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Critical Factors of Difficult-to-Ferment Juices and

Arrested Fermentations

Vidhya RamakrishnanFEBRUARY 15, 2018

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Factors Impacting Fermentations

Yeast Metabolism

Abiotic Temperature 

pH 

NutritionalMacronutrients‐ Nitrogen, phosphate

Micronutrients‐ Vitamins, minerals

Microbial

Competition for nutrients

Toxic compound production

Alteration of yeast metabolism

Stress

Osmotic, High Ethanol, 

Oxidative

Difficult to Ferment juices 

Problems arise even after maintaining good winemaking practices

Routine testing and nutrient supplementation of the must does not

fix the issue

Chronic problem

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Factors in Difficult Fermentations

Problematic Fermentations

Stress

Nutritional Imbalance

Influence of Microbial Load in the Must

Juice Composition Typical YAN levels in normal juices‐ >120 mg/L 

DTF juices have low YAN levels: < 80 mg/L

Typical Proline:Arginine ratio For non‐proline accumulating varieties‐ <2For proline accumulating varieties‐ <10   

DTF juices have a very high Pro:Arg ratios: >10, even as high as 80

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Juice Amendment Results

No significant improvement in fermentation with nitrogen 

amendment

This fermentation defect seen across multiple yeast strains

DTF juices

Metabolomic comparison of the 

yeast from normal and DTF juices

Nutritional composition analysis

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Ionic Levels in Juices

Ionic levels in juices measured by Atomic Absorption Spectroscopy‐ Calcium ions‐ Magnesium ions‐ Manganese ions‐ Potassium ions‐ Sodium ions‐ Zinc ions

By Chloridometer‐ Chloride ions

PC 2 (41%)

PC 1 (24%)

Ionic profiles varied by region 

and juice varietal

No obvious pattern observed 

differentiating easy and 

difficult to ferment juices 

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Effect of Nutritional Imbalance on Fermentations 

High proline

No/Low/high Biotin

Low Vitamins

Low Amino Acids

Total Nitrogen levels

Nutrient Study Results

Biotin deficiency had the most negative effect.

Biotin effectiveness decreases with decreasing nitrogen levels.

Vitamin deficiency negatively impacted the fermentation rates.

Minerals did not have a major impact.

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Biotin Deficiency and Nitrogen Levels

Excess NH4+ can be detrimental at no/low biotin concentrations

Summary of Effect of Combinatorial Nutritional Imbalance on Fermentations 

N = Normal, S = Sluggish

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Metabolomic Comparison of Normal and Problematic Fermentation

Yeast cells are harvested from normal and problematic fermentations

Metabolites are extracted and 

analyzed using GC‐MS‐TOF

The metabolite levels are 

compared using MetaboAnalyst

software

Pathways impacted in yeast from sluggish fermentations as compared to normal fermentations

Amino acid metabolism Biosynthesis of unsaturated fatty acids Butanoate metabolism Mannitol  Steroid metabolism Sugar metabolism TCA cycle

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Mannitol  

Sugar alcohol produced by plants and microbes. 

Functions Carbohydrate storage depot Osmoprotectant Scavenger of reactive oxygen species (ROS)

Effect of Oxidative Stress on Fermentation

H2O2H2O2 H2O2H2O2

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Intracellular Mannitol Accumulation

Conclusions from Juice Composition and Metabolomic Study

Low YAN levels is not the cause of the problematic fermentation

Oxidative stress results in mannitol accumulation in yeast 

High Pro:Arg ratio in the juice and mannitol accumulation in the 

yeast from these juices are signals suggesting stress in the vines  

Based on our study, nitrogen application was increased in the 

vineyard for the next few years. 

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Fermentation curves in DTF juice from consecutive vintages from the same vineyard after nitrogen application in the vineyard

Year 1

Year 2

Year 3

Impact of Bacteria in Must 

Study the effect of bacteria isolated from problematic fermentations 

on yeast 

Assess the ability of bacterial spent media to alter the yeast metabolic 

state [GAR+] ( has lower metabolic activity)

Study the effect of acetic acid and lactic acid produced by these 

bacteria on yeast metabolic state

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Bacteria from Problematic Fermentations Acetic acid and Lactic acid bacteria isolated classified into 3 groups:

Included strains of Acetobacter pasteurianus, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter oxydans, Lactobacillus kunkeii, Lactobacillus plantaram, Lactobacillus mali, Pediococcus damnosus.

• Inducing

• Inhibitory

• No effect

Both acetate and lactate levels produced vary across different genera

and within the same species. 

A. No Effect B. Inhibiting C. InducingYeast spots

Bacterial spots

Figure 1

Result from Spent Media Assay 

UCD 175 (Acetobacter pasteurianus) shows [GAR+] inducing 

phenotype in spent media assay.

1) Spent GGM media

2) GGM media

Spent media induction assay Grow bacteria in media Sterile filter  Inoculate yeast in spent media Screen on GGM plate

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Induction of [GAR+] prion state by acetic acidGGM plate

After Exposure to

No acetic acid

2% acetic acid

4% acetic acid

Different levels of acetic acid exposure elicit different metabolic response by yeast

Conclusions

Nitrogen supplementation using DAP should be done carefully taking into 

account the other potential limiting nutrients in the must. 

Oxidative stress results in mannitol accumulation in yeast. Chronic juice 

issues may reflect stress in the vineyard 

Effective and sufficient use of SO2 in the initial juice is important to 

alleviate bacterial impacts on yeast fermentations. 

Multiple factors in conjunction have a synergistic effect on yeast leading 

to problematic fermentation.

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Acknowledgements

V&E Department Staff 

American Vineyard Foundation (AVF)

Bisson lab

Thanks Linda!