cromatografia liquidachapitre_6_(hplc)[1]
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CHAPITRE
6
La chromato ra hie li uide haute
erformance HPLC
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1. Introduction5
70.09
0.1
2. Pompes8
10
0.06
0.07
0.08
2 7 3 n m
.
4. Colonnes et Phases
2
34 6
9
12 13
1411
0.04
0.05
A b s o r b a n c e a t
5. Détecteurs0.02
0.03
.
0
.
0 10 20 30 40 50 60
Retention Time (min)
Analysis of photodegradation products of metoclopramide solutions
‐. , . . .
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.
HPLC : phase mobile liquide
phase stationnaire très finement divisée
Injection de l’éluant sous des pressions de plusieurs centaines
e ars pour o ten r un t su sant.
Possibilit d agir de mani re tr s pr cise sur la s lectivit
entre les composés par le choix de la PS et de la composition
Exploitation des interactions soluté/PM/PS
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.
ompes m r ques conçues pour ma n en r un non
pulsé et stable.
2, 2, 2,…
nécessité de dégazer les solvants par ultrasons ou barbotage
d’hélium.
Eluant de composition fixe : mode isocratique 1 pompe
= ’
binaire, ternaire ou quaternaire selon le nombre de solvants
qu’elle peut mélanger
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solvant A solvant B solvant A solvant B
vanne
chambre de mélange pompe 1 pompe 2de débit
chambre de mélangepompe haute colonnepression
Gradient basse pression Gradient haute pression
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Pompe quaternaire
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.
n ect on rap e un vo ume pr c s vanne aute press on
plusieurs voies manuelle ou automatique
Fonctionnement en 2 temps :
•Chargement : communication entre pompe et colonne seulement, ntro uct on e c ant on press on atmosp r que a e une
seringue dans un petit volume tubulaire appelé boucle (nombreux choix
de volumes)
•Injection : insertion de l’échantillon dans le flux de PM par rotation de la
vanne
inversion du sens de circulation dans la boucleBonne reproductibilité des volumes si la boucle a été totalement
remplie par l’échantillon (volume prélevé de 5 à 10 fois > volume
boucle)
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Boucle d’injection reproductibilité du volume injecté
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.
o onne = u e ro , ca r , en ac er
Phase stationnaire maintenue entre 2 disques poreux situés à ses extrémités dont les volumes morts sont aussi faibles que possible
Tendance : réduction de la longueur et du diamètre interne
Diminution du débit jusqu’à quelques µL/min
onsomma on r u e uan
Meilleure résolutionPlus grande sensibilité
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Colonnes :
Type ID(mm)
Sample Load(approx.)
TypicalFlow Rate
RelativeSensitivity
Applications
Analytical 4.6 0.1 – 1.5 mg 0.5 ‐3 ml/min Standard separations
Solvent saver 3.0 150 ‐ 500 µg 0.3 ‐ 1.5 ml/min +Save solventStandard HPLC
instruments
Narrowbore 2.1 50 – 120 µg 0.1 ‐ 0.5 ml/min ++High sensitivityLimited sampleLC/MS
Microbore 1.0 10 ‐ 50 µg 10 ‐ 100 µL/min +++
Limited sampleLC/MS
Very high sensitivityCapillary 0.5 ‐ 0.3 1 ‐ 10 µg 1 ‐15 µl/min ++++ LC/MS
Peptides and proteins
Nano 0.1 ‐ 0.075 100 ‐ 200 n 200 ‐ 500 nl min +++++Very high sensitivityLC MS
Peptides and proteins
Semi‐prep 9.4 1 ‐ 10 mg 5 ‐ 10 ml/min mg preparative separation
‐ ‐
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Phases :• Chromato ra hie sur hase normale
• Chromatographie sur phase inverse• Chromatographie par paires d’ions• ’
• Chromatographie par exclusion stérique (cf chap 7)
• Chromatographie chirale
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•Type (monolithique, poreuse, non poreuse)
•Matériaux de base (silice, zircone, polymère,…)
•
et forme des particules,…)
, …
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Type
Majorité : particules poreuses de diamètre entre 3 et 10 µm’
à 400 m2/g).
