Control of Micro organisms‐

Sahaya Asirvatham

Prevent contamination

Prevent transmission of pathogen

To prevent decomposition & spoilage of product

To  prevent  contamination  in  aseptic  areas,  processes  like production of pharmaceuticals by fermentation.

To  maintain  aseptic  condition  in  operation  theaters,  filling area of non sterile pharmaceuticals.

Reasons for Controling Microorganisms

Sterilization Sterilization is defined as the process by which an article, surface or the medium is freed of all living microorganism either in vegetative or spore state.

Essential stage in processing of any product used for parenteral administration, broken skin, mucosal surface or internal organ.

Fundamentals of Microbial Control

Important terms: 

Thermal death point (TDP) It is the lowest temperature at which all of the microorganism present in the liquid suspension will be killed in just 10 minutes.

Thermal death time (TDT) It is the minimum length of time whereby all microorganism present in the liquid culture medium will be killed at given temperature.  

Fundamentals of Microbial Control

Disinfection: A treatment that reduces the total number of microbes on an object or surface, but does not necessarily remove or kill all of the microbes

Sanitation:  Reduction  of  the  microbial  population  to  levels considered safe by public health standards

Antiseptic:  A  mild  disinfectant  agent  suitable  for  use  on  skin surfaces

–cide:  to kill Bactericide:  chemical that destroys bacteria 

Fungicide:  a chemical that can kill fungal spores, hyphae, and yeastsVirucide: a chemical that inactivates virusesSporicide:  can destroy bacterial endosporesGermicide and microbicide:  chemical agents that kill microorganisms

Stasis and static: to stand still

Bacteristatic: prevent the growth of bacteriaFungistatic:  inhibit fungal growth

       Bactericidal Vs Bacteristatic  

Death (in terms of microorganisms) 

Irreversible loss of ability to reproduce.

Determined by inoculating culture to the medium

Pattern of Death in a Microbial Population

Bacterial  populations  die  at  a  constant logarithmic rate

Microorganisms were previously considered to be dead  when  they  did  not  reproduce  in  conditions that normally supported their reproduction

However  organisms  can  be  in  a  viable  but nonculturable (VBNC) condition  

Once they recover they may regain the ability to reproduce and cause infection  Pattern of Microbial death-an exponential

plot of survivors against mins of exposure to heating at 121 0C.

Conditions affecting Antimicrobial Activity

1. Type of agent:     Physical or chemical

2. Nature of heat

3. Concentration, Dose, Time & temperature  of the agent

4. Bioburdon

5. Mechnism of Action of the agent  

6.Environment:Physical & chemical properties of the medium or substance carrying the organismEffectiveness of heat in acid is greater than in alkaliConsistency of the material (viscous: less penetration)Concentration of carbohydrates increases thermal resistancePresence of extraneous organic matter (inactivation of agent or protective effect)Action of chemical agent Increases with increase in temperature. 

7. Kind of Microorganism: 

Microbial spp. Differe in susceptibility to physical & chemical agentsVegetative cell of spore forming bacteria are more susceptible than sporesSpores are most resistant

8. Physiological State of Cells:

Young actively metabolizing cells are more susceptible In dormant cells the agent which causes damage through the interference with metabolism, non growing cell would not be affected

        

How Antimicrobial Agents Work: Their Modes of Action??

1. Damage to the cell wall or inhibition of cell­wall synthesis

2. Alteration of permeability of cytoplasmic membrane

3. Alteration of physical /chemical state of proteins & nucleic acid

4. Inhibition of proteins & nucleic acid synthesis

Survivor Curve

When exposed to a killing process, populations of microorganismsgenerally  lose  their  viability  in  an  exponential  fashion, independent of the initial number of organisms.

Of the typical curves obtained, all have a linear portion which may be  continuous  (plot  A),  or  may  be  modified  by  an  initial  shoulder (B) or by a reduced rate of kill at low survivor levels (C).

Short  activation  phase,  representing  an  initial  increase  in  viable count, may be seen during the heat treatment of certain bacterial spores.

Survivor curves have been employed principally in the examination of heat sterilization methods, but can equally well be applied to anybiocidal process.

