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COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.

Rev. No.: 0 FECHA: 2011-03-28 CLAVE: CCAYAC-P-062

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Exactitud relativa recuperacin:

Es la aproximacin entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para elpropsito de esta gua, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad demicroorganismo inoculado o nivel de fortificacin.

Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana sehace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con ciertaseguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentracin microbiana.

Fortificacin de la muestra. Inoculacin de una cantidad conocida del o los microorganismos deprueba.

Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza ladispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando.

Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en elcual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperacin.

Lmite de deteccin: Es el numero ms pequeo de microorganismos en una muestra que puedeser detectado bajo las condiciones de anlisis. El limite microbiolgico de una prueba determina lapresencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g demuestra.

Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.Mtodo Normalizado: Proceso de medicin robusto donde pequeas variaciones en elprocedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados.Mtodos internacionalmente aceptados y validados.

Nivel de fortificacin o tamao del inculo: Es la cantidad conocida de microorganismosinoculados a una muestra.

Protocolo para la evaluacin del desempeo: Documento que describe los pasos a seguirdurante la evaluacin del desempeo de un mtodo analtico microbiolgico, cuyo fundamento seencuentra descrito en el presente documento.

Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecucin dela prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente ensituaciones normales.

Evaluacin del desempeo: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que unmtodo normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condicionesparticulares del laboratorio. Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que un

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mtodo analtico validado internacionalmente cumple con su propsito en las condiciones

particulares del laboratorio donde se realiza el anlisis.

Repetibilidad: Esel grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidospor la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la misma matriz,en las mismas condiciones de anlisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortosde tiempo.

Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individualesobtenidos por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de lamisma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medicin (personal) y en diferentestiempos (o a intervalos de tiempos ms largos).

4 DOCUMENTOS APLICABLES4.1 USP 32, Validation of Alternative Microbiological Methods.

4.2 USP 32, Validation of Compendial Procedures

4.3 USP 32, Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles

4.4 Dulce Toccheto S. Curso-terico-prctico Validacin de Mtodos Microbiolgicos bajo un

Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia. Proyecto TCC/Bolivia-Mxico. 2007.

4.5 European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiologicallaboratories. 2002.

4.6 G.A. Leotta, I. Chinen. Validacin de una tcnica de PCR mltiple para la deteccin deEscherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiologa. Vol.37, No. 12005.

4.7 Gua de Validacin de Mtodos Analticos. Colegio Nacional de Qumicos FarmacuticosBilogos de Mxico, A.C. Edicin 2002.

4.8 ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animalfeeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.

4.9 ISO/TR 13843:2000 - Water Quality Guidance on Validation of Microbiological methods.First Edition.

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4.10 ISO 17994:2004 Water QualityCriteria for Establishing Equivalence between Microbiological

methods. First Edition.

4.11 The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation andRelated Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf(febrero 2011)

4.12 Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods CommitteeGuidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methodsof Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf (febrero 2011)

5 DESCRIPCIN DE LA ACTIVIDAD.5.1 Estrategia para la evaluacin del desempeo de los mtodos de prueba

microbiolgicos.

Para cada mtodo de prueba a evaluar se deber contar con protocolo para la evaluacin deldesempeo particular que describa el mtodo a evaluar, la estrategia particular de evaluacin,los materiales y reactivos y las especificaciones.

Durante la ejecucin del protocolo de evaluacin se debern documentar las actividades y los

resultados.

Verificar que todos los materiales, medios y reactivos cumplen con los criterios de calidadconforme se establece en el sistema de gestin de calidad y conforme a la NMX-EC-17025-IMNC-2006. Antes de cada validacin deber comprobarse que el equipo utilizado, cumple conel calendario de mantenimiento y/o calibracin de cada laboratorio.

Con base en el protocolo de evaluacin se deber verificar que se cuenta con todos losmateriales y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y losanalistas que participaran en la evaluacin del desempeo.

La preparacin del inculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de laevaluacin del desempeo del mtodo.

5.2 Seleccin y obtencin de la matriz.Los criterios de seleccin de la matriz se debern describir en el protocolo para la evaluacindel desempeo de cada mtodo, considerando los siguientes lineamientos:

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Se debern elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la metodologa

a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ella para conocer sumicrobiota. Se deber contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos losanlisis. Las matrices elegidas y su justificacin deben mencionarse en el protocolo devalidacin.

