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Revista Facultadde Farmacia Universidad

Central de VenezuelaVol. 66 - Nº 2 - 2003 - ISSN: 0041-8307

Depósito legal: 195902 DF 224Caracas/Venezuela

LILACS

Universidad Central de VenezuelaRector

Dr. Giuseppe GiannettoVicerrector Académico

Dr. Ernesto GonzálezVicerrector Administrativo

Dr. Manuel MariñaSecretaria

Dra. Elizabeth Marval

Facultad de FarmaciaDecano

Dr. Orlando Vizcarrondo M.Director

Dr. Antonio Roye D.Coordinadora Académica

Dra. Norma Morante de RekowskiDirectora del Instituto de Investigaciones

Dra. Alba M. VargasDirector de Postgrado

Dr. Jaime CharrisCoordinadora de Extensión

Dra. Erika Holzhauser

Revista Facultad de FarmaciaDirectora

Dra. Alba M. Vargas

Editora:Dra. Fanny Carrillo de Padilla

Comité EditorialDra. Yarisma Rodríguez de BarbellaDra. Ana Stern de IsraelDra. Pilar Hernández S.Dra. Beatriz Gentille de IlleanoDr. Andrés ScarioniDra. Mary I. Cordero de TroconisDra. Aracelis OrtegaDr. Héctor ScannoneDr. Rafael MucciDr. Eduardo MartínDr. Solón N. SuárezDra. María C. Condado

Diagramación, composición, montaje e impresión

Miguel Ángel García e Hijo, S.R.L.Sur 15, Nº 107 - El Conde - Telf. 576.13.62

Caracas-Venezuela

Tiraje: 1.000 ejemplares - Diciembre 2004

DirecciónFacultad de Farmacia UCV - Apartado 40.109

Caracas 1040-A - Venezuela

Contenido

Esta revista se publica bajo los auspiciosdel Consejo de Desarrollo Científico

y Humanístico de la UCV

Efecto del Antídoto sobre la toxicidad 55en ratas del diclorvos

Effect of antidote on dichlorvos toxicity in rats

MAHIRA PARVEEN Y SANTOSH KUMAR

Estudio Toxicológico de Cnidoscolus 58chayamansa McVaugh

(Toxicological studies of Cnidoscoluschayamansa)

TORRICO, F. M.; GABAY, J.; SUÁREZ, A. I.Y COMPAGNONE, R.S.

Derivados N-metil, 67N-alquil-2-aminoindano,

diseño, síntesis, citotoxicidady efecto preliminar antiproliferativo

sobre epimastigotes de T. cruzi in vitro

N-methyl, N-alkyl-2-aminoindane derivatives,design, synthesis, cytotoxicity

and preliminar inhibitory growth activity onepimastigote form of T. cruzi in vitro.

DUERTO DE PÉREZ, Z.; PÉREZ, J.;GÓMEZ, L.; VIVAS, J.; ORFILA, L.

Evaluación de fitoquímicos en el exocarpio 73(cáscara) de algunas frutas cultivadas

en Venezuela

Evaluation of phytochemicals in the peelof some Venezuelan fruits

RINCÓN, ALICIA MARIELA; TAPIA, MARÍA SOLEDAD;PADILLA, FANNY C.

Índice de Autores 79Vol. 66 - 2003

Índice de Descriptores 80Vol. 66 - 2003

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Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003MAHIRA PARVEEN Y SANTOSH KUMAR

55Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 2 • 2003

Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003Efecto del Antídoto sobre la toxicidad en ratas del diclorvos

* Department of Biosciences. Barkatullah University, Bhopal. 462026 (M.P) India. Email: [email protected]

Efecto del Antídoto sobre la toxicidaden ratas del diclorvos

Effect of antidote on dichlorvos toxicity in rats

MAHIRA PARVEEN Y SANTOSH KUMAR

Resumen:

Los pesticidas organofosforados inhiben la actividad de la acetilcolinesterasa en mamíferos aún bajo exposiciónpor corto tiempo. Las ratas fueron tratadas intraperitonealmente con diclorvos por 24 y 48 horas, mostrando un62,2% de inhibición de la actividad de la acetilcolinesterasa a las 24 h del tratamiento con diclorvos. La inhibiciónde la enzima aumentó a 69,7% a las 48 h de la intoxicación con diclorvos. A otro grupo de ratas se le administrófisostigmina y diclorvos combinados por 24 y 48 h, respectivamente. La actividad de la acetilcolinesterasaaumentó significativamente en ambos grupos. El efecto protector de la fisostigmina contra la toxicidad deldiclorvos fue de 1,6 veces después de 24 h y de 1,4 veces a las 48 h. Las ratas tratadas con fisostigmina antesde la administración de diclorvos mostraron un aumento de la actividad de la acetilcolinesterasa de 21,55% yde 13,75 a las 24 h y 48 h, respectivamente. La actividad de la acetilcolinesterasa a las 24 h del tratamientocombinado con diclorvos y fisostigmina parecer ser mayor que a las 48 h.

Palabras claves: diclorvos, antídoto, acetilcolinesterasa

Summary :

Organophosphate pesticides inhibit acetylcholinesterase activity in mammals even in short term exposure. Ratswere injected with dichlorvos intraperitoneally for 24 and 48 hours. They showed 65,2% inhibition ofacetylcholinesterase activity after 24 hours dichlorvos treatment. Inhibition of enzyme was raised to 69,7%, after48 hours dichlorvos intoxication. In other two groups of rats physostigmine and dichlorvos were administered incombination for 24 and 48 hours respectively. Acetylcholinesterase activity was increased significantly in bothgroups. Protective effect of physostigmine from dichlorvos toxicity was 1.6 fold after 24 hours and 1.4 fold after48 hours. Rats treated with physostigmine prior to dichlorvos administration showed increase of 21,55% inacetylcholinesterase activity after 24 hours and increase of 13,75 % after 48 hours. Remarkably, AChE activityafter 24 hours treatment of dichlorvos and physostigmine in combination appeared to be greater than 48 hoursafter treatment of dichlorvos and physostigmine.

Keywords: dichlorvos, antidote, AChE.

Introduction

Organophosphate (OP) insecticides have the potentialto cause behavioral changes and intensive externalsymptoms of intoxication. These symptoms include nervousparalysis, convulsions, dyspnoea and death. It is nowunanimously accepted that, acute neurotoxicity occur dueto inhibition of enzyme acetylcholinesterase (AChE) followedby the accumulation of neurotransmitter acetylcholine innerve terminals. There are several antidotes for cholines-terase inhibitors. Some of the antidote compounds protectin vivo and in vitro disfunctioning of neuromuscularsystem remarkably.

Imidazole-pyridinium mono oximes, long chain pyridi-nium mono oximes, pyridostigmine and phosphorotries-terase are known antidotes against the anticholinesteraseaction of some known inhibitors. Physostigmine has alsobeen reported to be a protectant for sarin-induced ace-tylcholinesterase inhibition (Tuovinen et al 1999). The-refore, in the present study, an attempt has been made toevaluate the protective effect of physostigmine againstthe inhibitory action of another OP pesticide dichlorvoson AChE in brain of rat.

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Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003MAHIRA PARVEEN Y SANTOSH KUMAR

Material and methods

Male albino rats, Rattus norvegicus weighing 90-100g procured from Lupin Laboratory, Bhopal were usedas experimental animals and kept in plastic cages(12”x9”x9”). Animals were acclimatized to laboratoryconditions for about 10 days. Rats were fed with normalpellet diet and supplementary food mixture of rice branand water ad libitum.

OP pesticide (dichlorvos 0,0 dimethyl 0-2,2- dichlo-rovinyl phosphate, DDVP manufactured by HindustanCiba Giegy limited) and physostigmine (Himedia labora-tories) were purchased. Rats were divided into five groupsof five animals in each. Each dose was injected intrape-ritoneally with the help of a hypodermic syringe. Firstgroup received 7.0 mg/kg b.w. of dichlorvos for 24 hours.Second group received 7.0 mg/kg. b.w. dichlorvos for twosuccessive days and rats were sacrificed after 48 hours.Third group was treated with 0.10 mg/kg physostigmine30 minutes prior to dichlorvos administration (7.0 mg/kgb.w.) and animals were sacrificed after 24 hours. Fourthgroup received physostigmine (0.10 mg/kg.b.w.) 30 mi-nutes prior to first dose of dichlorvos and a second dosewas given after 24 hours from the first dose. Rats weresacrificed after 48 hours of first dose by cervical dislocation.Fifth group received normal saline solution intraperitoneally(control). None of the animals died during exposure.

Brain tissues were removed and placed in prechilled0.24M sucrose solution. Each tissue was weighed and a5% homogenate was prepared. AChE specific activity inbrain was assayed according to the technique of Metcalf(1951) using acetylcholine iodide as substrate. Experi-ments for assaying enzyme activity were conducted at37ºC and increase in absorbance was recorded at 540nm. Protein contents were estimated by adopting themethod of Lowry et al (1951). All values are shown asmean ± standard error (N=5). The level of significance wascalculated by using students ‘t’ test at P<0.01 and P<0.001.

Results

Dichlorvos intoxicated rats showed acute toxicitysymptoms after 24 and 48 hours treatment. Behavioralchanges observed due to dichlorvos treatment weresalivation, tremors, convulsions and weakness of legmuscles. This condition prevailed till the 48 hours of doseadministration. A decrease in intensity of toxicity symptomswas noticed in physostigmine pretreated animals.

AChE specific activity was observed to be 6.96 ±0.558 µm substrate hydrolyzed/mg protein/hour in controlrat brain. It became 2.42 ± 0.143 µm and 2.18 ± 0.173 µmdue to 24 and 48 hours toxicity of dichlorvos, respectively(Figure-1). After 24 hours of acute dichlorvos treatment asignificant inhibition (65.2%) of AChE specific activity

was observed (Figure-2). Forty eight hours exposure ofdichlorvos caused an inhibition of 69.7% in AChE activity.Results showed that AChE enzyme inhibition in bothgroups was significant (P<0.001). Furthermore, after 24hours dichlorvos treatment in physostigimine pretreatedanimals showed AChE activity as 3.92 ± 0.432 µm (P<0.01).After 48 hours dichlorvos and physostigimine, AchE activitybecame 3.10 ± 0.376 µm(P<0.01).

