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Desarrollo de una Técnica de Citometría de Flujo

Multiparamétrica que Permite Detectar Enfermedad Mínima

Residual por Debajo del Límite Establecido

Tesis Doctoral

Esther Domingo Rodríguez

Pamplona 2011

Servicio de Publicaciones de la Universidad de Navarra

ISBN 84-8081-125-0

Desarrollo de una Técnica de Citometría de Flujo Multiparamétrica que Permite Detectar

Enfermedad Mínima Residual por Debajo del Límite Establecido

Memoria presentada por Dª Esther Domingo Rodríguez para aspirar al grado de Doctor por la

Universidad de Navarra.

El presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección en el Servicio de Inmunología y autorizo

su presentación ante el Tribunal que lo ha de juzgar.

Pamplona, 21 de Julio de 2011

Dra. Dª Juana Merino Roncal

A mis padres, mi orgullo

A mi hermana, mi mitad

A mi abuelo, mi corazón

AGRADECIMIENTOS

a la Clínica Universidad de Navarra, en especial al Servicio de Inmunología, por haberme

permitido crecer en el ámbito profesional y personal.

a la Dra. Juana Merino, por darme la oportunidad de realizar este trabajo bajo su dirección, por

enseñarme la importancia del rigor en el trabajo y aconsejarme profesional y personalmente.

al Dr. Alfonso Sánchez-Ibarrola, por haberme dado la posibilidad de formar parte del Servicio de

Inmunología y por transmitirme su sentido de la responsabilidad y disciplina.

a la Dra. Cristina Moreno, por su paciencia y dedicación; por ayudarme y guiarme durante estos

años.

al Dr. Miguel Ángel Martínez-González, por su valioso y esclarecedor asesoramiento estadístico

sobre la distribución de Poisson.

a los pacientes y controles que han participado en el estudio haciendo posible este trabajo.

a las chicas, “mis chicas”, compañeras y amigas, por facilitarme el trabajo diario, escucharme y

aconsejarme durante todo este tiempo.

a Leire y Sara, porque juntas somos un equipo.

a Carmen y Jose, por su ayuda; por aprender tan rápido, siempre con una sonrisa.

a mis amig@s, por su ánimo y apoyo constante; por su cariño.

a Maider y Ricardo, por escucharme y animarme; por quererme.

a mi compañero, por llenar mi vida y estar siempre a mi lado, en lo bueno y en lo malo; por

quererme y recibirme siempre con la mejor “sonrisa”; por hacer que mi vida sea mejor.

a mis padres, a quienes debo todo lo que soy, por ser lo más importante de mi vida, por

enseñarme el valor del trabajo y la humildad; por su respeto, confianza y apoyo; por su amor

incondicional.

a mi hermana, por ser ella, por ser tal y como es; por ser una parte de mi, mi mitad. Por darme a

Julia.

a mi abuelo, por su buen humor y sus valiosos consejos; por ser mi cómplice, mi gran amigo, el

pilar de mi vida, mi corazón.

Índice

Esther Domingo Rodríguez Índice

INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 15

1. LA CUANTIFICACIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN EL MANEJO DE

PACIENTES CON NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS ................................................................ 17

1.1. TÉCNICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE EMR ................................................... 17

1.1.1. Técnicas moleculares ......................................................................................... 17

1.1.2. Citometría de Flujo ............................................................................................. 19

1.2. CUANTIFICACIÓN DE EMR EN LAS DIFERENTES NEOPLASIAS

HEMATOLÓGICAS ........................................................................................................... 21

1.2.1. Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) .................................................................. 21

1.2.2. Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA) ................................................................ 22

1.2.3. Mieloma Múltiple (MM) ....................................................................................... 23

1.2.4. Leucemia Linfática Crónica (LLC) ...................................................................... 25

2. SENSIBILIDAD DE LA CITOMETRÍA ...................................................................................... 28

2.1. NÚMERO DE CÉLULAS TUMORALES DETECTADAS ............................................ 28

2.2. NÚMERO DE LEUCOCITOS TOTALES ANALIZADOS ............................................. 29

PLANTEAMIENTO ..................................................................................................................... 37

1. HIPÓTESIS .............................................................................................................................. 39

2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 39

3. DISEÑO EXPERIMENTAL DEL DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE ALTA

SENSIBILIDAD ............................................................................................................................ 40

MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................ 41


A. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD ............ 43

1. PACIENTES Y CONTROLES .................................................................................................. 43

1.1. Pacientes .................................................................................................................... 43

1.2. Controles .................................................................................................................... 43

2. ANTICUERPOS MONOCLONALES ........................................................................................ 44

3. PROTOCOLO DE MARCAJE .................................................................................................. 47

4. PROTOCOLO DE CALIBRACIÓN DEL CITÓMETRO............................................................. 47

4.1. Ajuste del voltaje de los fotomultiplicadores ............................................................... 47

4.2. Comprobación diaria del funcionamiento del equipo .................................................. 52

4.3. Compensación de fluorescencias ............................................................................... 52

5. ADQUISICIÓN DE MUESTRAS .............................................................................................. 52

5.1. Adquisición estándar (muestras con una infiltración entorno a 10-4) .......................... 53

5.2. Adquisición para alta sensibilidad (muestras con una infiltración entorno a 10-5) ....... 53

6. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS .............................................................................................. 55

7. COMPARACIÓN CON RQ-PCR DE BCR-ABL ....................................................................... 55

8. COMPARACIÓN CON PCR DE BCL2-JH EN PACIENTES CON LINFOMA FOLICULAR ..... 55

9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................................ 57

B. APLICACIÓN CLÍNICA DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD ...... 58

1. LEUCEMIA AGUDA ................................................................................................................. 58

