TRAF2 interaccionan formando heterotrímeros y a su 

vez  constituyen  un  complejo  con  las  ubiquitin‐ligasas  cIAP1  y  cIAP2,  podría  ser  que  la 

sobreexpresión  de  TRAF1  inhibiera  de  alguna  manera  la  actividad  E3  ligasa  de  las  cIAPs 

bloqueándose de esta manera la degradación de TRAF2.  

La  ausencia  de  un  ligando  conocido  exclusivo  del  TNFR2  dificulta  el  estudio  de  la 

señalización del receptor, puesto que tanto el mTNF como la progranulina activan al TNFR1 y al 

Discusión 

128 

 

TNFR2 con cinéticas similares (Grell et al, 1995; Tang et al, 2011). Por ello, se ha recurrido al 

empleo de diversas técnicas de activación del receptor. En concreto, nos hemos basado en su 

sobreexpresión  para  forzar  su  trimerización  y  consecuente  activación  del  receptor.  Sin 

embargo, esta metodología presenta ciertos inconvenientes como la imposibilidad de estudiar 

de  manera  temporal  la  señalización  del  receptor  y  estar  forzándose  su  agregación  en  la 

membrana, pudiendo intensificarse la actividad del receptor. De esta manera, nos planteamos 

la consecución de un sistema de estudio del TNFR2 en el que el receptor pudiera ser activado 

tras  el  tratamiento  con  un  ligando  soluble  pudiéndose  controlar  tanto  la  dosis  del  ligando 

como  el  tiempo  de  estimulación.  Así,  generamos  el  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2 

consituído por  las  regiones extracelular y  transmembrana del  receptor RANK y por  la  región 

intracelular del TNFR2. A priori, la señalización desencadenada por este receptor será la propia 

del  TNFR2  al  estar  constituído  por  la  región  intracelular  íntegra  del  receptor,  pudiéndose 

estimular mediante el tratamiento con RANKL en un contexto celular donde el propio RANK se 

encuentre ausente. Cabe destacar que esta estrategia de generación de receptores quiméricos 

de distintos miembros de  la superfamilia de receptores TNFR se ha empleado anteriormente 

con éxito para el estudio de la señalización desencadenada por distintos receptores (Abe et al, 

2008). 

En el apartado V.2 se muestra como el receptor quimérico RANK‐TNFR2 se comporta 

de  manera  similar  al  TNFR2  siendo  capaz  de  desencadenar  el  mismo  tipo  de  respuesta 

biológicas que el  receptor silvestre y de  interaccionar con  las mismas proteínas adaptadoras 

TRAF. Puesto que se trata de un receptor de membrana plasmática, nuestro interés se centró 

también en el estudio de  la correcta  localización del receptor quimérico respecto al silvestre. 

En este aspecto, destaca cómo los estudios de inmunocitoquímica muestran la localización del 

TNFR2 y de RANK‐TNFR2 tanto a nivel de membrana como en el el citoplasma celular, mientras 

que  el  TNFR1  muestra  una  localización  intracelular  (ver  Figura  V‐19).  Como  ya  se  ha 

mencionado en  la  introducción,  la señalización del TNFR1 se caracteriza por  la  formación de 

dos  complejos  distintos,  dependiendo  el  segundo  de  ellos  de  la  previa  internalización  del 

receptor.  En  este  contexto,  la  estrategia  de  sobreexpresión  del  receptor  seguida  en  este 

trabajo  fuerza  su  agregación  y  consecuente  activación,  lo  que  conlleva  su  internalización  y 

explica la ausencia de señal a nivel de membrana. De hecho, diversos estudios sitúan al TNFR1, 

una vez activado, en el aparato de Golgi (Jones et al, 1999). Si bien  los análisis mostrados no 

nos permiten discernir  sobre  el orgánulo  en  el  cual parece  localizarse  el  receptor,  estudios 

realizados  en  las  células  HEK293  de  inmunicitoquímica  específica  del  Aparato  de  Golgi 

Discusión 

129 

 

muestran una localización de éste similar a la mostrada para el TNFR1. En cuanto al TNFR2 y a 

RANK‐TNFR2 se refiere, se ha descrito que el receptor sufre un proceso de endocitosis tras su 

interacción con su ligando, si bien la cinética de su internalización es más lenta que en el caso 

del TNFR1 (Pan et al, 2007), describiéndose su localización tanto a nivel de membrana como de 

endosomas  como  consecuencia  de  un  intenso  proceso  de  internalización  (Scherubl  et  al, 

2005). Al igual que en el caso del TNFR1, ensayos de inmunocitoquímica para el estudio de los 

endosomas en células HEK293 muestran una localización similar a la observada en el caso del 

TNFR2  y  el  receptor  quimérico.  Alternativamente,  mediante  estudios  citométricos 

comprobamos  la  localización  en  membrara  del  receptor  quimérico  en  células  no 

permeabilizadas  (ver Figura V‐20) Además, estos resultados nos proporcionan datos sobre  la 

alta eficacia de los procesos de transfección, pudiendo confirmar que prácticamente todas las 

células  han  resultado  tranfectadas  y  han  incorporado  tanto  el  plásmido  codificante  de  la 

proteína GFP como del receptor de interés. De esta manera podemos concluir que el receptor 

RANK‐TFNR2 puede  comparase  funcionalmente al TNFR2 y emplearse  como herramienta de 

estudio  de  la  señalización  del  receptor.  En  este  contexto,  cabe mencionar  que  se  estudió 

también  la señalización desencadenada por diversos receptores quiméricos RANK‐TNFR2 con 

deleciones en la región intracelular del TNFR2 equivalentes a las representadas en la Figura V‐3 

siendo los resultados obtenidos similares a las deleciones del TNFR2.  

A  la vista de  los resultados obtenidos, seguimos una estrategia de sobreexpresión de 

receptores quiméricos RANK‐TNFR2 para caracterizar funcionalmente al TNFR2. Así, se generó 

toda una serie de receptores quiméricos RANK‐TNFR2 en donde estudiar el papel funcional de 

la región 343‐378 del receptor en cuanto a su capacidad de inducir la degradación de TRAF2 y 

la activación de  JNK se refiere, puesto que estudios previos del laboratorio determinaron que 

dicha región se encuentra implicada en ambas actividades (Rodriguez, 2006). Estos receptores 

quiméricos  podrán  ser  empleados  posteriormente  para  la  generación  de  nuevas  líneas 

transfectantes  estables  en  las  que  estudiar  de  una manera más  profunda  y  precisa  estas 

nuevas  actividades  moduladoras  del  TNFR2  pudiéndose  identificar  y  describir  las  posibles 

proteínas implicadas en ellas, así como estudiar de manera temporal su actividad. 

El análisis  funcional de  los  receptores RANK‐TNFR2‐BKO  (ambos  sitios de  interacción 

con TRAF2), RANK‐TNFR2‐Δ343‐379 y RANK‐TNFR2‐BKO‐Δ343‐379 demostró que  la capacidad 

de degradación de TRAF2 por el módulo 343‐378 no requiere  la  interacción de TRAF2 con el 

receptor  (ver  Figura  V‐22)  Al  analizar  la  secuencia  de  esta  región  del  receptor,  se  pudo 

comprobar que se encuentra constituída por un elevado número de residuos de serina, siendo 

Discusión 

130 

 

muchos de ellos susceptibles de experimentar un proceso de fosforilación. Consecuentemente, 

generamos una serie de nuevos receptores RANK‐TNFR2‐BKO con distintas deleciones internas 

del módulo  343‐378,  analizando  su  capacidad  de  degradación  de  TRAF2.  De  esta manera, 

llegamos a identificar a la región 343‐349 como responsable de dicha actividad. Puesto que en 

esta región de 7 aminoácidos, 4 de ellos son serinas con alta susceptibilidad de ser fosforilados 

(ver Figura V‐23), generamos dos nuevos receptores en donde se encuentran mutadas en cada 

uno de ellos dos de las 4 serinas de dicha región (RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD y RANK‐TNFR2‐BKO‐

DAA). El análisis de  su capacidad de degradación de TRAF2 evidenció que ambas parejas de 

serinas se encuentran implicadas en esta actividad del receptor (ver Figura V‐30). 

Por  tanto, puede plantarse  la  idea de que  la  región 343‐349 del TNFR2 actúa  como 

elemento  modulador  de  la  activación  de  NF‐қB  por  el  TNFR2.  Resulta  particularmente 

interesante que mientras  la señal  iniciadora requiere  la  interacción de TRAF2 con el receptor 

para desencadenar la activación de NF‐қB, la señal finalizadora (la degradación de TRAF2, que 

causa  la  pérdida  de  la  capacidad  de  activación  de  NF‐қB  por  el  receptor)  parece  ser 

independiente  de  la  interacción  entre  el  receptor  y  la  proteína  adaptadora.  De  hecho,  el 

receptor  RANK‐TNFR2‐BKO,  incapaz  de  interaccionar  con  TRAF2,  sigue  induciendo  su 

degradación (ver Figura V‐25). En este contexto, el análisis de la capacidad de activación de NF‐

қB por RANK‐TNFR2‐AAD y RANK‐TNFR2‐DAA, incapaces de degradar a TRAF2 pero sí de unirse 

a ella, muestra como cada receptor aumenta de manera progresiva su capacidad de activación 

de dicho factor transcripcional a medida que aumenta la cantidad expresada del mismo. Por el 

contrario, al mutarse también ambos sitios de interacción con TRAF2 (RANK‐TNFR2‐BKO‐AAD y 

RANK‐TNFR2‐DAA)  se anula  la capacidad del  receptor de activar a   NF‐қB  (ver Figura V‐32 y 

Figura  V‐33).  Por  otro  lado,  resulta  interesante  el  hecho  de  que  la  deleción  completa  del 

módulo 343‐378 del  receptor no conlleva una activación de NF‐қB a  los mismos niveles que 

cuando  simplemente  se mutan  los  residuos  responsables  de  la  degradación  de  TRAF2  (ver 

Figura V‐32)  lo que  se desprende del  análisis del  receptor RANK‐TNFR2‐Δ343‐378  (presenta 

intactos ambos sitios de unión con TRAF2 pero carece del módulo 343‐378) en comparación 

con RANK‐TNFR2‐AAD y RANK‐TNFR2‐DAA  (ambos presentan  intactos ambos  sitios de unión 

con TRAF2 pero mutados los residuos implicados en su degradación) (ver Figura V‐32 y Figura 

V‐33). Estos resultados ponen de manifiesto la posible existencia de una función alternativa de 

la región 343‐378 en la regulación de NF‐қB y que no depende de la degradación de TRAF2. 