Fig. 20.1 Typical survivor curves for bacterial sporesexposed to moist heat or gamma­radiation.

Expressions of resistance

D­value: 

The  resistance  of  an  organism  to  a  sterilizing agent can be described by means of the D­value.   

For heat and radiation treatments, respectively, this  is  defined  as  the  time  taken  at  a  fixed temperature  or  the  radiation  dose  required  to achieve a 90% reduction in viable cells  (i.e. a 1 log cycle reduction in survivors). 

The calculation of the D­value assumes a linear type A survivor curve, and must be corrected to allow for any deviation from linearity  with type B or C curves.

Expressions of Resistance

In  order  to  assess  the  influence  of  temperature  changes  on thermal resistance a relationship between temperature and log D­value can be developed leading to theexpression of a z­value.

which represents the increase in temperature needed toreduce the D­value of an organism by 90% (i.e. 1 log cyclereduction). 

For  bacterial  spores  used  as  biological  indicators  for  moist  heat (B. Stearothermophilus) and dry heat (B. subtilis) sterilizationprocesses,  mean  z­values  are  given  as  10°C  and  22°C, respectively. 

The z­value is not truly independent of temperature but may beconsidered essentially constant over the temperature ranges used in heat sterilization processes.

Z­Value: 

In food industry unit of lethality has been devised, called as F­value. 

This is defined as the equivalent in minutes of 1210C of all heat considered with respectto its capacity to destroy spores or vegetative cells of perticular organism

F = D (log N0 – log N)

Where D = D­value at 1210C of the organism            N0 = Initial population Number/unit volume            N = Final Population number/unit volume   

It is used to calculate probable number of survivors remaining in a load     

F­Value: 

The inactivation factor is the degree to which the viable population of organisms isreduced by the treatment applied and is obtained by dividing the initial viable countby the final count

IF = 10t/D

Where  t = holding time at sterilizing temp. D = D­value for the marker organism at that temp.

Inactivation Factor

Sterilization Methods

I. Physical Methods

1. Heat Sterilization methods

Moist Heat

Dry Heat

Low Temperatures

l Moist Heat Sterilization

Mechanism  of  killing  is  a  combinantion  of  protein/nucleic  acid denaturation and membrane disruption

Effectiveness  Heavily  dependent  on  type  of  cells  present  as  well  as environmental conditions (type of medium or substrate)

Bacterial spores are much more difficult to kill than vegetative cells

Methods for Moist heat Sterilization 

a) Temperature at 100° C – Boiling

b) Temperature below 100° C – Pasteurization

c) Steam Under Pressure – Autoclave

d) Steam at Atmospheric Pressure­ Tyndallization 

Temperature at 100° C – Boiling

Most  vegetative  microorganism  are killed in 2­3 mins, but spores make take 2­3 hrs.

Endospores,  protozoan  cysts,  and  some viruses can survive boiling

Pasteurization

Used to reduce microbial numbers in milk and other beverages  while  retaining  flavor  and  food  quality  of the beverage

Retards spoilage but does not sterilize

Traditional treatment of milk, 63°C for 30 min

Flash  pasteurization  (high­temperature  short  term pasteurization);  quick  heating  to  about  72°C  for  15 sec, then rapid cooling

Tyndallisation

The media containing sugar and gelatin are exposed to 1000 C for 20 minutes on three successive days is known as tyndallization or intermittent sterilization. 

In first exposure it kills vegetative bacteria and spores, since they are in favorable medium, will germinate and killed on subsequent occasion.

Steam under pressure : Autoclave

Principle: 

The lethal effect of moist heat is due to the denaturation and coagulation of protein.

When  steam  makes  contact  with  the  cooler  articles  in  the autoclave  it  condenses  into  water  on  their  surface  and  in their interstices.

This  condensation  has  three  effects  of  critical  importance  for  sterilization process 

1. It wets the microorganisms on the articles and so provides this essential condition for their killing by moist heat.

2. It liberates the very large latent heat of steam and so rapidly heats up the articles to the sterilizing temperature.

3. It causes a great contraction in the volume of the stream and so promotes the ingress of fresh steam.

Autocalave

Method : 

Materials to be sterilized are placed in perforated diaphragm 

The test­tubes are plugged with non absorbent cotton and covered with paper to avoid drenching of plugs during the release of steam when condensation occurs 

After adjusting the water level, lid is kept in position and is closed tightly by means of screw clamps. 