2. MIELOMA MÚLTIPLE .............................................................................................................. 59


RESULTADOS ............................................................................................................................ 63

A. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD ............ 65

1. ANÁLISIS DE EXACTITUD ...................................................................................................... 65

2. ANÁLISIS DE ESPECIFICIDAD .............................................................................................. 67

3. ANÁLISIS DE PRECISIÓN ...................................................................................................... 70

3.1. Coeficiente de variación ............................................................................................. 70

3.2. Intervalo de confianza ................................................................................................. 73

4. TIEMPO DE ADQUISICIÓN ..................................................................................................... 75

5. COMPARACIÓN CON RQ-PCR DE BCR-ABL ....................................................................... 77

6. COMPARACIÓN CON PCR DE BCL2-JH EN PACIENTES CON LINFOMA FOLICULAR ..... 79

B. APLICACIÓN CLÍNICA DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD ...... 82

1. PACIENTES CON LEUCEMIA AGUDA ................................................................................... 82

1.1. Leucemia Linfoblástica Aguda .................................................................................... 82

1.2. Leucemia Aguda Bifenotípica ..................................................................................... 88

1.3. Leucemia Mieloblástica Aguda ................................................................................... 89

Citometría de flujo vs biología molecular en el seguimiento de pacientes con leucemia

aguda................................................................................................................................. 95

2. PACIENTES CON MIELOMA MÚLTIPLE ................................................................................ 98

Citometría de flujo vs inmunofijación en el seguimiento de pacientes con mieloma

múltiple ............................................................................................................................ 103

Contaminación con SP de muestras de MO de pacientes con MM ............................ 107

Influencia de la latencia en el procesamiento de la muestra sobre los resultados de

citometría ......................................................................................................................... 110


DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 113

CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 131

BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 135

ABREVIATURAS ...................................................................................................................... 149

ANEXO ...................................................................................................................................... 153

Introducción

Esther Domingo Rodríguez Introducción

17

1. LA CUANTIFICACIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN EL MANEJO DE

PACIENTES CON NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

En los pacientes con neoplasias hematológicas la persistencia de EMR tras el tratamiento se

asocia a un peor pronóstico, de modo que su cuantificación forma parte del seguimiento de

rutina. El grado de EMR evalúa la efectividad del tratamiento, proporcionando información muy

útil para la toma de decisiones terapéuticas, tales como prolongar el tratamiento, modificarlo,

realizar un trasplante de progenitores hematopoyéticos, etc. (Rubnitz y col.,2010).

1.1. TÉCNICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE EMR

Las técnicas que se utilizan para el análisis de EMR deben ser cuantitativas, sensibles y

específicas. En la actualidad, dos técnicas cumplen estos requisitos, las técnicas moleculares y

la citometría de flujo (Béné y Kaeda, 2009).

1.1.1. Técnicas moleculares

Las técnicas moleculares detectan la presencia en la célula tumoral de determinadas

alteraciones genéticas, proporcionando información muy valiosa que ayuda al diagnóstico del

paciente, tiene valor pronóstico y permite el seguimiento de la enfermedad. Pero su aplicabilidad

se limita a aquellos pacientes que presentan algún tipo de alteración rastreable, que suponen tan

sólo un 10-50% de los casos (van der Velden y col., 2003).

Un ejemplo de alteración rastreable son los genes de fusión. Surgen como resultado de una

alteración en el reordenamiento de fragmentos cromosómicos que involucran a las secuencias

de dos genes diferentes, de manera que su unión origina un único gen. Estos genes de fusión se

encuentran en algunos tipos de leucemias y sirven como marcadores moleculares para el

seguimiento de EMR. Este es el caso del gen BCR-ABL resultado de la t(9;22)(q34;q11) que

origina un nuevo cromosoma, más pequeño, denominado Cromosoma Philadelphia que está


18

presente además de en la leucemia mieloide crónica, en algunos pacientes con leucemia

linfoblástica aguda, especialmente en adultos (van der Velden y col., 2003) (Figura 1).

Cromosoma 9

normal

Cromosoma 22

normal

Cromosoma 9

(alterado)

ABL BCR-ABL

BCR

Cromosoma

Philadelphia

Figura 1: Generación del gen de fusión BCR-ABL como resultado de la t(9;22)(q34;q11).

La mayor parte de los análisis a nivel molecular son cualitativos, indicando sólo la presencia o

ausencia de células patológicas, con una sensibilidad entre 10-4 y 10-5. Para la monitorización de

EMR, en la que es muy importante cuantificar la carga tumoral, se emplea la reacción en cadena

de la polimerasa a tiempo real (RQ-PCR). Esta técnica detecta el producto específico de la

alteración genética a medida que se produce, de manera que al compararlo con los estándares

adecuados, proporciona una medida cuantitativa del grado de enfermedad, con una sensibilidad

entre 10-5 y 10-6 (van der Velden y col., 2007a).

La PCR también puede emplearse en la monitorización de EMR mediante el análisis de los

reordenamientos génicos de las inmunoglobulinas (Ig) y del receptor de los linfocitos T (TCR). En

este caso se emplea la PCR oligonucleótido alelo específica (ASO-PCR), que es una técnica

muy laboriosa, que utiliza cebadores diseñados para unirse específicamente a la región

generada tras el reordenamiento génico de cada paciente y posteriormente realiza una PCR

cuantitativa. Es una técnica muy compleja que no se utiliza de manera rutinaria (van der Velden.,

2003).


19

En resumen, las técnicas moleculares gozan de un alto consenso internacional pero son

laboriosas, requieren de más tiempo para la obtención de resultados y sobre todo, su

aplicabilidad es baja (Szczepanski, 2007; van der Velden y col., 2007b).