Diversos  estudios  han  demostrado  que  TRAF2  experimenta  un  proceso  de 

ubiquitinación de tipo K‐48 como paso previo a su degradación (Li et al, 2002; Wu et al, 2005). 

Discusión 

131 

 

Paralelamente, TRAF2 puede experimentar  también procesos de ubiquitinación de  tipo K‐63 

que han sido relacionados con su capacidad de activación de JNK (Shi & Kehrl, 2003). En este 

aspecto,  resulta  interesante  la  capacidad  de  interacción  de  TRAF2  con  ubiquitin‐proteasas 

como USP31, que reconoce específicamente cadenas de poliubiquitinas tipo K‐63 (Tzimas et al, 

2006). De esta manera, podría plantearse  la  idea de una ubiquitinación activadora  inicial de 

TRAF2 (tipo K‐63) que la convierta en un transductor activo de la señalización, siendo capaz de 

desencadenar  tanto  la  activación  de  NF‐κB  como  de  JNK.  Posteriormente,  TRAF2  podría 

experimentar  una  ubiquitinación  de  tipo  K‐48  que  conllevaría  su  degradación  por  el 

proteasoma de manera dependiente de  la previa  fosforilación del TNFR2 en  los  residuos de 

serina  indicados  anteriormente. De  esta   manera,  los  procesos  de  ubiquitinación  de  TRAF2 

podrían  plantearse  como  mecanismos  reguladores  de  TRAF2  activándolo  inicialmente  y 

posteriormente  induciendo  su  degradación  y  finalizando  su  actividad  y  con  ello  también  la 

capacidad  del  TNFR2  de  activar  a NF‐κB.  En  este  contexto,  varios  autores  han  identificado 

diversas proteínas intermediarias que podrían estar implicadas en la interacción de TRAF2 con 

las cIAPs, tales como AIMP2 (Choi et al, 2009) o la Esfingosina‐1 fosfato (Alvarez et al, 2010), la 

cual ha sido descrita como cofactor necesario para la actividad E3 ligasa de TRAF2.  

Resulta por tanto lógico plantearse que la conexión entre la región 343‐349 del TNFR2 

y  la  ubiquitinación  y  consecuente  degradación  de  TRAF2  sea  por medio  de  un  proceso  de 

fosforilación del receptor que induzca una posterior fosforilación de TRAF2, tratándose de una 

modificación  post‐traducional  ligada  a  los  procesos  de  ubiquitinación  como  elemento 

iniciador.  Cabe  destacar  que  esta  región  343‐349  solapa  parcialmente  con  la  región  de 

interacción del TNFR2 con p80TRAK (del inglés p80 TNF Receptor Associated Kinase), localizada 

entre  los residuos 338‐379 del receptor  (Darnay et al, 1997). Por ello, podría plantearse que 

mediante  la  interacción del receptor con p80TRAK o con otra quinasa aún no  identificada, se 

produzca  la  fosforilación  del  receptor  y  una  consecuente  fosforilación  y  ubiquitinación  de 

TRAF2. Se ha descrito que tras  la activación de  los TNFRs, TRAF2 es fosforilado en sus serinas 

11 y 55, siendo estas modificaciones necesarias tanto para su capacidad de activación de JNK 

como de NF‐қB e  implicadas en  la  inhibición de  la activación prolongada de  JNK. La quinasa 

PKCZeta parece ser responsable de  la fosforilación de TRAF2 en su serina 55 (Blackwell et al, 

2009; Thomas et al, 2009; Zhang et al, 2011).  

Discus

IntercocapacecaspasinteracTNFR2nivelesқB. Estactivacla caspno es (regiónactivacde  TRAcapacimismo

TNFR

sión 

132 

 

Figura VI‐1onexión  cuandes  de  activar  asas  induciendocción de TRAF22  (región  intracs intracelularesta reducción deción de NF‐қB ypasa 8 y, en concapaz de degrn  intracelular ción de las mismAF2  (derecha) idad de activacio tiempo, las pr

Son  num

R1, de maner

1: Representacido el TNFR2 dea NF‐қB,  promo  la muerte  ce2 con cIAP1 y ccelular  del  reces de dicha prote los niveles dey limitarse la innsecuencia, proradar a TRAF2.del  receptor mas respuestasy,  por  tanto, ión de NF‐қB, aroteínas cIAP so

merosos  los  e

ra que el TNF

ión esquemáticegrada a TRAFoviendo  la  suplular.  Sin  embIAP2 que inhibeeptor  represeneína adaptadore TRAF2 afecta nteracción de laomoviéndose lo Cuando se enrepresentada s biológicas queno  disminuir  lal igual que el Ton capaces de i

estudios  que

FR2 es capaz

ca de  la  interc2. Debido a  supervivencia  celargo,  esta  actien a la caspasantada  en  azul) ra (derecha), litambién a la seas proteínas cIAos procesos de cuentra bloqueen  marrón),  lae en el caso antos  niveles  intrTNFR1, intensificnteraccionar co

e  apuntan  a

z de aumenta

conexión  funciou  interacción  coular.  El  TNFR1ividad  se  ve  pa 8. La inducciótiene  como  comitando la capeñalización del AP con el recepmuerte celulareada  la capacida  activación  interior. Sin embaracelulares  de cándose los fenon el TNFR1, lim

a  una  interc

ar el potenci

onal entre el Ton TRAF2, el T  también  es  carcialmente  bln de la degradaonsecuencia  unpacidad del receTNFR1, al reduptor, favoreciénr. B) Interconexdad del TNFR2 nicial  de  los  rargo, al no prodTRAF2,  el  TNFnómenos de sumitando la activ

conexión  ent

al citotóxico

TNFR1 y el TNFTNFR1 y el TNFcapaz  de  activaoqueada  debidación de TRAF2na  disminución eptor de activaucirse su capacindose la activacxión cuando el de degradar areceptores  supducirse la degraR2  no  ve  limitpervivencia celvación de la cas

tre  el  TNFR2

 del TNFR1 (

 

FR2. A) FR2  son ar  a  las do  a  la 2 por el de  los 

ar a NF‐idad de ción de TNFR2  TRAF2 pone  la adación tada  su ular. Al pasa 8. 

2  y  el 

Fotin‐

Discusión 

133 

 

Mleczek et al, 2002; Rodriguez et al, 2011; Weiss et al, 1997). Esta inteconexión entre distintos 

receptores de  la superfamilia TNFR no resulta única puesto que se ha podido comprobar que 

tanto  el  TNFR1  como  el  TNFR2  están  implicados  en  la  activación  de  la  apoptosis  por  FASL 

(Ligando de FAS) (Takada et al, 2007). Por otro lado, diversos estudios indican que, a pesar de 

carecer de DD en  su  región  intracelular, el TNFR2 es  capaz de desencadenar un proceso de 

muerte  celular  en  tipos  celulares muy  concretos,  tales  como  las  células  de  hibridoma  de 

células T PC60 (Depuydt et al, 2005), así como de iniciar una cascada de muerte celular atípica 

de manera independiente del TNFR1 y que se ve intensificada tras la inhibición de las caspasas 

(Biragyn et al, 2008). La indicación de que este tipo de muerte celular se vea intensificada con 

la inhibición de la caspasas apunta hacia una posible activación de la necroptosis. Sin embargo, 

todo lo conocido al respecto de este tipo atípico de muerte celular hace referencia al TNFR1 no 

existiendo datos en cuanto al TNFR2 se refiere.  

En cuanto a la interconexión existente entre el TNFR1 y el TNFR2, se considera a TRAF2 

como un elemento clave del papel citotóxico mediado por el TNFR1 en presencia del TNFR2, 

puesto que  la  interacción de TRAF2 con el TNFR1 y con  las proteínas antiapoptóticas cIAP1 y 

cIAP2 reduce la habilidad del receptor para inducir procesos de apoptosis  (Fotin‐Mleczek et al, 

2002).  Cuando  el  TNFR1  y  el  TNFR2  se  encuentran  activados  de  manera  simultánea,  la 

degradación  de  TRAF2  inducida  por  el  TNFR2  inhibe  la  interacción  entre  el  TNFR1  y  las 

proteínas  cIAP1  y  cIAP2,  lo que  intensifica  la  capacidad  apoptótica del TNFR1. De  la misma 

manera, puesto que  la capacidad de activación de   NF‐қB por el TNFR1 también depende, en 

parte, de  su  interacción  con  TRAF2,  la  inducción de  la degradación de  TRAF2 por  el  TNFR2 

supone una reducción en la capacidad del TNFR1 de activar a dicho factor de transcripción (ver 

Figura  V‐29  y  Figura  VI‐1). De  nuevo,  se  pone  de manifiesto  la  dualidad  de  las  respuestas 

biológicas  desencadenadas  por  el  TNF  siendo  capaz, mediante  la  activación  de  los mismos 

receptores,  de  desencadenar  respuestas  biológicas  tan  dispares  como  la  proliferación  y  la 

muerte celular mediante el balance entre señales pro‐ o antiapoptóticas.  

Por  todo  ello,  resulta  interesante  el  estudio  concreto  que  la  capacidad  o  no  de 

degradación  de  TRAF2  por  el  TNFR2  tiene  sobre  la  señalización  del  TNFR1  en  cuanto  a  su 

capacidad  de  activación  de  NF‐қB  y  de  inducir  procesos  de muerte  celular  se  refiere.  Los 

estudios realizados ponen de manifiesto la importancia reguladora de TRAF2 en la señalización 

de  los  receptores y como ésta no se encuentra  relacionada con  la  interacción con el TNFR2, 

puesto  que  la  cotransfección  del  TNFR1  con  RANK‐TNFR2‐BKO,  receptor  incapaz  de 

interaccionar  con  TRAF2  pero  si  de  degradarlo,  resulta  en  la  disminución  de  los  niveles  de 

Discusión 

134 

 

activación de NF‐қB (ver Figura V‐29 y Figura VI‐2). De hecho, al bloquearse la degradación de 

TRAF2  por  el  TNFR2  se  observa  una  potenciación  de  la  activación  de NF‐қB  cuando  ambos 

receptores son expresados. Esto se observa en el estudio de la activación de NF‐қB cuando el 

TNFR1  es  expresado  conjuntamente  con  RANK‐TNFR2‐AAD  o  con  RANK‐TNFR2‐DAA,  cuya 

capacidad  de  activación  de  NF‐қB  no  se  ve  limitada  a  medida  que  aumenta  la  cantidad 

presente del receptor (ver Figura V‐36 y Figura VI‐2).  