Cuando el mtodo analtico a ser verificado se destina al anlisis de varios tipos dealimentos, la matriz se escoge con base al cuadro de categoras que aparece en la ISO16140, y ser aquella donde se esperan las mayores dificultades para la recuperacindel microorganismo de prueba con respecto de las matrices ms analizadas en ellaboratorio.

5.3 Preparacin del inculo5.3.1 Determinacin de la concentracin de la cuenta bacteriana en la Fase estacionaria.

Este procedimiento es general y adecuado para la mayora de los microorganismos de prueba,pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inculos constantes.

Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml decaldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h,(este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo demicroorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a

35C +/- 2C, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una deellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estndar,incubar a 35C +/- 2C, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilucin para conocer laconcentracin de microorganismos.

Registrar los resultados indicando la concentracin de microorganismos en cada dilucin. Estosresultados servirn de referencia para la estimacin de la dilucin adecuada a utilizar durante lafortificacin de las muestras en la evaluacin del desempeo del mtodo de prueba.

Antes de cada prueba deber repetirse la preparacin del inculo de forma idntica que en ladeterminacin de concentracin de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inculo

deber ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubacin, volumen necesario que lleve la concentracinmicrobiana, para fortificar cada una de las alcuotas de acuerdo al protocolo de evaluacin de desempeo del mtodo enparticular. Durante su manipulacin se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fra.Nota 2: Cuando la matriz sea slida, fortificar las alcuotas. Si es lquida se puede fortificar la matriz completa o las alcuotas.

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5.4 Preparacin de muestrasRegistrar la muestra con la siguiente informacin:

Fecha y hora de muestreo, Tipo de muestra, Procedencia lugar de muestreo, Cantidad.

Homogeneizar perfectamente y separar la muestra que se utilizar para el anlisis. Si esperecedera, el sobrante se debe guardar en refrigeracin. Se recomienda iniciar el anlisisinmediatamente.

5.4.1 Fortificacin de la muestra.En condiciones aspticas dividir la muestra cuantitativamente siguiendo el mtodo de prueba.Inocular la muestra con una concentracin conocida del microorganismo de prueba.

5.5 MTODOS CUALITATIVOS.5.5.1 Criterios de Aceptacin

Parmetro Criterio de aceptacin

Lmite de deteccinDemostrar que el mtodo es capaz de recuperarmenos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de lasrepeticiones.

RepetibilidadNo ms del 20 % de las repeticiones con

resultados negativos al inocular menos de 5 UFC

ReproducibilidadInoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienenresultados negativos en no ms del 20 % cuando

realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

IncertidumbreMencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a

las mediciones.

5.5.2 Lmite de deteccinDemostrar que el mtodo es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % delas repeticiones.

Microorganismo de Prueba: Utilizar al menos aquellos microorganismos indicados comocontrol positivo en el mtodo de prueba, el tamao del inculo deber ser menor de 5 UFC.

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Matriz seleccionada: Verificar por sextuplicado la ausencia del microorganismo de prueba.

Repeticiones: 30 repeticiones.

Clculos:

Ejemplo:

Se desea validar el mtodo para aislamiento de un patgeno; para la determinacin del lmitede deteccin deber prepararse un inculo de menos de 5 UFC del patgeno.

Al realizar la estimacin de la curva microbiana se determina que en la dilucin 10 -7, se obtienen150 UFC/mL. Antes de la prueba deber preparar un inculo fresco, y realizar dilucionesdecimales hasta 10-9, a partir de esa dilucin transferir dos mililitros a cada una de las 30porciones de muestra. En paralelo verificar el inculo, transfiriendo 1 mililitro de la suspensin a6 cajas de Petri.

Para la verificacin del inculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los clculos paradeterminar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es vlida si se

inoculan menos de 5 UFC.

Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el mtodo de prueba. Registrar losresultados de ausencia y presencia.

Ausencia. 5Presencia 25

Entonces:

83.33%Lectura10030

25Lectura ==

Conclusin:Se cumple con el criterio de aceptacin

100esrepeticiondeNo.

positivosdeNo.Lectura =

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5.5.3 RepetibilidadLos resultados de mtodos cualitativos se registran comnmente como positivo negativo presencia-ausencia por lo que la repetibilidad se calcula utilizando los datos obtenidos en laprueba de limite de deteccin. El criterio de aceptacin es igual o menor al 20%.