1.1.2. Citometría de flujo

La detección de EMR por citometría de flujo (CF) se basa en la capacidad de diferenciar

inmunofenotípicamente las células neoplásicas de las que no lo son. Para ello es indispensable

analizar al detalle el patrón antigénico tumoral e identificar los marcadores en que se diferencia

de su equivalente normal. Un análisis detallado de la población patológica muestra la expresión

de patrones inmunofenotípicos anormales, tales como expresión antigénica aberrante,

asincronías, sobreexpresión o pérdida de expresión de algún marcador. Utilizando una apropiada

combinación de anticuerpos monoclonales, las células leucémicas se reconocen por situarse en

los denominados espacios vacios que dejan las células normales en el histograma

correspondiente (Lucio y col., 2001). Por tanto, para poder identificar las células neoplásicas

residuales después del tratamiento, es imprescindible que el estudio inmunofenotípico al

diagnóstico sea muy meticuloso (Al-Mawali y col., 2009a). En ocasiones esto puede proporcionar

información sobre la existencia de mecanismos de resistencia al tratamiento o sobre la

posibilidad de aplicar terapia dirigida (Peters y Ansari, 2011).

La citometría de flujo es una técnica cuantitativa, específica, con una sensibilidad de 10-4,

aplicable a más del 90% de los pacientes con neoplasias hematológicas y que proporciona

resultados rápidos, siendo muy útil en la toma de decisiones terapéuticas en tiempo real. Por

todo ello, se considera indispensable en el diagnóstico, clasificación y monitorización de las

neoplasias hematológicas, estando presente en la práctica totalidad de los centros hospitalarios

(Craig y Foon, 2008; Campana, 2009a-b).

En cuanto a la concordancia de resultados entre la citometría de flujo y las técnicas moleculares

en la cuantificación de EMR, diversos estudios han observado que se sitúa entre un 75% y un

94% (Malec y col., 2004; Neale y col., 2004; Ryan y col., 2008; Irving y col., 2009; Thörn y col.,


20

2011). Las discrepancias observadas se deben, en gran medida, a las diferencias de sensibilidad

y aplicabilidad existentes entre ambas técnicas (Tabla 1).

Tabla 1: Técnicas de aplicación habitual para cuantificación de EMR.

CF RQ-PCR

Sensibilidad 10-4 10-5-10-6

Aplicabilidad >90% 10-50%

Disponibilidad de resultados Horas Días

Grado de implantación Mayor Menor

CF, citometría de flujo; RQ-PCR, PCR a tiempo real


21

1.2. CUANTIFICACIÓN DE EMR EN LAS DIFERENTES NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

1.2.1. Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA)

El valor pronóstico del grado de EMR en LLA, tanto infantil como de adultos, ha sido evaluado

por múltiples estudios. Todos ellos establecen que la detección de EMR tiene mayor valor

pronóstico en las fases iniciales del tratamiento, especialmente después de la inducción (Basso y

col., 2009; Ratei y col., 2009; Campana, 2010; Stow y col., 2010).

En LLA la citometría de flujo es aplicable virtualmente a todos los pacientes (>95%), mientras

que tan sólo un 15-45% de los pacientes presentan genes de fusión y otras alteraciones

citogenéticas rastreables por las técnicas moleculares estándar. Por eso, la técnica de elección

para la cuantificación de EMR en LLA es la citometría de flujo, alcanzándose por tanto una

sensibilidad de 10-4 (Szczepanski, 2007; Campana, 2009a-b; Irving y col., 2009; Coustan-Smith y

Campana, 2010; Cazzaniga y col., 2011).

Hay que destacar que existen datos en la bibliografía de persistencia de EMR detectada con

técnicas moleculares al final del tratamiento, que predicen mayor riesgo de recaída en pacientes

con LLA tanto B como T, tanto adultos como niños. En 2004, se publicaron dos estudios sobre

LLA infantil que comparaban el análisis de EMR por citometría y PCR Ig/TCR. Ambos estudios

sugerían que un nivel de EMR 0.001% podría ser relevante (Malec y col. en 2004; Neale y col.,

2004). Paganin y col., estudiaron EMR en LLA infantil mediante RQ-PCR Ig/TCR y determinaron

un grupo de pacientes con EMR+ no cuantificable, por tener un nivel de enfermedad próximo al

límite de detección de la técnica (<10-4). El 27% de estos pacientes recayeron por lo que

proponen la necesidad de nuevos ensayos para poder predecir de forma más precisa las

recaídas (Paganin y col., 2008). Bassan y col., estudiaron la utilidad del análisis de EMR a nivel

molecular para establecer una clasificación según el riesgo de recaída, con el objetivo de

individualizar el tratamiento. Analizaron pacientes adultos diagnosticados de LLA-B o T, en los

que realizaron el estudio de EMR mediante RQ-PCR las semanas 10, 16 y 22, correspondientes

a los ciclos 4, 6 y 8 del tratamiento de inducción/consolidación. Observaron que la supervivencia

a los 5 años fue superior en los pacientes EMR- que en los EMR+ (p=0.001), siendo la presencia

de EMR el factor de riesgo más significativo. El nivel de EMR en las semanas 16 y 22 se


22

correlacionó estrechamente con la recaída, con una sensibilidad de 10-4 o mayor. Concluyen

que el nivel de EMR durante la terapia de inducción/consolidación define el grado de riesgo y

permite establecer la mejor estrategia terapéutica en función de dicho riesgo (Bassan y col.,

2009). Para Stow y col. el riesgo de recaída es directamente proporcional al nivel de EMR. En

este trabajo, la incidencia de recaída a los 5 años en niños diagnosticados de LLA-B con EMR

post-inducción entre 0.01 y 0.001% es significativamente superior a la observada en pacientes

con EMR <0.001% (12.7% vs 5%; p<0.047), por lo que proponen realizar un estrecho

seguimiento de dichos pacientes (Stow y col., 2010).