        

Figura VI‐2: Representación esquemática y  resumen de  la capacidad  funcional de diversos  receptores RANK‐TNFR2. Se representan esquemáticamente, en comparación con el receptor quimérico RANK‐TNFR2, diversos receptores quiméricos RANK‐TNFR2 con diversas mutaciones puntuales en su región intracelular, siendo capaces de interaccionar con TRAF2 (rectángulos grises indicados como SKEE y KPL) o no (rectángulos negros SKAA y AAA), así como de inducir la degradación de TRAF2 (módulo I gris oscuro intacto) o no (con las mutaciones puntuales AAD y DAA  representadas  en  rectángulos  grises).  A  la  derecha  se  indica  la  capacidad  (+)  o  no  (‐)  de  cada  uno  de  los receptores quiméricos representados de  interaccionar con TRAF2  (y por  tanto de activar a NF‐κB), de degradar a dicha proteína adaptadora así como de aumentar la capacidad citotóxica del TNFR1. 

Reforzando la importancia de la degradación de TRAF2 por el TNFR2 en la señalización 

del TNFR1 y su independencia de la interacción TNFR2‐TRAF2, los estudios de ciclo celular nos 

muestran como únicamente los receptores capaces de inducir la degradación de TRAF2 (RANK‐

TNFR2 y RANK‐TNFR2‐BKO) son capaces de aumentar  la capacidad citotóxica del TNFR1  (ver 

Figura V‐38 y  Figura VI‐2). Sin embargo, cabría esperar que los receptores RANK‐TNFR2‐AAD y 

RANK‐TNFR2‐DAA (incapaces de degradar a TRAF2 pero sí de  iteraccionar con él y, por tanto, 

capaces de activar a NF‐қB), al cotransfectarse conjuntamente con TNFR1  fueran capaces de 

reducir el papel citotóxico del TNFR1 al estar potenciada la activación de NF‐қB (Figura V‐30 y 

en consecuencia,  las señales proliferativas. Sin embargo, observamos como  la cotransfección 

del TNFR1 con  los receptores RANK‐TNFR2‐AAD y RANK‐TNFR2‐DAA no disminuye  los niveles 

de muerte celular en comparación con los obtenidos en el caso de la transfección única con el 

TNFR1 (ver Figura V‐32 y Figura VI‐2). Puesto que la capacidad de TRAF2 de limitar la activación 

de  las  caspasas  por  el  TNFR1  reside  en  su  interacción  con  cIAP1  y  cIAP2,  los  niveles 

intracelulares de éstas podrían actuar como limitadores de la capacidad de TRAF2 de bloquear 

la  apoptosis.  Así,  aunque  los  niveles  intracelulares  de  TRAF2  sean  elevados,  los  niveles  de 

cIAP1 y cIAP2 se mantendrían, no observándose una disimución de la capacidad citotóxica del 

RANK‐ TNFR2‐BKO‐AAD

RANK‐ TNFR2‐BKO‐DAA

RANK‐TNFR2

RANK‐TNFR2‐BKO

RANK‐ TNFR2‐DAA

RANK‐ TNFR2‐AAD

241439SKAA AAAIAAD

RANKec (1‐241) TNFR2ic (267‐439)

241439SKEE KPL

343 379

I

241439SKAA AAAIDAA

241439SKAA AAAI

241439SKEE KPLIAAD

241439SKEE KPLIDAA

DegradaciónTRAF2

Interacción TRAF2

+

‐‐

‐

+

+

+

+‐

‐

‐

‐

Capacidad citotóxica

+

+‐

‐

‐

‐

Discusión 

135 

 

receptor. Estos resultados ponen de manifiesto la compleja regulación a la que se encuentran 

sometidos  estos  receptores  así  como  el  delicado  balance  existente  entre  las  señales 

proliferativas y de muerte celular. 

Al  igual que en el caso de  la degradación de TRAF2, estudios previos del  laboratorio 

demostraron  que  la  región  del  TNFR2  comprendida  entre  los  aminoácidos  343‐378  se 

encuentra implicada en la capacidad del receptor de activar a JNK (Rodriguez, 2006). El análisis 

funcional  de  los  receptores  RANK‐TNFR2‐BKO    y  de  RANK‐TNFR2‐343‐378  demuestra  que 

ambos  receptores,  a  pesar  de  no  ser  capaces  de  unirse  a  TRAF2,  activan  a  JNK  (ver  Figura 

V‐33). En consecuencia, nos planteamos identificar los residuos concretos de la región 343‐378 

responsables de dicha actividad. Puesto que el análisis del perfil de fosforilación de esta región 

del  receptor  mostraba  la  existencia  de  diversos  residuos  de  serina  susceptibles  de 

experimentar un proceso de fosforilación, estando varias de ellas implicadas en la degradación 

de TRAF2, nos planteamos  la posibilidad de que algunos de estas serinas también estuvieran 

implicadas en  la activación de JNK. Por ello, analizamos  la capacidad de activación de JNK de 

receptores  incapaces  de  interaccionar  con  TRAF2  y  que,  además,  presentaban  mutados 

diversos residuos de serina del módulo 343‐378. El análisis de fosforilación de c‐Jun realizado 

nos mostró que ninguno de  los receptores analizados perdiera por completo su capacidad de 

activación  de  JNK  (ver  Figura V‐34).  Sin  embargo,  el  receptor  RANK‐TNFR2‐BKO‐CAA  sí  que 

muestra una menor capacidad de activación de JNK que el resto de receptores ensayados, si 

bien  los resultados obtenidos no nos permiten concretar  los residuos  implicados, así como el 

mecanismo responsable de esta actividad. En este contexto, cabe destacar que los residuos de 

serina 376 y 377, mutados en el receptor RANK‐TNFR2‐BKO‐CAA, no figuran entre los previstos 

como susceptibles de experimentar un proceso de fosforilación (ver Figura V‐23).  

La activación de JNK por el TNF en la mayoría de tipos celulares ocurre sin una indución 

significativa de  la muerte celular, debido a que el  tratamiento con TNF únicamente produce 

una  activación  transitoria  de  JNK  (Franzoso  et  al,  2003)  en  comparación  con  la  activación 

prolongada de dicha quinasa que  tiene  lugar  tras  la exposición a  la  luz ultravioleta y a otros 

estímulos de estrés celular. Para que sea capaz de inducir procesos de muerte celular, JNK ha 

de encontrarse activado de manera crónica, tal y como ocurre durante la inhibición de NF‐κB. 

De  hecho,  en  presencia  de  complejos  funcionales  de NF‐κB,  la  activación  de  JNK  ejerce  un 

efecto proliferativo (Li & Verma, 2002). La activación de NF‐κB supone la activación de diversas 

proteínas diana entre  las que destacan Gadd45betta, XIAP (miembro de  la familia  IAP) y A20 

que  inhiben  la  actividad  de  JNK  (Boone  et  al,  2002;  Papa  et  al,  2004;  Salvesen & Duckett, 

Discusión 

136 

 

2002). Además, la acumulación de ROS se encuentra controlada por NF‐κB, bloqueando así la 

muerte  celular  inducida por  el  TNF  (Sakon  et  al, 2003),  resultando  éstos necesarios para  la 

activación prolongada de JNK inducida por los receptores de la superfamilia TNFR, al inactivar 

al inhibidor de ASK1 (Matsuzawa et al, 2002). Además, FHC (del inglés Ferritin Heavy Chain) y 

Mn‐SOD (del  inglés Mn ++ SuperOxide Dismutase) también se encuentran controlados a nivel 

transcripcional  por  NF‐κB  ejerciendo  un  papel  importante  en  la  inhibición  de  la  capacidad 

citotóxica del TNF al reducir la producción de ROS (Curtin et al, 2002; Torti & Torti, 2002). 

Si  bien  se  ha  descrito  un  comportamiento  bifásico  en  cuanto  a  la  capacidad  de 

activación  de  JNK  en  respuesta  a  distintos  estímulos,  existiendo  una  fase  temporal  de 

activación dependiente de TRAF2 y una fase prolongada independiente de TRAF2 pero sí de la 

producción  de  ROS,  en  ningún  estudio  se  ha  planteado  la  posibilidad  de  la  implicación  de 

regiones distintas de los receptores en dichas respuestas. Por tanto, que el TNFR2 sea capaz de 

fosforilar a  c‐Jun  tanto de manera dependiente  como  independiente de TRAF2 plantea una 

nueva alternativa a cómo los receptores del TNF son capaces de activar a JNK.  

 

Figura VI‐3: Posibles respuestas biológicas del TNFR2 como consecuencia de la activación de JNK. Tras la activación del TNFR2, su interacción con TRAF2 induce tanto la activación de NF‐κB como de AP‐1 lo que conlleva la activación  de  procesos  implicados  en  la  proliferación  y  supervivencia  celular.  Dichas  actividades  se  encuentran reguladas por  la capacidad del  receptor de  inducir  la degradación de TRAF2  limitando así  la activación de dichos factores de transcripción. Además, el TNFR2 es capaz de activar a JNK de una manera  independiente de TRAF2  lo que situado en un contexto de inhibición de NF‐κB podría resultar en el desencadenamiento de procesos de muerte celular por el receptor. 

mTNF

TNFR2

TRAF2

ACTIVACIÓN NF-κB

ACTIVACIÓN AP-1

mTNF

TNFR2

Activación prolongada de JNK

TRAF2

mTNF

TNFR2

JNK

?

Supervivencia celular Muerte celular ?

