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Damiana Ferrari Diagnostica microbiologica con POCT nei paesi in via di sviluppo Formazione di tecnica in analisi biomediche Scuola Superiore Medico Tecnica Locarno Lavoro di diploma 2008 – 2009 svolto presso il Laboratorio di Chimica e Immunologia Clinica Ospedale San Giovanni, Bellinzona Responsabile : Dr. Franco Keller

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Damiana Ferrari

Diagnostica microbiologica con POCT nei paesi in via di sviluppo

Formazione di tecnica in analisi biomediche Scuola Superiore Medico Tecnica Locarno Lavoro di diploma 2008 – 2009 svolto presso il Laboratorio di Chimica e Immunologia Clinica Ospedale San Giovanni, Bellinzona Responsabile : Dr. Franco Keller

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Indice 1 Riassunto / Abstract 2

2 Introduzione 3

2.1 L’HIV 3

2.1.1 Ciclo di replicazione 4

2.1.2 Monitoraggio 5

2.2 Basi tecniche di citometria a flusso 5

2.3 Il Cyflow Counter Partec 7

2.4 Scopo del lavoro 8

3 Materiali e metodi 9

3.1 Materiali 9

3.1.1 Campioni 9

3.1.2 Strumenti 9

3.2 Metodi 10

3.2.1 Principio del metodo non volumetrico: TruCount BD 11

3.2.1.1 Preparazione del campione 11

3.2.2 Principio del metodo volumetrico: TVAC Partec 12

3.2.3 Calibrazione 13

3.2.4 Conteggio assoluto dei CD4 (CD4 easy count kit) 13

3.2.5 Conteggio percentuale dei CD4 (CD4 % easy count kit) 14

4 Risultati 16

4.1 Studio della popolazione 16

4.2 Analisi statistica 16

4.2.1 Analisi descrittiva 16

4.2.2 Analisi statistica dei conteggi assoluti dei CD4+ 17

4.2.3 Analisi statistica dei conteggi percentuali dei CD4+ 19

5 Discussione 20

6 Conclusione 23

7 Glossario 24

8 Bibliografia 25

9 Ringraziamenti 28

10 Allegati 29

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1. Riassunto / Abstract

Abstract

Introduction The HIV is the etiological agent of the AIDS. It is one of the world’s biggest health problems, with 33 million people infected (in 2007). The HIV reproduces itself in T-helper lymphocytes (CD4+ cells) and reduces the immune defence. The CD4+ count is the most important laboratory parameter to select patients for therapy at the right time and to monitor the effect of ART (antiretroviral therapy). The foundation of Dr. Maggi (Lugano), bought the essential cytometer CyFlow Counter (Partec) for Mada (North of Cameroon, Africa). Objectives The purpose of this study is to determine whether the Partec essential flow cytometer for the analysis of T-lymphocytes CD4 is as performant and reliable as the FACSCalibur BD, which is the “Gold standard”; and to estabilish that the use of CyFlow is appropriate in developing countries. Materials and methods 103 peripheral blood samples collected in EDTA tubes were taken from the laboratory of the Oncology Institute of Southern Switzerland at the San Giovanni Hospital in Bellinzona. The blood samples were analysed on the essential flow cytometer Partec CyFlow Counter after the count of CD4+ with the FACSCalibur Multitest method. Two methods are used: absolute count of CD4+ and perceptual count of CD4+ with the CD45/SSC gating strategy. Results CD4+ absolute and percentage counts obtained for the Partec CyFlow method were compared to the CD4+ counts results of the BD FACSCalibur using the Passing & Bablok regression. The CD4 absolute count of Partec methods, is as accurate as the FACSCalibur method. The perceptual count don’t correlated to the reference method. Conclusion The Partec CyFlow Counter is an accurate method when compared to the gold standard. This method is also cheap, easy to operate and had a short sample processing time. The instrument is compact and durable and is ideal for placement in the Mada hospital.

Riassunto Introduzione L’HIV é l’agente eziologico dell’AIDS. Questo virus rappresenta uno dei più grossi problemi sanitari del mondo, con 33 milioni di persone infette (nel 2007). L’HIV si riproduce nei linfociti T helper (CD4+) e riduce le difese immunitarie. Il conteggio dei CD4+ è il più robusto indice di competenza immunitaria, indispensabile per stabilire l’inizio ed il monitoraggio di una terapia antiretrovirale. Il gold standard per l’analisi dei CD4+ è la citometria a flusso. Il CyFlow Counter (Partec, Germania) è un citometro a flusso essenziale che è stato acquistato dalla Fondazione Opera Umanitaria del Dr. Maggi (Lugano) per l’ospedale di Mada (Camerun). Obiettivi L’obiettivo principale di questo lavoro di diploma è stabilire se il CyFlow Counter si possa considerare un’apparecchiatura efficiente ed affidabile, se messa a confronto con il FACSCalibur (BD, USA). Inoltre, si vuole valutare la semplicità di utilizzo di questo citometro in laboratori con personale non specializzato. Materiali e metodi 103 campioni di sangue intero, provenienti dal laboratorio dell’Istituto Oncologico della Svizzera Italiana presso l’Ospedale San Giovanni di Bellinzona, sono stati analizzati al CyFlow Counter dopo il conteggio dei CD4+ con il metodo TruCount BD del FACSCalibur. Sono state utilizzate due metodiche Partec: il conteggio assoluto e il conteggio percentuale dei CD4+. Risultati I conteggi effettuati con il CyFlow Counter Partec sono stati paragonati a quelli ottenuti con il FACSCalibur BD utilizzando la regressione secondo Passing & Bablok. Il conteggio assoluto dei CD4+ effettuato con entrambe le metodiche è risultato paragonabile al metodo di riferimento. Il conteggio dei CD4% presenta invece sia un bias costante sia un bias proporzionale. Conclusione Il CyFlow Counter Partec è uno strumento affidabile per il conteggio assoluto dei CD4. Inoltre, è uno strumento di facile utilizzo adatto all’uso nella routine dell’ospedale di Mada.

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2. Introduzione 2.1 L’HIV L’HIV (virus da immunodeficienza umana) è l’agente eziologico dell’AIDS (sindrome da immunodeficienza acquisita). Esso rappresenta uno dei più grossi problemi sanitari del mondo, che diminuisce la speranza di vita nei paesi con un’alta prevalenza di infezione quali l’Africa e l’Asia. Dal primo caso di AIDS riportato nel 1981 l’infezione da HIV ha raggiunto vaste proporzioni stimate a 33,2 milioni di persone infette nel mondo nel 2007. Le nuove infezioni sono stimate a 3,0 milioni ogni anno, mentre le persone decedute nel 2007 a causa dell’AIDS sono 2,0 milioni. [1]

Figura 1. L’HIV nel mondo nel 2007. Con un incidenza che supera il 5% della popolazione, Africa e Asia sono i paesi maggiormente colpiti dal virus. [20]

L’AIDS è una malattia caratterizzata da una massiccia riduzione del numero di linfociti T CD4+, accompagnata da gravi infezioni di patogeni che raramente sono la causa di malattie nelle persone sane, oppure da forme aggressive di neoplasmi, come il sarcoma Kaposi e il linfoma a cellule B. Ci sono due tipi (ceppi) di HIV: tipo 1 (HIV-1), più virulento e responsabile dell’AIDS a livello mondiale e tipo 2 (HIV-2), meno patogenico, che causa una lenta progressione all’AIDS ed è di limitata distribuzione geografica (Africa occidentale e Asia). L’HIV è un retrovirus a RNA che contiene proteine virali, trascrittasi inversa (RT) e integrasi. L’RNA a singolo filamento è protetto dal “core” (nucleo capside di proteine) e lo strato esterno è composto da un “envelope” lipidico (120 nm di diametro) derivato dalla membrana della cellula ospite.[2]

Figura 2. La struttura dell’HIV è composta da un involucro esterno lipidico (envelope) che sostiene le proteine adibite all’attaccamento del virus alla cellule (gp120 e gp41) e da un capside di proteine (core) che protegge il genoma virale (ssRNA).[21] All’interno del virus ci sono gli enzimi responsabili del ciclo di replicazione virale, quali la trascrittasi inversa e l’integrasi.