L’espace inter‐particule permet des débits de 1 à 3 mL/min avec des pressions accep a es.
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≈ 1995 : introduction des particules sphériques non poreuses
But : augmenter l’efficacité
Mais : ‐ volume inter‐particule important élargissement des pics
‐ ↓ de la surface ↓ de la capacité de chargement
‐ ’
≈ 1990‐2000 :Colonnes monolithiques :
et mésopores de 20 à 500 Å
occupant 80% du volume de la
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‐
Alumine 6‐12
Zircone 7‐13
Polymères
(styrène/divinylbenzène)1‐13
Graphite poreux 1‐13
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Géométrie
Diamètre des particules
Uniformité des particulesTaille des pores
Particule sphérique de
silice macroporeuse
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Chimie de la silice
Très polaire par la présence des fonctions silanols séparation basée sur les coefficients d’adsorption
Hydrogen bonded vicinal silanol goups
Siloxanebonds
so a e
silanol goups
Geminal
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Modifications chimiques de la silice : les silices greffées
xat on e mo cu es organ ques sur es onct ons s ano s par es a sons covalentes ajustement de la polarité séparation basée sur les coefficients
de partage
monomérique
monoc oros ane
polymériquedi‐ ou trichlorosilane
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2 17 3
R = (CH2) 7CH3 octyl (C8)
= 2 3 6 5
R = (CH2)6C6H5 phenyl hexyl
R = CH NH amino ro l Bonded
R = (CH2)3CN cyanopropyl
R = (CH ) OCH CH(OH)CH OH diol
phases
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End‐capping
Silanisation secondaire avec du TMS désactivation des sites de
silanols restés libres
O
Si
Si
OH OH
soluté
OH
Augmentation du taux de couverture
Moins d’interactions solutés – silanolssoluté
XMoins d’interférences dans le processus
chromatographique
O
Si
O
Si
OO
OO
SiSi
SiSi
Moins de tailingMeilleure reproductibilité
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Chromatographie sur phase normale ‐ silice poreuse
SiO2
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Phase normale : mode d’interaction
Adsorption
Interactions polaires – ponts hydrogènes
Phase stationnaire polaire Phase mobile : solvants non ou peu polaires
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Chromatographie sur phase inverse
Partage entre PM et PS
Phase stationnaire apolaire Phase mobile : solvants polaires
SiO2
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Exemple RP – C18
Source : Thermo Fisher
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Reverse – phase avec 100% H2O comme PM ???