En resumen, existen datos que parecen indicar que merece la pena detectar EMR por debajo de

0.01% en LLA.

1.2.2. Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA)

En LMA, el momento del tratamiento en el que la detección de EMR tiene mayor valor pronóstico

ha sido ampliamente discutido sin llegarse a alcanzar un claro consenso. En 2008, Kern y col.

realizaron una revisión sobre la monitorización de EMR en LMA en la que compararon estudios

realizados por citometría y por biología molecular. En esta revisión, los estudios basados en

citometría sugieren que los momentos con mayor valor informativo son, después de la inducción

y después de la consolidación. A nivel molecular, destacan una gran heterogeneidad de

resultados y proponen una monitorización continuada durante 3 meses en los que cualquier

aumento de la carga tumoral puede considerarse predictivo de recaída (Kern y col., 2008). Para

Al-Mawali y col. los momentos para la detección de EMR que mejor definen el riesgo de recaída

también son tras la inducción o después de la consolidación, dependiendo del tipo de leucemia y

de la técnica utilizada (Al-Mawali y col., 2009a-b). Shook y col., realizaron una revisión sobre la

cuantificación de EMR en LMA en la que reflejaban la gran variabilidad presente en la bibliografía

publicada hasta la fecha (Shook y col., 2009). Kröger y col. refieren que es tras la consolidación

cuando los estudios a nivel molecular se correlacionan significativamente con el pronóstico,

mientras que por citometría la detección de EMR muestra una mayor correlación con el

pronóstico tras la inducción (Kröger y col., 2010a). En una revisión realizada por Kern y col. en

2010, se muestran diversos estudios que reflejan la falta de consenso en cuanto a qué momento

tiene mayor valor pronóstico: tras la inducción o después de la consolidación (Kern y col., 2010).


23

Más recientemente, Peters y Ansari, proponen que el nivel de EMR tras la inducción puede

utilizarse para personalizar la estrategia de tratamiento post-inducción, ya que la probabilidad de

recaída en pacientes con EMR puede ser hasta 5 veces mayor. Por otra parte consideran que el

momento con mayor valor predictivo es el final de la consolidación (Peters y Ansari, 2011). En

relación al trasplante, Diez-Campelo y col. proponen el día +100 post-trasplante como el

momento que mejor predice el pronóstico (Diez-Campelo y col., 2009) y un estudio multivariante

reciente realizado por Walter y col. concluye que la presencia de EMR pre-trasplante es el único

factor que se asocia con mayor riesgo de recaída y muerte en pacientes con LMA (Walter y col.,

2011).

En los pacientes con leucemia promielocítica aguda (LPA) el momento para la detección de EMR

que ha mostrado mayor valor pronóstico ha sido después de la consolidación (Cazzaniga y col.,

2006).

En cuanto a la técnica para la monitorización de EMR en LMA, la citometría de flujo es la que

presenta mayor aplicabilidad (80-90% vs 10%-30% para las técnicas moleculares) (Szczepanski

y col., 2001). La sensibilidad que alcanza es 10-3-10-4, ligeramente inferior a la que presenta en

LLA por las dificultades que plantean algunas características propias de la LMA, como es la

presencia de varias poblaciones patológicas o el hecho de que en ocasiones algunas de ellas no

expresan un marcador minoritario, lo que dificulta la realización de doble adquisición (Al-Mawali y

col., 2009a). En LPA la técnica de elección es la RQ-PCR para el gen de fusión PML-RAR,

resultado de la t(15;17) presente aproximadamente en el 90% de los pacientes. (Al-Mawali y col.,

2009a-b).

1.2.3. Mieloma Múltiple (MM)

Dentro de los criterios convencionales que definen la remisión completa en pacientes con MM se

incluye, de manera indispensable, la ausencia de paraproteína en suero y/u orina mediante la

técnica de inmunofijación (IF) (Chanan-Kahn y Giralt, 2010). La determinación del cociente de

cadenas ligeras libres en suero (sFLC, serum Free Light Chains) es un criterio de incorporación

más reciente, que define el concepto de “remisión completa estricta” cuando dicho cociente se


24

encuentra dentro de la normalidad (Durie y col., 2006). Sin embargo, este criterio está siendo

muy cuestionado y aún no ha sido validado (de Larrea y col., 2009; Kröger y col., 2010c).

Además de los criterios convencionales, otros métodos ayudan al estudio de EMR en MM. La

hibridación in situ con fluorescencia (FISH), la citometría de flujo y los métodos moleculares son,

junto con el análisis del quimerismo donante-receptor en pacientes alotrasplantados, los métodos

más sensibles para la detección de EMR en MM (Harousseau y col., 2009; Kröger y col., 2010b).

De entre todos ellos destaca la citometría por ser aplicable a todos los pacientes y proporcionar

una sensibilidad clínicamente relevante (10-4). Kumar y col. en un artículo publicado en 2010

afirman que la citometría de flujo es una técnica sencilla, rápida y más sensible que la

inmunofijación y que se correlaciona mejor con el resultado. Otros estudios también avalan la

utilidad de la citometría para detectar EMR en MM y proponen el análisis post-trasplante como

punto de chequeo más relevante (Sarasquete y col., 2005; Owen y Rawstron, 2005; Rawstron y

col., 2008; Paiva y col., 2008 y 2011).