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I linfociti T CD4+, detti anche linfociti T helper, hanno un ruolo molto importante nella regolazione del sistema immunitario; la coordinazione della risposta immunitaria e la stimolazione dei linfociti B a produrre anticorpi ne sono degli esempi. Il cluster of differentiation (CD) è una proteina espressa sulla superficie cellulare del sistema ematopoietico e, nel caso del linfocita T presentante CD4, è sito di legame con il virus HIV. [3,4] 2.1.1 Ciclo di replicazione e sviluppo

Più fasi compongono il ciclo di replicazione del HIV che in vivo dura 24 ore. L’attaccamento alla cellula avviene tramite l’interazione tra la glicoproteina virale gp120 e il recettore CD4 dei linfociti T helper. Questo legame causa dei cambiamenti conformazionali dei recettori che permettono al virus di interagire con altri siti cellulari corecettori quali il CXCR4 e il CCR5. La fusione permette al virus di legarsi alla cellula ospite, penetrare al suo interno e rilasciare l’RNA. Successivamente, la trascrittasi inversa permette la trascrizione dell’RNA a singolo filamento in DNA doppio filamento che va ad integrarsi nel genoma della cellula ospite grazie all’integrasi virale, formando il provirus. I provirus servono alla produzione di proteine e genomi RNA virali che saranno assemblati per formare i virioni. Alla fine del ciclo di replicazione i virioni passano attraverso la membrana acquistando lo strato esterno lipidico (envelope); questo passaggio provoca la lisi del linfocita T helper.

Figura 3. Sviluppo dell’AIDS. In seguito al contagio da HIV si sviluppa la sindrome retrovirale acuta che è caratterizzata da un aumento esponenziale della concentrazione del virus nel sangue. Nella fase di latenza clinica, di tempo variabile, avviene una lenta moltiplicazione del virus con conseguente diminuzione dei linfociti T CD4 che, raggiunto il limite di 200 cellule/µl, sfocia in AIDS.[22]

La patogenesi dell’AIDS è suddivisa in tre fasi principali in base alla carica virale e alla concentrazione dei CD4+. (Figura 3.) Nelle settimane seguenti all’infezione primaria c’è una forte replicazione del HIV che causa la sindrome retrovirale acuta (Window period). In questa fase avviene lo sviluppo di una risposta immunitaria specifica antivirale e il 40-80% dei pazienti, entro 3-6 settimane dal contagio, presenta sintomi simili a quelli presenti nella mononucleosi. Nel sangue sono presenti più di 100 milioni di copie di RNA per millilitro e vi è una forte diminuzione dei CD4+. Superata la fase esponenziale, il virus continua a moltiplicarsi ma lentamente, facendo diminuire il numero dei CD4+. La continua replicazione dell’HIV-1 nelle cellule ospiti con la conseguente eliminazione di queste ultime e l’attivazione immunologica cronica, provoca negli anni la degenerazione del sistema immunitario. Il numero dei CD4+ diminuisce gradualmente (inferiore a 200 cellule/µl)

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abbassando le difese immunitarie e amplificando il rischio di infezioni opportunistiche: polmonite da Pneumocystis carinii, meningite da criptococco, candidosi orali ed esofagee. Attivazioni ricorrenti di Herpes zoster e linfomi maligni non-Hodgkin sono molto frequenti in questa fase, come anche sintomi quali sudorazioni notturne, febbre, diarrea, gravi perdite di peso e stanchezza. Quest’ultima fase viene definita sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) e può portare alla morte dell’individuo. [2,5,6] 2.1.2 Monitoraggio

Per monitorare questa malattia si può ricorrere a due metodi: la determinazione della carica virale e la citometria a flusso. [7] La citometria a flusso è considerata la tecnica “gold standard” per il conteggio assoluto (cellule/µl) dei CD4+ in quanto essi sono il bersaglio principale del virus HIV. Grazie all’accuratezza, la precisione e la riproducibilità del metodo, la quantificazione delle cellule CD4+/µl si è dimostrato il più robusto indice di competenza immunitaria e indispensabile per monitorare e valutare la progressione della malattia. Grazie ai dati che si ottengono si può stabilire l’inizio di una terapia antiretrovirale (HAART – Highly Active Anti-Retroviral Therapy) e il suo monitoraggio. [3,7,10] Il metodo maggiormente utilizzato per la conta dei CD4+ è denominato “a Singola Piattaforma” e si avvale dell’utilizzo di Micro beads e di una sola apparecchiatura - cioè il citometro: ha il vantaggio di essere estremamente preciso ma con un impatto economico elevato. Questo fatto ha stimolato i ricercatori a trovare soluzioni alternative per applicazioni citometriche mantenendo un buon rapporto qualità/prezzo dell’analisi ed ha spinto anche le ditte produttrici di apparecchiature per la diagnostica, a mettere a punto delle strumentazioni adeguate alle necessità delle popolazioni in via di sviluppo. [8,9] Tra queste, la ditta Partec (Münster, Germania) ha creato la linea Essential Healthcare comprendente il CyFlow Counter: un citometro a flusso di piccole dimensioni, che può essere alimentato dalla batteria dell’automobile o da pannelli solari. Questo “point-of-care” complesso (strumento utilizzabile al letto del paziente), con l’ausilio di due microscopi a fluorescenza per la ricerca del parassita della malaria ed i bacilli della tubercolosi, costituisce la strumentazione di base, per lo screening e il monitoraggio delle malattie più frequenti nei paesi poveri, in particolare in Africa. Citometri a flusso essenziali come il CyFlow Counter e apparecchiature più sofisticate e all’avanguardia possono, pur essendo strumenti con tecnologie di diverso livello, fornire informazioni che vanno dalle più semplici alle più complesse grazie alla tecnica di indagine in comune, che è la citometria a flusso; infatti la citometria a flusso (CFM) è una tecnica che consente la misurazione simultanea delle caratteristiche fisiche e/o chimiche delle cellule. 2.2 Basi tecniche di citometria a flusso Il citometro a flusso, a differenza di un contaglobuli, permette di rilevare caratteristiche qualitative individuando antigeni di superficie e citoplasmatici delle cellule in esame. Il principio di funzionamento è uguale per tutti i citometri a flusso:

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le cellule sono forzate ad allinearsi mediante un flusso laminare e ad attraversare individualmente un punto di misura dove interagiscono con il fascio di luce del sistema di eccitazione.

Figura 4. Funzionamento di un citometro a flusso. Le cellule presenti nel campione (sample) vengono allineate grazie al fluido di trasporto (sheath fluid) ed attraversano la cuvetta dove avviene l’incontro con la luce del laser. Il sistema ottico, comprendente filtri, specchi dicroici e tubi fotomoltiplicatori (PMT), permette la lettura del segnale che verrà elaborato dal software. Con il citometro a flusso é possibile analizzare la grandezza (forward scatter), granularità (side scatter) ed i parametri chimici delle cellule con la fluorescenza.[23]