H O
MeCNMeCN
MeCN
MeCN
MeCN
MeCN
22
H2O
MeCN conditions normales
ex: H2O/ACN 50/50
conditions initiales
H O
H2O
H O
2
H2OH2O
H2O
H2O après 10 volumes de colonnede PM à 100% H2O
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everse – p ase avec 2
comme : so u on
« polar shielding »
MeCN
MeCN
H2OH2O
H2O H2O
MeCN
e
MeCNMeCN
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Phases greffées et interactions hydrophiles
HILIC modePeut être considérée comme une chromatographie en phase normale avec
une p ase mo e aqueuse‐organ queColonnes HILIC plus polaires que colonnes RP augmentation du % d’eau
dans la PM diminution de la rétention (inverse de la RP)
Séparation d’oligosaccharides par HILIC, variation du % eau de la PM
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Exemples : HILIC mode
Phase amino propyl
Mixte : RP, HILIC, échange anion faible suivant PM
Source : Phenomenex
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Phase cyano propyl
CN
CN
O
O
O
OVerapamil
Nicardipine
N
O
OCH3H3CO
ONifedipine
Source : Grace Davison
2
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Phase Zic HILIC
zwitterionic
Source : SeQuant
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C18 RP mode
NH RP mode
S.U. Bajad et al JCA, 1125 (2006) 76‐88
mo eO
C H 2O H
H
HO H
H O H
SiO2
HILIC modeN H 2H
O OO OH
Amide HILIC modeH H
NH2
NH2 HILIC modeO
N
N
OOPPP
OH OH
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Phase en graphite poreux :
Particules sphériques de carbone poreux
sorp on
Hydrophobesπ – π
Dipôles‐dipôles induits
Source Thermo Fisher
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Phase en graphite poreux :
Source Thermo Fisher
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Qualité HPLC pas de stabilisants, filtrés 0.45 µm, dégazés
Mode isocratique : un (mélange de) solvant(s)Mode gradient : variation de la composition durant l’élution
Phase normale : solvant peu ou non polaire (Hexane, CH2Cl2)Phase inverse : solvant polaire (H2O, MeOH, ACN)
Modification de la polarité de la PM
modification du coefficient de distribution K (CS/CM) modification du facteur de rétention k
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4 types d’interactions entre molécules de solvant et de soluté :• ionique (quand soluté et solvant ont des moments dipolaires)• de dispersion (due à l’attraction entre elles des molécules voisines)• diélectriques (favorisent la dissolution des solutés ioniques dans les
so van s po a res• par ponts H (entre donneur et accepteur de protons)
Solvant Indice de
polarité
Densité
(g/ml)
Limite UV
(nm)
Indice de
réfraction
Pt
d’ébullition
(°C)
Eau 10 1 190 1.333 100
Méthanol 5.1 0.791 205 1.326 65
Acétonitrile 5.8 0.786 190 1.341 82
Isopropanol 3.9 0.785 210 1.384 82
Tetrahydrofurane
. .
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Solvent properties and miscibility
Source Thermo Fisher
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2
Analyse sur RP18 avec différents mélanges CH3CN/H20
Débit : 1 ml/min
100 % ACN 40 % ACN
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PP + NBPP + NB
80 % ACN
sec. sec.
PP
NB
PP + NB
sec.sec.
60 % ACN 20 % ACN
PP
PPNB
sec. sec.
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Elution à gradient :
Utilisée quand l’élution isocratique ne permet pas une bonne séparation
ou que la séparation est trop longue
Gradient : changement continu de la phase mobile pendant la séparation
Séparation d’un mélange
’
a) Isocratique : ACN/H20 50/50
b) Isocratique : ACN/H20 70/30
c) Gradient : 30 à 85 % d’ACN
en 7 minutes
ffé f l d d
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Différents profils de gradient
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Elution à gradient : effet du profil de gradient
Choix d’une colonne HPLC
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Choix d une colonne HPLC
organicsoluble
MW < 2000
a ueoussoluble
organicsoluble
>
aqueousso u e
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hexane
organic
soluble
methanolmethanol/H2O
acetonitrile
acetonitrile/H Osoluble
MW < 2000soluble
non‐ionicaqueoussoluble
ionic
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normal phase
hexanesoluble
adsorption
normal phasebonded
reversed phaseorganicsoluble methanol
reversed phaseMW < 2000
2
acetonitrileacetonitrile/H2O
THF
gel permeationGPC
soluble
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non‐ionicreverse p ase
bonded
MW < 2000
aqueous reversed phaseon e
using ionization control
ionic reversed phasebonded
us ng on‐pa r ng
ion exchange
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organicsoluble
gel‐permeation
MW > 2000
gel‐filtration
aqueoussoluble
ion‐exchange modewith wide pore material
reverse phase modewith wide pore material
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Chromatographie par paires d’ions
Objectif : améliorer la séparation de composés ioniques ou très polaires qui ont
’
Nécessité d’augmenter la rétention diminution de leur caractère ionique
Solutions :
Modifier le pH
Ajouter à la PM un composé porteur à la fois d’une chaîne carbonée et d’un
groupement de charge opposée à celle du composé à séparer
Création d’une paire d’ions globalement neutre, stable et lipophile qui sera
Soluté ionisé Paire d’ions
(acides) A
‐
+
R
+↔
A
‐
R
+
(bases) BH+ + R
‐↔ BH
+R‐
Soluté hydrophile Paire d’ions hydrophobe
= agen pa ran
Moins retenu en RP Mieux retenue en RP
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Soit un soluté acide ionisé A‐ pairé par R+.