Actualmente son varios los autores que apoyan la necesidad de revisar los criterios

convencionales que definen la remisión completa, para establecer una nueva definición de dicho

concepto que incluya criterios más sensibles, entre los que destaca principalmente el análisis por

citometría de flujo. En una revisión realizada por Harousseau y col. en 2009 sobre el papel de la

remisión completa en MM, afirman que es necesaria una evaluación más precisa del estado del

paciente que incluya entre otros, criterios como el inmunofenotípico. Para Ladetto y col. las

técnicas moleculares tienen un mayor valor predictivo por su mayor sensibilidad, pero la

citometría es una técnica más sencilla y goza de una mayor aplicabilidad, por lo que consideran

que se debe realizar un esfuerzo internacional para estandarizar, tanto los criterios moleculares

como los citométricos (Ladetto y col., 2010). En la revisión realizada por Chanan-Kahn y Giralt

observan que, gracias a las nuevas estrategias terapéuticas, el nivel de remisión alcanzado en

los pacientes con MM es cada vez más profundo, por lo que consideran necesario el desarrollo y

validación de nuevas técnicas más sensibles, como la citometría y la PCR, para su aplicación

rutinaria en MM (Chanan-Kahn y Giralt, 2010). Un estudio más reciente realizado por Paiva y col.

en pacientes con MM post-inducción, afirma que la remisión inmunofenotípica se traduce en una

mayor supervivencia y un mayor tiempo libre de progresión por lo que debe hacerse un esfuerzo

para incorporar la citometría de flujo en la evaluación rutinaria de pacientes con MM (Paiva y col.,

2011). Yuan y Stetler-Setevenson afirman que, aunque el uso de la citometría en rutina para


25

pacientes con MM aún no es generalizado, ha demostrado proporcionar información relevante

que ayuda al diagnóstico, tiene valor pronóstico y estratifica a los pacientes según el riesgo de

recaída, principalmente aquellos que han sido trasplantados. Concluyen con la necesidad de

nuevos estudios para integrar la citometría en la práctica clínica estándar (Yuan y Stetler-

Setevenson, 2011). Finalmente, en un informe reciente elaborado por el grupo internacional para

el mieloma se propone la remisión inmunofenotípica y la remisión molecular como criterios

necesarios para definir la remisión completa en MM. Afirman que los criterios convencionales

deberían adaptarse al desarrollo de las nuevas tecnologías con la aplicación de técnicas más

sensibles (Rajkumar y col., 2011).

Con respecto al análisis molecular de EMR en pacientes con MM, hasta hace poco tiempo la

remisión molecular se alcanzaba en muy pocos pacientes, casi exclusivamente en el contexto

post-alotrasplante. Pero, con la aplicación de las nuevas terapias más intensas y eficaces, este

nivel de remisión profundo será alcanzado por un mayor número de pacientes, por lo que serán

necesarios futuros estudios que evalúen su relevancia clínica (Harousseau y col., 2009). En este

sentido, Ladetto y col. realizaron un estudio de EMR a nivel molecular en pacientes con MM a los

que se les administró un intenso tratamiento de consolidación. Observaron que el nivel de

respuesta tras el tratamiento fue superior al logrado por pacientes autotrasplantados. La remisión

molecular tras el tratamiento fue alcanzada por el 18% de los pacientes (vs 3% en

autotrasplantados) y permaneció estable durante los 42 meses que duró el estudio, definiendo

un grupo de pacientes con buen pronóstico (Ladetto y col., 2010).

1.2.4. Leucemia Linfática Crónica B (LLC-B)

En 2008 el grupo de trabajo para la LLC del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-WG, National

Cancer Institute-sponsored working group on chronic lymphocytic leukemia) publicó la última

guía para el diagnóstico y tratamiento de la LLC. Es una actualización de las guías anteriormente

publicadas, en la que se detallan las recomendaciones para el manejo de pacientes con LLC y

que incluye, por primera vez, el concepto de remisión clínica en ausencia de EMR, definido como

la presencia de menos de 1 célula leucémica por cada 10000 leucocitos, en SP y/o MO. Según

esta guía, los estudios que pretendan alcanzar remisiones completas duraderas deberán incluir

técnicas con la sensibilidad suficiente como para detectar EMR, ya que la ausencia de células


26

leucémicas residuales al final del tratamiento parece tener un potente valor pronóstico positivo

(Hallek y col., 2008).

En LLC, las técnicas empleadas para el análisis de EMR son la citometría de flujo y la ASO-PCR.

La citometría es la técnica que se usa de forma general en rutina, por ser aplicable a todos los

pacientes y por su mayor implantación en los hospitales. La ASO-PCR es una técnica

personalizada, muy laboriosa y tan sólo se aplica en centros altamente especializados (Rawstron

y col., 2007; Kröger y col., 2010b; Böttcher y col., 2011).

Por tanto, según todo lo expuesto, la técnica de elección para la detección de EMR en

neoplasias hematológicas es, en general, la citometría de flujo, por su mayor aplicabilidad (Tabla

2), rapidez y por su mayor implantación en los centros hospitalarios. Este hecho hace que el

umbral establecido para la EMR con valor clínico sea 10-4, simplemente por ser el límite de

detección de la citometría. Así lo refleja Campana en una revisión publicada en 2009 en la que

afirma que el nivel típicamente usado para definir EMR+ es 0.01%, simplemente porque

representa el límite de detección de la citometría de flujo estándar (Campana, 2009a).

Tabla 2: Consenso actual relativo a la cuantificación de EMR en las neoplasias hematológicas

más frecuentes.

Enfermedad EMR Técnica Aplicabilidad Sensibilidad

LLA Post-Inducción CF >95% 10-4

RQ-PCR 15-45% 10-5-10-6

LMA Post-Ind/Cons* CF 80-90% 10-3-10-4

RQ-PCR 10-30% 10-5-10-6

MM Post-Trasplante CF ~100% 10-4

IF

LLC Post-Tratamiento CF ~100% 10-4

Ind, inducción; Cons, consolidación. CF, citometría de flujo, RQ-PCR, PCR a tiempo real; IF, inmunofijación * No existe consenso.