Da questa interazione vengono generati dei segnali dipendenti dalle caratteristiche fisiche delle cellule (diametro, volume, rapporto nucleo/citoplasma, granulosità interna, rugosità di superficie) e dalla presenza di marcatori fluorescenti sulla loro superficie, nel citoplasma o nel loro nucleo. Per svolgere tutto questo, il citometro si avvale del funzionamento di tre componenti: fluidica, ottica ed elettronica. Fluidica Lo scopo della fluidica consiste nel trasportare le cellule, tramite un flusso, attraverso la cuvetta per l’interrogazione da parte del laser. Il fluido che trasporta il campione (sheath) serve ad accelerare ed ordinare le cellule al centro del flusso per permettere la lettura di ogni singola cellula; questo processo è detto focalizzazione idrodinamica. La velocità di passaggio delle cellule è variabile e differente in base all’analisi da eseguire. Ottica L’ottica si avvale dell’utilizzo di filtri e specchi dicroici che realizzano la separazione dei percorsi ottici e la selezione delle lunghezze d’onda. I primi parametri che si analizzano sono i parametri fisici: side scatter e forward scatter. Con il termine “scatter” si identifica la dispersione della luce. Il forward scatter è un parametro più sensibile a rilevare le proprietà di superficie delle cellule e quindi a mostrare il loro volume. Il side scatter è un parametro invece più sensibile a rilevare le caratteristiche interne delle cellule e quindi la loro granularità. Per analizzare le caratteristiche chimiche si ricorre all’utilizzo di anticorpi monoclonali coniugati con dei fluorocromi. I fluorocromi sono sostanze fluorescenti che, se colpite da una luce incidente ad una particolare lunghezza d’onda, hanno la capacità di emettere luce ad una lunghezza d’onda maggiore. La

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transizione di energia è detta fluorescenza e il range di emissione di lunghezza d’onda di un particolare fluorocromo è chiamato spettro di emissione. I fluorocromi più comunemente usati sono FITC (isotiocianato di fluoresceina) e PE (ficoeritrina). Per l’eccitazione dei fluorocromi si fa uso di sorgenti luminose come le lampade convenzionali (a incandescenza, ai vapori di mercurio) oppure laser con differenti lunghezze d’onda di eccitazione (Argon, Krypton, Elio-Neon, Elio-Cadmio). In seguito si utilizzano filtri e specchi dicroici per selezionare il determinato range di lunghezza d’onda da far giungere ai tubi fotomoltiplicatori (PMT). Elettronica L’elettronica prevede un trattamento dei segnali dei sensori che consiste nell’amplificazione dei segnali analogici attraverso il lavoro dei fotomoltiplicatori. Questi segnali analogici vengono convertiti in analogico-digitali per essere elaborati dal computer collegato allo strumento. Tramite specifici software, gli impulsi recepiti vengono trattati fino ad ottenere informazioni statistiche e dati d’immagine; la distribuzione del segnale viene quindi rappresentata con istogrammi di frequenza o citogrammi.[3,9,11,12] 2.3 Il CyFlow Counter Partec

Il citometro a flusso trattato in questo lavoro, CyFlow Counter Partec (figura 5), possiede una tecnologia essenziale per l’analisi dei CD4+. Esso è uno strumento compatto (L 325 mm x H 330 mm x P 265 mm), adatto al trasporto (11,5 kg) che può essere alimentato anche tramite pannelli solari o la batteria dell’automobile. Esso é connesso a due bottiglie (Sheath e Waste) che servono all’aspirazione del fluido di trasporto all’interno dello strumento per permettere la focalizzazione idrodinamica del campione, e lo scarico dei rifiuti liquidi. Le cellule allineate nella cuvetta di quarzo (350 x 200 µm) vengono colpite dal laser a 532 nm che eccita nello spettro verde i fluorocromi PE e PE-Dy647 coniugati ad anticorpi monoclonali anti-CD4 e anti-CD45. I filtri ed i tubi fotomoltiplicatori che compongono la parte ottica dello strumento permettono la detezione dei due segnali di fluorescenza (FL2 e FL3) e della granularità cellulare

(SSC) che, tramite il software CyView (Windows), sono elaborati in istogrammi e/o grafici dot plot. Figura 6. Sistema ottico del CyFlow Counter Partec. Lo strumento possiede un laser a 532 nm per l’analisi delle cellule del campione. Un sistema di filtri e tubi fotomoltiplicatori permettono la selezione e l’amplificazione del segnale luminoso da far giungere ai tre detettori: due per le fluorescenze (FL2 e FL3) ed uno per la granularità cellulare (SSC).[25]

2.4 Scopo del lavoro

Figura 5. Il CyFlow Counter Partec [24]

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La situazione sanitaria nei paesi in via di sviluppo, in particolare l’Africa, è critica; la cura ed il monitoraggio dei malati è molto difficile in quanto c’è carenza di strutture sanitarie adeguate ed a disposizione dei villaggi, in particolare i più isolati. Per aiutare le zone più povere, il Dr. Giuseppe Maggi costruì tra il 1950 ed il 1976 ben 6 ospedali in Camerun: a Omwan, St. André, Tokombéré, Peté, Zinah e Mada. In suo onore fu costituita la Fondazione Opera Umanitaria Dr. Giuseppe Maggi, con sede a Lugano.

Grazie al sostegno finanziario della Fondazione, sono state acquistate le attrezzature della ditta Partec (descritte in precedenza) che saranno destinate all’ospedale di Mada nell’Estremo Nord del Camerun (vedi Figura 8.). Questi strumenti vengono definiti POCT (point-of-care), perché si possono installare in qualsiasi luogo adibito a laboratorio che, come nel caso di vari villaggi africani isolati e carenti di strutture sanitarie, può trattarsi di un laboratorio mobile su un furgone. L’obiettivo principale di questo lavoro di diploma è stabilire se il citometro a flusso “CyFlow Counter” della gamma di prodotti Partec, che è in grado di eseguire il conteggio dei CD4+, sia in numero assoluto (µl) che in valore percentuale (%), si possa considerare un’apparecchiatura efficiente ed affidabile se messa a confronto con un altro citometro a flusso, non appartenente alla linea Essential Care, come il citometro FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Come secondo obiettivo, si vuole valutare la semplicità di utilizzo di questo citometro in laboratori con personale non specializzato.

3. Materiali e metodi

Figura 7. Rappresentazione degli ospedalicostruiti dal Dr. Maggi in Camerun.[26]

Figura 8. L’ospedale di Mada in Camerun.[27]

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3.1 Materiali 3.1.1 Campioni I campioni utilizzati per questo studio sono stati gentilmente concessi dal Laboratorio del Servizio di Ematologia Morfologica dell’Istituto Oncologico della Svizzera Italiana (IOSI) a Bellinzona. Si tratta prevalentemente di campioni ematologici di pazienti coinvolti nello Studio Coorte Swiss HIV (SHCS) e in parte campioni dei pazienti oncologici dei quali occorre monitorare e valutare lo stato immunologico. I campioni di sangue intero (da 3 a 5 ml), anticoagulati con EDTA o eparina e conservati a temperatura ambiente, sono processati per l’analisi tra le 12-24 h dal prelievo, in accordo con le raccomandazioni del Center for Disease Control.[13] 3.1.2 Strumenti Gli oggetti in esame, messi a confronto per questo studio, sono due citometri a flusso ed i loro risultati: • FACSCalibur (Becton Dickinson USA) dotato di due laser e con un software dedicato: Multiset. Esso é lo strumento di riferimento di questo studio. Con il FACSCalibur, il laboratorio partecipa ai protocolli educazionali, ossia controlli di qualità esterni UKNEQAS (United Kingdom National External Quality Assessment Service). Per questo motivo le sue performance strumentali, e di applicazione sono sotto continuo monitoraggio.

• CyFlow Counter (Partec GmbH, Germania), installato provvisoriamente per un mese al laboratorio di Chimica e Immunologia Clinica (LC-CIC) dell’Ospedale San Giovanni di Bellinzona e trasferito successivamente all’ospedale di Mada in Camerun.