La aire d’ions formée en solution est retenue ar la colonne l’é uilibre de
rétention du soluté est décrit par :
A‐R+ (phase mobile) ↔ A‐R+ (phase stationnaire)
La rétention dépend de :
1) la fraction des molécules de soluté A dans la PM (déterminée par le pH de
2) la concentration de l’agent pairant et sa tendance à former une paired’ions
3) la valeur de k (facteur de rétention ou de capacité) de la paire d’ions A‐R+
Agents pairant typiques :
• Alkylsulfonates (R‐SO3‐), acides carboxyliques (TFA,…), BF4
‐, ClO4‐, …)
• Sels de tetraalkylammonium (R4N+)
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X : principe actif, base forte
X1, X2, X3 : produits de dégradation de X, bases fortes
B et HP : acide benzoïque et acide hydroxybenzoïque, produits de dégradation de MP et PP
Conditions chromatographiques :
a e ac a e, p = .
b) 45% MeOH/55% acétate + 65 mM octane sulfonate
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Chromatographie chirale (énantiosélective)
Pourquoi?
Propriétés pharmacologiques des stéréoisomères parfois très différentes.
Exemple: stéréosélectivité dans l’action des médicaments.
Principe :
proportionnelles à l’abondance de chacune des deux formes.Formation de complexes diastéréomères réversibles entre les 2 énantiomères et un
agent complexant chiral (sélecteur chiral, CS)
(R)‐X + (R)‐CS ↔ (R)‐X…(R)‐CS et (S)‐X + (S)‐CS ↔ (S)‐X…(S)‐CS
Deux méthodes :
•PS chirale
• + a c ra
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Phase mobile avec sélecteur chiral
PS classique en phase inverse ou en phase normale
PM contenant un additif chiral en concentration appropriée
Établissement d’équilibres multiples :
Formation de complexes entre sélecteur (R)‐CS et énantiomères (R)‐X et(S)‐X dans la PM (cst d’association)
Distribution des énantiomères (R)‐X et (S)‐X entre PM et PS (cst de
distribution
Distribution des complexes X…
CS entre PM et PS (cst de distribution)
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Phase stationnaire chirale
Moyen le plus simple et le plus pratique pour les séparations d’énantiomères.Le sélecteur chiral est lié de préférence par liaison covalente (alternativement par
forte adsorption physique) au support de la PS, habituellement des particules de
silice poreuse.
Pendant la migration de l’échantillon dans la colonne, les énantiomères sont
retenus par association avec le sélecteur de la PS. Des complexes
as r os som res se ormen ans a . eur va eur e es su sammen
différente, leur séparation est possible.Nécessité d’une PS chirale qui interagisse plus fortement avec un des deux
énantiomère.