Figure 1

Comparative AChE specific activity in brain of Rattusnorvegicus subjected to dichlorvos toxicity, dichlorvos

and physostigmine treatment for 24 and 48 hours.Specific activity is expressed as µm substrate

hydrolyzed/mg protein/hour. All values were indicatedas mean ± standard error (N=5).

Figure 2

Comparative percent inhibition of AChE specific activityin brain of Rattus norvegicus subjected to dichlorvostoxicity, with and without physostigmine treatment

for 24 and 48 hours.

Discussion

AChE specific activity is significantly inhibited in ratsafter the dichlorvos intoxication. Concomitantly, behavioralchanges are indicated as a result of the disturbance ofcholinergic system (Parveen & Kumar 2001). It is now wellestablished that AChE is inhibited in rat’s brain to theexposure to numerous organophosphates (Broberger etal 2000; Carr et al 2001). In the present studydichlorvosinhibited AChE specific activity in a treatment durationdependent manner. Repeated dosing of dichlorvos causedmore inhibition as compared to that of single dose.

In rats treated with physostigmine before dichlorvosadministration, AChE inhibition was decreased, showing


Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003Efecto del Antídoto sobre la toxicidad en ratas del diclorvos

1.6 and 1.4 fold protective effect of physostigmine,similar to results of Tuovinen et al (1999).

This compound is useful in protective therapy ofcholinergic dysfunction as it’s affinity is associated withAChE esteric site. Physostigmine and pyridostigmine havebeen previously reported to be capable of increasingtolerance level in OP intoxicated mammals. (Tuovinen etal 1999 and Dube et al 2000). These results did notinclude a chronic follow-up, but this outcome does notexclude the enzyme effects from longer exposures. Inhi-bitory results of the dichlorvos and protective results ofphysostigmine in the present study reflect early responseof the brain to these compounds. Inhibition observed inthe in vivo exposures varied from approximately 40-70%inhibition of acetylcholinesterase specific activity.

This inhibition of AChE was observed at both expo-sures, and did exhibit a strong exposure-response rela-tionship. Kinetics evaluations of AChE inhibition in ratbrain induced by OP showed temperature dependence.(Dave et al 2000). AChE enzyme shows a combinedmolecular dynamics and its diffusion occurs through neu-romuscular junctions making it widely distributed andcirculated enzyme in the body (Kua et al 2002, Tai et al2003). AChE specific activities were examined in this studyas a possible mechanistic rationale for reduced AChE–dichlorvos interaction in presence of physostigmine. Addi-tional isoforms of AChE may exist, but they may also besensitive to inhibition by dichlorvos. This possibility couldbe further explored by the use of other esterase inhibitorsto examine the inhibition of the remaining activity.

Results suggests the importance of studying the diver-sity of isoenzyme abundance and physical characteristicsof rat AChE. Antidotes of AChE inhibitors have medicalapplication in the treatment of disorders such as organo-phosphate induced toxicity. Physostigmine seems to be aptotective agent against Ops intoxication and suggestedto be a beneficial antidote against dichlorvos intoxication.Utility of understanding the biochemical mode of actionfor OPs in presence of physostigmine is that it may lead tothe development of a new tool to account for the presence

of OP induced toxicity, thereby allowing for the elucidationof toxicity caused by these pesticides. We may have aclear explanation to these findings in further studies byunderstanding the kinetic mechanisms after evaluation ofAChE kinetics.

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Recibido: noviembre 2003Aceptado: junio 2004

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Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003TORRICO, F. M., GABAY, J., SUÁREZ, A. I. Y R.S. COMPAGNONE

1 Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela2 Facultad de Ciencias, Escuela de Química, Universidad Central de Venezuela

Estudio Toxicológico de Cnidoscoluschayamansa McVaugh

(Toxicological studies of Cnidoscolus chayamansa)

TORRICO, F. M1.; GABAY, J1.; SUÁREZ, A. I.1 Y COMPAGNONE, R.S.2

Resumen

Cnidoscolus chayamansa (Euforbiaceae) es una planta cuyas hojas han sido empleadas como alimento enMéxico y América Central, y utilizada con diferentes propósitos medicinales entre ellos: mejorar la memoria y lafunción cerebral, combatir la artritis, la diabetes y la obesidad, disminuir el colesterol e incrementar las plaquetasen pacientes que reciben quimioterapia. Aún cuando se han realizado estudios a nivel nutricional, no existeninvestigaciones que avalen su utilidad en el campo medicinal. El objetivo de este trabajo fue realizar un estudiotoxicológico de esta planta y para ello utilizamos tres formas diferentes de preparación, utilizadas por lapoblación. Se determinó la toxicidad aguda, la dosis tóxica 50 (DT50) y la dosis letal 50 (DL50). Estos ensayosrevelaron como efectos predominantes: contorsión, letargia y piloerección, siendo el primero el efecto tóxico másrelevante. Se evaluó la citotoxicidad in vitro, de los diferentes tipos de liofilizados, y se obtuvo que el porcentajede citotoxicidad fue bajo. Estos estudios permiten apoyar el uso de la chaya con los propósitos terapéuticosutilizados por la población debido a que la DT50 es cincuenta veces menor que la DL50 y además, los efectos tóxicospresentados son leves y reversibles.

Palabras claves: Cnidoscolus chayamansa, toxicidad aguda, citotoxicidad

Abstract

Cnidoscolus chayamansa (Euforbiaceae) is a food plant from Mexico and Central America. Its leafs has been usedfor medicinal purposes such as: improve memory, arthritis, obesity, to lower high cholesterol, and to increase thelevels of platelets in patients receiving chemotherapy. The literature about Cnidoscolus chayamansa shows onlynutritional reports but there are not reports of medical research. The purpose of this investigation was to performtoxicological studies of the plant, using three different modes of preparation of the extract used in folk medicine.

The LD50 and DT50 were determined. The assays showed that predominant effects were: lethargy, contortion andpiloerection. The citotoxicity in vitro was evaluated. The results indicated that Cnidoscolus chayamansa can beused for therapeutic purposes due the low value of DT50 and because the toxics effects are lights and reversible.

Keywords: Cnidoscolus chayamansa, acute toxicity, citotoxicity

Introducción:

En los últimos años se han revalorizado los productosnaturales como sustancias de interés médico, veterinario,cosmético y agroquímico y en la actualidad el 25% de lasdrogas que se comercializan en el mercado, provienen deuna fuente vegetal (Primo y col., 2001). Sin embargo, secalcula que en todo el mundo, la validación química,farmacológica y biomédica solo se ha llevado a cabo en5% de estas especies (Huerta, 1997).

Los principales usos que se reportan de la plantaCnidoscolus chayamansa son: el consumo humano de

hojas y cogollos cocinados y también se usa en alimenta-ción de animales como cabras y cerdos. Las hojas de estaplanta han sido utilizadas con fines medicinales entreellos: mejorar la memoria y la función cerebral, combatirla artritis, la diabetes y la obesidad, disminuir el colesterole incrementar las plaquetas en pacientes que recibenquimioterapia (Molina y col., 1997, Annan, 1997).

El estudio científico de las plantas medicinales pre-tende reducir los riesgos de su utilización incontrolada,además de comprobar su actividad farmacológica y


Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003Estudio Toxicológico de Cnidoscolus chayamansa McVaugh

ampliar su espectro, así como también estandarizarsu dosis.

Los estudios científicos son los que han de marcar lapauta en el desarrollo de la fitoterapia, ya que la investi-gación clínica, farmacológica, química y botánica de lasplantas es la que sin duda nos han de dar las claves de lautilización segura de las plantas medicinales. Con el objetode evaluar los posibles efectos tóxicos de la Cnidoscoluschayamansa nos propusimos determinar las propiedadestoxicológicas in vivo e in vitro de los liofilizados deCnidoscolus chayamansa preparados en tres diferentesformas: decocción, infusión y maceración. Este últimoobjetivo es para obtener datos que se relacionen con laforma de preparación y garantizar cual es la mejor de ellasque disminuya los efectos tóxicos en los consumidores.

Materiales y métodos:

EXTRACTOS DE LA PLANTA A INVESTIGAR:

Se utilizó la hoja de la planta Cnidoscolus chayamansaque fue recolectada en el Jardín Medicinal de la Facultadde Farmacia de la U.C.V., e identificada por el botánicoStephen Tillet. Una muestra representativa de la planta seencuentra en el Herbario «Victor Ovalles» identificadacomo MYF-19622. Las hojas de la planta (50 gramos)fueron preparadas en tres diferentes formas: infusión,decocción y maceración. En la Infusión se calentó aguahasta temperatura de ebullición (100 ºC) y luego se agre-garon las hojas de la planta. En la decocción se hirvieron lashojas de la planta en agua por un período de 10 a 15minutos. Para obtener el extracto de las hojas por ma-ceración se dejaron reposar en agua fría durante 48horas. Las diferentes preparaciones fueron sometidas alproceso de liofilización, proceso que se realizó en ellaboratorio de Productos Naturales de la Facultad deFarmacia de la UCV.

Determinación de la toxicidad aguda de losdiferentes liofilizados de Cnidoscoluschayamansa

Se determinó la dosis tóxica media (DT50) y la dosisletal media (DL50) de los diferentes liofilizados de Cnidos-colus chayamansa en animales experimentales. Comoanimales de experimentación se utilizaron ratones machosde la cepa Balb-c con un peso promedio de 20 g.,provenientes del Bioterio del Instituto Venezolano deInvestigaciones Científicas (I.V.I.C.). Todos los animalesfueron alimentados con dieta comercial (Ratarina) ytuvieron acceso libre a comida y agua. La determinaciónde la DT50 y la DL50 se realizó por el método descrito porLitchfield y Wilcoxon (1949) y en el cual los animalesfueron pesados y distribuidos de manera aleatoria engrupos de 6 y cada grupo fue tratado con una dosisde Cnidoscolus chayamansa en sus diferentes tipos de

preparaciones administrándolas por vía intraperitoneal(i.p.) y usando como volumen requisito 0.1ml por cada 10g de peso corporal. Estas dosis se implementaron enorden creciente desde 25 mg/kg hasta 8000 mg/kg,procediéndose al registro de los efectos observadosdurante 90 minutos (Irwin, 1964).

Para la determinación de la DT50 se escogió comoefecto tóxico el más frecuente el cual fue «contorsiónintestinal» y se seleccionó el período de tiempo en que seobservó el máximo efecto. Para la determinación de la DL50

se registró el número de ratones muertos por cada dosis.