Ejemplo:

Usando los datos del ejemplo de lmite de deteccin.

Supongamos que:

Ausencia 5Presencia 25

Entonces:

Lectura =5

30100 Lectura =16.66%

Conclusin:Se cumple con el criterio de aceptacin

5.5.4 ReproducibilidadInoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

Las repeticiones debern suceder en momentos diferentes.Ejemplo:

Analista UnoAusencia: 1Presencia: 9

Lectura =1

10100 Lectura =10%

Cumple elcriterio de

repetibilidadSe cumple el

criterio dereproducibilidadAnalista Dos

Ausencia: 2Presencia: 8 Lectura=

2

10

100

Lectura=

20%

Cumple el

criterio derepetibilidad

5.5.5 Incertidumbre del mtodo Microbiolgico (Eurachem:2002)El concepto de incertidumbre no puede ser aplicado directamente a resultados cualitativos enpruebas microbiolgicas por lo que solo se mencionan las siguientes:

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Fuentes de IncertidumbreDistribucin de los microorganismos en la muestra;Efecto de la matriz;Personal operativo;Mediciones (pesada o medicin de la muestra);Diluciones y volmenes;Homogeneizacin;Calidad de los medios;Tiempo hasta la inoculacin;Temperatura de incubacin;

5.6 MTODOS CUANTITATIVOS.Parmetro Criterio de aceptacin

Repetibilidad r < 30 %

Reproducibilidad R < 30 %

Recuperacin Entre el 90% y el 110% log

SesgoLa diferencia absoluta

de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

Incertidumbrea) Especificar el mensurando.b) Identificar las fuentes de incertidumbre

5.6.1 Seleccin de MatricesMuestras naturalmente contaminadas. Para evaluar la capacidad de un mtodo pararecuperar de forma consistente un microorganismo o grupo de microorganismos de inters, esimportante contar con muestras naturalmente contaminadas, estas debern de sercomprobadas por el mtodo de prueba por duplicado. Estas muestras debern ser utilizadaspara la comparacin de muestras.

Muestras no contaminadas. Se debe contar con matrices no contaminadas, es decir, que nocuenten con el microorganismo de inters (en algunos casos pueden producirse artificialmentemediante esterilizacin).Se deber comprobar usando el mtodo de prueba por duplicado.

Los resultados de las matrices debern registrarse e incluirse en el informe de validacin.

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5.6.2 Repetibilidad.La determinacin de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre losresultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismascondiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo.

Analito: Usar una cepa del microorganismo de inters asociado a la prueba.Nmero de repeticiones: 30 (a excepcin NMP 10 repeticiones)Nivel de fortificacin: 1 nivel (valor medio)

5.6.2.1 Muestras no contaminadas.Fortificacin de la muestra. Inocular una concentracin conocida de microorganismos tal que alconcluir el anlisis se recuperen cuentas de aproximadamente el valor medio del intervalo delectura.

5.6.2.2 Muestras naturalmente contaminadas.Verificar por duplicado la concentracin de los microorganismos.

Ejemplo

Cuando el mtodo de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC,se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 ml de cada dilucin por placa. El inculo en la muestradebe ser tal que despus del mtodo de anlisis se recuperen aproximadamente 80 UFC

Lmite Inferior log(25) La diferenciaentre log(250) y log(25)

Diferenciaentre 2

log(25) + 0.5 UFC

25 1.40

Lmite Superior log(250)1 0.5 1.90 79

250 2.40

Lmite Inferior log(15) La diferenciaentre log(150) y log(15)

Diferenciaentre 2

log(15) + 0.5 UFC

15 1.18

Lmite Superior log(150)1 0.5 1.68 47

150 2.18

Si se considera que se realizar una sola dilucin entonces la concentracin del microorganismoen la dilucin 10-1 deber ser de aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamaode la muestra es de 25 g entonces se deberan inocular aproximadamente 2000 UFC

Nota 3: Todos los inculos deben ser verificados utilizando la tcnica de vaciado en placa,empleando para el clculo 6 cajas.

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DesarrolloPartiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas,proceder como se indica en el mtodo de prueba.