Autoclave is switched on, steam valve is kept open until all the air is expelled out and steam comes out. 

The steam valve is closed and the pressure begins to rise 

As the pressure begins to rise to 15lbs/sq.in (psi), time is noted. One of the electrical coils is switched off (when 2 coils are used) or steam valve is opened partially so as to 

maintain the pressure constant at 15psi. 

After 15 min the autoclave is switched off and is allowed to cool down

After all the steam has escaped from the open steam valves, autoclave is opened and all the sterilized materials are removed 

Pharmaceutical applications:

 Sterilization of culture media, apron and rubber tubing etc

 Sterilization of injections solution and suspensions.

  Sterilization  of  surgical  dressings  and  fabrics  such  as  cotton  wool,  gauze  swabs, ribbon gauze, masks,  and caps etc.

 Sterilization of packaging materials such  as containers like metal drum, card board boxes and wrappings such as nylon film, paper etc.

Dry Heat Sterilization

Principle: The killing effect of dry heat is because of denaturation of protein, oxidative  damage and toxic effect of elevated levels of electrolyte.

Method: there are three methods for dry heat sterilization.

Flaming

Incineration

Hot air oven

Flaming:  inoculating  loop  or wire,  tip  of  forceps  and  searing spatulas  are  held  in  Bunsen     flame till they become red hot.

Incineration:  it  is  excellent method  for  safely  destroying materials  such  as  contaminated cloths, pathological materials etc.

Hot Air Oven

It  consists  of  a  double  walled  chamber  insulated  with asbestos sheet or glass wool to prevent radiation of heat. 

The  chamber  is  heated  electrically  and  maintained thermostatically. The  temperature  can  be  noted  on  the  thermometer  which can be inserted from top.

The  hot  air  oven  can  be  operated  at  150˚C  for  150  min, 160˚C for 2 Hrs, 170˚C for 60 min and 180˚C for 30 min  for sterilization of the articles. 

Hot air oven is generally used for sterilization of glassware, metal devices and other articles which are spoiled by autoclaving.

Precautions:

All  the  glassware  must  be  clean  and  dry  to  prevent  internal contamination after sterilization.

It is essential to wrap the apparatus before placing them into the oven.

The oven must be loaded when it is cool.

The  temperature  must  not  raise  above  180˚C  in  any  case  otherwise  the cotton plugs and papers may be charred.

Before  removing  the  apparatus,  oven  should  be  cooled  to  room temperature.

Pharmaceutical Applications:

It is used to sterilize glassware’s forceps, scissors, scalpels.

It is used to sterilize all glass syringes.

Pharmaceutical product such as liquid paraffin, dusting powder, fats and grease can be sterilize. Sterilization of anhydrous material.

Sterilization of powders.

Decrease microbial metabolism, growth, and reproduction

Chemical reactions occur slower at low temperatures

Liquid water not available

Psychrophilic microbes can multiply in refrigerated foods

Refrigeration halts growth of most pathogens

Slow freezing more effective than quick freezing

Organisms vary in susceptibility to freezing

Refrigeration and Freezing

Dessication is drying (98% of the water is removed) inhibits growth due to removal of water

Lyophilization (freeze­drying)

Substance is rapidly frozen and sealed in a vacuumSubstance may also be turned into a powderUsed for long­term preservation of microbial culturesPrevents formation of damaging ice crystals

Dessication and Lyophilization

The use of dessication as a means of preserving apricots

Lyophilization

Ionizing radiation:  if the radiation ejects orbital electrons from an atom causing ions to form

Nonionizing radiation:  excites atoms by raising them to a higher energy state but does not ionize them

l Radiation as a Microbial Control Agent

Ionizing Radiation

Gamma radiation produced by Cobalt­60 source

Powerful sterilizing agent; penetrates and damages both DNA and protein; effective against both vegetative cells and spores

Often used for sterilizing disposable plastic labware, e.g. petri dishes; as well as antibiotics, hormones, sutures, and other heat­sensitive materials

Also can be used for sterilization of food; has been approved but has not been widely adopted by the food industry

Mode of action 

Radiation can cause both ionization and excitation and their absorption is not affected by structure of the molecule. It may act directly or indirectly.