Estudios in vitro

Se determinó la toxicidad in vitro de los diferentesliofilizado de Cnidoscolus chayamansa mediante la eva-luación de la citotoxicidad en células BHK21 por el métododel Azul de Tetrazolio (MTT) siguiendo el método descritopor Denizot y col. (1986). Las células BHK21 fueroncultivadas en frascos de 25 cm2 (NUNCLON) en un mediode Eagle Dubecco modificado (DMEM, GIBCO) suple-mentado con 10% de suero fetal de ternera (GIBCO), 100U/mL de penicilina y 2 µg/mL de anfotericina B (GIBCO), a37ºC en una atmósfera de 5% de CO2.. Estas células fueronsometidas a tripsinización y fueron sembradas en placasde 96 pozos e incubadas hasta obtener un cultivo con-fluente. Una vez obtenido se removió el medio y seprocedió a agregar medio fresco conteniendo el extractode la planta a ser evaluada en concentraciones de 10, 100y 1000 µg/mL) y las placas fueron incubadas por 24 horas.Luego del período de incubación se agregó 100 µL de MTTal 98% (SIGMA) a cada pozo y se incubaron las placas enlas condiciones descritas anteriormente por un período de3 horas. Pasado este tiempo se descartó el sobrenadantede los pozos por inversión de la placa y a cada uno de lospozos se le agregaron 100 µL de dimetilsulfoxido al 95%(ANALAR). Se procedió a la lectura de las densidadesópticas en un lector de ELISA a una longitud de onda de570 nm. Los resultados son expresados en el porcentajede citotoxicidad en función de la DO obtenida en lascélulas sin tratamiento.

Análisis Estadístico

Los resultados de citotoxicidad obtenidos se analizaronestadísticamente a través de la prueba de t de student(análisis de varianza de una vía), utilizando para ello elprograma de computación Statistix.

Resultados

DETERMINACIÓN DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DE LOS

DIFERENTES LIOFILIZADOS DE CNIDOSCOLUS CHAYAMANSA

Los resultados obtenidos en la determinación de laDL50 se muestran en la Tabla I, en ellos se puede apreciar

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que la DL50 y sus límites de confianza al 95% sonsimilares (7100 mg/Kg) en los tres tipos de preparacionesde la planta.

DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE LOS DIFE-RENTES LIOFILIZADOS DE CNIDOSCOLUS CHAYAMANSA

Los efectos tóxicos observados en los animales deexperimentación tratados con las diferentes preparacionesde Cnidoscolus chayamansa se presentan en las TablasII a, b y c. Como puede observarse con todos los tipos depreparaciones la contorsión intestinal, la letargia y lapiloerección fueron los principales efectos tóxicos encon-trados, siendo la contorsión el efecto tóxico más importan-te. Para las preparaciones de Cnidoscolus chayamansa:decocción (Tabla IIa), maceración (Tabla IIb) e infusión(Tabla IIc) a las dosis más elevadas, se observaron lossiguientes efectos tóxicos: ataxia, ptosis palpebral, diuresis,apnea, hiperventilación, hiperactividad e hipersensibilidad.

En vista de que el efecto tóxico más resaltante fue«contorsión», procedimos a obtener el tiempo de efectopico del mismo en todos los tipos de preparaciones deplantas evaluadas, en función de las dosis (Fig. 1). Seobservó en el caso de los liofilizados de Cnidoscoluschayamansa cuya forma de preparación fue la de infusión(Fig. 1a) que el efecto tóxico de contorsión se comenzó aobservar a la dosis de 50 mg/Kg mientras que las pre-paraciones de maceración (Fig. 1b) y decocción (Fig. 1c)se observó a la dosis de 100 mg/Kg, siendo el efecto picoa los 30 minutos de observación, en todas las preparacio-nes. En el caso del liofilizado de Cnidoscolus chayamansapreparado por maceración, a todas las dosis evaluadas seobservó que el efecto pico fue a los 30 minutos (Fig. 1b)a excepción de la dosis de 4000 mg/kg, en donde elefecto de contorsión se mantuvo durante todo el períodode observación. En los tres tipos de preparaciones seobservó que el efecto tóxico «contorsión» es proporcionala la dosis administrada debido que cuanto más alta es ladosis más temprano se observa el efecto tóxico y semantiene por más tiempo.

DETERMINACIÓN DE LA DOSIS TÓXICA MEDIA (DT50) DE LOS

DIFERENTES LIOFILIZADOS DE CNIDOSCOLUS CHAYAMANSA

El efecto tóxico escogido para realizar la determinaciónde la DT50 fue: contorsión, por ser el más sobresaliente enel estudio de toxicidad aguda, mientras que el período deobservación seleccionado fue de 30 minutos por ser elperíodo donde se observó el máximo efecto tóxico selec-cionado. Los resultados de la DT50 junto con los límites deconfianza, obtenidos con cada una de las preparaciones deCnidoscolus chayamansa ensayadas, se muestran en laTabla III. Se puede observar que las DT50 es de 140 mg/kgpara las tres preparaciones herbales y los límites deconfianza son similares en las preparaciones realizadas

con maceración y con decocción, mientras que en lapreparación: infusión el límite de confianza inferior co-rresponde a una dosis más baja en comparación con lasotras dos preparaciones.

DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD IN VITRO DE LOS DIFE-RENTES LIOFILIZADOS DE CNIDOSCOLUS CHAYAMANSA ME-DIANTE LA EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD EN CÉLULAS

BHK21POR EL MÉTODO DEL AZUL DE TETRAZOLIO (MTT)

Los resultados obtenidos en el estudio de citotoxicidadrealizado en células BHK21 se muestran en la Figura 2. Seobserva que en todos los tipos de liofilizados a medidaque se incrementa la dosis, el porcentaje de citotoxicidades mayor. El mayor porcentaje de citotoxicidad se obtuvocon la preparación decocción a la dosis de 1000 µg/mL,sin embargo con ninguna de las dosis ensayadas en losdiferentes liofilizados estudiados no se alcanza el 50% decitotoxicidad.

Los liofilizados: infusión y decocción (Figura 2) tuvieronun comportamiento similar a la dosis de 1000 µg/mL,siendo esta significativamente diferente de las otras dosisempleadas (p<0.05). En base a estos resultados podemosconsiderar que los efectos citotóxicos de los diferentestipos de liofilizado de Cnidoscolus chayamansa sondependientes de la dosis.

Discusión

En la población es muy común el uso de plantas confines curativos, sus beneficios se han pasado de generaciónen generación, de modo que se tiene cierta confianza alutilizarlas, además de que el alto costo de las medicinasde origen sintético, hacen que el uso de las plantasmedicinales sea más atractivo.

Es imperativo que el uso de plantas medicinales estésustentado por estudios científicos en donde se evalúe suseguridad y eficacia. Avalar los beneficios terapéuticos delas plantas, ya tradicionalmente empleadas por la pobla-ción con fines curativos, constituye todo un proceso endonde se le da gran importancia a los estudios detoxicidad (Irwin, 1964, Fugh-Berman, 2000). Con losresultados obtenidos en dichos estudios, se puede estimar,no solo el riesgo potencial de los efectos adversos quepuedan presentarse en el hombre al consumir preparadosa base de plantas, sino también, se puede establecer ladosis a la cual se evaluaran las posibles actividadesfarmacológicas de la planta y/o sus principios activos. Demanera, que al investigar una planta potencialmenteterapéutica, los primeros estudios que se realizan son losde toxicidad (Malone, 1983).

Los resultados que se obtuvieron al evaluar la toxi-cidad aguda en ratones Balb-c tratados con las diferentespreparaciones de Cnidoscolus chayamansa, revelan



Tabla I

Resultados de la evaluación de la DL50 para los diferentes tipos de preparacionesde Cnidoscolus chayamansa

Preparación Dosis Chi2 del Grados Chi2 de DL50 Límitesde la planta ensayadas estudio de libertad la tabla (g/kg) de confianza

(g/kg) (g/kg)

Maceración 4, 6, 7 y 8 2,724 2 5,991 7,10 5,22 – 9,65

Infusión 2, 5 y 8 2,028 1 3,841 7,20 5,18 – 9,99

Decocción 5, 7 y 8 1,95 1 3,841 7,20 5,03 – 10,29

Tabla IIa

Porcentaje de animales experimentales que presentaron los efectos tóxicosobservados (10-90 minutos), a las diferentes dosis de Cnidoscolus chayamansa

obtenida por decocción

EFECTOS TÓXICOS OBSERVADOS (%)

Dosis (mg/Kg) contorsión Piloerección apnea estereotipia hiperventilación Ptosis palpebral

10 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 0 0 0 0 0

125 0 0 0 0 0 0 0

500 30 66.67 0 0 0 16.67 0

30 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0

100 16.67 0 16.67 0 0 0 0

125 50 66.67 33.33 0 0 0 0

500 66.67 83.33 16.67 0 0 50 16.67

60 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 16.67 0 0 0 0

125 0 50 50 0 0 0 0

500 33.33 66.67 0 0 16.67 33.33 16.67

90 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 0 0 0 0 0

125 0 0 0 0 0 0 0

500 0 66.67 0 16.67 0 16.67 0

62


como principales efectos tóxicos: contorsión y piloerec-ción. Estos efectos, junto con la diarrea (observada enmenor grado) pueden asociarse a trastornos gastrointes-tinales, siendo la piloerección y la diarrea, consecuenciade la contorsión intestinal. La letargia, la hiperventilacióny otros efectos como son: ataxia, ptosis palpebral,apnea, hiperactividad e hipersensibilidad observadoscon dosis elevadas de las diferentes preparacionesutilizadas, pueden asociarse con alteraciones del SistemaNervioso Central (Irwin, 1964).