27

Sin embargo, algunos datos expuestos anteriormente reflejan que un nivel de EMR por debajo

del umbral establecido podría tener mayor valor pronóstico, tanto en LLA (Bassan y col., 2009;

Stow y col., 2010) como en MM (Harousseau y col., 2009; Ladetto y col., 2010) o en linfoma del

manto. En esta última entidad, Pott y col. realizaron un estudio al final del tratamiento de

inducción y observaron que los pacientes que alcanzaban la remisión molecular tenían una

mayor duración de la respuesta. Además, la remisión molecular sostenida durante el periodo

post-inducción, predice el resultado del trasplante autólogo en pacientes jóvenes o el de la

terapia de mantenimiento en pacientes de edad avanzada (Pott y col., 2010). Este nivel de

sensibilidad sólo es alcanzado actualmente por las técnicas moleculares, que como ya hemos

explicado, son aplicables a un menor porcentaje de pacientes. Merecería la pena, por tanto,

intentar desarrollar una técnica de citometría de flujo de alta sensibilidad.


28

2. SENSIBILIDAD DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Existen dos factores principales que determinan la sensibilidad de la citometría de flujo: el

número de células diana detectadas y el número de células totales analizadas. Aplicado a un

análisis de EMR, ambos factores son el número de células tumorales detectadas o tamaño del

cluster tumoral y el número de leucocitos totales analizados.

2.1. NÚMERO DE CÉLULAS TUMORALES DETECTADAS

La mayor parte de los autores consideran que deben detectarse entre 10 y 20 células tumorales

para considerar que una muestra es EMR+ (Cazzaniga y col., 2006; Krampera y col., 2006;

Damm-Welk y col., 2007; de Tute y col., 2007; Dworzak y col., 2008; Al-Mawali y col., 2009b;

Björklund y col., 2009; Ratei y col., 2009; Kröger y col., 2010a).

Sin embargo, cuando se trata de cuantificar EMR, suele afirmarse que es necesario detectar al

menos 100 células tumorales (CLSI., 2007a; Rawstron y col., 2008; Yuan y Stetler-Stevenson,

2011). Esto se basa en el hecho de que las células tumorales residuales son consideradas

eventos raros por lo que, teóricamente, siguen una distribución de Poisson. En esta distribución

el coeficiente de variación (CV) es igual a 100/√n, siendo “n” el número de eventos del cluster

tumoral. De modo que un cluster de 100 eventos tendrá un CV del 10% (Harvey Motulsky, 2010),

lo que se considera una precisión adecuada. Sin embargo, hay autores que reducen a 50 el

número mínimo de células tumorales que deben ser detectadas para realizar un análisis preciso

de EMR (Rawstron y col., 2007; Craig y Foon, 2008; Irving y col., 2009; Wilson col., 2010).

Incluso existen estudios que cuantifican EMR detectando tan sólo 20 (Ritgen y col., 2008;

Böttcher y col., 2009), 15 (Thörn y col., 2009) ó 10 células tumorales (Stark y col., 2009). Otros

autores no mencionan el número de eventos tumorales detectados en que basan su

cuantificación (Borowitz y col., 2008; Ryan y col., 2008; Stow y col., 2010).

Llama la atención la ausencia de referencias bibliográficas en que realmente se haya

cuantificado la precisión de un análisis citométrico en función del número de eventos detectados.

Tan sólo un artículo publicado por Serke y col. en 1997 intentó medir la precisión del análisis

citométrico. Se trataba de un estudio multicéntrico en el que se cuantificaban células CD34+ en

muestras de aféresis. La hipótesis de los autores mantenía que las diferencias de repoblación en


29

pacientes trasplantados con dosis de células CD34+ por debajo del umbral se debían

fundamentalmente a imprecisión en la cuantificación de dichas células por citometría. Se

analizaron dos estrategias citométricas distintas: por una parte, se realizaron 3 réplicas de cada

determinación, adquiriéndose 50000 leucocitos totales en cada una y calculándose el coeficiente

de variación (CV) del porcentaje de células CD34+ obtenido. En esta estrategia el número de

células CD34+ detectadas era variable de unas muestras a otras. En la segunda estrategia, se

realizaron 3 réplicas de cada determinación, adquiriéndose en cada caso el número de

leucocitos suficiente como para obtener un cluster de células CD34+ de 250 eventos. Observaron

que el CV era significativamente menor con esta estrategia, además de que en la primera

dependía del número de leucocitos adquiridos. Pero realmente, no analizaron el CV para

distintos tamaños de cluster tumoral ni comprobaron que fuera necesario detectar 100 eventos

para que la precisión fuera suficiente. Como hemos explicado anteriormente, esta afirmación es

una suposición teórica basada en la distribución de Poisson.

2.2. NÚMERO DE LEUCOCITOS TOTALES ANALIZADOS

Un análisis cualitativo de EMR por citometría requiere la adquisición de 200000 a 300000

leucocitos (de Tute y col., 2007; Dworzak y col., 2008; Björklund y col., 2009; Ratei y col., 2009;

Luria y col., 2010), aunque algunos autores adquieran cantidades más elevadas (Krampera y

col., 2006; Holowiecki y col., 2008; Itälä y col., 2008; Martínez-Sánchez y col., 2008; Motwani y

col., 2008).

Los autores que pretenden cuantificar EMR adquieren entre 500000 y (Rawstron y col., 2007;

Borowitz y col., 2008; Irving y col., 2009; Thörn y col., 2009; Kröger y col., 2010a; Wilson y col.,

2010; Peters y Ansari, 2011) y 1 millón de leucocitos totales (San Miguel y col., 2001; Craig y

Foon, 2008; Böttcher y col., 2011; Rajkumar y col., 2011; Walter y col., 2011; Yuan y Stetler-

Stevenson., 2011), siendo todavía una minoría los autores que adquieren 2 millones de

leucocitos para cuantificar EMR (San Miguel y col., 2002; Sarasquete y col., 2005; Paiva y col.,

2011).