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Mécanismes de la reconnaissance chirale
Modèle à « 3 points » : nécessité d’avoir au moins 3 points d’interaction pour qu’un sélecteur chiral puisse distinguer 2 énantiomères (règle de Dagliesh)
•Complémentarité de taille et de forme entre analyte et sélecteur chiral
•Interactions intermoléculaires non‐covalentes (principalement électrostatiques) :
Interactions ioniques
Ponts hydrogène
on‐ p e, p e‐ p e, …
Interactions π‐π
…
•Si le sélecteur et l’analyte possèdent des régions hydrophobes correspondantes,
liaison par interactions hydrophobes
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Exemples de phases stationnaires chirales
• Sélecteurs macromoléculaires d’origine semi‐synthétique (polysaccharides)• Sélecteurs macromoléculaires d’origine synthétique (poly(met)acrylamide)
• Sélecteurs macromoléculaires d’origine naturelle (protéines)
• Sélecteurs oligomériques macrocycliques ou de taille intermédiaire (cyclodextrines)
• Entités ioniques synthétiques de faible poids moléculaire pour échange
ioni ue
• Sélecteurs chélatants pour échange de ligand chiral
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= enchaînements cycliques de 5 à 7 molécules de glucose greffées par
l’intermédiaire d’un « bras » de quelques atomes de carbone sur la PS.
De forme cylindrique, elles présentent une cavité hydrophobe tandis que la
paroi externe est hydrophile.
Inclusion sélective de composés qui forment à la surface de la phase
chirale des complexes diastéréoisomères réversibles
α‐cyclodextrine
Fast HPLC
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Fast HPLC
Tendance : séparations très rapides, de moins d’une minute pour les échantillons
Une fois optimisées les valeurs de k et de α (optimisation de la capacité et de la
sélectivité), la résolution et le temps d’analyse ne dépendent plus que de N.
Les conditions qui favorisent les séparations rapides incluent l’utilisation de petites
particules, de colonnes plus courtes et de débits plus importants.
’ ’
l’utilisation de •Ultra‐haute pression = UPLC ou UHPLC (> 6000 psi ou 400 bar)
•Température plus élevée = HT‐HPLC
•Particules spéciales
UPLC ‐ UHPLC
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vo u on es a es e par cu es
10 min
Late 1960’s
40μm pellicular non‐porous coated
m n‐ ‐
5,000 plates/meterEarly
1970’s10μm Irregular micro‐porous1000‐2500 si 70‐180 bar
10 min
40,000 plates/meter
1980’s to present day
3.5 ‐ 5μm spherical micro‐porous1500‐4000 psi (110‐280 bar)80,000 ‐ 115,000 plates/meter
Exemples de PS utilisées en UHPLC
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Exemples de PS utilisées en UHPLC
C18— Trifunctionally Bonded C18— ropr e ary n capp ng— Widest pH range
— Trifunctionally Bonded C8— Proprietary Endcapping—
Shield RP18—
— Embedded polar group
Phen l— Trifunctionally Bonded C6 Phenyl— Proprietary Endcapping
Le challenge de la courbe de Van Deemter
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Le challenge de la courbe de Van Deemter
( )u C C u
B AH
M S +++=
Particule = élément central de la
Plus petites particules meilleures séparations sur de plus grandes
plages de vélocités
augmentation de la vitesse et de
Exemples
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Source Thermo Fisher
Séparation en gradient UHPLC d’une digestion à la trypsine d’albumine de serum bovin.
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HT ‐ HPLC
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Augmentation de la température :
, équivalent à une augmentation de la pression (cf UHPLC)
• Augmentation du coefficient de diffusion du soluté • même efficacité à un débit plus élevé et un temps d’analyse plus court
• efficacité améliorée à temps d’analyse égal
Inconvénients
°
• Possibilité de gradients de t°dans la colonne manque d’uniformité de la t°
• Instabilité des colonnes
• Diminution de la sélectivité
« me eure » emp ra ure = comprom s en re max e αmax
B =
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=ugmen a on e a emp ra ure : u
C quand T
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.