Los efectos tóxicos observados, podrían atribuirse ala presencia del HCN en las tres preparaciones herbales.El HCN se forma a partir de los glicósidos cianogénicos,los cuales son parte de la composición de la planta

Cnidoscolus chayamansa (Cruz, 2001). Se ha descritoque los glicósidos cianogénicos son compuestos quesufren hidrólisis por acción de la Beta-glicosidasa dandoorigen al ácido cianhídrico (HCN). Este ácido se producecuando las hojas de la planta sufren algún daño capaz dedestruir las células vegetales, de esta manera, los glicósidoscianogénicos contenidos en vacuolas citoplasmáticas, seliberan y entran en contacto con las enzimas hidrolíticasque se encuentran en la pared celular (Rosso y Pagano,2000). Al respecto, Amelot (1999) asocia al HCN conprocesos de inflamación gastrointestinal con hemorragia.Mientras que otros investigadores (Consejo General deColegios Oficiales de Farmacéuticos de España, 2000),refieren que la combinación del cianuro procedente del

Tabla IIb

Porcentaje de animales experimentales que presentaron los efectos tóxicos observados(10-90 minutos), a las diferentes dosis de Cnidoscolus chayamansa: infusión


Dosis (mg/Kg) contorsión letargia Piloerección diarrea estereotipia hiperventilación Diuresis Ptosis palpebral hipersensibilidad

10 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0 0 0

100 16.67 0 0 0 0 0 0 0 0

125 33.33 0 0 0 0 0 0 0 0

250 30 0 0 0 0 0 0 0 0

2000 50 16.67 16.67 16.67 0 0 33.33 0 0

30 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50 16.67 0 16.67 0 0 0 0 0 0

100 33.33 16.67 0 16.67 0 0 0 0 0

125 66.67 16.67 66.67 0 0 0 0 0 0

250 83.33 33.33 33.33 0 0 0 0 0 0

2000 100 66.67 50 66.67 0 33.33 33.33 50 0

60 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50 16.67 0 0 0 0 0 0 0 0

100 16.67 0 0 0 0 0 0 0 0

125 50 16.67 66.67 0 0 0 0 0 0

250 50 16.67 50 0 0 0 0 0 0

2000 100 66.67 50 83.33 33.33 33.33 33.33 50 0

90 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 0 0 0 0 0 0 0

125 33.33 0 66.67 0 0 0 0 0 0

250 16.67 16.67 0 0 16.67 0 0 0 0

2000 50 33.33 0 0 16.67 33.33 0 33.33 33.33



Tabla II c.

Porcentaje de animales experimentales que presentaron los efectos tóxicos observados(10-90 minutos), a las diferentes dosis de Cnidoscolus chayamansa: Maceración


Dosis (mg/Kg) Contorsión Letargia Piloerección Diarrea Estereotipia Hiperventilación Diuresis Ataxia

10 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 0 0 0 0 0 0

125 33.33 16.67 0 0 0 0 0 0

500 33.33 16.67 0 0 0 0 0 0

4000 100 33.33 33.33 33.33 0 66.67 33.33 50

30 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0 0

100 16.67 33.33 0 0 0 0 0 0

125 50 50 16.67 0 0 0 0 0

500 66.67 33.33 16.67 16.67 33.33 0 0 0

4000 100 33.33 33.33 0 0 83.33 33.33 66.67

60 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0 0

100 16.67 16.67 0 16.67 0 0 0 0

125 33.33 33.33 16.67 0 33.33 0 0 0

500 50 50 16.67 16.67 16.67 0 0 0

4000 100 16.67 66.67 0 0 83.33 0 66.67

90 minutos

25 0 0 0 0 0 0 0 0

50 0 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 0 16.67 0 0 0 0

125 0 0 0 0 0 0 0 0

500 0 16.67 0 0 16.67 0 0 0

4000 100 16.67 66.67 0 0 83.33 0 66.67

Tabla III

Resultados de la evaluación de la DT50 para las diferentes preparaciones de Cnidoscolus chayamansa

Preparación Dosis Chi2 Grados Chi2 DT50 Límitesde la planta ensayadas del estudio de libertad de la tabla (mg/kg) de confianza

(mg/kg) (mg/kg)

Maceración 25, 50, 100, 125 0,972 2 5,991 140 101 - 195

Infusión 25, 50, 100, 125, 250 1,764 3 7,815 140 76 - 259

Decocción 25, 50, 100, 125 0,6996 2 5,991 140 102 - 193

64


Figura 1

Determinación del tiempo de efectopico «contorsion» para el liofilizado deCnidoscolus chayamansa preparada enla forma de (a0 infusión, (b) maceracióny (c) decocción.

Figura 2

Evaluación de cititoxicidadobtenida en células BHK21

expuestas a diferentesconcentraciones del

liofilizado de Cnidoscoluschayamansa preparada

en la forma de infusión (■),maceración (▲), y decocción

(●). (n=6, *p<0,05).



HCN, con la enzima citocromo oxidasa, produce altera-ciones de la cadena respiratoria, que se manifiesta conalteraciones del ritmo respiratorio, trastornos de la con-ciencia, entre otros. Solo a altas dosis de las diferentespreparaciones herbales, se observó la convulsión comoefecto tóxico, que en muchos casos precedió la muertedel animal. Esta observación, concuerda con lo reportadoen la literatura para la toxicidad del HCN, donde consideranque el envenenamiento a altas dosis del HCN, tiene comomanifestación principal convulsiones tónicas y clónicas(Routt y James, 1999). De todos los efectos tóxicospresentados, seleccionamos como más importante el decontorsión, y consideramos que se debe realizar unestudio en donde se investigue, el mecanismo involucradoen este efecto tóxico ya que podría estar mediado por laestimulación de receptores presentes en la musculaturalisa intestinal.

En los animales de experimentación utilizados, se daun proceso de desintoxicación bastante rápido debido aque con el uso de todas las preparaciones de Cnidoscoluschayamansa, el tiempo de efecto pico para contorsiónfue entre los 10 y 30 minutos en el rango de dosis entre50 y 2000 mg/mL, efecto que disminuyó gradualmente.Sin embargo, el efecto tóxico se mantuvo durante todo elperíodo de observación, al utilizarse dosis elevadas delos diferentes preparados de la planta. Estos resultadosconcuerdan con lo expuesto por otros investigadores(Consejo General de Colegios Oficiales de Farmacéuticosde España, 2000), donde se indica que las drogas quecontienen HCN no suponen riesgo severo para el que lasingiere, ya que es necesario la ingesta rápida y en grandescantidades del mismo para producir efectos tóxicos,debido a que el organismo es capaz de trasformar loscianuros ingeridos en tiocianatos, que luego son elimi-nados a través de la orina. De tal manera que, cuando ladosis de cianuro en el organismo, es superior a lacapacidad del mismo para trasformarla, se produce unaintoxicación severa. En nuestros estudios se obtuvieronefectos tóxicos con cada una de las preparaciones,siendo menor en el preparado decocción donde el efectoaparece tardíamente y desaparece más rápido y solo seobserva a los 60 minutos a dosis elevadas (500 mg/Kg) .Estos resultados coinciden con lo expresado por Annan(1997) y Molina (1999), quienes recomiendan la cocciónde la planta en agua hirviente por un período de 15 a 20minutos, para eliminar los glucósidos cianogénicos a loscuales se les atribuyen las propiedades tóxicas.

En nuestro estudio se observa que la DT50 para las trespreparaciones evaluadas fue de 140 mg/kg , y los límitesinferiores de los intervalos de confianza fueron: 101, 76 y102 mg/kg para los liofilizados: maceración, infusión ydecocción respectivamente. Esto significa que para lapreparación: infusión, la toxicidad se presenta a dosis más

bajas. El objetivo de determinar los límites de confianzapara la DT50 es el de obtener la actividad terapéutica deestos extractos con dosis por debajo de estos valores, paraasí poder garantizar que la eficacia y la potencia de laactividad terapéutica estén alejadas del riesgo tóxico.

La DL50 y los límites de confianza para este parámetrofueron similares en las tres preparaciones evaluadas deCnidoscolus chayamansa. En base a los resultadosobtenidos, podemos afirmar que la toxicidad aguda deCnidoscolus chayamansa en ratones Balb-c es baja.Además, la DT50 se aleja considerablemente de la DL50 (50veces mayor). Estos resultados son muy importante parafuturas investigaciones farmacológicas de la planta, porqueclasifican a los liofilizados de Cnidoscolus chayamansa(bajo las formas de preparación: maceración, infusión ydecocción) como seguros para ser utilizadas como agentesterapéuticos.

No podemos descartar que los pocos efectos tóxicosobservados en las diferentes preparaciones, se deben ala existencia de otros compuestos tóxicos además delHCN, presentes en las preparaciones evaluadas, que nose ven afectados por los procesos a los cuales fueronsometidos las diferentes preparaciones de Cnidoscoluschayamansa. Esto nos conduce a considerar necesaria larealización de análisis químicos de las diferentes prepa-raciones, para establecer a cuál o cuáles compuestosquímicos presentes se le atribuye la toxicidad.

Los resultados obtenidos en los estudios de citotoxi-cidad nos corroboran lo obtenido en animales experi-mentales, ya que los diferentes tipos de preparacionesproducen porcentajes bajos de citotoxicidad en la líneacelular BHK21. En general, con todas las preparaciones seobservó que dicho efecto era dependiente de la dosis.

Nuestros resultados indican que la hoja de la plantaCnidoscolus chayamansa puede ser utilizada con losfines terapéuticos señalados en la bibliografía popular ycientífica (Molina y col., 1997; Annan, 1997) ya que losefectos tóxicos que se observan son leves y reversibles enel tiempo. Es recomendable establecer la forma correctade preparación así como la dosis a ingerir de dicha plantapara establecer una máxima seguridad y consideramosque esta planta cumple con los requisitos fundamentalespara pasar a estudios posteriores donde se aíslen losprincipios activos a los cuales se deben sus múltiplesacciones terapéuticas y analizar a través de qué mecanis-mos tienen su actividad farmacológica.

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Recibido: enero 2004Aceptado: septiembre 2004


Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003Derivados N-metil, N-alquil-2-aminoindano, diseño, síntesis, citotoxicidad y efecto preliminar antiproliferativo sobre epimastigotes de T. cruzi in vitro

1 Laboratorio de Química Medicinal, Facultad de Farmacia, UCV.2 Laboratorio de Fisicoquímica de Parásitos, IBE, UCV.3 Laboratorio de Cultivo Celular, Facultad de Farmacia, UCV.

Derivados N-metil, N-alquil-2-aminoindano,diseño, síntesis, citotoxicidad y efecto

preliminar antiproliferativo sobreepimastigotes de T. cruzi in vitro

N-methyl, N-alkyl-2-aminoindane derivatives, design, synthesis,cytotoxicity and preliminar inhibitory growth activity

on epimastigote form of T. cruzi in vitro.