Figura 9. FACSCalibur BD [28]

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3.2 Metodi In citometria a flusso la conta delle cellule CD4, in valore percentuale ed in numero assoluto (cells/µl), può essere eseguita mediante tecnologie di conta “a singola piattaforma” o “a doppia piattaforma”. Il termine “piattaforma” indica la strumentazione usata; di conseguenza, il metodo a doppia piattaforma implica l’utilizzo di due apparecchiature: il citometro a flusso ed un contaglobuli. Per quanto riguarda la singola piattaforma, il solo strumento utilizzato è il citometro a flusso che fa anche da contaglobuli. Principio Per la conta a doppia piattaforma occorre avere a disposizione i dati ematologi di tutti prelievi in questione eseguiti su un contaglobuli: leucociti (WBC) ed il valore percentuale dei linfociti totali; a questi dati si aggiungono quelli forniti dall’analisi citometrica, ossia il valore % dei CD4+. Per effettuare ciò si sfrutta la strategia di gating CD45/SSC che consiste nell’identificazione dei linfociti T helper, ossia la popolazione CD45+ (linfociti), CD3+ (cellule T), CD4+ e negativa per CD8 (T citotossici). Il conteggio si esegue secondo la formula: % CD4 x % Linfociti x WBC = Conteggio assoluto dei CD4+ (cells/µl)

Per la conta “a singola piattaforma” i dati di cui si necessita sono forniti dal citometro stesso che, come già accennato, fa anche da contaglobuli. [3,11] La conta a singola piattaforma presenta meno fonti di variabilità rispetto alla tecnica a doppia piattaforma comunemente usata nei tempi passati e, vari studi multicentrici, hanno mostrato che fornisce un coefficiente di variazione (CV) migliore e minori rischi di generare risultati falsati. [14] A sua volta, la Singola Piattaforma si può svolgere con

metodo non-volumetrico

metodo volumetrico

Figura 10. Three-Color SSC/CD45 Lymphocyte Gating Method. Il gate R1 (rosso) nel grafico CD45/SSCindica la popolazione dei linfociti che viene suddivisa dai marcatori in T helper (CD3+, CD4+) e Tcitotossici (CD3+, CD8+). Per effettuare il conteggio assoluto, il software calcola il valore % dei CD4+.[29]

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3.2.1 Principio del metodo non-volumetrico: TruCount BD

Il metodo utilizzato dal citometro di riferimento BD FACSCalibur, è un metodo non volumetrico che viene comunemente indicato come analisi TruCount (dal nome delle provette trucount fornite dalla ditta produttrice). Le provette in questione contengono un numero noto di microbiglie fluorescenti liofilizzate alle quali viene dispensato il sangue intero. Vengono utilizzati ben quattro anticorpi monoclonali per quattro diverse fluorescenze ed il software dedicato fornisce i dati (% e in assoluto) di tutte le sottopopolazioni linfocitarie oltre ai valori di Ratio tra T helper e T suppressor. Lo scopo di avere le biglie già all’interno della provetta, implica che esse si diluiscono con il sangue che viene dispensato e si mischiano direttamente con le cellule ematiche. Il citometro quindi, conta sia le cellule ematiche che le biglie come eventi corpuscolati ma, dal momento che le biglie hanno dimensioni molto ridotte rispetto alle cellule e un’intensità di fluorescenza molto elevata, esse vengono visualizzate a fondo scala del diagramma e non si possono confondere con le cellule marcate con gli anticorpi monoclonali che hanno un’intensità di fluorescenza molto minore. A quel punto il software dedicato capta i plot e traccia delle regioni (gate) sulle quali fa un conteggio preciso degli eventi che ne sono contenuti, secondo la seguente formula si ottiene poi il numero di cellule per microlitro.[3]

3.2.1.1 Preparazione del campione In una provetta TruCount vengono pipettati 50 µl di sangue intero e 10 µl di una combinazione anticorpale che consiste in un mix di anticorpi monoclonali: CD3, CD8, CD45 e CD4. L’incubazione è effettuata a temperatura ambiente ed al buio per 15 minuti, in seguito vengono aggiunti 500 µl di lyse Buffer e dopo 10 minuti si procede all’acquisizione. È importante che il volume di campione venga dispensato utilizzando il metodo di pipettaggio inverso (di precisione). [15]

Figura 12. Rappresentazione grafica del conteggio dei CD4+ con FACSCalibur. [31]

Figura 11. Visualizzazione su grafico dei risultati delFACSCalibur. Il gate rappresentato in rosa corrispondealle biglie ed è ben separato dalle altre popolazioni visibili.Il conteggio degli eventi presenti nel gate delle bigliepermette di stabilire la concentrazione assoluta dellecellule presenti nel campione.[30]

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3.2.2 Principio del metodo volumetrico: True Volumetric Absolute Counting (TVAC), Partec Il citometro a flusso CyFlow Counter utilizza un metodo di singola piattaforma volumetrico. L’analisi del campione viene effettuata sfruttando il TVAC, ovvero il conteggio assoluto delle cellule presenti in un volume fisso stabilito da due elettrodi calibrati. Questa tecnica permette di misurare l’esatta concentrazione delle cellule (c), analizzando tutti gli eventi (N) in un volume (V) stabilito di 200 µl di preparato.

Figura 13. True Volumetric Absolute Counting Partec: schema del circuito di aspirazione a volume esatto del CyFlow Partec [32] La conta delle cellule inizia quando il livello del liquido raggiunge il primo elettrodo e termina quando esso è all’altezza dell’elettrodo inferiore (Figura 14.). Tutti gli eventi registrati dallo strumento sono visualizzati sullo schermo. [16,17]

Figura 14. Elettrodi per l’aspirazione esatta dei 200 µl [33]

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3.2.3 Calibrazione Ogni strumentazione prima di fornire dei risultati deve essere sottoposta ad una calibrazione tecnica che ha lo scopo di valutarne la corretta funzione. Essa si avvale dell’uso di biglie fluorescenti fornite dal produttore e viene generalmente effettuata ogni giorno prima del conteggio dei campioni. Per quanto riguarda il citometro CyFlow Partec la calibrazione viene effettuata con le Count Check Beads green Partec. Per il lotto utilizzato (Sf081114, scadenza il 1.2010), la concentrazione delle biglie era di 25’350/ml (+/- 10%).

Figura 15. Schermata di calibrazione del CyFlow Counter. Durante l’acquisizione, le biglie vengono rappresentate sugli istogrammi (SSC, CD4 e CD45) e sui grafici a due dimensioni. Per effettuare la calibrazione occorre modificare il gain (potenza di amplificazione del segnale) affinché le biglie siano al centro dei grafici.[34]

Questa calibrazione permette di impostare il voltaggio corretto di lettura per ogni canale di conta e stabilire se il circuito fluidico è pulito o presenta delle bolle d’aria. Una volta superata la calibrazione lo strumento è pronto per la processazione dei campione. 3.2.4 Conteggio assoluto dei CD4 (CD4 easy count kit) Questo tipo di conteggio prevede il trattamento del campione con un solo anticorpo monoclonale anti-CD4 coniugato al fluorocromo PE (CD4 mAb PE) e successivamente esso viene diluito con buffer non lisante per permettere l’acquisizione delle cellule.

Figura 16. Procedura di preparazione dei campioni per l’analisi dei CD4 assoluti. Al campione di sangue intero viene aggiunto l’anticorpo monoclonale anti-CD4 che, dopo un’incubazione al buio e successiva diluizione con buffer non lisante, viene processato al CyFlow Counter.[35]

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Pipettare 20 µl di sangue EDTA in una provetta da 3,5 ml Starstedt (55 x 12 mm) e aggiungere 20 µl di CD4 mAb PE, mescolare delicatamente e incubare 15 minuti al buio a temperatura ambiente. Aggiungere in seguito 800 µl di no lyse buffer e analizzare il campione al CyFlow. [18] La fluorescenza del campione viene rappresentata graficamente sul display del CyFlow da un istogramma (Figura 15.).