ClculosCalcular el log de las UFC contadas por placa en cada repeticin

A B C D E

1 Repeticin Placa 1 Placa 2 log(Placa 1) log(Placa 2)

2 Repeticin 1 70 UFC 90 UFC 1.85 1.95









Excel texto # "UFC" # "UFC" =LOG(B2) =LOG(C2)

Calcular la desviacin estndar relativa (DSR) y elevar al cuadrado

D E F G H I1 log(Placa 1) log(Placa 2) Desviacin Estndar MEDIA DSR DSR22 1.85 1.95 0.077 1.900 0.0406 0.0016513 1.85 1.96 0.076 1.905 0.0400 0.0016004 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000 0.0000005 1.88 1.91 0.023 1.897 0.0123 0.0001516 1.89 1.91 0.015 1.903 0.0081 0.0000657 1.89 1.94 0.041 1.915 0.0214 0.0004588 1.75 1.90 0.110 p1.826 0.0600 0.003600

9 1.94 1.90 0.026 1.921 0.0134 0.00018010 1.89 1.93 0.034 1.910 0.0178 0.000316

Excel =LOG(B2) =LOG(C2) =DESVEST(D2:F:2) =PROMEDIO(D2:E2) =(F2/G2) =H2^2

Calcular la media cuadrtica de la DSR usando la siguiente frmula

RSDA =RDS12 +RDS22 +...+RDSn2

n

RSD =s

x

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Para determinar la repetibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribucin

normal de Z con 95% de confianza.

Repetibilidad (r)= 2.8 X RSD de repetibilidad

I J KDSR2 DSR(a) r

0.001651

0.0299 0.0836

0.0016000.0000000.0001510.0000650.0004580.0036000.0001800.000316"=H2^2 "=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10))) "=J2*2.28

5.6.3 ReproducibilidadLa determinacin de la reproducibilidad (R) sirve para verificar el grado de concordancia entrelos resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por diferentes analistas, en lasmismas condiciones, en la misma muestra, en diferentes tiempos.

Desarrollo.

Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentesprocedern como se describi para repetibilidad hasta el clculo del cuadrado de la DSR

Ejemplo:

A B C D E F G H I

1 AnalistaRepeticin Placa 1 Placa 2

Log(Placa 1)

Log(Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2

2

A

Repeticin 1 79 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.004 1.900 0.0020 0.000004

3 Repeticin 2 60 UFC 67 UFC 1.78 1.83 0.034 1.802 0.0188 0.000354








11 AnalistaRepeticin Placa 1 Placa 2

Log(Placa 1)

Log(Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2

12

B

Repeticin 1 70 UFC 79 UFC 1.85 1.90 0.037 1.871 0.0198 0.000394









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Calcular la media cuadrtica utilizando la siguiente frmula:

RSDAB =RDS12 +RDS22 +...+RDSn2

n

Para determinar la reproducibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de ladistribucin normal de Z con 95% de confianza.

Reproducibilidad (R) = 2.8 X RSDI J K

1 DSR2 DSR(ab) R2 0.000004

0.0309 0.0865

3 0.0003544 0.0003165 0.000246

6 0.0015117 0.0017038 0.0000389 0.00000010 0.00010011 DSR212 0.00039413 0.00028914 0.00003815 0.00024616 0.00151117 0.001703

18 0.00003819 0.00000020 0.000100

J K

"=RAIZ((SUMA(I2:I10,I12:I20)/CONTAR(I2:I10,I12:I20))) "=J2*2.28

5.6.4 RecuperacinEs la cantidad de UFC que el mtodo de prueba es capaz de recuperar cuando es inoculado unnumero conocido de microorganismos.

Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC,en cada repeticin y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular ellogaritmo del inculo verificado.