DUERTO DE PÉREZ, Z.*1; PÉREZ, J.1; GÓMEZ, L.1; VIVAS, J.2; ORFILA, L.3

Resumen

La quimioterapia del mal de Chagas requiere del diseño y desarrollo de nuevos compuestos específicos y notóxicos. Los derivados con potencialidad tripanocida N-metil, N-alquil-2-aminoindano 4, 5, 7 y 8 se diseñaron através de la modificación molecular de la terbinafina 2, con el propósito de valorar tanto su citotoxicidad en líneascelulares BHK21 (riñón humano) y vero (riñón de mono) como su capacidad de inhibir el crecimiento in vitro deepimastigotes de T. cruzi. Los compuestos se sintetizaron con buenos rendimientos y se caracterizaron utilizandoRMN1H, IR, p.f, análisis elemental y espectrometría de masas. La relativa baja citotoxicidad, en las líneas celularesnormales, mostrada por el derivado N-metil,N-bencil-2-aminoindano 5 y su actividad antiproliferativa, del ordende 37%, comparado con el control y el patrón de actividad terbinafina, nos anima a proseguir los ensayos yampliarlos a la forma amastigote, forma intracelular de T. cruzi.

Palabras clave: síntesis; N-metil, N-alquil-2-aminoindano; actividad antiproliferativa; epimastigotes; T. cruzi;citotoxicidad; MTT.

Abstract

Chemotherapy against Chagas’ disease requires design and development of specific and non toxic newcompounds. N-methyl, N-alkyl-2-aminoindane derivatives 4, 5, 7 y 8 as potential tripanocidal agents were designedby molecular modification of terbinafine 2, with the aim of assess their cytotoxicity in BHK21 (human kidney) andvero (monkey kidney) cell lines, as well as, their inhibitory growth activity on epimastigote form of T. cruzi in vitro.The compounds were synthesized with excelent yields and characterized by RMN1H, IR, mp, elemental analysesand MS. The relative low cytotoxicity showed in normal cell lines by the N-methyl, N-benzyl-2-aminoindanederivative 5 and its 37% inhibitory growth activity in comparison with the control and terbinafine activity,encourage us to continue with the assays and expand them to the amastigote form of T. cruzi.

Key words: Synthesis; N-methyl, N-alkyl-2-aminoindane; inhibitory growth activity; epimastigote; T. cruzi;cytotoxicity; MTT.

Introducción

La enfermedad de Chagas permanece presentecomo uno de los grandes problemas de salud en elcontinente americano (Docampo, 2001). A pesar delos avances en bioquímica y fisiología de T. cruzi

(Urbina, 2002), Cerecetto y col., (2002), es imperiosala búsqueda de nuevas, efectivas y selectivas drogascon disminuídos o carentes efectos tóxicos sobre elhospedador. En esta búsqueda, la sensibilidad delas formas extracelular e intracelular (epimastigotey amastigote) del parásito, es de especial interés.

Estudios llevados a cabo en nuestro laboratorioreportan al 2-aminoindano 1 como sistema estruc-tural capaz de atravesar barreras biológicas (Gómez,

68

Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003DUERTO DE PÉREZ, Z.; PÉREZ, J.; GÓMEZ, L.; VIVAS, J.; ORFILA, L.

1990) y presentar además acción tripanocida enexperimentos con T. evansi, in vivo y T. cruzi, invitro (Gómez y col., 1990). El T. cruzi es sensible alos inhibidores de la biosíntesis de esteroles, desa-rrollados como agentes quimioterapéuticos antimi-cóticos, cuyo modo de acción es el agotamiento deesteroles esenciales endógenos o acumulación deintermediarios tóxicos, o ambos (Abe y col., 1994).Entre estos inhibidores está la alilamina terbinafina2 (Lazardi y col., 1990), (Urbina y col., 1996).

Materiales y métodos

Químico

Los compuestos diseñados se sintetizaron me-diante procedimientos convencionales de síntesis(Esquema de Síntesis). El N-metil-2-aminoindano 3se obtuvo a través de la aminación reductiva de la2-indanona con borohidruro de sodio, (Cannon ycol., 1979). Esta amina fue N-alquilada, con diferen-tes grupos funcionales utilizando el método dePfeiffer y col. (1982), para generar los compuestosN-alquilados respectivos 4, 5 y 6. La síntesis delclorhidrato de N-metil, N-(2-cloroetil)-2-aminoindano7 se llevó a cabo haciendo reaccionar el clorhidratodel alcohol 6 disuelto en benceno seco, con clorurode tionilo (Hall y col., 1987). Finalmente, el com-puesto 8 se obtuvo utilizando KSCN en etanol al95% y reflujo a partir del derivado cloroetilado 7.

Los puntos de fusión fueron tomados en capilaresde vidrio, usando un aparato de punto de fusiónThomas–Hoover Uni-Melt y no están corregidos. Losespectros de resonancia magnética nuclear se to-maron en tubos de 5 mm de diámetro en unespectrómetro JEOL-Eclipse 270 MHz (UCV). Losdesplazamientos químicos se reportan en ppmusando como solvente DMSO-d6 y TMS como estándarinterno. La multiplicidad de las señales se indicacomo: (s) singlete, (m) multiplete y (sa) señal ancha.El benceno se secó con sodio y destiló en un rangode 2 °C. Cloruro de tionilo se destiló en un rango de1°C. Los espectros infrarrojos fueron tomados enKBr utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer1600 Series FTIR. Las absorciones más relevantesse reportan en centímetros recíprocos (cm-1). Lacalibración fue hecha con poliestireno 1601 cm-1. Elmicroanálisis elemental fue realizado por AtlanticMicrolab, Inc. Norcross, Georgia, USA. Los espectrosde masa fueron tomados en espectrómetro VARIAN3800 MS/GC (UCV). La cromatografía analítica decapa fina (TLC; Rf) se realizó sobre silica gel-60F254

y fue visualizada por UV.

Tomando en consideración lo expuesto, se aplicóel método de modificación estructural, sobre lamolécula biológicamente activa 2, para diseñar elsistema N-metil, N-alquil-2-aminoindano (Figura 1).La aplicación del método incluye:

– Eliminar, en la estructura 2, el anillo aromáticoB del fragmento naftaleno e introducir un átomo decarbono entre el anillo aromático A y el carbonobencílico, de tal manera de obtener el núcleo base 2-aminoindano capaz de atravesar barreras biológicas.

– Eliminar el fragmento ter-butil-acetilen-alil en2 y sustituirlo con grupos funcionales que dentro deotras estructuras han sido reportados como rele-vantes para la acción tripanocida (Rodríguez, 2001),(Szjanman, 2001), (Szjanman y col., 2000), (Rodrí-guez y col., 1998), (Nussbaumer y col., 1994),(Gómez y col., 1990).

– Mantener la presencia del nitrógeno terciarioalifático, ahora formando parte del núcleo semirrí-gido 2-aminoindano, para así introducir caracterís-ticas electrónicas y estéricas que podrían ser deutilidad en el estudio de receptores biológicos.

Figura 1:

Aplicación del método de modificación estructuralen el diseño del sistema N-metil, N-alquil-2-aminoindano,

estructuralmente relacionado con terbinafina.

Sistema N-metil, N-alquil-2-aminoindanoCompuesto R4 Alil5 Bencil7 Cloroetil8 Tiocianoetil

2

Reactivos: a. MeNH2, 40% en MeOH, NaBH4. b. Bromuro de alilo,Na2CO3, EtOH 90% T.A / 12h. c. Cloruro de bencilo, Na2CO3, EtOHabs. T.A / 12h. d. Bromoetanol, Na2CO3, EtOH abs.T.A / 12h. e.SOCl2, benceno, T.A / 24h. f. KSCN, EtOH 95%, reflujo 5h.

1



Síntesis del clorhidratode N-metil-2-indanamina 3

Sobre 4,43 g (0,03352 mol) de 2-indanona(Aldrich) se agregó 25 mL de metanol. A estasolución metanólica, enfriada entre 0-5 °C en unbaño de hielo, se le agregó 14,5 mL de soluciónacuosa de metilamina al 40% (0,168 mol). A lamezcla se añadió 1,6 g de borohidruro de sodio(0,04223 mol) en pequeñas porciones en un períodode 20 minutos, manteniendo en todo momento latemperatura de la solución entre 0-10 °C. La mezclaresultante se dejó en agitación a temperatura am-biente por una hora y luego se le agregó 15 mL demetanol y 4,47 g (0,042 mol) de carbonato desodio. Finalizada la reacción, se sometió a evapo-ración bajo presión reducida y al residuo se añadió15 mL de agua. La mezcla se extrajo con éter (6 x25 mL). Los extractos etéreos fueron combinados ysecados en MgSO4; el filtrado fue evaporado apresión reducida. El sólido resultante fue tratadocon ácido clorhídrico etéreo para producir un crudosólido que al ser recristalizado en alcohol isopropílicocaliente produjo 4,09 g (63,81 %) del clorhidrato,pf: 234-235 °C con desc. Lit.: 230-233 °C (Huebner,1961) y 210 °C con desc. (Levin y col., 1944).

Síntesis del clorhidrato de N-metil,N-alil-2-aminoindano 4

Sobre una solución de 20 mL de etanol al 90%y 1,4 g (0,00762 mol) de clorhidrato de N-metil-2-indanamina 3 se agregó 1,615 g (0,01524 mol) decarbonato de sodio hasta alcanzar pH alcalino.Luego se incorporó, poco a poco, 0,922 g (0,0076mol ª 0,66 mL) de bromuro de alilo (Aldrich) y lamezcla se agitó a temperatura ambiente por 24horas. La mezcla resultante se filtró, el residuoblanco fue lavado con etanol (2 x 5 mL). La evapo-ración del etanol a presión reducida produjo unsólido que se trató con éter saturado con HClconcentrado para producir la sal clorhídrica. Larecristalización de esta sal en alcohol isopropílicocaliente produjo 1,4 g (82,11%) del clorhidrato.

Síntesis del clorhidrato de N-metil,N-bencil-2-aminoindano 5

A 1 g (0,0054 mol) del clorhidrato de N-metil-2-indanamina 3 en 20 mL de etanol absoluto, seagregó 1,15 g (0,0108 mol) de carbonato de sodiohasta alcanzar pH 7,5-8,0. Luego se añadió, gota agota, 0,6214 mL (0,0054 mol) de cloruro de bencilo(Aldrich). La mezcla se dejó durante la noche atemperatura ambiente y en agitación. La suspensiónresultante se filtró, el sólido resultante se lavó conetanol absoluto (3 x 15 mL). La evaporación deletanol a presión reducida produjo un sólido que setrató con éter saturado con HCl concentrado para

obtener la sal clorhídrica. La recristalización de estasal en alcohol isopropílico caliente produjo 1,25 g(83,89%) del clorhidrato.