Figura 17. Rappresentazione grafica del conteggio assoluto dei CD4. [36]

3.2.5 Conteggio percentuale dei CD4 (CD4 % easy count kit) Il conteggio percentuale dei CD4+ è composto da due parti: la marcatura dei leucociti con anticorpo monoclonale anti-CD45 e quella dei CD4+ con il rispettivo anticorpo monoclonale (forniti entrambi dalla Partec). Il conteggio percentuale viene effettuato contando i leucociti totali evidenziabili con il CD45 mAb PE-Dy647 e rappresentati su un grafico Side Scatter (SSC) in base alla loro granularità. Questo permette di distinguere la popolazione dei linfociti totali e, grazie al grafico della fluorescenza PE dei CD4, si evidenzia il cluster dei CD4+. A 20 µl di sangue intero EDTA si aggiungono 10 µl di CD4 mAb PE e 10 µl di CD45 mAb PE-Dy647 e si mescola delicatamente. Dopo un’incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente al buio si aggiungono 400 µl di Buffer 1 e si mescola delicatamente. Appena prima della misurazione aggiungere 400 µl di Buffer 2 e analizzare al CyFlow entro 10 minuti. [19]

Figura 18. Procedura d’analisi dei CD4(percentuali ed assoluti). Il campione di sangueintero viene marcato con anticorpi monoclonalianti-CD4 e anti-CD45, diluito e lisato con i buffer1 e 2 e processato al CyFlow Counter. [37]

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Le popolazioni cellulari sono rappresentate con un grafico dot plot che mostra la granularità in relazione alla fluorescenza delle cellule del campione. La selezione del gate dei CD4 e dei linfociti totali deve essere effettuata manualmente. Il software effettua la conta di tutti gli eventi compresi nel perimetro disegnato nel grafico ed esprime il conteggio dei linfociti T CD4 in assoluto ed in percentuale.

Figura 19. Rappresentazione grafica del conteggio percentuale dei CD4.[38]

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4. Risultati 4.1 Studio della popolazione I campioni analizzati in questo studio sono 103. In un caso, è stato riscontrato un problema di lisi degli eritrociti e il campione è stato escluso dallo studio. Nella tabella dei dati (vedi allegati) vengono riportati i risultati dei conteggi per la popolazione CD4+, in assoluto ed in percentuale, ottenute con le metodiche differenti Il citometro a flusso FACSCalibur BD, che utilizza la metodica di riferimento per l’analisi dei CD4+, viene paragonato al citometro a flusso essenziale CyFlow Counter Partec. Questo tipo di comparazione è di fondamentale importanza ai fini di determinare la relazione che esiste tra la nuova tecnologia che si vorrebbe applicare e il metodo di referenza già consolidato. 4.2 Analisi statistica 4.2.1 Analisi descrittiva Dall’analisi statistica descrittiva dei risultati dei CD4 assoluti risulta che i dati non sono distribuiti in modo normale. Media e mediana di ogni singola serie di dati sono significativamente differenti con un p-valore di 0,0001. La rappresentazione grafica dei risultati, inoltre, non è gaussiana. Tabella 1. Analisi statistica descrittiva dei CD4 assoluti. Media, mediana e valore p della metodica Partec per il conteggio dei CD4 assoluti e per i CD4% e metodo BD.

N Media (CD4/µl) Mediana (CD4/µl) Distribuzione

normale: p

Metodica Partec CD4 assoluti 103 533,93 478,00 <0,0001

Metodica Partec CD4% 103 486,16 445,00 <0,0001

Metodo TruCount BD 103 547,63 500,00 <0,0001

L’analisi di varianza 1-way ANOVA (che studia l’effetto di un fattore in misurazioni ripetute) con le metodiche riferite al conteggio dei CD4 assoluti mostra che i risultati eseguiti sugli stessi campioni non sono significativamente diversi (p = 0,3007). Essendoci alcuni dati molto discosti dalla retta di identità tra i due metodi (outliers), è stato deciso di utilizzare la regressione non parametrica secondo Passing & Bablok. Questo perché i metodi parametrici sarebbero stati pesantemente influenzati dagli outliers. Per quanto riguarda l’analisi descrittiva dei CD4% la situazione è analoga a quella osservata nel caso dei CD4 totali. Media, mediana (31,30% e 30,00%) così come la rappresentazione grafica dei risultati, evidenziano una distribuzione non normale dei dati. I risultati ottenuti con il FACSCalibur si distribuiscono normalmente (p 0,113) con una media di 26,59 e una mediana di 27,00. (v. Tabella 2.)

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Tabella 2. Analisi statistica descrittiva dei CD4%. Media, mediana e valore p delle metodiche Partec e TruCount BD mostrano una differenza significativa dei risultati.

N Media (CD4%) Mediana (CD4%) Distribuzione

normale: p

Metodica Partec CD4% 103 31,30 30,00 0,001

Metodo TruCount BD 103 26,59 27,00 0,113

Per i CD4% è stato eseguito il test t di Student per valutare la differenza tra le medie ottenute con le due metodiche di misura. Il valore p ottenuto è di 0,0027, quindi le due serie di misure sono significativamente diverse tra loro. 4.2.2 Analisi statistica dei conteggi assoluti dei CD4+ La correlazione tra il metodo di riferimento e la metodica per la conta assoluta dei CD4 con il CyFlow, utilizzando la regressione di Passing & Bablok, é di:

- pendenza: 9,78 con intervalli di confidenza al 95% da -4,58 a 18,99 - intercetta: 0,97 con intervalli di confidenza al 95% da 0,94 a 1,00

Figura 20. Regressione di Passing & Bablok per il conteggio assoluto dei CD4. Confronto tra la metodica Partec per il conteggio assoluto dei CD4 ed il metodo BD.

La regressione di Passing & Bablok tra il conteggio dei CD4 con il metodo dei CD4% ed il metodo TruCount BD è di:

- pendenza: 10,12 con intervalli di confidenza al 95% da -5,50 a 23,20 - intercetta: 0,89 con intervalli di confidenza al 95% da 0,85 a 0,93

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Essa presenta un bias proporzionale.

Figura 21. Regressione di Passing & Bablok per il conteggio assoluto dei CD4. Confronto tra la metodica Partec per il conteggio percentuale dei CD4 ed il metodo BD. Analizzando la regressione secondo Passing & Bablok del conteggio assoluto dei CD4 (con la metodica Partec per il conteggio dei CD4%) per i campioni con 500 CD4+/µl o meno (valore limite di rilevanza clinica), si può notare che i dati sono dispersi in modo uniforme attorno alla retta.

Figura 22. Regressione di Passing & Bablok per il conteggio assoluto dei CD4 inferiori a 500cellule/µl. Confronto tra la metodica Partec per il conteggio percentuale dei CD4 ed il metodo BD

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4.2.3 Analisi statistica dei conteggi percentuali dei CD4+

Nel confronto metodi per i CD4% la regressione di Passing & Bablok presenta sia un bias costante sia un bias proporzionale. - pendenza: -3,29 con intervalli di confidenza al 95% da -5,93 a -1,30 - intercetta: 1,29 con intervalli di confidenza al 95% da 1,20 a 1,39

Figura 23. Regressione di Passing & Bablok per il conteggio percentuale dei CD4. Confronto tra la metodica Partec ed il metodo BD.