Discusión 

137 

 

De  esta  manera,  la  interacción  TNFR2‐TRAF2  estaría  implicada  en  la  respuesta 

temporal de activación de JNK, lo que conlleva la activación de señales proliferativas, mientras 

que  la  activación  de  JNK  por  la  región  343‐378  del  receptor  podría  estar  implicada  en  la 

activación prolongada de JNK que se encuentra relacionada con  la activación de procesos de 

muerte  celular  en  un  contexto  de  inhibición  de  la  actividad  de  NF‐κB.  Además,  resulta 

importante también  la capacidad del receptor de degradar a TRAF2. En este contexto, podría 

plantarse un modelo de activación de  la señalización del TNFR2 (Figura VI‐3) según el cual  la 

unión  inicial de TRAF2  con el  receptor  conlleva  tanto  la activación de NF‐κB  como de AP‐1, 

induciendo  la transcripción de genes  implicados en  la proliferación y supervivencia celular. Al 

mismo tiempo, la activación del TNFR2 supone la degradación de inhibiéndose la capacidad de 

dicha proteína activadora de activar a ambos  factores de transcripción. Puesto que el TNFR2 

también activa a JNK de manera independiente de TRAF2, esta actividad permanecería intacta 

tras  la  indución de  la degradación de TRAF2,  lo que en un   contexto de  inhibición de NF‐κB 

podría traducirse en  la  indución de un proceso de muerte celular en unas condiciones en  las 

que el receptor permanezca activo el tiempo suficiente para inducir la degradación de TRAF2 y 

seguir siendo capaz de activar a JNK.  Sin embargo, al desconocerse los mecanismos implicados 

en la capacidad del receptor de activar a JNK de manera independiente de TRAF2, no podemos 

afirmar  si  esta  activación  de  JNK  por  el  receptor  podría  acabar  originando  un  proceso  de 

muerte  celular,  pero  de  ser  así  podría  explicar  la  capacidad  del  TNFR2  de  inducir  procesos 

citotóxicos  de manera  independiente  del  TNFR1  en  diversos  tipos  celulares  (Depuydt  et  al, 

2005). 

Sin embargo, estos planteamientos resultan difíciles de estudiar bajo una estrategia de 

sobreexpresión  al  ser  imposible  diferenciar  entre  una  activación  temprana  o  tardía  de  la 

señalización del receptor. De nuevo, resulta esencial  la generación de un sistema de estudio 

del receptor en el que se pueda controlar tanto la intensidad del estímulo como la duración de 

la señal. 

Como se ha mencionado a lo largo del presente trabajo, el objetivo de la generación de 

receptores quiméricos RANK‐TNFR2 funcionalmente equiparables al TNFR2 es la generación de 

un  sistema  celular  de  estudio  de  la  señalización  del  receptor  de  manera  controlable  e 

independiente del TNFR1. De esta manera,  la obtención de una  línea celular que exprese de 

manera estable al  receptor quimérico RANK‐TNFR2 nos permitirá estudiar  su activación y  la 

señalización  desencadenada  como  consecuencia del  tratamiento  con RANKL,  en  un  sistema 

celular  que  no  exprese  RANK,  pudiendo  así  controlar  tanto  la  dosis  del  ligando  como  la 

Discusión 

138 

 

duración  de  la  activación.  Además,  el  tratamiento  conjunto  de  RANKL  y  TNF  nos  permite 

activar  tanto  al  TNFR2  (en  su  forma  quimérica)  como  al  TNFR1,  pudiendo  así  estudiar  la 

interconexión entre ambos receptores sin necesidad de forzar su agregación y activación. 

En el presente trabajo se describe la generación de un sistema de estudio y expresión 

del  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  en  las  células  L929  de manera  estable  y  permanente, 

obteniéndose diversas  líneas celulares L929 en donde se encuentran  insertados y expresados 

de manera  estable  el  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  así  como  diversas  deleciones  de  la 

región intracelular del mismo. Como primera aproximación para el estudio de la funcionalidad 

y  viabilidad  del  sistema,  realizamos  tratamientos  con  RANKL  y  TNF  así  como  con 

combinaciones  de  ambas  citoquinas  precedidas  de  un  pretratamiento  con  RANKL  (para 

conseguir una activación inicial del receptor quimérico). De esta manera, comprobamos como 

el  tratamiento  combinado  de  RANKL  y  TNF  en  la  línea  L929‐RANK‐TNFR2  incrementa  el 

expresión  de  distintos  marcadores  de  muerte  celular  (ver  Figura  V‐42).  El  tratamiento 

combinado con ambas citoquinas produce un aumento en el número de células positivas para 

AnexinaV y 7‐AAD, en comparación con el tratamiento con TNF, lo que nos indica además que 

dicho proceso citotóxico ocurre mediante  la consecución de  la apoptosis. Por otro  lado, al no 

observarse  incremento del número de células positivas para 7ADD, podemos concluir que  la 

muerte celular observada no ocurre mediante un proceso de necrosis (ver Figura V‐45).  

El incremento de la capacidad citotóxica del TNFR1 al encontrarse activado el TNFR2 se 

debe  básicamente  a  la  inducción  de  la  degradación  de  TRAF2  promovida por  el  TNFR2. De 

hecho,  mediante  estudios  de  sobreexpresión,  hemos  comprobado  como  al  mutarse 

específicamente  los residuos del receptor responsables de tal degradación, no se observa un 

incremento  en  los  niveles  de  muerte  celular  registrados  cuando  se  sobreexpresan 

simultáneamente ambos receptores (ver Figura V‐32). Sin embargo, tras el tratamiento de las 

distintas  líneas  celulares  L929  que  expresan  de manera  estable  los  receptores  quiméricos 

RANK‐TNFR2  con  RANKL  y  TNF  únicamente  observamos  un  incremento  de  los  niveles  de 

muerte celular, en comparación con el tratamiento con TNF, en la línea celular que expresa de 

manera  estable  al  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  íntegro.  Tras  el  tratamiento  con  ambas 

citoquinas de las líneas L929 que expresan de manera estable a RANK‐TNFR2‐Δ403 y a RANK‐

TNFR2‐Δ379  no  se  observa  una  disminución  en  el  número  de  células  viables  tras  los 

tratamientos  con  ambas  citoquinas  (ver  Figura V‐43)  ni  un  incremento  en  el  porcentaje  de 

células  positivas  para  distintos  marcadores  de  muerte  celular  en  comparación  con  el 

tratamiento aislado con TNF (Figura V‐47). Estos resultados contrastan con los datos obtenidos 

Discusión 

139 

 

mediante  los  experimentos  de  sobreexpresión,  en  donde  se  produce  una  activación 

intensificada de la señalización del receptor, y los experimentos de activación con ligando, en 

donde  pudieran  requerirse  otros  factores  o  condiciones  para  inducir  por  completo  la 

señalización  del  receptor.  A  este  respecto,  resultaría  interesante  la  generación  de  nuevas 

líneas  L929  en  donde  se  expresen  de manera  estable  los  receptores  RANK‐TNFR2‐Δ403  y 

RANK‐TNFR2‐Δ386‐414, ambos carentes de un sitio de  interacción con  las proteínas TRAF, así 

como  RANK‐TNFR2‐AAD  y  RANK‐TNFR2‐DAA,  en  donde  se  encuentran mutados  de manera 

específica los residuos responsables de la indución de la degradación de TRAF2. El estudio de la 

viabilidad  celular  tras  el  tratamiento  combinado  de  RANKL  y  TNF  en  comparación  con  el 

tratamiento  de  TNF  en  estas  nuevas  líneas  celulares  permitirá  dilucidar  los  mecanismos 

concretos implicados en la señalización del receptor.  

Paralelamente,  este  sistema  de  estudio  de  la  señalización  del  TNFR2  nos  permitirá 

identificar las proteínas implicadas tanto en la degradación de TRAF2 como en la activación de 

JNK por  la  región 343‐378 del  receptor,  llegando a establecer  tanto  las  vías de  señalización 

responsables  de  ambas  actividades  como  los  efectos  biológicos  de  la  activación  de  JNK 

independiente de la interacción de TRAF2 con el receptor.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CONCLUSIONES

                                                                                                                     Conclusiones 

140 

 

VII. CONCLUSIONES 

1. La proteína adaptadora TRAF2 potencia  la capacidad del TNFR2 de activación de NF‐κB y 

JNK, mientras  que  TRAF1  y  TRAF3  ejercen  un  efecto  inhibitorio  sobre  la  actividad  del 

receptor. 

2. El  receptor  quimérico  RANK‐TNFR2  es  plenamente  funcional  y  equiparable  al  receptor 

TNFR2. 

3. Las  región 343‐349 del TNFR2 es  responsable de  la capacidad del  receptor de  inducir  la 

degradación de la proteína adaptadora TRAF2. 

4. La  degradación  de  TRAF2  inducida  por  el  TNFR2  desempeña  un  papel  clave  en  la 

interacción  funcional  entre  el  TNFR2  y  el  TNFR1,  modulando  tanto  su  capacidad  de 

activación de NF‐κB como su potencial citotóxico. 

5. Los residuos de serina del módulo 343‐378 del TNFR2 no están implicados en la capacidad 

del TNFR2 de activar a JNK. 

6. Las  líneas  celulares  L929  que  expresan  de  manera  estable  y  funcional  el  receptor 

quimérico RANK‐TNFR2 o sus variantes permiten el estudio de la señalización del TNFR2 al 

tratarlas  con RANKL. Esto permite el estudio  independiente del TNFR1 y del TNFR2, así 

como el de la interconexión funcional ente entre ellos. 

 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BIBLIOGRAFÍA 

   

 

 

 

 

   

        Bibliografía 

141 

 

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PUBLICACIONES 

   

 

 

 

 

NF-�B Signal Triggering and Termination by Tumor NecrosisFactor Receptor 2*□S

Received for publication, January 31, 2011, and in revised form, April 6, 2011 Published, JBC Papers in Press, May 10, 2011, DOI 10.1074/jbc.M111.225631

Montserrat Rodríguez‡1,2, Lucía Cabal-Hierro‡1,3, María Teresa Carcedo‡, Juan Manuel Iglesias‡, Noelia Artime‡3,Bryant G. Darnay§, and Pedro S. Lazo‡4

From the ‡Departamento de Bioquímica y Biología Molecular and Instituto Universitario de Oncología del Principado deAsturias (IUOPA), Universidad de Oviedo, 33071 Oviedo, Spain and the §University of Texas, MD Anderson Cancer Center,Houston, Texas 77030

Tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) activates tran-

scription factor �B (NF-�B) and c-Jun N-terminal kinase (JNK).