Síntesis del clorhidrato de N-metil,N-(2-hidroxietil)-2-aminoindano 6

Sobre 1,4 g (0,0076 mol) de clorhidrato de N-metil-2-indanamina en 20 mL de etanol absoluto seagregó 2,48 g (0,0234 mol) de carbonato de sodio.Luego se añadió, gota a gota, 1 mL (0,0076 mol ª0,9524 g) de bromoetanol y la mezcla se dejó enagitación durante la noche a temperatura ambiente.La mezcla resultante se filtró y el solvente se evaporóa presión reducida para dejar un semisólido que sedisolvió en éter etílico. Tratamiento de esta soluciónetérea con éter saturado con HCl concentrado produjoun sólido blanco. La recristalización de esta sal serealizó en alcohol isopropílico caliente, produciendo1,7 g (98 %) del clorhidrato que luego de una caracte-rización parcial fue utilizado en la obtención de 7.

Síntesis del clorhidrato de N-metil,N-(2-cloroetil)-2-aminoindano 7

A una mezcla de 1 g (0,0044 mol) del aminoal-cohol 6 en 25 mL de benceno seco se agregó 8 mL(0,1096) de cloruro de tionilo. La reacción fueinmediata. El benceno y el exceso de cloruro detionilo se evaporaron a presión reducida, obtenién-dose un sólido que fue disuelto en agua y ácidoclorhídrico diluido. Esta solución ácida se extrajocon éter etílico (2 x 10 mL). Luego la fase acuosa sealcalinizó con hidróxido de amonio concentradohasta pH mayor de 10 y se extrajo con tetraclorurode carbono (3 x 10 mL). Los extractos orgánicosfueron combinados y secados en MgSO4. El filtradofue evaporado a presión reducida para dar 0,803 g(86,8%) de la base libre en forma de un aceite queluego de disuelto en éter seco, se trató con étersaturado con ácido clorhídrico concentrado. El sólidoobtenido fué recristalizado en alcohol isopropílico-éter etílico para dar 0,987 g (91,38%) del clorhidrato.

Síntesis del clorhidrato de N-metil,N-(2-tiocianoetil)-2-aminoindano 8

En la menor cantidad posible de etanol al 95% sedisolvió 0,1736 g de sulfocianuro de potasio (el calorayudó a la disolución). Utilizando una inyectadora sele agregó, en el lapso de una hora, 0,4 g (0,00163mol) de clorhidrato de N-metil, N-(2-cloroetil)-2-ami-noindano 7 previamente disuelto en la menor cantidadposible de etanol al 95%. La mezcla se dejó en reflujopor cinco horas y luego en agitación a temperaturaambiente durante la noche. Se filtró. La soluciónresultante se evaporó a presión reducida, el sólidofue recristalizado en alcohol isopropílico calienteobteniéndose 0,37 g (89,5 %) de la sal clorhídrica.

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(*) Análisis elemental calculado (%): C 58,09; H 6,374; Cl 13,188; N 10,421; S 11,928.

Análisis encontrado (%): C 57,98; H 6,54; Cl 13,15; N 10,48; S 12,01.

Tabla

Características físicas y datos espectroscópicos

N°

4

5

7

8

Rend (%)

82,11

83,89

91,38

89,5

1H RMN (DMSO-d6) d (ppm)

2,64 (s, 3H, N-CH3); 3,25-3,95 (m,7H, ArCH2-CH-CH2-, -CH-N, -N-CH2-);5,29-5,52 (m, 2H, -CH=CH2); 6,05-6,13 (m, 1H, -CH=CH2); 6,92-7,24(m, 4H, ArH); 12,62 (sa, 1H, R3N+H).

2,12 (s, 3H, N-CH3); 2,54-3,65 (m,6H, ArCH2-CH-CH2-, -N-CH2-); 4,29-4,31 (m, 1H, -CH-N); 7,10-7,63 (m,9H, ArH); 10,17 (sa, 1H, R3N+H).

2,77 (s, 3H, N-CH3); 3,4-3,5 (m, 6H,ArCH2-CH-CH2-, -N-CH2-); 4,06-4,16(m, 3H, -CH-N-, CH2Cl); 7,21-7,24 (m,4H,ArH)

1,08-1,24 (m, 2H, CH2-SCN); 2,18 (s,3H, N-CH3); 2,27-2,83 (m, 6H, ArCH2-CH-CH2-, -N-CH2-); 3,39-3,56 (m, 1H, -CH-N); 7,18-7,48 (m, 4H, ArH).Análisis Elemental calculado yencontrado (*)

P.f (°C).HCl

201-203

200-202

158-160

178-180

IR (cm-1)

2154 (SCN)

MS.m/z (%)

188 (M+-HCl)100%.

238 (M+-HCl)100%

210 (M+-HCl)

232 (M+-HCl)

Biológicos

1. Citotóxico

Se aplicó la metodología de Mosman (1983) yDenizot (1986) sobre líneas celulares normalesBHK21 (riñon humano) y vero (riñón de mono). Laviabilidad celular se analizó a través del métodocolorimétrico del MTT. Se calculó el porcentaje decitotoxicidad con respecto al control y se realizó laevaluación estadística. Los resultados se expresanen % de citotoxicidad según el cálculo: % C = 1 – (A/B) x 100, donde A = densidad óptica de célulastratadas y B = promedio de densidad óptica decélulas control (Figuras 2 y 3).

2. Efecto inhibitorio de la proliferaciónde T. cruzi

Se aplicó el método de Castellani y col. (1967)sobre epimastigotes de T. cruzi, aislados de paciente(cepa EP), facilitados por el Centro de BiologíaMolecular de Parásitos (BioMolP) de la Universidadde Carabobo, mantenidos in vitro en el laboratoriopor repiques sucesivos en medio de cultivo LIT. Lacuantificación se realizó por procedimiento indirecto.

Figura 2

Efecto citotóxico en células BHK21

Figura 3

Efecto citotóxico en células vero



De un stock de 10 mM de cada droga, se hicierondiluciones seriadas para las concentraciones reque-ridas, diluyendo en DMSO a 100X. Se estudió elefecto antiproliferativo de cada compuesto químicoa 100 mM, paralelamente a un cultivo control sindroga (Figura 4).

excelente rendimiento. La caracterización de losderivados obtenidos se realizó por RMN 1H, espec-trometría de masa, punto de fusión, análisis elemen-tal y espectroscopía IR.

El experimento preliminar de inhibición delcrecimiento de epimastigotes de T. cruzi in vitro,mostró para el compuesto 5 un valor de inhibicióndel orden de 37%, comparado con el control y ladroga terbinafina que nos sirve de patrón conocidode actividad y desarrolló, además, baja citotoxicidaden las células vero y BHK21 ensayadas. El com-puesto cloroetil 7 tiene una citotoxicidad alrededorde 25% menor que 8, respuesta que no esperába-mos dada su funcionalidad alquilante. Los derivados4 y 5 presentan baja y similar citotoxicidad si se lescompara con 7 y 8, patrón que se repite en lasdiferentes concentraciones estudiadas. En líneascelulares vero se observa que el más citotóxico esel derivado cloroetil 7. No se ensayó el derivado8. En líneas celulares BHK21 el compuesto mástóxico es el compuesto 8, manteniendo este patrónde citotoxicidad en concentraciones de 5,50 y100 ppm.

Conclusiones

El estudio de la inhibición de la proliferación invitro de epimastigotes de T. cruzi, ensayado para elcompuesto 5, nos anima a continuar con los ensayosen epimastigotes y ampliarlos a la forma amastigote,tanto por las razones de facilidad de transporte enmembranas biológicas que presenta su estructurabase 2-aminoindano, como por la relativa bajacitotoxicidad mostrada en células vero y BHK21ensayadas. Así mismo, nos ofrece la oportunidad decontinuar realizando modificaciones estructuralesque contribuyan a potenciar dicho efecto .

El sistema N-metil, N-alquil-2-aminoindano dise-ñado incorpora características electrónicas y esté-ricas relativas al nitrógeno terciario alifático, queahora en este sistema forma parte del núcleo se-mirrígido 2-aminoindano, lo que constituye un aportea futuros posibles estudios, de receptores biológicosy sus requerimientos electrónicos y estéricos.

El diseño, síntesis y caracterización química decompuestos nuevos constituye, per se, un aporte ala investigación científica, así como lo es la conduc-ción de experimentos biológicos con nuevos o yaconocidos derivados sintéticos, en la exploración desus capacidades como agentes capaces de actuarcontra agentes patógenos como T. cruzi, y quepudiesen significar avances en el desarrollo de nue-vas estructuras y/o el mejoramiento de las caracte-rísticas estructurales o fisicoquímicas de las mismas,con la finalidad última de una quimioterapéutica útilen la erradicación de la enfermedad de Chagas.

Resultados y discusión

La síntesis de los compuestos propuestos selogró, con excelente rendimiento y de acuerdo conel diseño y procedimiento sintético mostrado en elesquema de síntesis. En la obtención de los com-puestos N-alquilados 4, 5 y 6 se aplicó, con algunasmodificaciones, el método de N-alquilación reporta-do por Pfeiffer y colaboradores, haciendo reaccionarla amina secundaria 3 con el bromuro de alilo,cloruro de bencilo y bromoetanol, respectivamente,a temperatura ambiente y utilizando como solventeetanol y carbonato de sodio como base. Bajo estascondiciones el rendimiento crudo de la reacción deN-alquilación fue bastante bueno. El compuesto N-metil, N-(2-hidroxietil)-2-aminoindano 6 se obtuvosólo como material de partida para la obtención delderivado 7 y por esta razón fue caracterizado par-cialmente. Sin embargo, la aplicación de la técnicade cromatografía en capa fina utilizando comosistema CHCl3:CH3OH:NH4OH conc. (90:5:5) mostró,para este compuesto, una sola mancha con Rf 0,65y su espectro infrarrojo mostró señales entre 3000a 3500 cm-1 que se corresponden con bandas deestiramiento del grupo hidroxilo. La evidencia espec-troscópica, la capacidad de formar la sal clorhídricay la reacción con el cloruro de tionilo en la obtencióndel derivado 7, junto a la caracterización total de 7,son pruebas consistentes con la estructura asignadaal compuesto 6. La síntesis del clorhidrato de N-metil, N-(2-tiocianoetil)-2-aminoindano 8 se llevó acabo utilizando KSCN en etanol al 95% y reflujo apartir del derivado cloroetilado 7 obteniéndose con

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Agradecimientos

Al Instituto de Investigaciones de la Facultad deFarmacia (IIF) y Consejo de Desarrollo Científico y Hu-manístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuelapor el financiamiento otorgado. A la doctora Mary CarmenMuiños y Laboratorio Novartis por proveer la terbinafina.