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5. Discussione Il conteggio dei CD4+ è di primaria importanza nel monitoraggio della progressione della malattia e dello stato immunologico dei pazienti infetti da HIV. Inoltre, è il parametro più importante per stabilire l’inizio della terapia antiretrovirale e/o la profilassi contro patogeni opportunisti. Per questo motivo, il conteggio dei CD4+ richiede accuratezza e precisione per garantire una corretta tempistica terapeutica. Come spiegato in precedenza, la citometria a flusso è descritta come il metodo “gold standard” per questa analisi, in quanto è accurata e precisa. Gli svantaggi di questa tecnica sono i costi, la complessità nell’interpretazione e la necessità di personale specializzato. Con i point-of-care si mira a ridurre tutte queste problematiche per permettere l’analisi dei CD4+ anche nei paesi in via di sviluppo. Con questo lavoro, si vuole valutare l’attendibilità del citometro a flusso CyFlow Counter Partec. Esso è uno strumento di costo contenuto con tecnologia essenziale, che è stato paragonato ad uno strumento di riferimento, con tecnologia nettamente superiore. Per questo confronto è molto importante considerare la differenza tra i due strumenti. Il CyFlow Counter è uno strumento compatto, di piccole dimensioni e di peso contenuto che può essere facilmente trasportato ed utilizzato in qualsiasi luogo; mentre per il citometro FACSCalibur è richiesto, per la sua mole, un posizionamento fisso e stabile. La metodica è semplice e veloce, non necessita di analisi aggiuntive (emogramma), mentre per il FACSCalibur e la metodica Trucount è necessario l’utilizzo di microbiglie per il conteggio. Grazie alla semplicità del funzionamento e del software dedicato (CyView) non è necessario disporre di personale altamente specializzato mentre per il funzionamento del FACSCalibur ci vuole un personale tecnico qualificato che conosca bene lo strumento ed i software più complessi e sofisticati. Il kit dei reagenti d’analisi ha costi contenuti e lo strumento non necessita di servizi di manutenzione; per il FACSCalibur invece il materiale di consumo, più completo e mirato a conteggi particolari, ha costi più elevati di circa due terzi. (kit CyFlow: ca.300 CH-F per 100 test, kit Calibur Mix di 4 anticorpi monoclonali e Buffer: 1000 CH F per 100 test) ed i contratti di manutenzione dell’apparecchio, che hanno lo scopo di coprire le spese dei pezzi di ricambio, hanno costi che si aggirano tra i 10’000 e 20’000 CH-F l’anno. Gli svantaggi riscontrati sono semplicemente sulla completezza dell’analisi, in quanto la metodica non fornisce informazioni riguardo i linfociti CD3 e nemmeno i linfociti CD8 o il valore di ratio tra T Helper e T suppressor (CD4/CD8) che sono invece dati forniti intrinsecamente all’analisi svolta con il metodo TruCount della Becton Dickinson. Per quanto riguarda invece le bolle d’aria che si formano all’interno del circuito fluidico, svantaggio del CyFlow che è stato il componente principale che ha influenzato il lavoro di confronto dei dati, occorre precisare che di fatto in citometria a flusso i problemi più frequenti sono legati al sistema fluidico indipendentemente dallo strumento. Una considerazione da fare è che le performance strumentali migliorano con il tempo e l’utilizzo; ciò significa che una macchina rodata da anni ed utilizzata quotidianamente ha sicuramente delle performance migliori rispetto alla stessa macchina nuova. Nel caso specifico del CyFlow Counter, i campioni acquisiti erano i primi in assoluto e nel primo mese di

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messa in funzione; durante il periodo di studio e contemporaneamente di rodaggio dello strumento, sono intercorsi dei periodi di inutilizzo (periodi scolastici e festività) e questo ha portato a riscontrare ulteriori problematiche sul funzionamento della fluidica. Il problema di bolle riscontrato, è imputabile sicuramente al fatto che la macchina è rimasta periodicamente inutilizzata. Anche nelle macchine più sofisticate, problematiche legate alla fluidica si riscontrano spesso per gli stessi motivi. Per quanto riguarda l’analisi statistica, i confronti sono stati effettuati utilizzando la regressione secondo Passing & Bablok.

La metodica Partec per i CD4+ assoluti ha mostrato una buona concordanza con il metodo di riferimento in quanto la regressione calcolata con i dati ottenuti possiede degli intervalli di confidenza al 95% che indicano che essa é molto vicina all’identità (dove x=y), perché comprende 0 nell’intercetta e 1 nello slope. Usando la seconda metodica Partec (dei CD4%) si ha una maggiore differenza con il metodo TruCount BD; essa presenta infatti un bias proporzionale. Questo è ben visibile sul grafico con un maggior scostamento della retta di regressione dall’identità, che si accentua ancora di più quando aumenta il numero di CD4+ presenti nel campione. Negli ambiti clinici i valori di CD4+/µl compresi tra 200 e 500/µl sono il principale allarme di una diminuzione delle difese immunitarie, quindi nel nostro caso, vista la migliore precisione dei conteggi nel range sopracitato rende il metodo affidabile e soddisfacente alle richieste del settore. (Vedi Tabella 3.)

Tabella 3. Stadiazione dell’infezione da HIV secondo WHO e CDC in base al conteggio dei CD4+.[39]

Con la funzione della retta di regressione della metodica dei CD4 assoluti è stato calcolato il valore limite di importanza clinica, ovvero 500 CD4/µl (misurati con lo strumento di riferimento). Questo valore corrisponde a 495 CD4/µl ed è applicabile a tutti i pazienti monitorati con la metodica dei CD4 assoluti. Lo stesso è stato eseguito con la metodica dei CD4% ed il valore limite ottenuto è 455 CD4/µl. (vedi Tabella 4.)

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Tabella 4. Valore limite clinico applicabile alle metodiche Partec dei CD4 assoluti e percentuali. Per quanto riguarda il conteggio dei CD4% la differenza di misura tra i due metodi è ben visibile. La metodica Partec, rispetto al metodo di riferimento, presenta sia un bias costante sia un bias proporzionale. Si può quindi affermare che il metodo non è paragonabile al gold standard. Questa discordanza è da imputare in primo luogo alla differenza del metodo; la metodica Partec sfrutta l’anticorpo monoclonale anti-CD4 e il conteggio dei linfociti totali viene effettuato delimitando il gate dei linfociti su un grafico SSC/CD4. Per il metodo TruCount il conteggio avviene partendo dall’individuazione del gate dei linfociti totali CD45+ e con una sequenza di “Gate booleani” per individuare e separare dal conteggio generale la popolazione dei linfociti T CD3 e successivamente le sue sottopopolazioni (CD4 e CD8). La causa principale della differenza sui valori percentuali è imputabile ai diversi parametri di soglia impostati nei software di acquisizione delle due rispettive macchine che di conseguenza svolgono una selezione sulla popolazione ematica cambiando il valore del denominatore su cui viene effettuato il conteggio.

CD4/µl

Valore limite clinico 500

Metodica Partec CD4% 455

Metodica Partec CD4 assoluti 495

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6. Conclusioni A conclusione di questo lavoro si può dire che l’obiettivo principale, ovvero valutare l’attendibilità del CyFlow Counter, è stato raggiunto in modo soddisfacente se pur con delle riserve sui valori dei CD4+ espressi in percentuale. Di fatto questo dato non ha un grande impatto nella diagnostica e nel monitoraggio dei pazienti HIV+, in quanto la competenza immunitaria è espressa dal numero di CD4+/µl. Lo strumento in esame ha soddisfatto il secondo obiettivo del lavoro, in quanto è di facile utilizzo e l’interpretazione dei risultati è molto semplice. Da marzo 2009, il CyFlow Counter Partec é utilizzato nella routine quotidiana del laboratorio dell’ospedale di Mada (Estremo Nord del Camerun) da tecnici di laboratorio camerunensi.

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7. Glossario μl Microlitro AIDS Sindrome da immunodeficienza acquisita ART Terapia antiretrovirale CDC Center for Disease Control and Prevention (USA) CD Cluster of differentiation DNA Acido Desossiribonucleico FITC Isotiocianato di fluoresceina FSC Forward scatter HIV Virus da immunodeficienza umana mAb Anticorpo monoclonale PE Ficoeritrina PMT Tubo fotomoltiplicatore POCT Point of Care Testing RT Trascrittasi inversa SSC Side scatter ssRNA Acido Ribonucleico a singolo filamento WHO World Health Organisation

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8. Bibliografia [1] UNAIDS/WHO, 2008 Report on the global AIDS epidemic, July 2008. [2] Murray, P., et al., Manual of clinical microbiology,9th edition volume 2. Washington DC: ASM

Press, 2007. [3] WHO, Laboratory Guidelines for enumerating CD4 T Lymhocytes in the context of HIV/AIDS,

New Dehli, 2007 [4] Parham, P., et al., The Immune System, New York: Garland Publishing; Current Trends, 2000. [5] Lawrence, M., et al., Current: Medical diagnosis & treatment, 39th edition. McGraw Hill,

2000. [6] Center of Disease Control and Prevention: Department of Health and Human Service, Current

Guidelines: Comparison of the Revised World Health Organization and CDC Surveillance Case Definitions and Staging Systems for HIV Infection, 2008.