Finalmente calcular el % de recuperacin

% Recuperacin= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100Logaritmo de las UFC inoculadas

A B C D E F G H I J1 Analista Repeticin Placa 1 Placa 2 Cuenta log(Cuenta ) Media (log(Cuenta )) Inculo log (Inculo) % Recuperacin2

A

Repeticin 1 79 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90

1.89 80 UFC 1.90 99%

3 Repeticin 2 60 UFC 67 UFC 64 UFC 1.804 Repeticin 3 77 UFC 86 UFC 82 UFC 1.915 Repeticin 4 77 UFC 70 UFC 74 UFC 1.876 Repeticin 5 89 UFC 70 UFC 80 UFC 1.907 Repeticin 6 69 UFC 89 UFC 79 UFC 1.908 Repeticin 7 77 UFC 80 UFC 79 UFC 1.899 Repeticin 8 80 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90

10 Repeticin 9 78 UFC 83 UFC 81 UFC 1.91

=PROMEDIO(B2:C2) =LOG(E2) =PROMEDIO(F2:F10) "=LOG(H2) "=G2/I2

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5.6.5 SesgoEl sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenidoexperimentalmente.

A partir de los clculos de recuperacin, calcular el valor absoluto de la diferencia de la mediade los logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inculo utilizado.

Sesgo= JDonde Ve= valor esperado

Vo= valor obtenido5.6.6 Incertidumbre.Especificar el mensurando.Identificar las fuentes de incertidumbre

5.7 Criterios de aceptacin para la evaluacin de mtodos microbiolgicos.Cuantitativos

Parmetro Criterio de aceptacinRepetibilidad r < 30 %

Reproducibilidad R < 30 %Recuperacin Entre el 90% y el 110% log

SesgoLa diferencia absoluta

de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

Incertidumbrea) Especificar el mensurando.b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Cualitativos

Parmetro Criterio de aceptacin

Lmite de deteccinDemostrar que el mtodo es capaz de recuperarmenos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de lasrepeticiones.

RepetibilidadNo ms del 20 % de las repeticiones con

resultados negativos al inocular menos de 5 UFC

ReproducibilidadInoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienenresultados negativos menores o iguales al 20 %

cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

IncertidumbreMencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a

las mediciones.

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5.8 Elaboracin del protocoloElaborar un protocolo de validacin que incluya lo siguiente:

TtuloProtocolo para la evaluacin del desempeo del mtodo: el nombre y clavedel mtodo que se pretende evaluar.

1.ObjetivoConsiderar los parmetros de desempeo a evaluar y el analito adeterminar

2. Campo de aplicacinIndicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validacin

3. Mtodo de ensayo Elaborar un diagrama de flujo del mtodo en cuestin

4. EquipoMencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificacin

y/o calibracin, si aplica)5. Materiales Indicar los materiales a utilizar

6. Reactivos y Medios deCultivo

a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.b) Indicar los medios de cultivo a utilizarc) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inculos

7. MuestrasIndicar las caractersticas, forma de almacenamiento y cantidades demuestra estimadas para llevar a cabo la validacin.Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas.

8. Desarrolloexperimental

Detallar las instrucciones para cada uno de los parmetros de desempeoa ensayar.

9. Resultados Formato para el registro de resultados

10. Anlisis estadsticoEstablecer para cada parmetro de desempeo la herramienta estadsticaa utilizar para su evaluacin.

11. Criterios deaceptacin

Establecer los criterios de aceptacin que deben cumplirse con surespectiva referencia bibliogrfica.

Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.

5.9 Ejecucin del protocoloDebern documentarse todos los resultados en los formatos descritos en sus protocolos, todoslos registros debern estar firmados por el personal que realiza la actividad y mostrar evidencia

de supervisin.

Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deber estardocumentado y autorizado.

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5.10 Elaboracin del InformeElaborar un informe de resultados de validacin que incluya lo siguiente:

TtuloInforme de resultados de la evaluacin del desempeo del mtodo: elnombre y clave del mtodo que se evalo.

1.ObjetivoConsiderar los parmetros de desempeo evaluados y el analitodeterminado.

2. Campo de aplicacin Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplic la validacin

4. EquipoListado de los equipos utilizados y su estado decalibracin/verificacin/mantenimiento

5. Materiales Listado de los materiales utilizados.

6. Reactivos y Medios decultivo

Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.

7. Muestras

Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento, marca, presentacin,caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo lavalidacin.Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadasutilizadas.

8. Mtodo de ensayo Incluir el diagrama de flujo del mtodo.

9. Desarrollo

experimental

Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los

parmetros de desempeo.

10. ResultadosPresentacin de resultados en forma de tablas, sealando fechas de inicioy trmino, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz,unidades y clave de bitcora o registro primario

11. Anlisis de resultadosPresentar en forma de tabla los criterios de aceptacin considerados y losresultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.