30

En cualquier caso, aunque se adquieran 2 millones de leucocitos la sensibilidad de la citometría

permanece en el rango de 10-4 ya que la detección de 100 eventos tumorales en 2 millones de

leucocitos analizados equivale a 1 célula tumoral en 20000 sanas (Figura 2).

Nº de células

tumorales detectadas

Nº de leucocitos

totales analizados

Sensibilidad

alcanzada

10-4

10-5

1 millón

2 millones

10 millones

100

1 en 10000

1 en 100000

1 en 20000

Figura 2: Influencia del número de leucocitos analizados sobre la sensibilidad de la citometría de

flujo.

La estrategia clásica de enriquecimiento basada en la centrifugación sobre gradiente de

densidad no es aplicable a la citometría de flujo de neoplasias hematológicas, porque la

cuantificación de EMR debe referirse al total de leucocitos, además del hecho de que no puede

descartarse la pérdida de células patológicas tras el uso del gradiente o su sobrerrepresentación

por pérdida selectiva de otras subpoblaciones (Rawstron y col., 2008; Béne y Kaeda, 2009; Yuan

y Stetler-Stevenson, 2011). Por similares razones, tampoco se pueden aplicar técnicas de

enriquecimiento basadas en separación celular inmunomagnética, ampliamente utilizadas en la

detección de células circulantes de tumor sólido (Goodale y col., 2009).

El único sistema para aumentar la sensibilidad de la citometría de flujo en el análisis de EMR es

el incremento significativo del número de leucocitos totales analizados. Si se analizan 10 veces

más leucocitos, la sensibilidad de la citometría aumenta 1 logaritmo (Figura 2).

Sin embargo, como hemos explicado anteriormente, no está demostrado que sea realmente

imprescindible cuantificar 100 células tumorales para que el análisis sea preciso. Si la

cuantificación de 50 eventos fuera suficiente para alcanzar una precisión razonable, el número


31

de leucocitos totales a analizar para alcanzar una sensibilidad de 10-5 se reduciría a 5 millones

(Figura 3).

Nº de células

tumorales detectadas

Nº de leucocitos

totales analizados

Sensibilidad

deseada

5millones50

10millones100

10-5

Figura 3: Número de leucocitos totales que deben ser analizados para alcanzar una sensibilidad

de 10-5 en función del número de células tumorales detectadas.

Cinco millones de leucocitos sigue siendo una cantidad de células varias veces superior a la que

se suele adquirir en citometría de flujo estándar, y sobre todo, superior al número de leucocitos

que se suelen marcar en un solo tubo. Esto significa que plantearse realizar un estudio de

citometría de alta sensibilidad implica marcar varios tubos con una misma combinación de

anticuerpos y adquirirlos conjuntamente.

Con los citómetros analógicos, realizar una adquisición conjunta de varios tubos implicaba

asumir que en el fichero de los datos iban a quedar registradas todas las fluctuaciones que

sufrieran las fluorescencias al cambiar de un tubo a otro. Cuando se inicia la adquisición de un

tubo, inevitablemente se producen turbulencias que afectan a la estabilidad de la fluorescencia, y

que influyen significativamente en los resultados. En un citómetro analógico, cuando se detiene

la adquisición, cesa definitivamente el grabado de datos en el fichero. Por este motivo, hay que

cambiar de tubo sin parar la adquisición, lo que conlleva registrar todos los datos, incluso los

generados durante las turbulencias derivadas del cambio de tubo.


32

Actualmente disponemos de citómetros digitales, que digitalizan la fluorescencia emitida por la

célula. Entre las muchas ventajas que esto ofrece, una muy evidente es que permite realizar

adquisiciones independientes de tubos distintos, incorporando los datos al mismo fichero. Es

decir, la adquisición se detiene entre tubo y tubo, y cuando se vuelve a reanudar, los datos se

siguen grabando en el mismo fichero. Esto permite excluir del fichero los datos correspondientes

a las turbulencias generadas en el inicio de la adquisición de cada tubo, garantizando la fiabilidad

de los resultados (Figura 4).

a. b.

Figura 4: Intensidad de fluorescencia del marcador CD19 a lo largo de la adquisición de 6 tubos

diferentes, realizado al modo de los citómetros analógicos, es decir, sin excluir las turbulencias

del frente de la muestra de cada tubo (a), y excluyéndolas en un citómetro digital (b). En la figura

(a) se observa cómo las turbulencias afectan significativamente a la intensidad de expresión de

CD19, a diferencia de lo que se observa en la figura (b).

La segunda ventaja de los citómetros actuales a la hora de adquirir cantidades muy elevadas de

células es la rapidez que proporciona la electrónica digital. Esto permite que el tiempo total de

adquisición se mantenga en un marco razonable para la práctica clínica.


33

Además de estas dos ventajas fundamentales, la citometría digital ofrece otras de enorme

importancia, como son el hecho de que mide la cantidad total de fluorescencia que emite la

célula (parámetro área, A), en vez de la intensidad máxima de fluorescencia emitida, que es lo

que se evaluaba en los citómetros analógicos con el parámetro altura (H). La fluorescencia se

cuantificaba en una escala de 1024 unidades (llamadas canales de fluorescencia), mientras que

actualmente la escala se divide en 262144 canales (Figura 5). Esto aumenta la resolución de los

citómetros digitales, especialmente para señales débiles de fluorescencia. A ello se añade el

hecho de que los citómetros actuales permiten analizar de seis a ocho fluorescencias

simultáneamente, además de que cuentan con óptica de reflexión en vez de transmisión (Figura

6). En la Tabla 3 se resumen las ventajas de los citómetros disponibles actualmente en los

laboratorios de ámbito hospitalario, con respecto a los que utilizábamos hasta hace muy poco

tiempo.