The mechanisms mediating these activations are dependent

on the recruitment of TNF receptor-associated factor 2

(TRAF2) to the intracellular region of the receptor. TNFR2 also

induces TRAF2 degradation. We show that in addition to the

well characterized TRAF2 binding motif 402-SKEE-405, the

human receptor contains another sequence located at theC-ter-

minal end (amino acids 425–439), which also recruits TRAF2

and activates NF-�B. In addition to that, human TNFR2 con-

tains a conserved region (amino acids 338–379) which is

responsible for TRAF2 degradation and therefore of terminat-

ing NF-�B signaling. TRAF2 degradation and the lack of NF-�Bactivation when both TNFR1 and TNFR2 are co-expressed

results in an enhanced ability of TNFR1 to induce cell death,

showing that the cross-talk between both receptors is of a great

biological relevance. Induction of TRAF2 degradation appears

to be independent of TRAF2 binding to the receptor. Amino

acids 343-TGSSDSS-349 are essential for inducing TRAF2 deg-

radation because deletionmutants of this region or point muta-

tions at serine residues 345 and346or 348 and349obliterate the

ability of TNFR2 to induce TRAF2 degradation.

Tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2)5 is one of the two

receptors known to bind TNF, this cytokine can be found as a

transmembrane (mTNF) or a soluble (sTNF) form. Whereas

both mTNF and sTNF activate TNFR1, TNFR2 is mainly acti-

vated by mTNF (1, 2), which upon binding to the receptor,

causes its trimerization and activation. The fact that mTNF is

the optimal activator of TNFR2 has implied serious limitations

in the study of this receptor. Because the activation of TNFR2

depends on its aggregation, receptor activation can be forced by

its overexpression or by the use of specific antibodies against

the receptor (3, 4).

TNFR2 lacks any intrinsic catalytic activity within its cyto-

plasmic tail, thus any signal emerging from the receptor

depends on the recruitment of adaptor proteins. TNFR2 can

bind directly TRAF2 and through this interaction signals for

NF-�B and JNK activation, as the expression of a dominant

negative form of the adaptor protein (TRAF2dn) can suppress

both the activation of NF-�B and JNK (5).

Seven different TRAFproteins have been identified so far (6).

All of them share a highly conserved TRAF domain at the pro-

tein C terminus and, with the exception of TRAF1, a N-termi-

nal-RING finger domain followed by five to seven zinc-finger

motifs (7, 8). TRAF proteins were initially considered as adap-

tor proteins between TNFRs and the kinases implicated in the

activation of JNK or I�B kinase IKK (9). It was then described

that TRAF proteins, because of their RING finger domain,

might act as E3 ubiquitin ligases, which catalyze K63-linked

ubiquitination (10). In the case of TRAF2 this requires the

interaction with cellular inhibitor of apoptosis 1 (cIAP1) and 2

(cIAP2) (11). More recently, it has been suggested that TRAF2

is by itself unable to act as a E3 ligase (12) and that sphingosine

1-phosphate might act as a cofactor required for the E3 ligase

activity associated to TRAF2 (13) to catalyze K63-linked

ubiquitination.

As for the interaction of TRAF2 and TNFR2, by using

sequential truncations of the receptor cytoplasmic tail (amino

acids 266–439), a sequence comprising amino acids 384 to 423

was proposed to be responsible of TRAF2 recruitment (14).

Further analysis of this sequence limited the TRAF2 binding

motif to amino acids 402-SKEE-405 (15, 16). More recently,

another TRAF2 binding site with a suggested negative regula-

tory role has been identified on the murine TNFR2 (17). This

site comprises amino acids 433–437, and its sequence does not

fit with any of the consensus motifs known for TRAF2 interac-

tion with TNFRs.

Recently it has been described that TNFR2 activation

induces changes in TRAF2 subcellular localization (18, 19).

Upon TNFR2 stimulation, TRAF2 translocates to a Triton

X-100 insoluble compartment (20, 21) where the adaptor pro-

tein is K48-linked ubiquitinated and finally degraded by the

proteasome (19, 22). In this process, cIAP1 interactswith the E2

* This work was supported by Grant SAF2009-07227 from the Spanish Minis-try of Science and Technology (MICINN) and by Grant IB09-066 from thePlan Regional de Ciencia y Tecnología del Principado de Asturias (PCTI).The IUOPA is supported by Obra Social Cajastur.

□S The on-line version of this article (available at http://www.jbc.org) containssupplemental Table S1 and Figs. S1 and S2.

1 Both authors contributed equally to this work.2 Recipient of a fellowship from the Spanish Ministry of Education.3 Recipients of fellowships from the PCTI.4 To whom correspondence should be addressed: Departamento de Bio-

quimica y Biologia Molecular and Instituto Universitario de Oncologia delPrincipado de Asturias (IUOPA), Universidad de Oviedo, Campus de ElCristo, 33071 Oviedo, Spain. Tel.: 34-98-510-4213; Fax: 34-98-510-3157;E-mail: pslazo@uniovi.es.

5 The abbreviations used are: TNFR2, tumor necrosis factor receptor 2; TRAF2,TNF receptor-associated factor 2; cIAP, cellular inhibitor of apoptosis;TRAK, TNF receptor-associated kinase.

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THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 286, NO. 26, pp. 22814 –22824, July 1, 2011© 2011 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.

22814 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 286 • NUMBER 26 • JULY 1, 2011

Fn5

ZSI

protein Ubc6 thus leading to ubiquitination and proteasomal

degradation of TRAF2 (11, 19, 22). As it has been previously

mentioned, TNFR2 has no enzymatic activity within its cyto-

plasmic tail. Nevertheless it has been reported the activation of

serine-threonine kinases and tyrosine kinases by TNFR2. Thus,

it has been established the association between p80TRAK (p80

TNF receptor-associated kinase) and a region of TNFR2 com-

prising amino acids 354–397 (23). The role of this kinase in

TNFR2 signaling remains to be investigated. The role of tyro-

sine kinases in TNFR2 signaling has not been clarified either. It

has been described that TNFR2 can recruit the tyrosine kinase

ETK, which interacts with the 15 C-terminal amino acids of

TNFR2 (amino acids 425–439). Its activation seems to be inde-

pendent of TRAF2, because overexpression of the mutant

TRAF2dn does not affect ETK activation by the receptor (24).

Our work has focused on the study of NF-�B signaling

pathway considering both its triggering and its termination.

We have found two regions within the receptor involved in

NF-�B activation. Both of them recruit TRAF2 upon recep-

tor activation. One of these regions contains the well char-

acterized TRAF2 binding motif 402-SKEE-405. The second

region identified is located on the C terminus, comprises

amino acids 425–439 of the receptor and its sequence does

not fit with known TRAF2 binding motifs. This region over-

laps with the receptor’s ETK binding site, pointing to a pos-

sible connection between tyrosine kinases and the new

NF-�B activation site. We have also found that human

TNFR2 contains a conserved region localized between

amino acids 338 and 379 of the receptor in which amino

acids 343–349 are essential for inducing TRAF2 degrada-

tion and therefore for terminating NF-�B signaling by

TNFR2, also having important consequences in the signaling

by TNFR1. This region contains several serine residues

which are potential phosphorylation sites and partially over-

laps with the p80TRAK binding region (amino acids 354–

397), suggesting a possible connection between this kinase

activity and the functions here assigned to the 338–379

region of TNFR2.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Plasmids—Expression plasmids encoding human Myc-

tagged TRAF2 and its mutant version Myc-TRAF2dn (lacking

amino acids 1–87, corresponding to the Ring Finger) have been

described elsewhere (25). The NF-�B reporter construct pNF-

�B-SEAP encodes a thermoresistant secretable alkaline phos-

phatase under the control of a promoter where its minimal

promoter region was complemented with four tandem copies

of the NF-�B binding site (GGGGACTTTCCC) (26). Plasmid

encoding NIK-mut, in which lysines 429 and 430 are both

mutated to alanines, and plasmid encoding I�B�dn, lackingamino acids 1 to 36, were a gift from David Wallace (The

Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Plasmid

encoding TNFR1 was a gift from Bharat B. Aggarwal (MD

Anderson, Houston, Texas). Expression plasmids encoding

human FLAG-tagged TNFR2 (pCMV1-FLAG-TNFR2) and its

deletion R2-�379 were a gift from B.B. Aggarwal (MD Ander-

son Cancer Center, Houston, Texas). Unless otherwise indi-

cated, TNFR2 constructs used in this work were generated by

PCR using standard methods and the primers indicated in sup-

plemental Table S1. To generate point mutations by PCR

mutagenesis, the Quick Change Site-directed Mutagenesis kit

of Stratagene was used together with the primers indicated in

supplemental Table S1. The sequences of all plasmids gener-

ated in this work were verified by automated DNA sequencing.

Cell Lines and Transient Transfection—Human embryonic

kidney 293 (HEK 293) cell line was obtained from theAmerican

Type Culture Collection and cultured in minimal essential

medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% gluta-

mine, 0.13% bicarbonate, and antibiotics (100 units/ml penicil-

lin, 50 mg/ml streptomycin). For transient transfections, HEK

293 cells (2 � 105 cells/well on 6-well plates) were seeded and

transfected with Lipofectamine Reagent Plus (Gibco BRL) fol-

lowing manufacturer’s instructions. Cells and the conditioned

supernatants were harvested 24–36 h after transfection.

Western Blotting and Antibodies—Proteins were separated

by SDS-PAGE, electroblotted onto PVDF membranes (Bio-

Rad), blocked for 1 h in 5% nonfat milk in TBS-0.1% Tween and

incubated with the indicated primary antibodies (at 1:1.000

dilution in TBS-0.1% Tween) and the appropriate secondary

antibody (at 1:10.000 dilution in 5% nonfat milk in TBS-0.1%

Tween).

Primary antibody to TRAF2 (c-20) was obtained from Santa

Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) and anti-FLAG

(F3165) and anti-�-actin (A5441) from Sigma. Secondary anti-

bodies anti-rabbit IgG and anti-mouse IgG conjugated horse-

radish peroxidase were purchased from Sigma. Blots were

developedwith an enhanced chemiluminescence detection sys-

tem (GE Healthcare).