[7] Balakrishnan, P., et al., Low-cost monitoring of HIV infected individuals on highly active

antiretroviral therapy (HAART) in developing countries, Indian J Med Res., 2005; 121(4):345-55.

[8] Sherman, G.G., et al., CD4+ T cell enumeration in HIV infection with limited resources, J

Immunol Methods, 1999; 222(1-2):209-17. [9] Pattanapanyasat, K., et al., Evaluation of a new single-parameter volumetric flow cytometer

(CyFlow(green)) for enumeration of absolute CD4+ T lymphocytes in human immunodeficiency virus type 1-infected Thai patients, Clin Diagn Lab Immunol., 2005; 12(12):1416-24.

[10] Janossy, G., et al., Affordable CD4(+) T-cell counts on 'single-platform' flow cytometers I.

Primary CD4 gating, Br J Haematol. 2000; 111(4):1198-208. [11] Gambirasio, F., Citometria a flusso: corso di base, Scuola Superiore Medico Tecnica Locarno,

2008 [12] Wulff, S., et al., Guide to flow cytometry, DakoCytomation [13] Centers for Disease Control and Prevention, Guidelines for Performing Single-Platform

Absolute CD4+ T-Cell Determinations with CD45 Gating for Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus, MMWR 2003;52(No. RR-2).

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[14] Deems, D., BD Biosciences: FACSCount Instrument, 2004. [15] Bekton Dickinson BD [16] Partec GmbH, CyFlow® Counter: Instrument Operating Manual, 2008. [17] Brando, B., et al., Alternative CD4+ T Cell Enumeration Technologies: volumetric approaches,

5° EWGCCA Euroconference, Athens Sept. 22-24, 2005. [18] Partec GmbH, CD4 easy count kit, 2008 [19] Partec GmbH, CD4% easy count kit, 2008

Figure [20] www.unaids.org/en/KnowledgeCentre/HIV/Data/GlobalReport/2008/2008_Global_

report.asp, consultato il 20.4.2009 [21] www.web-books.com/eLibrary/Medicine/Infectious/AIDS_HIV.htm, consultato il 3.5.2009 [22] www.answers.com/topic/hiv, consultato il 3.5.2009 [23] www.reprocell.co.uk/Shop/Diagnostic-AND-Flow-Cytometry-Services/Flow-Cytometry-

Services/976-Sample-Analysis-Service.html, consultato il 3.5.2009

[24] Partec GmbH, CyFlow® Counter: Instrument Operating Manual, 2008 [25] Partec GmbH, CyFlow® Counter: Instrument Operating Manual, 2008 [26] Presentazione power point della Fondazione Opera Umanitaria Dr. G. Maggi, conferenza de

“La Medicina di laboratorio all’Ospedale di Mada, Estremo Nord Camerun (26.9.2008) [27] Foto di Annette Zuber [28] www.biotech.missouri.edu/cic/img/bd-facscalibur.jpg consultato il 30.4.2009 [29] Presentazione power point di Pattanapanyasat, K., Evaluation of two volumetric flow

cytometers for the quantitation of CD4+ T-cells in Thai HIV-1 infected patients. [30] Presentazione power point di Pattanapanyasat, K., Evaluation of two volumetric flow

cytometers for the quantitation of CD4+ T-cells in Thai HIV-1 infected patients.

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[31] Rappresentazione dei risultati del FACSCalibur BD, tratto da un rapporto d’analisi, Laboratorio di Ematologia Morfologica, IOSI Bellinzona.

[32] www.partec.com, consultato il 3.5.2009 [33] www.partec.com, consultato il 3.5.2009 [34] Partec GmbH, CyFlow® Counter: Instrument Operating Manual, 2008 [35] www.partec.com [36] Partec GmbH, CyFlow® Counter: Instrument Operating Manual, 2008 [37] www.partec.com, consultato il 3.5.2009 [38] Partec GmbH, CyFlow® Counter: Instrument Operating Manual, 2008 [39] www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5710a3.htm#tab, consultato il 28.5.2009

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9. Ringraziamenti I miei ringraziamenti vanno a tutte le persone che mi hanno aiutato e sostenuto durante lo svolgimento del mio lavoro di diploma:

• Dr. Franco Keller, che in questi mesi mi ha seguita nel mio lavoro di diploma, sia nella parte scritta che in quella pratica

• L’Ente Ospedaliero Cantonale ed EOLAB per avermi dato la possibilità di svolgere questo lavoro presso il Laboratorio di Chimica e Immunologia Clinica dell’Ospedale San Giovanni di Bellinzona

• La Fondazione Opera Umanitaria Dr. G. Maggi per avermi messo a disposizione il CyFlow Counter per questo lavoro

• Il laboratorio dell’Istituto Oncologico della Svizzera Italiana per avermi fornito i campioni da analizzare

• Dr. Marco Balerna e Mauro Imperiali per l’aiuto nell’analisi statistica dei risultati

• Dr. Tiziano Balmelli per la fornitura di materiale bibliografico

• Il direttore della SSMT di Locarno Andrea Boffini, il docente di chimica clinica Giovanni Togni e le insegnanti Daniela Marcacci e Sonja Marci per le correzioni ed i consigli dati

• Felicita Gambirasio per i suoi insegnamenti di citometria a flusso e per il suo prezioso aiuto nella correzione del testo

• Il capo laboratorio Roberto Francesconi e tutto il team del laboratorio dell’Ospedale San Giovanni di Bellinzona per il tempo messo a disposizione per lo svolgimento della parte pratica

• La mia famiglia e Andrea per il sostegno e per l’aiuto nella correzione del testo

• Annette Zuber per le foto del suo soggiorno a Mada

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10. Allegati 1. CD4 easy count kit

2. CD4% easy count kit

3. Tabella dei dati

4. Descrittivo dei CD4 assoluti ottenuti con la metodica Partec dei CD4 assoluti

5. Descrittivo dei CD4 assoluti ottenuti con la metodica Partec dei CD4%

6. Descrittivo dei CD4 assoluti ottenuti con il FACSCalibur BD

7. Descrittivo dei CD4% ottenuti con la metodica Partec

8. Descrittivo dei CD4% ottenuti con il FACSCalibur BD

9. Correlazione di Blant & Altman per i CD4 assoluti

- Metodica dei CD4 assoluti

- Metodica dei CD4%

10. Correlazione di Blant & Altman per i CD4%

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N° paziente

Partec FACS Calibur

Metodica CD4

assoluti Metodica CD4% TruCount

CD4 assoluti CD4% CD4 assoluti CD4 % CD4 assoluti81222005 244 14 188 14 143 81222007 688 22 603 21 700 81222008 730 28 646 23 806 81222009 394 26 332 27 392 81222010 266 10 262 10 288 81222011 402 28 378 28 407 81222012 719 41 700 34 837 81222013 631 33 613 29 544 81222014 498 12 425 12 420 81222015 116 17 118 16 111 81223001 711 45 665 42 651 81223002 431 27 491 24 504 81223003 472 25 434 24 450 90112002 449 21 465 20 473 90112005 983 41 885 34 898 90112006 291 15 267 14 298 90112007 357 21 310 21 333 90112008 552 35 537 35 580 90112009 327 15 296 16 312 90112010 695 37 697 34 715 90112015 237 25 259 23 243 90112003 302 61 291 44 323 90112012 388 25 360 20 360 90112013 545 34 505 29 533 90112014 1345 30 630 26 759 90113005 583 31 562 30 605 90112016 1121 42 826 32 983 90112018 632 41 593 36 641 90112019 761 50 654 42 680 90112020 600 23 521 22 579 90113008 527 45 340 38 551 90112011 478 43 445 36 500 90113001 660 24 648 33 652 90113002 426 22 427 20 426 90113003 448 38 345 37 439 90113006 379 28 310 23 360 90113007 412 21 492 17 522 90113009 497 25 399 27 510 90113010 346 37 298 27 344 90113011 761 50 733 41 795 90113012 406 33 369 28 390