L’analyse par chromatographie a principalement pour but de repérer la
présence ou de doser un composé présent pour lequel on a choisi un
détecteur bien adapté.
ua s u ec eur :•Sensibilité•Bruit négligeable
•Réponse indépendante des variations des paramètres d’utilisation(pression, température, débit, composition de la phase mobile)
•Non‐destructif •Stable au cours du temps
••Grande vitesse de réponse
Modes de détection les plus courants basés sur les propriétés optiques
des composés : absorption, fluorescence, indice de réfraction
Limites de détection et de uantification
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LOD = plus petite concentration d’un analyte détectable (pas nécessairement quantifiable)
LOQ = plus petite concentration d’un analyte quantifiable avec une
précision et une justesse acceptables
Rapport signal sur bruit (S/N)
LOD S/N = 3
LOQ S/N = 10
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Detector Relative
sensitivity
Useful with
gradient
T°sensitivity Analytes
Yes Presence of Specific IR bands
Refractive
Index
+ No High Universal
Conductivity ++ No Moderate Charged compounds
UV‐Vis +++ Yes Presence of chromo hores
ELSD +++ Yes Universal
‐
Fluorescence ++++ Yes Fluorophore
++++ es n versa wselective detection possible
Détecteur à indice de réfraction
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Un faisceau lumineux (mono‐ ou polychromatique) passe à travers une cellule à
deux compartiments dont l’un est rempli avec la PM seule et l’autre avec la PM
sortant de la colonne. La différence d’indice de réfraction entre les deux li uides
qui apparaît lorsqu’un analyte est mélangé à la PM provoque un déplacement
angulaire du rayon diffracté.
Le RI est utile dans le cas de composés qui ne possèdent pas de chromophores
’, , ,
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, , ,
(conductimètre)Généralement utilisé en conjonction avec une autre technique de détection
Applications : Sucres, Alcools, Lipides, Polymères,…
Avantages
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•Réponse « universelle »
Détecte tout ce qui se trouve en solution.
Sauf si l’analyte a exactement le même RI que la phase mobile
•Utilisation facile
•Peu de paramètres
•Très robuste
•Peu sensible à l’encrassement et aux “bulles”
Désavantages
•Faible sensibilité
•Absence de sélectivité
• ens e aux c angemen s e , emp ra ure e v scos
•Pas d’utilisation de gradients
Détecteur spectrophotométrique UV‐Visible :
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Mesure la perte d’intensité de lumière UV ou Vis. lors du passage dans une solution
Détection basée sur la loi de Lambert‐Beer (A = εlC) : l’absorbance A de la
phase mobile est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde λ ou
’ ’ .
‐ , , .
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La sensibilité optimale est obtenue en utilisant le détecteur à la longueur d’onde où l’absorbance du composé d’intérêt est la plus grande (λ )
Le détecteur UV/Vis est le plus répandu en HPLC
Bien u’a ant des limitations articulièrement our les com osés ui ne possèdent pas de chromophore UV), il possède la meilleure combinaison
de :
•Linéarité•Gamme dynamique• o us esse•Facilité d’utilisation
’ composés.
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• Très robuste• Facilité d’utilisation
• Compatible avec les gradients
• Non‐destructif
• • ~70% des publications HPLC utilisent un UV/Vis.
Désavantages
• Pas universel
• Pas aussi sélectif que d’autres techniques (Fluo, MS, ECD)
• Détection affectée par la composition de la phase mobile
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Détecteur à barrette de diodes (PDA ou DAD)
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Soit :
‐Changement de longueur d’onde en cours d’analyse
‐ ’ ’ simultanément
‐Enregistrement de l’absorbance sur tout un domaine de longueurs
d’onde
Absorbance en 3D
Enregistre l’absorbance sur tout le spectre UV Vis
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Enregistre l absorbance sur tout le spectre UV‐Vis
Permet la création de bibliothèques spectrales
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Le PDA acquiert un spectre par unité de temps en fonction de la vitesse
d’acquisition du détecteur
Le spectre acquis au sommet du pic est considéré comme référence
L’algorithme de pureté de pic analyse tous les spectres d’un pic par rapport
au s ectre de référence
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• Détection “universelle” UV‐Vis• Bonne Sélectivité
• Gamme dynamique
• Spectres UV‐Vis des pics
Bibliothèques
• Estimation de la pureté d’un pic
Désavantages
• o ns sens e que c ass que
• Complexe
• Plus de bruit qu’un détecteur UV classique
• Composés de même famille possèdent le même spectre
Caractéristiques de quelques chromophores :
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Source Thermo Fisher
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Source Thermo Fisher
Détecteur spectrofluorimétrique
Les composés fluorescents réémettent sous forme de lumière tout ou une
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Les composés fluorescents réémettent sous forme de lumière tout ou une
partie du rayonnement de la source lumineuse auquel ils sont soumis.