Direct action: Every microorganism and living cell having target region which is radiation sensitive, a single ionization of radiation in this sensitive zone or region will kill the microorganism. 

Indirect effect: Absorption of radiation by water, within or surrounding living cell produces free radicals. these are powerful oxidizing and reducing agent capable of damaging essential molecule and therefore causing death.  

Sterilization with Ionization; Radiation machine which uses Cobalt 60 as a Gamma radiation to sterilize fruits, veg, fish, meat, etc..

Applications 

Sterilization of disposable surgical materials and equipments ex. Plastic syringes, catheters, hypodermic needle and scalpel blade.

Sterilization of adhesive dressings.

Sterilization of single application capsule of eye ointment.

Sterilization of catgut

Sterilization of packaging materials such as plastic films and aluminium foil.

Sterilization of bacterial and viral vaccines.  

Used in radiotherapy of cancer.

Increased shelf life of food achieved by Ionizing Radiation

Ultraviolet Radiation

DNA absorbs ultraviolet radiation at 260 nm wavelength

This causes damage to DNA in the form of thymine dimer mutations

Useful for continuous disinfection of work surfaces, e.g. in biological safety cabinets

Non­Ionizing Radiation

Ultraviolet Radiations 

Method: The effectiveness of the method depends on the wavelength absorbed by the particular region or component of microbial cell.

260nm  is  the  wavelength  giving  100%  effectiveness  because  it  is  the  adjacent wavelength strongly absorb by nucleoprotein. 

Applications

Irradiation of incoming and internal air of sterile filling area of antibiotic plants.

Sterilization of thermolabile products.

Improvement of bacteriological water used to manufacture non sterile  pharmaceuticals.

As aid to asepsis in manufacturing houses and hospitals.

To prevent cross infection in hospitals and schools

Modes of Action of Ionizing Vs Nonionizing Radiation

Filters are used to sterilize these heat­labile solutions.

Filters simply remove contaminating microorganisms fromsolutions rather than directly destroying them. 

The filters are of two types: 

(a) Depth filters 

 (b) Membrane filters.

Filtration

Consist  of  fibrous  or  granular  materials  that  have  been  bonded  into  a  thick layer filled with twisting channels of small diameter. 

The solution containing microorganisms is sucked in through this layer under vacuum and microbial cells are removed by physical screening or entrapment and also by adsorption to the surface ofthe filter material.

Depth filters

Depth filters are of the following types:

1. Candle filters: 

These are made up of 

(a) diatomaceous earth  

(b) unglazed porcelain 

They are available in different grades of porosity and are used widely for purification of water for drinking and industrial uses.

2. Asbestos filters

Made of asbestos such as magnesium silicate. 

Eg: Seitz and Sterimat filters 

  These  are  disposable  and  single­use  discs  available  in  different grades. 

They  have  high  adsorbing  capacity  and  tend  to  alkalinize  the filtered fluid.

 Their use is limited by the carcinogenic potential of asbestos.

3.Sintered glass filters

These are made up of finely powdered glass particles, which are fused together. 

They have low absorbing property and are available in different pore sizes. 

These filters, although can be cleaned easily, are brittle and expensive.

Membrane Filters

Porous  membranes  with  defined  pore  sizes  that remove  microorganisms  primarily  by  physical screening. 

These  filters are circular porous membranes and are usually 0.1 mm thick. 

Although  a  wide  variety  of  pore  sizes  (0.015–12μm) are available, membranes with pores about 0.2μm are used, because the poresize is smaller than the size of bacteria.

This has replaced Depth Filters.

Membrane Filter Sterilisation

Filtration equipment used for microbial control

The role of HEPA filters in Biological Safety Cabinets

High­Efficiency  Particulate  Arresting   (HEPA)  air  filters  are  used  in  medical facilities, automobiles, aircraft, and homes. 

The  filter  must  remove  99.97%  of  all particles  greater  than  0.3  micrometer  from the air that passes through.