TNFR2 and TRAF2 Co-immunoprecipitation Assay—HEK

293 cells were cotransfected with 1 �g of pCMV1-FLAG-

TNFR2 or its deletions and/or mutants together with 0.3 �g ofpRK-Myc-TRAF2. 24 h after transfection, cells were harvested

and lysed in 200 �l of Lysis buffer (20 mM Tris pH 8.0, 150 mM

NaCl, 1 mM DTT, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 �g/�l leu-peptine, 1�g/�l aprotinine, 2mM sodiumorthovanadate). Two

20-�l fractions were collected as inputs for TRAF2 and TNFR2

or its variants as expression controls. The remaining 160 �lfraction was incubated with 1 �g of anti-FLAG antibody at 4 °C

in rotation for 1 h and then with 20 �l of protein G-Sepharose

beads in rotation at 4 °C overnight. After threewasheswith lysis

buffer and an additional onewith low salt buffer (20mMTris pH

8.0, 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 �g/�l leupeptin, 1 �g/�l apro-tinin, 2 mM sodium orthovanadate), the immunoprecipitate

was resuspended in SDS-sample buffer and subjected, together

with inputs, to SDS-PAGE and Western blot with anti-TRAF2

(TRAF2) and anti-FLAG (TNFR2 and its variants).

NF-�B-SEAP Reporter Assay—HEK 293 cells were tran-

siently cotransfected with pNF-�B-SEAP (0.5 �g) and the

expression plasmids specified in each case. 36 h after transfec-

tion, the conditioned medium was removed and assayed for

SEAP activity as previously described (26). The activity of SEAP

was assayed on a 96-well fluorescent plate reader (Cytofluor

TM 2350, Millipore). The average (� S.D.) number of relative

fluorescent light units for each transfection was then deter-

mined and reported as fold activation with respect to control

vector-transfected cells.

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Activation of NF-�B by TNFR2

JULY 1, 2011 • VOLUME 286 • NUMBER 26 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 22815

ZSI

ZSI

Sequence Analysis—The multiple sequence alignment of the

intracellular region of TNFR2 from different species was gen-

erated using ClustalW (27). The alignment was edited using

GENEDOC. Intracellular TNFR2 protein sequences were

obtained from NCBI protein data base and corresponds to the

followingaccessnumbers : gi 339758gbAAA36755.1 (Homosapi-

ens); gi 55591327 ref XP_525188.1 (Pan troglodytes); gi 108997205

ref XP_001105753.1 (Macacamulata); gi 199828 gbAAA39752.1

(Musmusculus); gi 27662550refXP_233644.1 (Rattusnorvegicus);

gi 281349276 gb EFB24860.1 (Ailuropoda melanoleuca); gi

76674315 ref XP_582626.2 (Bos taurus); gi 157427685 ref

NP_001090910.2 (Sus scrofa); gi 194208037 ref XP_001489894.2

(Equus caballus); gi 73950773 ref XP_544562.2 (Canis familiaris).

TNFR2 protein sequence was analyzed with NetPhos (28) that

produces neural network predictions for serine, threonine, and

tyrosine phosphorylation sites in eukaryotic proteins.

Quantification of theHypodiploid Population—HEK293 cells

were transfected with the plasmids of interest together with 0.2

�g of pEGFP-F, a plasmid expressing a farnesylated version of

GFP used as a reporter of transfection. After 36 h, the cells were

collected together with any floating cells in the culture media,

washed with PBS first, and then with 500 �l of buffer H (20 mM

Hepes pH 7.2, 160 mM NaCl and 1 mM EGTA). After these

washes the cells were incubated for 5 min at room temperature

in 500 �l of 0.04% digitonin in buffer H, pelleted and resus-

pended in 1 ml of buffer H with 200 �g/ml of RNase A and 10

�g/ml of propidium iodide for a final incubation of 30 min in

the dark. The cells were analyzed in a Cytomics FC500 (Beck-

man Coulter) cytometer to quantify variations in the sub

G0/G1 population of the transfected cells.

RESULTS

TRAF2 Depletion Induced by TNFR2 Correlates with a

Decrease in TNFR2-mediated NF-�B Activation—Signaling via

TNFR2 causesTRAF2degradation (22). To investigate the rela-

tionship between this phenomenon and the activation of

NF-�B,we analyzed the activation of this transcription factor inseveral conditions in which the extent of TNFR2-induced

TRAF2 degradation was controlled. Thus, increasing amounts

of a mammalian expression vector encoding FLAG-tagged

human TNFR2 was transfected into HEK 293 cells together

with either a TRAF2 encoding plasmid or a NF-�B-dependentreporter construct (pNF-�B-SEAP). As shown in Fig. 1, A and

B, as the expression of the receptor increased there was a deple-

tion of the adaptor protein so that at the highest dose assayed

TRAF2was undetectable. On the other hand, TRAF2was easily

detected in the absence of TNFR2. As for NF-�B, the highest

activation was observed at low doses of the receptor, which

correlates with elevated levels of TRAF2; then the extent of

NF-�B activation decreased as the amount of expressed recep-

tor increased (Fig. 1C) and again, this correlates with the low-

ering in the levels of the adaptor protein.With respect to recep-

tor overexpression, two different molecular weight bands

corresponding to TNFR2 were detected by Western blot. The

different electrophoretic mobilities may be the consequence of

post-translationalmodifications (N-glycosylation andO-glyco-

sylation) experimented by the receptor (29).

TNFR2 Activates NF-�B in the Absence of the Canonical 402-

SKEE-405TRAF2Binding Site—Wewanted to test whether the

abrogation of TRAF2 recruitment by the receptor had the same

FIGURE 1. TRAF2 depletion induced by TNFR2 correlates with the inhibition of TNFR2-mediated NF-�B activation. HEK 293 cells were transientlytransfected with the indicated amounts of pFLAG-TNFR2 either with 0.3 �g of pRK-Myc-TRAF2 or with 0.5 �g of pNF-�B-SEAP reporter vector. To analyze TRAF2protein levels, cells were harvested 36 h after transfection, and cell extracts subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis with anti-FLAG antibody to detectreceptor expression (A) or with anti-TRAF2 antibody (B). For the analysis of NF-�B activation (C), conditioned medium was removed 36 h after transfection andassayed for SEAP activity as described under “Experimental Procedures.” The results in C represent the mean � S.D. of three independent transfectionexperiments.

balt3/zbc-bc/zbc-bc/zbc02611/zbc6917-11z ZSUBMIT 16 xppws S�1 3/6/11 10:36 Comments: ARTNO: M111.225631

Activation of NF-�B by TNFR2

22816 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 286 • NUMBER 26 • JULY 1, 2011

AQ: A

F1

consequences in signaling than depletion of TRAF2. With this

purpose we tested TNFR2 capability to activate NF-�B when

the canonical 402-SKEE-405 TRAF2 binding site was abolished

either by mutation (R2-SKAA) or by internal deletion (R2-

�386–414). As shown in Fig. 2B, both the double point muta-

tion and the deletion mutant were still able to mediate NF-�Bactivation although to a lower extent than the wild-type recep-

tor. On the other hand the mutant receptor R2-�424 (lacking

the 15C-terminal amino acids but still carrying the intact SKEE

TRAF2 binding motif) showed a reduced ability to activate

NF-�B. Moreover, the mutant receptor R2-�403 (in which

amino acids 403–439 were deleted) was the only one unable to

activate NF-�B, indicating that the complete ability to activate

NF-�B lies in the C-terminal half of the receptor (Fig. 2, A and

B). All this led us to consider the possible existence of a novel

region of the receptor capable of binding TRAF2.

TNFR2 Binds TRAF2 through a Region Comprising the 15

C-terminal Amino Acids of the Receptor—The results reported

above raised the question of whether the R2-SKAA mutant or

the R2-�386–414 deletion mutant were able of recruiting

TRAF2 and whether these alterations were not sufficient to

obliterate the binding of TRAF2 to the receptor, thus providing

an explanation to the activation ofNF-�B induced by the recep-

tors carrying the double mutation or the deletion. For this pur-

pose, we carried out co-immunoprecipitation assays of TRAF2

with TNFR2 and some receptor variants affecting the 402-

SKEE-405 binding site (represented in Fig. 3A). As shown in

Fig. 3B, panel 1, TNFR2 and R2-�424 (both carrying an intact

canonical 402-SKEE-405TRAF2 bindingmotif) boundTRAF2.

Mutant receptors R2-�386–414 and R2-SKAA, both with

alterations in the canonical TRAF2 binding site, also bound

TRAF2, indicating the existence of a novel TRAF2 binding site

in the receptor. From the binding of TRAF2 to the mutant

receptor R2-�386–414 and the lack of binding to the deletion

mutant R2-�403 it can be inferred that an alternative TRAF2

binding module should be located in the region comprising the

C-terminal amino acids 415–439. In this region, which

sequence is 415-PETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS-439, it

is included the sequence 421-STEE-424 that fits to the major

TRAF2 binding consensus motif (P/S/T/A)X(Q/E)E (30). To

analyze the implication of this sequence in the novel TNFR2-

TRAF2 interaction detected, we constructed and assayed the

mutant receptor R2-SKAA-STAA (containing the sequences

402-SKAA-405 and 421-STAA-424). This receptor still bound

TRAF2, (Fig. 3B, panel 2), indicating that the sequence 421-

STEE-424 is not responsible for the novel interaction detected.

Therefore, we ruled out that the sequence 421-STEE-424

within the C-terminal end of the receptor was responsible for

binding TRAF2. We therefore focused our studies on the

sequences 415-PETLLG-420 and 425-KPLPLGVPDAGMKPS-

439. To test whether 415-PETLLG-420 was able to interact

with TRAF2, we assayed R2-SKAA-�424, a receptor, which

lacks amino acids 424–439 and carries the mutation 402-

SKAA-405. This receptor did not bind TRAF2, (Fig. 3B, panel

3) indicating that the second TRAF2 binding site should be

located within amino acids 425-KPLPLGVPDAGMKPS-439.