12. ConclusinEfectuar una conclusin final en donde se seale que el mtodo se ajusta aluso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)

13. Bibliografa Referencias utilizadas.

14. Anexos

Los que aplique: Registros primarios, Bases de datos utilizadas Certificados de equipos, Medios de cultivo Cepas Formatos de verificacin, Grficos de control, etc.

Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.

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6.0 NOTIFICACIN DE VIGENCIA

Se otorga un periodo de transicin de 180 das contados a partir de la fecha de publicacin para quelos laboratorios que se encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a stos criterios.

Para los laboratorios que soliciten autorizacin posterior a la fecha de publicacin, debern cumplirstos criterios de inicio.

Estos criterios se aplicarn en todos los procesos de evaluacin que se realicen a los 180 dasnaturales, a partir de la fecha de publicacin del documento en la pgina web de la COFEPRIS.

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Anexo Informativo 1

Gua Informativa para la fortificacin de una matriz

La fortificacin de muestras se hace por medio de la adicin de diluciones conocidas delmicroorganismo a prueba, a partir de su Fase Estacionaria (FE), en la matriz en cuestin, como sigue:

Estimacin de la dilucin de trabajoA partir de un cultivo del microorganismo de inters en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento).Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente queutilice el laboratorio.

Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10 -6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar

cuenta estndar.

Realizar las lecturas y clculos de los nmeros de clulas en cada una de las diluciones para establecerla dilucin que ser usada en la fortificacin de la matriz y registrar los resultados de los recuentos yclculo.

Preparacin del InculoPreparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultadosobtenidos en la estimacin de la dilucin de trabajo, verificar la concentracin del inculo porsextuplicado.

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Anexo Informativo 2

Gua informativa de formatosCuadro 1: VALIDACI N PARCIAL DE:

FASE ESTACIONARIAAnalista: Fecha:

Nombre del microorganismo:

Caldo: Volumen de caldo: Temperatura y tiempo total de incubacin:

Intervalos de tiempo de lectura: FE en UFC/mL=

Horas vol. de inculoen placa

Dilucin Cuenta UFCPlaca 1

Cuenta UFCPlaca 2

Promedio decuentas

UFC/mL

Clculos:

Cuadro 2: VALIDACI N PARCIAL DE:

CLCULO DE INCULOSAnalista: Fecha:

Nombre del microorganismo:

Parmetro de desempeo:

FE en UFC/mL=

Dilucinde FE

Concentracinde UFC/mL

Dilucin Nivel y concentracin a laque se quiere llegar enUFC/g mL

Dilucinseleccionada

Volumennecesario

Clculos:

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Cuadro 3: Anlisis de la matriz en estudio (prueba de ausencia del analito).

Matriz: Mtodo de prueba:

Analito:

Fecha:

UFC/mL en FE: _________________

Analista:

Parmetro de desempeo:

Alcuotas de 25 g Resultado del anlisis Observaciones

1

2

3

4

5

6

Cuadro 4: Clculos para la obtencin de los datos de la dilucin y el volumen seleccionado de la FE parafortificar las alcuotas de la matriz en estudio del LD.

Matriz: Analista(s):

Fecha: Mtodo de prueba:

Parmetro de desempeo:Lmite de deteccin

Analito: ________________________________________

No. de UFC/mL en FE: ____________________________

Nivel a confirmar:LD no declarado: _______ UFC/25gLD declarado:_______

Niveles que se prueban:

No. de alcuotas: _____________ Cantidad de muestra por alcuota:_________

Nivel: ________Dilucin seleccionada de la FE:Concentracin en UFC/mL que corresponde a la dilucin seleccionada:Clculos:

RESULTADOS:Dilucin de FE:___________

Volumen de FE:___________

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Cuadro 5: Resultados del parmetro de Lmite de DeteccinMatriz: Mtodo de prueba:

Analito:

Fecha:

UFC/mL en FE:________

No. de replicas del niveldeclarado: 30

Analista:

Nivel de

fortificacin (N1)

Concentracin

esperada en

UFC/25g

Resultado

(registrar (+) o (-) )

No. total de positivos x 100 /

No. total de alcuotas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15.30

R= resultado, en esta tabla se registran 3 porque se hace la determinacin por nivel para 3 medios de cultivo en el caso deSalmonella.N1= nivel declarado en el mtodo de prueba.