Recibido: noviembre 2003Aceptado: septiembre 2004


Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003Evaluación de fitoquímicos en el exocarpio (cáscara) de algunas frutas cultivadas en Venezuela

1 Unidad de Investigación Análisis de Alimentos. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela2 Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos. UCV

* A quien debe dirigirse la correspondencia

Evaluación de fitoquímicos en el exocarpio(cáscara) de algunas frutas cultivadas

en Venezuela

Evaluation of phytochemicals in the peel of some

Venezuelan fruits

RINCÓN, ALICIA MARIELA1*, TAPIA, MARÍA SOLEDAD2, PADILLA, FANNY C1.

Resumen

Los estudios nutricionales se han dirigido hacia la investigación del efecto protector y preventivo de los alimentosa ciertas enfermedades, tales como las cardiovasculares, algunos tipos de cáncer y otras enfermedadesdegenerativas, así como el envejecimiento. Esto se atribuye a que ciertos alimentos pueden suministrar unamezcla óptima de fitoquímicos tales como antioxidantes naturales, fibras y otros compuestos bioactivos. En estetrabajo, las fracciones liofilizadas de cáscara de níspero (Manilkara achras), pomagás (Syzygium malaccense)y dos variedades de guayaba, rosada y blanca (Psidium guajava) y (Psidium acutangulum) se evaluaron encuanto al contenido de polifenoles totales, capacidad antioxidante, fibra dietética y vitamina C. Los polifenolestotales se separaron mediante una extracción líquido-líquido, usando mezcla de solventes orgánicos y agua ycuantificados por el método de Folin-Ciocalteau, con ácido gálico como estándar; la capacidad antioxidante porel método del 2,2.difenil-1-picrylhydracyl (DPPH•), y el contenido de fibra dietética y vitamina C se determinaronpor métodos oficiales AOAC. Las cáscaras mostraron altos valores de polifenoles extraíbles (43,74 – 77,9 g GAE/Kg) b.s., así como fibra dietética y vitamina C. El alto contenido de polifenoles se correlaciona con la capacidadantioxidante. Estos resultados sugieren que las fracciones de las cáscaras de frutas podrían ser utilizadas paraobtener «fibra dietética antioxidante», un nuevo concepto que combina las propiedades de la fibra y compuestosbioactivos con capacidad antioxidante.

Palabras claves: cáscara de níspero (Manilkara achras), cáscara de pomagás (Syzygium malaccense), cáscarade guayaba (Psidium guajava) y (Psidium acutangulum), fitoquímicos, compuestos bioactivos, fibra dietéticaantioxidante.

Abstract

Nutritional studies have been focused on the protective and preventing effect of some vegetable foods on certaindiseases such as cardiovascular, cancer, age related and degeneration diseases. These effects are attributed tothe presence of phytochemicals such as antioxidants, fiber and other bioactives compounds. The objetive of thiswork was evaluated the antioxidant capacity, total polyphenols, dietary fiber and vitamin C content in the freezedried peel of Hamilkara achras, Syzygium malaccense, Psidium guajava y Psidium acutangulum. Polyphenolswere extracted from samples using aqueous-organic solvents by liquid-liquid extraction and were estimated bythe Folin-Ciocalteau method. The antioxidant activity of polyphenol compounds was studied using the free radicalDPPH° scavenging methods; and dietary fiber and vitamin C were assessed by the AOAC methods. Results showedaverage polyphenols content of 43.74-77.9 g GAE / Kg (d.w), high vitamin C and dietary fiber values. There iscorrelation between the antioxidant capacity and polyphenol content. These results indicate that the fruit peelscould also be used to obtain antioxidant fiber, a new concept which combines in a single natural product theproperties of dietary fiber and antioxidant compounds.

Keyword: Manilkara achras peel, Syzygium maláccense peel, Psidium guajava peel, Psidium acutangulumpeel, phytochemical, bioactive compounds, antioxidant dietary fiber.

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Revista Facultad de Farmacia. Vol. 66 • Nº 1 • 2003RINCÓN, ALICIA MARIELA, TAPIA, MARÍA SOLEDAD, PADILLA, FANNY C

Introducción

Estudios epidemiológicos indican que un consumofrecuente de frutas está asociado a un menor riesgo deinfarto y cáncer (Beecher, 1999). Existe una evidenciacada vez más fuerte de que los alimentos contienentambién sustancias fisiológicamente activas que cumplen,al igual que los nutrientes, una función que contribuye areducir la incidencia de ciertas enfermedades y por tantoson necesarias para una vida saludable, dichas sustanciasreciben el nombre de fitoquímicos (Beecher, 1999, Stein-metz y Potter, 1991). La mejor vía para entender losbeneficios a la salud suministrados por alimentos vegetalesy la base para la creación de alimentos funcionales, es lacaracterización de sus constituyentes fisiológicamenteactivos, los fitoquímicos (Hasler y Blumberg, 1999). Sinembargo, los constituyentes específicos responsables detales efectos positivos no están completamenteelucidados. Entre los compuestos bioactivos se encuentranlos polifenoles, constituyendo uno de los grupos demetabolitos más numerosos y ampliamente distribuidosen el reino vegetal y forman parte integral de la dietaanimal y humana, que van desde simples moléculasfenólicas a compuestos altamente polimerizados comolos taninos; la aparición de este complejo grupo desustancias en alimentos vegetales es extremadamentevariable (Bravo, 1998).

La fibra dietética, y más recientemente, los micro-constituyentes presentes en frutas y vegetales, se con-sideran que juegan un rol significativo en la prevención deenfermedades crónicas y degenerativas. Se han realizadomuchos estudios en animales o en humanos sobre lacapacidad de las diferentes fibras alimentarias para reducirlas concentraciones de colesterol en el plasma (Dillard yGerman, 2000).

El interés actual en la vitamina C se centra en suhabilidad para actuar como antioxidante; el ascorbato esun donante de electrones (o agente reductor) en lasreacciones químicas intra y extracelulares, por lo que elascorbato podría desempeñar un papel esencial en ladefensa frente a la oxidación celular (Economos y Clay,1999). El níspero, pomagas y guayaba son frutas amplia-mente consumidas en Venezuela, especialmente en formafresca. Tales frutas podrían ser fuente potenciales defitoquímicos con implicaciones favorables sobre la salud.

Considerando que las cáscaras de las frutas y vegetalescontienen la mayor cantidad de compuestos bioactivos,entre los cuales están la fibra dietética, la vitamina C y lospolifenoles, con efectos favorables a la salud, en estetrabajo se evaluó el contenido de fibra dietética, vitaminaC y polifenoles totales, así como la capacidad antioxidantede los extractos de las cáscaras de níspero (Manilkaraachras), pomagás (Syzygium malaccense) y dos varie-

dades de guayaba, rosada y blanca (Psidium guajava) y(Psidium acutangulum) respectivamente.

Materiales y Métodos

Muestras: frutas de níspero (M. achras), pomagás (S.malaccense) y dos variedades de guayaba (P. guajava) y(P. acutangulum) fueron adquiridas en el mercado local(Quinta Crespo, Caracas) Las frutas tenían un grado demadurez adecuado (pulpa firme), sin daños visibles, almomento de ser procesadas.

La obtención de las harinas de las cáscaras de lasfrutas, se presenta en la figura 1.

Figura 1

Esquema tecnológico para la obtención de harinasliofilizadas de cáscaras de níspero (M. achras), pomagás

(S. malaccense) y dos variedades de guayaba(P. guajava) y (P. acutangulum)

Frutas

Cáscara

LiofilizarMoler en procesador

Braun

Tamizar (malla 60)HARINAS

Almacenar(T. ambiente) en bolsas

plásticas al vacío

Lavar y separar fracciones:cáscara y pulpa; descartarlas semillas

EQUIPOS:

Espectrofotómetro uv/vis Génesis 5

Fibertec System E 1023. Módulo de filtración

Liofilizador Labconco, Freeze Dry Modelo LYPH-LOCK12, temp (-47-488 °C); presión 250-350 X 103 Mbar

Espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301, personal fluo-rescence software, versión 1,2 para windows, 1995-1996.

Reactivos: todos los reactivos usados fueron gradoanalítico.

MÉTODOS

Extracción de polifenoles, usando mezcla de solven-tes: 0,8% HCl 2 N en Metanol/agua (50:50); acetona:agua(70:30)



Polifenoles totales: Método Folin-Ciocalteau, (Mon-treau F.R. 1972)

Actividad antioxidante: a los extractos obtenidos seles determinó la capacidad antioxidante mediante elmétodo del radical DPPH• (Sánchez-Moreno y col., 1998).Fundamento: generación de radicales libres a partir deuna solución metanólica de 2,2-difenil-1-pycril-hidracil.En forma de radical, el DPPH• absorbe a 515 nm, absor-bancia que disminuye por la presencia de otras especiesradicales o por reducción con un agente oxidante. Elparámetro EC50, el cual refleja la concentración delextracto que atrapa en un 50% el radical libre DPPH•, seexpresó en términos de g de muestra equivalente por g deDPPH• en el medio de reacción. El tiempo(TEC50) paraalcanzar el estado de equilibrio a EC50 se calcula porregresión lineal. También se calculó la eficiencia anti-rradical (AE) mediante la ecuación:

AE= 1/EC50.TEC50.

Fibra dietética soluble e insoluble: método oficial(AOAC, 2000)

Vitamina C: método fluorométrico, (AOAC, 2000)

Análisis estadístico

Cada muestra se analizó por triplicado. Los resultadosse expresan como valores promedio ± la desviación están-dar. La comparación de las medias se realizó por análisisde varianza (ANOVA), utilizando un nivel de significanciade p< 0,05 . Los análisis de regresión lineal y ANOVA, seejecutaron utilizando el programa estadístico StatgraphicsPlus, versión 5.1, para windows 1.4, (1994-1995).