To test the function of the most N-terminal amino acids of this

sequence, we constructed the mutant R2-SKAA-AAA (which

contains themutations 402-SKAA-405 and 425-AAA-427) and

to test the most C-terminal amino acids of the sequence we

generated a mutant receptor containing the double mutation

402-SKAA-405 and deleted from amino acidA434 to theC-ter-

minal residue (R2-SKAA-�434). As shown in Fig. 3B, panels 4

and 5, neither of these two mutant receptors bound TRAF2,

indicating the implication of amino acids at both ends of this

C-terminal sequence in the binding of the adaptor protein. We

also carried out experiments studying the interaction between

wild-typeTNFR2or keymutant receptors described abovewith

FIGURE 2. TNFR2 activates NF-�B in the abscence of the canonical 402-SKEE-405 TRAF2 binding site. A, schematic diagram of TNFR2 and its mutants ordeletions. Diagrammatic representation of TNFR2 intracellular region (amino acids 266 – 439) and its mutants or deletions. Numbers indicate the amino acidposition in the full-length human receptor sequence. In deletions, the last residue retained is numbered. Point mutations are indicated in black boxes. Theability to activate NF- �B is also indicated on the right. B, NF-�B activation induced by TNFR2 and its mutants or deletions. HEK 293 cells were transientlytransfected with 0.1 �g of expression vectors encoding TNFR2, R2-�424, R2-�403, R2-SKAA, or R2-�386 – 414 together with 0.5 �g of pNF-�B-SEAP. Condi-tioned medium was removed 36 h after transfection and assayed for SEAP activity. The results represent the mean � S.D. of three independent transfectionexperiments.

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endogenous TRAF2, rather than with the ectopically expressed

adaptor protein. The results confirmed all the observations

made with the ectopically expressed TRAF2 protein (Fig. 3B,

panel 6). From our study it can be concluded the existence of a

novel TRAF2 binding region in TNFR2, located at the 15 C-ter-

minal amino acids of the receptor which fits neither the major

(P/S/T/A)X(Q/E)E nor theminor PXQXTTRAF2 binding con-

sensus motifs (30).

The Novel TRAF2 Binding Region Signals for NF-�B Activa-

tion in a TRAF2-, NIK-, and I�B�-dependent Fashion—We

next addressed the question ofwhether the newTRAF2binding

site was responsible for the activation of NF-�B detected in the

FIGURE 3. TNFR2 binds TRAF2 through a region comprising the 15 C-terminal amino acids of the receptor. A, schematic diagram of TNFR2 and its mutantsor deletions. Diagrammatic representation is as in Fig. 2. The ability to bind TRAF2 is also indicated on the right. B, TNFR2-TRAF2 co-immunoprecipitation. HEK293 cells were cotransfected with 1 �g of expression plasmid encoding FLAG-tagged TNFR2 or its variants as indicated and 0.3 �g of pRK-Myc-TRAF2 (1 to 5)or without pRK-Myc-TRAF2 (6) to test the interaction with endogenous TRAF2. 24 h after transfection, cells were harvested and lysed. Inputs were analyzed todetermine receptor and TRAF2 expression levels. Immunoprecipitation was carried out with anti-FLAG antibody. Immunoprecipitates were resolved bySDS-PAGE and Western blotted with anti-TRAF2 antibody as indicated. Novel constructs tested in each panel are marked with an asterisk.

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Activation of NF-�B by TNFR2

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absence of 402-SKEE-405 TRAF2 binding motif (see Fig. 2B).

With this goal we transiently cotransfected TNFR2 (both

TRAF2 binding sites intact), R2-SKAA (without a functional

canonical TRAF2 binding site), R2-�424 (lacking the C-termi-

nal TRAF2 binding site), R2-SKAA-�424 (with the canonical

TRAF2 bindingmotif mutated and the C-terminal one deleted)

and R2-�403 (with both TRAF2 binding sites deleted) either

alone or together with a expression plasmid encoding mutant

inactive versions of TRAF2 (TRAF2dn) and assayed them for

the activation of NF-�B using the NF-�B dependent reporter

plasmid pNF-�B-SEAP. As expected from our previous results

(see Fig. 3), TNFR2, R2-SKAA and R2-�424, each one carrying

at least one functional TRAF2 binding site, activated NF-�Bwhereas R2-SKAA-�424 and R2-�403, with no functional

TRAF2 binding sites, were unable to activate the transcription

factor (Fig. 4A), indicating again that TRAF2 recruitment by

TNFR2 is a pre-requisite for the activation of NF-�B. This ideais further stressed because TRAF2dn abolished signaling from

either TNFR2 region (Fig. 4A). It is remarkable that each region

implicated in NF-�B activation signals with similar strength.

The wild-type TNFR2, however, displayed an activation power

that was not additive of those two components, indicating that

both sites were not completely independent.We also wanted to

test the functional implication of NIK and I�B�, two signal

transducers classically related to NF-�B signaling pathway, in

the activation of NF-�B by the C-terminal region of the recep-

tor. For this purpose, we transiently cotransfected the expres-

sion plasmids encoding TNFR2, R2-SKAA, or R2-�424 with

either a plasmid encoding a catalytically inactive version of NIK

(NIK-mut) or a plasmid encoding a non degradable version of

I�B� (I�B�dn) and assayed them for activation of NF-�B as

described above. As shown in Fig, 4B, both NIK-mut and

I�B�dn obliterated NF-�B activation induced by both TRAF2

binding regions in TNFR2. We therefore concluded that there

are no differences between the two TRAF2 binding sites as for

the pathways they use to activate NF-�B. It can also be con-

cluded that TNFR2 activates NF-�B by both the classical and

the alternative pathways.

The Novel NF-�B Activation/TRAF2 Binding Site Is Highly

Conserved—To explore the conservation status of the novel

NF-�B activation/TRAF2 binding site, we made a multiple

amino acid sequence alignment of TNFR2 intracellular regions

from different species. The result indicates that the novel

NF-�B activation/TRAF2 binding site, comprising amino acids

425 to 439 of the human receptor, is highly conserved among

the species analyzed (supplemental Fig. S1). This comparison

revealed another three modules which are highly conserved in

addition to the NF-�B activation/TRAF2 binding sites. These

three conserved modules comprise amino acids 266–285

(module I), amino acids 291–321 (module II) and amino acids

338–379 (module III).We therefore aimed at studying the pos-

sible implication of thesemodules in the degradation of TRAF2

triggered by TNFR2.

The Region Comprising Amino Acids 338–379 of TNFR2 Is

Involved in TRAF2 Degradation—The observations reported

above led us to generate some new variants of TNFR2 with

FIGURE 4. The novel TRAF2 binding site activates NF-�B in a TRAF2, NIK, and I�B�-dependent fashion. A, analysis of TRAF2 implication in NF-�B activationmediated by the C-terminal TRAF2 binding site. HEK 293 cells were transiently transfected with 0.1 �g of expression vectors encoding TNFR2, R2-SKAA,R2-�424, R2-SKAA-�424, or R2-�403 as indicated, together with 0.5 �g of pNF-�B-SEAP and, when indicated, with 0.2 �g of a plasmid encoding TRAF2dn.Conditioned medium was removed 36 h after transfection and assayed for SEAP activity. B, analysis of the functional relevance of NIK and I�B� in TNFR2-de-pendent NF-�B activation. HEK 293 cells were transiently transfected with 0.1 �g of expression vectors encoding TNFR2, R2-SKAA, R2-�424, or R2-SKAA-�424as indicated, together with 0.5 �g of pNF-�B-SEAP and, when indicated, with 0.2 �g of an expression vector encoding NIK-mut or I�B�dn. Conditioned mediumwas removed 36 h after transfection and assayed for SEAP activity.

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some internal deletions lacking amino acids 304–345 (R2-

�304–345) in whichmodule II has been partially eliminated or

lacking amino acids 343–378 (R2-�343–378) in which module

III has been eliminated, aswell as others containing partial dele-

tions from the C terminus (R2-�379 and R2-�343) as shown in

Fig. 5A. We cotransfected the plasmids encoding such mutant

receptors together with TRAF2 expression vector and exam-

ined their ability to trigger TRAF2 degradation. As shown in

Fig. 5B, R2-�379 andR2-�304–345were able to induceTRAF2degradation. By contrast, R2-�343 and R2-�343–379 failed to

induce TRAF2 degradation. These results indicate that the

region comprised between amino acids 343 and 378 is involved

in the induction of TRAF2 degradation. These amino acids are

comprised within the conserved module III of the receptor

mentioned above, which may therefore have an important role

in TNFR2 signal transduction.

Amino Acids 345-SS-346 and 348-SS-349 of TNFR2 Are

Responsible for Receptor-induced TRAF2 Depletion—As men-

tioned above, amino acids 343–378 of TNFR2 appear to be

responsible for the degradation ofTRAF2 induced by the recep-

tor. We therefore focused on the search of the specific residues

responsible of this activity. The region 343–378 of TNFR2 con-

tains 11 serine residues (Fig. 6A) which were analyzed with the

NetPhos software to predict possible phosphorylation sites. As

shown in Fig. 6A, 7 of the 11 serine residues were predicted as

phosphorylation sites with a score higher than 0.8. We there-

fore generated new mutant receptors (represented in supple-

mental Fig. S2A) with internal deletions within this region and

FIGURE 5. The region comprising amino acids 343–378 of TNFR2 is involved in TRAF2 degradation. A, schematic diagram of TNFR2 and its deletions.Diagrammatic representation is as in Fig. 2. Black boxes indicate the conserved modules and, when required, the amino acid sequence is indicated. The abilityto induce degradation of TRAF2 is also indicated on the right. B, analysis of TRAF2 degradation induced by different TNFR2 deletion mutants. HEK 293 cells weretransiently transfected with 0.3 �g of pRK-Myc-TRAF2 and the indicated amounts of pTNFR2, pR2-�379, pR2-�343, pR2-�304 –345, or pR2-�344 –379, all FLAGtagged. 36 h after transfection, cells were harvested and lysed. Equal aliquots were resolved by SDS-PAGE and Western blotted with anti-TRAF2 or anti-FLAG(receptor) antibodies.

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Activation of NF-�B by TNFR2

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also with the TRAF2 binding sites (402-SKEE-405 and 425-

KPL-427) mutated (402-SKAA-405 and 425-AAA-427) so that

they were unable to interact with the adaptor protein (and

therefore named R2 BKO, from TRAF2 binding knock out).