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Anexo Informativo 3

Gua informativa para la construccin de hojas de clculoPorcentaje de recuperacin

AnalistaRepeticin

Placa1

Placa2 Cuenta

=CONCATENAR("log(",E1,")")

=CONCATENAR("Media(",F1,")") Inculo

=CONCATENAR("log(",H1,")")

%Recuperacin

=PROMEDIO(C2:D2) =LOG(E2)

=PROMEDIO(F2:F10) =LOG(H2) =G2/$I$2

=PROMEDIO(C3:D3) =LOG(E3)=PROMEDIO(C4:D4) =LOG(E4)

=PROMEDIO(C5:D5) =LOG(E5)=PROMEDIO(C6:D6) =LOG(E6)=PROMEDIO(C7:D7) =LOG(E7)=PROMEDIO(C8:D8) =LOG(E8)

=PROMEDIO(C9:D9) =LOG(E9)=PROMEDIO(C10:D10) =LOG(E10)

SesgoAnalista

Repeticin

Placa1

Placa2 Cuenta

=CONCATENATE("log(",E1,")")

=CONCATENATE("Media(",F1,")") Inculo

=CONCATENATE("log(",H1,")") SESGO

=AVERAGE(C2:D2) =LOG(E2)

=AVERAGE(F2:F10) =LOG(H2)=ABS(G2-

I2)


=AVERAGE(C4:D4) =LOG(E4)=AVERAGE(C5:D5) =LOG(E5)=AVERAGE(C6:D6) =LOG(E6)=AVERAGE(C7:D7) =LOG(E7)

=AVERAGE(C8:D8) =LOG(E8)=AVERAGE(C9:D9) =LOG(E9)


Reproducibilidad

Analista

Repeticin

Placa 1

Placa 2

=CONCATENAR("log(",C1,")")

=CONCATENAR("log(",D1,")")

DesviacinEstandar MEDIA DSR

DSR2 DSR(ab) R

=LOG(C2) =LOG(D2)=DESVEST(E2:F2)

=PROMEDIO(E2:F2)

=G2/H2

=I2^2

=RAIZ((SUMA(J2:J10,J12:J20)/CONTAR(J2:J10)))

=K2*2.8


=PROMEDIO(E3:F3)

=G3/H3

=I3^2


=PROMEDIO(E4:F4)

=G4/H4

=I4^2

=LOG(C5) =LOG(D5)

=DESVEST(E5

:F5)

=PROMEDIO(E

5:F5)

=G5/H

5

=I5^

2


=PROMEDIO(E6:F6)

=G6/H6

=I6^2


=PROMEDIO(E7:F7)

=G7/H7

=I7^2


=PROMEDIO(E8:F8)

=G8/H8

=I8^2


=PROMEDIO(E9:F9)

=G9/H9

=I9^2


=PROMEDIO(E10:F10)

=G10/H10

=I10^2

Analista

Repeticin

Placa 1

Placa 2


=CONCATENAR("log(",D11,")")

DesviacinEstandar MEDIA DSR

DSR2


=PROMEDIO(E12:F12)

=G12/H12

=I12^2


=PROMEDIO(E13:F13)

=G13/H13

=I13^2


=PROMEDIO(E14:F14)

=G14/H14

=I14^2


=PROMEDIO(E15:F15)

=G15/H15

=I15^2


=PROMEDIO(E16:F16)

=G16/H16

=I16^2


=PROMEDIO(E17:F17)

=G17/H17

=I17^2


=PROMEDIO(E18:F18)

=G18/H18

=I18^2


=PROMEDIO(E19:F19)

=G19/H19

=I19^2


=PROMEDIO(E20:F20)

=G20/H20

=I20^2

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RepetibilidadRepeticin

Placa1

Placa2

=CONCATENAR("log(",B1,")")


DesviacinEstandar MEDIA DSR DSR2 DSR(a) r

=LOG(B2) =LOG(C2)=DESVEST(D2:E2)

=PROMEDIO(D2:E2) =F2/G2

=H2^2

=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10)))

=J2*2.8



=H3^2



=H4^2



=H5^2



=H6^2



=H7^2



=H8^2



=H9^2


=PROMEDIO(D10:E10)

=F10/G10

=H10^2

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