L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’analyte.
Lampe au deuterium ou au xenonλ d’excitation sélectionnée par un filtre ou un monochromateur
Isolement de la λ d’émission ar un second filtre ou monochromateur
λ d’émission dirigée vers le photodétecteur
a ec on par uorescence a eu quan une mo cu e a sor e e a
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lumière, atteignant ainsi un niveau d’énergie plus élevé (excitation).’
perdue est émise sous forme de lumière (émission) – La molécule
fluoresce.
Le FL enregistre à la fois les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, ce
qui donne lieu à de très grandes sélectivité et sensibilité .
es ongueurs on e son sp c ques c aque compos uorescen .
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• Sensibilité 10 à 1000x lus sensible u’un UV
Recherche de « traces »• Sélectivité
• Faible bruit de fond• Technique simple et nondestructive
Désavantages
• Peu de composés fluorescents• Besoin de dérivatiser les analytes• Reproductibilité inter‐labo
• Réponse dépend de T°, pH, viscosité, polarité solvant• Les λEx et λEm peuvent varier
• N cessite p usieurs scans pour trouver es va eurs optima es
Détecteur électrochimique (ampérométrique)
Les composés pouvant être réduits ou oxydés en présence d’un potentiel
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électrique peuvent être détectés à de très faibles concentrations par des mesures électrochimi ues sélectives.
Potentiel constant variation du courant
Détecteur conductimétrique
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Mesure le changement de conductivité électrique due à la présence d'un soluté dans la phase mobile (de façon absolue ou différentielle).
Avantage: détecteur utilisé pour solutés ioniques.Inconvénient: sensibilité très grande à la température.
Détecteur ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)
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Evaporation de la PM suivie de la mesure de la lumière diffusée par les particules d’analyte non volatile.
Utile pour tous les solutés ayant une volatilité plus faible que la PM.
L’intensité de la lumière diffusée dépend de la taille des particules
d’analyte.
3 étapes :
• Nébulisation : effluent transformé en aérosol
É
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• Évaporation : la partie volatile de l’effluent est éliminée (solvants), les
‐
• Détection : les particules interceptent un rayon de lumière, l’intensité
de lumière diffractée est ro ortionnelle à la uantité de articules détectées
Source : Grace
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• Détecte les composés qui n’absorbent pas en UV‐Vis.• eu re u s avec es so van s qu a sor en eaucoup en .• Utilisation de gradients (avantage sur RI).• Possibilité de varier la T°de nébulisation pour optimiser la détection.
• Applications : Sucres, Polymères, Triglycérides
Désavantages
• Pas de tampons/additifs non‐volatils• Techni ue destructive.• Besoin de gaz de nébulisation (habituellement N2).• TOUS les ELSD sont non‐linéaires.• ’ .
Détecteur de masse
O i i i d dé d ill l’UPLC
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Optimisation des détecteurs de masse pour travailler avec l’UPLC’
Vitesses de changement de mode d’ionisation minimisés
• ESI +• ESI –
• APCI +
• APCI ‐
Dwell times minimisés
Simple et triple quadrupôle
Temps de vol (TOF, QTOF)
r nc paux ec eurs u s s
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.
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rug scovery
Préformulation
Pharmacocinétique et métabolisme
Développement process
Développement formulation
…