The analysis of their ability to induce TRAF2 degradation

showed that the region comprising amino acids 343–349 is

responsible of this activity (supplemental Fig. S2B). In this

sequence of 6 amino acids, 4 of them are serines which are

potential phosphorylation sites. We therefore generated two

new mutant receptors in which serines 345 and 346 or serines

348 and 349 were mutated. In these receptors the binding of

TRAF2 was also knocked out and were therefore named

R2-BKO-AAD and R2-BKO-DAA, respectively (see Fig. 6B).

The Western blot analysis of cell extracts in which increasing

amounts of the expression plasmids coding for these receptors

were cotransfected with the expression plasmid coding for

TRAF2 showed that neither receptorwas able to induceTRAF2

degradation (Fig. 6C). We can therefore conclude that any of

these 4 serine residues appear to be essential for inducing

TRAF2 degradation, thus providing the receptor site in which

NF-�B signal termination is initiated. It is important to stress

that all the receptors used in this study were unable to bind

TRAF2, thus showing that the induction of TRAF2 degradation

by TNFR2 appears to be independent of TRAF2 binding.

TNFR2 Enhances the Ability of TNFR1 to Induce Cell Death—

Both TNF receptors can trigger NF-�B activation (5, 31), and it

is known that TNFR2 can potentiate the cytotoxicity of TNFR1

(32, 33). To test if the TRAF2 degradation module identified in

the cytoplasmic region of TNFR2 is necessary for the coopera-

tion between the two TNF receptors to induce cell death,

HEK293 cells were transfected with a fixed amount of TNFR1

and increasing amounts of wild-type TNFR2 or with R2-� 343,

a TNFR2 deletion mutant lacking the two TRAF2 binding sites

and the module necessary to induce the degradation of TRAF2

FIGURE 6. Amino acids 345-SS-346 and 348-SS-349 of TNFR2 are responsible for receptor-induced TRAF2 degradation. A, sequence analysis of region343–379 to detect potential phosphorylation sites. The amino acid sequence between residues 343 and 379 is indicated. The 11 serine residues within thissequence are marked with asterisks. The sequence was analyzed with the NetPhos software to identify serine residues that could be phosphorylated. 7 of theserine residues show a score higher than 0.8. B, schematic representation of the mutations of region 343–349 of TNFR2. Diagrammatic representation of TNFR2mutants is as in Fig. 5. The ability to induce TRAF2 degradation is also indicated on the right. C, mutation of serines 345- 346 or 348 –349 abrogates TRAF2degradation. HEK 293 cells were transiently transfected with 0.3 �g of pRK-Myc-TRAF2 and increasing amounts of pR2-BKO-AAD or pR2-BKO-DAA (all FLAGtagged) as indicated. 36 h after transfection cells were harvested and lysed. Equal aliquots of the lysates were resolved by SDS-PAGE and Western blotted withanti-TRAF2, anti-FLAG (receptors) or anti-�-actin antibodies.

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Activation of NF-�B by TNFR2

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(see Fig. 7B). As shown in Fig. 7A the percentage of hypodiploid

cells induced by TNFR1 increased in a dose-dependentmanner

with respect to the amount of TNFR2 that was cotransfected

with it. On the other hand, when themutant receptor R2-�343was cotransfected with TNFR1, no enhancement of TNFR1

cytotoxicity was observed.

DISCUSSION

It was initially described that TNFR2 initiates its signal trans-

duction through TRAF2 recruitment to the receptor cytoplas-

mic tail, leading to NF-�B (5, 14) and JNK activation (4). To

identify the binding site for TRAF2, sequential deletions of the

intracellular tail of TNFR2 lacking the 16 (TNFR2–16), 37

(TNFR2–37), and 59 (TNFR2–59) C-terminal amino acids

were used (14). It was shown that both full-length TNFR2 and

TNFR2–16-bound TRAF2, while TNFR2–37 and further dele-

tions did not associate with the adaptor protein. From these

experiments it was concluded that the 16 C-terminal amino

acids of TNFR2 were not relevant for TRAF2 binding, and con-

sequently, for NF-�B activation. This first approach has been

generally accepted, and no interest has been focused in this

region as a potential NF-�B activator module. In our study we

show that in addition to the well characterized TRAF2 binding

motif 402-SKEE-405, TNFR2 contains a second region impli-

FIGURE 7. TNFR2 enhances the ability of TNFR1 to induce cell death. A, quantification of the sub G0/G1 population induced by coexpression of TNFR1 andTNFR2.HEK 293 cells were transfected with 0.5 �g of pTNFR1 alone or together with increasing amounts of pTNFR2 as indicated, as well as with 0.2 �g ofpGEGF-F. Thirty-six hours later, cells were harvested, stained with propidium iodide, and analyzed by flow cytometry to quantify the sub Go/G1 population inthe transfected cells. B, schematic diagram of TNFR2 and its deletion R2-�343. The receptors are represented as in Fig. 5. C, quantification of the sub-G0/G1population induced by coexpression of TNFR1 and R2-�343. HEK 293 cells were transfected as in A and the percentage of hypodiploid cells in the transfectedcells was quantified by flow cytometry.

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Activation of NF-�B by TNFR2

22822 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 286 • NUMBER 26 • JULY 1, 2011

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cated in the activation of NF-�B. Our results show that this

novel TRAF2 binding site regulates NF-�B activation posi-

tively, as its deletion decreases the ability of the receptor to

activate NF-�B. This novel binding site, comprising amino

acids 425–439 partially overlaps with the one described by

Grech et al. (17) for the murine receptor for which a negative

regulatory role inNF-�B signalingwas suggested. In this regard,

it should be mentioned that the murine receptor has 13 extra

amino acids in its C-terminal region which could account for

this functional difference. Moreover, we show that NF-�B acti-

vation by both TRAF2 binding sites occurs via the classical and

the alternative pathways. From our experiments it is not possi-

ble to discern if TRAF2 association to this new binding site is

direct or indirect. The sequence of this region fits neither into

themajor TRAF2 bindingmotif nor into theminor one and, on

the other hand, this region was shown to directly associate with

other proteins such as the tyrosine kinase ETK (24). It is there-

fore likely an indirect association between this new binding site

and TRAF2. This novel NF-�B activator/TRAF2 association

site is highly conserved among different species.When the phe-

nomenon of TRAF2 degradation was described (11, 19, 22, 34)

TNFR2 signal transduction became more complex. The pres-

ent study brings TRAF2 degradation into consideration and

opens a new aspect of TNFR2 signal transduction.

In our study NF-�B is activated with different efficiency as

increasing amounts of TNFR2 are expressed. This correlates

with changes in TRAF2 protein level and agrees with the well

known implication of TRAF2 inNF-�B activation (5).We show

that a novel region of the receptor comprising amino acids 343–

349 is responsible for the induction of TRAF2 degradation, a

process that negatively regulates TNFR2-induced NF-�B acti-

vation. TRAF2 is the target of TNF-induced ubiquitination, a

modification that has been linked to a proteasome dependent

degradation (11, 19) through K48-linked polyubiquitin chains.

In addition, it has also been reported that TNF, through

TNFR1, can induce another TRAF2 ubiquitination pattern,

implicating K63-linked polyubiquitin chains, a modification

not related to degradation but to JNK activation (35). In this

regard it is interesting the identification of TRAF2 interaction

with ubiquitin proteases such as USP31, which shows specific-

ity for K63-linked polyubiquitin chains (36) or CYLD (37). It is

therefore conceivable that TRAF2 can be initially modified

through K63-linked polyubiquitin chains, converted into an

active signal transducer and then, through K48-linked

polyubiquitin chains, tagged for the proteasomal machinery,

bringing to an end TRAF2-dependent signaling process. It is

well known that TRAF2 interacts with cIAP1 and cIAP2 and

that these interactions cause TRAF2 degradation by the protea-

some (19). In this context, several authors have identified dif-

ferent intermediates thatmight be implicated in the interaction

TRAF2-cIAPs, such as AIMP2 (38) or sphingosine 1-phosphate

(13), which has been described as a cofactor for E3 ubiquitin

ligase activity of TRAF2 (39). On the other hand, it has been

recently described the role of A20 on TRAF2 lysosomal degra-

dation in conditions in which TNF triggers cell death. So, in

these conditions TRAF2 should be degraded both by the pro-

teasome and the lysosome (40).

The connection between region 343–349 and TRAF2 ubiq-

uitination is probably mediated through a phosphorylation

event. Such post-translational modification has been classically

related as the initiator step in the ubiquitination process. In this

regard it is interesting that the conserved module III, in which

amino acids 343–349 are included, partially overlaps with the

TNFR2 p80TRAK (p80 TNF Receptor Associated Kinase)

binding motif, which is located between amino acids 338 and

379 (23). Thus, it is possible that region 343–378, through its

association with p80TRAK or another kinase as yet unidenti-

fied, mediates TRAF2 phosphorylation and subsequent ubiq-

uitination, a process necessary both for NF-�B activation and

TRAF2 degradation. In summary, region 338–379 could act as

an “on-off” switch in TNFR2-induced NF-�B activation. In this

regard, it is particularly interesting that while the “on” signal

requiresTRAF2 binding to the receptor, the “off” signal appears

to be independent of TRAF2 recruitment since R2-�379, areceptor lacking both TRAF2 binding sites, is able to induce

TRAF2 degradation. TNFR2 does not have a death domain in

its intracellular region, so it is unable to induce cell death by

itself. However, we found that it is able to increase the cytotoxic

effect mediated by TNFR1. This crosstalk between the two

receptors seems to relay on the ability of TNFR2 to induce

TRAF2 degradation. In this context, TRAF2 could be consid-

ered as a central player in the cytotoxic effect mediated by

TNFR1, since TRAF2 interaction with TNFR1 and the anti-

apoptotic proteins cIAP1 and cIAP2 reduced the ability of this

receptor to induce cell death (33). On the other hand, when

TNFR2 and TNFR1 are coactivated the degradation of TRAF2

induced by TNFR2 abrogates the interaction between TNFR1

and the anti-apoptotic proteins, thus enhancing the cell death

induced by TNFR1. This observation could be envisaged as a

particular situation of the classical phenomenom in which the

balance between the apoptotic and antiapoptotic signals trig-

gered byTNFdetermineswhether the final outputwill be either

cell death or cell survival.

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Activation of NF-�B by TNFR2

22824 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 286 • NUMBER 26 • JULY 1, 2011

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