Resultados y discusión

POLIFENOLES TOTALES

Los resultados del contenido de compuestos fenólicostotales de las cáscaras en estudio se muestran en la Tabla1. Todas las muestras presentaron altos valores de poli-fenoles totales. El estudio estadístico reveló que entre lascáscaras de níspero y pomagas no hubo diferenciasestadísticamente significativas (p< 0,05).

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Los valores de EC50 se presentan en la Tabla 1. Todaslas fracciones de cáscara de frutas estudiadas tuvieron

Muestra Polifenolestotales DPPH•

(g GAE/Kg)

EC50 TEC50 EA(g mx, bs /g DPPH*) (minutos) (1/EC50.TEC50)

Níspero 45,17 ± 0,097a 6,41 ± 0,181ª 41,51 ± 0,56ª 0,0033a

(M.achras)

Pomagás(S.malaccense) 43,74 ± 0,246a 6,81 ± 0,136ª 41,76 ± 0,3ª 0,0035a

Guayaba rosada(P. guajava) 58,7 ± 0,32b 1,92 ± 0,245b 38,45 ± 0,42b 0,0140b

Guayaba blanca(P. acutangulum) 77,9 ± 3,0c 2,62 ± 0,57c 54,74 ± 1,23c 0,010c

Letras iguales en una misma columna indica que no existen diferencias estadísticamente significativas (p< 0,05)

Cada valor es el promedio ± desviación estándar, n=3.

GAE: equivalentes de ácido gálico (estándar)

EC50: Concentración del extracto de la muestra que «secuestra» el 50% del radical libre DPPH•

TEC50: tiempo necesario (de equilibrio) para que el extracto de la muestra «secuestre» el 50% del radical libre DPPH•

EA: eficiencia antirradical, relaciona los parámetros EC50 y TEC50

b.s.: base seca mx: muestra

Tabla 1

Contenido de polifenoles totales extraíbles, expresados como equivalentes de ácido gálico, actividadde barrido del radical libre DPPH• en las fracciones de piel de níspero, pomagás y guayaba

76


una alta actividad de barrido del radical libre DPPH•, des-tacándose las muestras de cáscara de guayaba en sus dosvariedades, que presentaron los valores menores de EC50 ylos mayores valores de compuestos fenólicos totales.

El análisis de regresión lineal entre los valores EC50 delos diferentes extractos de las cáscaras de las frutas y elcontenido de polifenoles totales mostró una correlaciónestadísticamente significativa (p< 0,05). La literatura mues-tra una correlación lineal entre la actividad antioxidantey los extractos polifenólicos en frutas y vegetales (Robardsy col, 1999) y bebidas (Saint-Cricq de Gaulejac y col,1999), pero no para las cáscaras de las frutas aquíestudiadas. Esta correlación sugiere que la contribuciónde los compuestos fenólicos en este modelo es alta.

Los valores EC50, expresados en (g antioxidante/gDPPH•), de algunos estándares son los siguientes: ácidogálico: 0,026; ácido tánico: 0,059; ácido cafeico: 0,069;quercertina: 0,084 y DL∝-tocoferol: 0,201(Sánchez-Moreno y col., 1998).

Al relacionar el valor de EC50 de un antioxidante comoel DL-∝-tocoferol y los valores de EC50 obtenidos en esteestudio encontramos que un gramo de cáscara de níspero,un gramo de cáscara de pomagás y un gramo de cáscarade guayaba, en sus dos variedades (P. guajava y P.acutangulum) es equivalente al poder antioxidante de31,35 mg, 29,51 mg, 104,1 mg y 76,72 mg de DL-α-tocoferol respectivamente. Las analogías de las diferentesmuestras en estudio con otros antioxidantes se muestranen la Tabla 2.

FIBRA DIETÉTICA Y ACIDO ASCÓRBICO

En la Tabla 3 se muestran los valores obtenidos defibra dietética en las fracciones liofilizadas de las cáscarasde níspero (M. achras), pomagás (S. malaccense) y dosvariedades de guayaba (P. guajava) y (P. acutangulum).

Todas las muestras tuvieron un contenido de fibra dietéticatotal por encima de los requerimientos diarios (20-40 g/persona/ día) (INN, 2000), por lo que se puede inferir queestas frutas son una buena fuente de fibra dietética. Lafracción principal encontrada en las harinas de las cáscarasde las frutas fue la fibra dietética insoluble, representandoentre 96 y 98% de la fibra dietética total. Esto puede serexplicado por el alto contenido de celulosa en la paredcelular en las cáscaras de las frutas, pues esta fracciónestá constituida principalmente por celulosa, hemicelulosay lignina. Se conoce que el consumo de fibra dietéticainsoluble provoca en el organismo un aumento en elvolumen y peso de la masa fecal, reduce la constipación yaumenta la eliminación de moléculas orgánicas, mutáge-nos y ácidos biliares por lo que se reduce el riesgo decáncer de colon (López y col., 1997).En cuanto a la fibradietética soluble, las muestras estudiadas tuvieron entre 2y 4% de la fibra dietética total; la cantidad de fibra dietéticasoluble que aportan los residuos al organismo son fisioló-gicamente importantes ya que esta fracción es el sustratomayoritario para la fermentación colónica (Gallaher ySchneeman, 1997) por lo que con su ingesta se logra unadisminución en la concentración de colesterol y glucosa ensangre, un incremento en la eliminación de ácidos biliaresy el crecimiento y proliferación de la flora colónica.

Desde el punto de vista funcional, la fracción solubledetermina la solubilidad, hinchamiento, capacidad deretención de agua y viscosidad de la fibra, factoresdeterminantes cuando se realiza la incorporación en unalimento, debido a que estas propiedades son las quedeterminan el grado máximo de añadido.

La cáscara de guayaba en sus dos variedades rosaday blanca, tiene un mayor contenido de fibra dietéticatotal en comparación con las otras cáscaras de frutasestudiadas. Las cáscaras de las otras frutas también po-seen un contenido de fibra total adecuado, por lo que seríafactible en el enriquecimiento de productos alimenticios.

Muestra: Estándar antioxidante (mg)(1 g) de

cáscara de: Ácido gálico Ácido tánico Ácido cafeico Quercertina DL-∝-tocoferol

Níspero 4,05 9,20 10,76 13,10 31,35

Pomagás 3,81 8,66 10,13 12,33 29,51

Guayaba rosada 13,54 30,13 35,34 43,75 104,7

Guayaba blanca 9,92 22,52 26,33 32,06 76,12

Tabla 2

Antioxidante (mg) que se corresponden con un gramo de muestra



El análisis estadístico reflejó que hubo diferenciasestadísticamente significativas (p< 0,05) en los parámetrosde fibra dietética soluble, fibra dietética insoluble y fibradietética total.

En la Tabla 3 se muestran los valores obtenidos deácido ascórbico en las muestras de las cáscaras deníspero (M. achras), pomagás (S. malaccense) y las dosvariedades de guayaba (P. guajava) y (P. acutangulum).

La vitamina C es un componente nutricional deimportancia porque interviene en los procesos bioquímicosy metabólicos del organismo tales como la proteccióncontra infecciones y enfermedades, la síntesis de colágeno,además de poseer propiedades antioxidantes por lo queretarda el deterioro y la rancidez. Al realizar el análisisestadístico (ANOVA) en la determinación del contenidode vitamina C para cada una de las muestras, se encontróque existen diferencias estadísticamente significativas(p< 0,05) entre todos los valores experimentales obtenidos.Las cáscaras de guayaba variedad rosada, mostraron losvalores más elevados de vitamina C. Aun cuando losvalores de vitamina C en los frutos completos reportadosen la Tabla de Composición de Alimentos (INN 2001) sonmayores que los obtenidos en este estudio, podríamosseñalar que las cáscaras de las frutas podrían constituirseen una fuente aprovechable de tal vitamina.

Conclusiones

Las fracciones de cáscara de níspero (M. achras),pomagás (S. malaccense) y guayaba en sus dos variedades(P. guajava) y (P. acutangulum) presentaron niveleselevados de compuestos fenólicos, fibra dietética total yvalores aceptables de vitamina C. Existe una correlaciónestadísticamente significativa entre el contenido de

polifenoles totales y la capacidad antioxidante. Los fito-químicos o compuestos bioactivos (polifenoles, fibradietética y ácido ascórbico) contribuyen significativamentea la alta capacidad antioxidante de las cáscaras de lasfrutas. Dado que las cáscaras de los frutos aquí analizadosson fuente de fibra dietética y están asociadas conantioxidantes naturales como polifenoles y ácido ascór-bico, podrían ser calificados como alimentos funcionalespudiéndose constituir en suplementos alimenticios y sercomercialmente explotados. Sería altamente recomen-dable identificar los compuestos fenólicos de las cáscarasde las frutas en estudio.

Agradecimientos

Al Instituto de Investigaciones Farmacéuticas de laFacultad de Farmacia, UCV, proyecto IIF-2000. Las autorasagradecen a la Lic. Patricia Carrillo por su ayuda en larealización de los análisis de actividad antioxidante.

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Muestra: Fibra dietética (g/100 g b.s) Vitamina CCáscaras de (mg/100 g)

FDS FDI FDT

Níspero 0,391 ± 0,002 a 24,53 ± 0,021ª 24,92 9,77 ± 4,17a

Pomagás 0,331 ± 0,014b 20,39 ± 0,046b 20,72 4,47 ± 5,54b

Guayaba rosada 1,83 ± 0,27c 46,72 ± 2,16c 48,55 28,17 ± 2,18c

Guayaba blanca 1,53 ± 0,17d 39,19 ± 0,97d 40,86 27,39 ± 2,4d

FDS: fibra dietética soluble; FDI: fibra dietética insoluble; FDT: fibra dietética total

Los valores son el promedio ± desviación estándar (n=3).

Letras diferentes en una misma columna expresa diferencias estadísticamente significativas.

Tabla 3

Fibra dietética soluble, insoluble y total (g/100 g) y vitamina C (mg/100 g)en los extractos de cáscara de níspero, pomagás y guayaba

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Recibido: septiembre 2004Aceptado: diciembre 2004



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