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35

N° paziente

Partec FACS Calibur

Metodica CD4 assoluti Metodica CD4% TruCount

CD4 assoluti CD4% CD4 assoluti CD4 % CD4 assoluti

90114013 101 19 130 13 134 90114014 202 22 220 23 264 90114015 540 29 498 27 646 90114016 678 28 684 27 755 90115001 343 32 308 31 366 90115002 307 21 439 22 498 90115003 255 10 240 10 297 90115004 558 32 497 33 612 90115016 176 21 156 21 179 90115017 227 19 190 21 215 90115018 109 10 102 10 102 90115015 896 30 708 27 832 90115019 186 15 194 13 176 90116001 367 30 365 18 374 90115002 540 26 440 22 498 90115004 591 40 562 33 612 90114008 251 18 232 14 240 90114009 346 41 379 26 342 90126001 695 27 582 28 678 90126003 770 32 772 29 831 90126004 555 32 555 27 566 90126005 601 34 593 30 581 90126007 686 30 692 30 713 90126008 455 26 424 20 476 90126012 383 15 336 13 364 90127002 127 18 112 14 116 90127003 215 21 186 17 191 90127004 372 36 365 33 385 90127008 1725 62 1600 47 1796 90127009 324 30 236 24 307 90127010 680 49 663 41 689 90127011 738 42 634 38 736 90128001 366 20 338 17 379 90128002 234 24 210 20 231 90128003 540 45 489 31 602 90129006 816 54 712 33 868 90129007 687 46 690 37 694 90129005 342 42 293 27 353 90130001 1326 67 1154 51 1412 90126001 691 27 593 28 678 90126003 831 32 782 29 831

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36

N° paziente

Partec FACS Calibur

Metodica CD4 assoluti Metodica CD4% TruCount

CD4 assoluti CD4% CD4 assoluti CD4 % CD4 assoluti

90126007 686 30 692 30 713 90126008 455 26 424 20 476 90126012 383 15 336 13 364 90127002 127 18 112 14 116 90127003 215 21 186 17 191 90127004 372 36 365 33 385 90127008 1725 62 1600 47 1796 90127009 324 30 236 24 307 90127010 680 49 663 41 689 90127011 738 42 634 38 736 90128001 366 20 338 17 379 90128002 234 24 210 20 231 90128003 540 45 489 31 602 90129006 816 54 712 33 868 90129007 687 46 690 37 694 90129005 342 42 293 27 353 90130001 1326 67 1154 51 1412 90126001 691 27 593 28 678 90126003 831 32 782 29 831 90126004 545 31 533 27 566 90126005 594 34 626 30 581 90126007 686 30 689 30 713 90126008 470 29 521 20 476 90126012 356 15 351 13 364 90127002 124 18 110 14 116 90127003 223 22 200 17 191 90127004 423 36 347 33 385 90127008 1754 65 1551 47 1796 90127009 308 30 251 24 307 90127010 632 47 651 41 689 90127011 745 44 686 38 736 90128001 387 19 340 17 379 90128002 235 27 234 20 231 90128003 523 42 480 31 602 90129006 824 55 696 33 868 90129007 697 46 703 37 694 90129005 332 40 298 27 353 90130001 1414 70 1135 51 1412

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37

 

v2.11

Test Describe - Summary

CD4 assoluti Partec (metodica CD4 assoluti)

Performed by labimm Date 12 maggio 2009

n 106

Mean 533.93 Median 478.00 95% CI 475.15 to 592.71 95.9% CI 406.00 to 545.00

SE 29.645 Range 1653.0

Variance 93153.77 IQR 344.92 SD 305.21

95% CI 268.92 to 352.91 Percentile 0th 101.00 (minimum)

CV 57.2% 25th 341.17 (1st quartile) 50th 478.00 (median)

Skewness 1.68 75th 686.08 (3rd quartile)

Kurtosis 4.14 100th 1754.00 (maximum)

Shapiro-Wilk W 0.87 p <0.0001

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38

 

v2.11

Test Describe - Summary CD4 assoluti partec (metodica %)

Performed by labimm Date 12 maggio 2009

n 106

Mean 486.16 Median 445.00 95% CI 435.75 to 536.57 95.9% CI 369.00 to 521.00

SE 25.424 Range 1498.0

Variance 68515.44 IQR 348.17 SD 261.75

95% CI 230.63 to 302.66 Percentile 0th 102.00 (minimum)

CV 53.8% 25th 298.00 (1st quartile) 50th 445.00 (median)

Skewness 1.56 75th 646.17 (3rd quartile) Kurtosis 4.46 100th 1600.00 (maximum)

Shapiro-Wilk W 0.89

p <0.0001

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39

 

v2.11

Test Describe - Summary CD4 assoluti FACSCalibur

Performed by labimm Date 12 maggio 2009

n 106

Mean 547.63 Median 500.00 95% CI 482.92 to 612.34 95.9% CI 408.00 to 579.00

SE 32.636 Range 2015.0

Variance 112902.47 IQR 345.17 SD 336.01

95% CI 296.06 to 388.52 Percentile 0th 102.00 (minimum)

CV 61.4% 25th 343.83 (1st quartile) 50th 500.00 (median)

Skewness 2.14 75th 689.00 (3rd quartile) Kurtosis 6.83 100th 2117.00 (maximum)

Shapiro-Wilk W 0.82

p <0.0001

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40

v2.11

Test Describe - Summary CD4 % partec

Performed by labimm Date 12 maggio 2009

n 106

Mean 31.30 Median 30.00 95% CI 28.82 to 33.77 95.9% CI 27.00

SE 1.248 Range 60.0

Variance 165.16 IQR 18.17 SD 12.85

95% CI 11.32 to 14.86 Percentile 0th 10.00

CV 41.1% 25th 21.92 50th 30.00

Skewness 0.78 75th 40.08 Kurtosis 0.56 100th 70.00

Shapiro-Wilk W 0.96

p 0.001

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41

v2.11

Test Describe - Summary

CD4% FACScalibur

Performed by Labimm Date 12 maggio 2009

n 106

Mean 26.59 Median 27.00 95% CI 24.77 to 28.40 95.9% CI 24.00 to 28.00

SE 0.917 Range 41.6

Variance 89.05 IQR 13.00 SD 9.44

95% CI 8.31 to 10.91 Percentile 0th 9.37 (minimum)

CV 35.5% 25th 20.00 (1st quartile) 50th 27.00 (median)

Skewness 0.32 75th 33.00 (3rd quartile) Kurtosis -0.22 100th 51.00 (maximum)

Shapiro-Wilk W 0.98

p 0.113

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42

Correlazione di Blant & Altman per i CD4 assoluti

- Metodica dei CD4 assoluti

- Metodica dei CD4%

95% Limits of

agreement 95% CI Lower -315.32 -358.08 to -272.56 Upper 192.38 149.62 to 235.14

n 106

Correlation - absolute

difference v average 0.37

Bias -13.70

95% CI -39.36 to 11.97 SE 12.945

t statistic -1.06

DF 105 p 0.2925

SD of differences 133.28 between single

measurements

95% Limits of

agreement 95% CI Lower -274.92 -318.93 to -230.92 Upper 247.53 203.53 to 291.54

n 106 Correlation -

absolute difference v average

0.49

Bias -61.47

95% CI -86.41 to -36.53 SE 12.580

t statistic -4.89

DF 105 p <0.0001

SD of differences 129.52 between single measurments

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43

Correlazione di Blant & Altman per i CD4%

95% Limits of

agreement 95% CI Lower -5.72 -7.48 to -3.96 Upper 15.14 13.38 to 16.90

n 106 Correlation - absolute difference v average 0.60

Bias 4.71

95% CI 3.68 to 5.73 SE 0.517

t statistic 9.11

DF 105 p <0.0001

SD of differences 5.32 between single measurements