H A

Figura 5: Diferencias entre la citometría analógica (izquierda) y la digital (derecha). En los

citómetros analógicos se medía la altura del pulso eléctrico (H), que correspondía a la máxima

intensidad de fluorescencia emitida por la célula, mientras que en los digitales se mide el área

(A), que es proporcional a la cantidad total de fluorescencia de la célula. La escala se dividía en

1024 canales en los citómetros analógicos (izquierda), frente a los 262144 canales de los

digitales (derecha)


34

a.

H

FITC

APC-H7

Laser rojo

(633nm)

Laser azul

(488nm)

FSC

PerCP-Cy5.5

PE-Cy7

PESSC

APC

b.

PMT4

PMT3

PMT2

PMT1

Figura 6: Óptica de reflexión de un citómetro FACSCanto con 6 detectores (a) vs óptica de

transmisión en un citómetro FACSCalibur con 4 detectores (b). La eficiencia de la transmisión

era <85%, mientras que la de la reflexión es >95%.


35

Tabla 3: Ventajas de los citómetros disponibles actualmente en laboratorios de diagnóstico.

Citómetros analógicos Citómetros actuales

Señal Analógica Digital

Parámetro para evaluar la fluorescencia Altura del pulso (H) Área del pulso (A)

Escala (canales) 1024 262144

Compensación Durante la adquisición Después de la adquisición

Nº de fluorescencias 3-4 6-8

Óptica Transmisión Reflexión

Rapidez Menor Mayor

Planteamiento del Trabajo

Esther Domingo Rodríguez Planteamiento

39

1. HIPÓTESIS

El umbral con valor clínico establecido actualmente en el seguimiento de EMR en la mayoría de

las neoplasias hematológicas es 10-4, porque este es el límite de sensibilidad de la citometría de

flujo, que es la técnica que se usa mayoritariamente en este tipo de estudios. La citometría digital

permite plantearse aumentar la sensibilidad de la técnica, sin comprometer su especificidad,

exactitud y precisión, y aplicarla en la práctica diaria para el seguimiento de los pacientes, con

claras ventajas frente a la técnica estándar.

2. OBJETIVOS

2.1. Desarrollar una técnica de citometría de alta sensibilidad para la cuantificación de EMR

en neoplasias hematológicas por medio de la adquisición y análisis de 6 millones de

leucocitos:

2.1.1. Analizar si el aumento del ruido de fondo originado por la adquisición de un

número tan elevado de células compromete la exactitud, precisión y

especificidad de la técnica.

2.1.2. Analizar el CV de la medición de EMR en función del número de células

tumorales detectadas, para determinar el tamaño mínimo que debe tener el

cluster tumoral.

2.1.3. Establecer si el tiempo requerido es aplicable a la práctica clínica.

2.1.4. Validar la técnica comparándola con los resultados obtenidos mediante biología

molecular.

2.2. Aplicar dicha técnica a pacientes con leucemia aguda y mieloma múltiple cuyo

seguimiento se realice en la Clínica Universidad de Navarra durante el periodo de

tiempo que dure el trabajo.

2.2.1. Comparar los resultados de citometría con los obtenidos mediante técnica

molecular, o por inmunofijación en el caso del mieloma.

2.2.2. Analizar si el aumento de sensibilidad de la citometría aplicado a la

monitorización del paciente aporta beneficios a su seguimiento.

Esther Domingo Rodríguez Planteamiento

40

3. DISEÑO EXPERIMENTAL DEL DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE ALTA SENSIBILIDAD

Comparación con Técnica molecular

5 MM 5 LLC-B 4 SLPC-T Muestras con EMR

en torno a 10-4

5 MM 5 LLC-B 4 SLPC-T Muestras con EMR

en torno a 10-5

- TÉCNICA ESTÁNDAR -

Marcaje, adquisición y análisis de 500000 leucocitos

×5 ×5 ×5

Infiltración real = Media de las 5 determinaciones

- TÉCNICA DE ALTA SENSIBILIDAD -

Marcaje, adquisición y análisis de 6 millones leucocitos

Análisis de Exactitud, Especificidad y Precisión

Dilución 1/10

Material y Métodos

Esther Domingo Rodríguez Material y Métodos

43

1. PACIENTES Y CONTROLES

1.1. Pacientes

Se utilizaron muestras EMR+ de 23 pacientes con diferentes neoplasias hematológicas (Tabla 4):

- Ocho muestras de médula ósea de pacientes con Mieloma Múltiple (MM)

- Ocho muestras de sangre periférica de pacientes con Leucemia Linfática Crónica B (LLC-B)

- Cuatro muestras de sangre periférica de pacientes con Síndrome Linfoproliferativo Crónico T

(SLPC-T):

. Dos Síndromes de Sézary (SS)

. Una Leucemia de Linfocitos Grandes Granulares T (LLGG-T)

. Un Síndrome Linfoproliferativo Post-Trasplante (SLP post-Tx )

- Dos muestras de médula ósea de pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) BII, una de

ellas Phi+

- 1 muestra de médula ósea de un paciente con Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA) M2

1.2. Controles

Incluimos en el estudio 6 muestras de donantes sanos, 3 de médula ósea y 3 de sangre periférica.

Todas las muestras, tanto de MO como de SP, se extrajeron en tubos con EDTA. Las muestras

presentaban una infiltración en torno a 10-4, es decir, en el umbral de detección actualmente

establecido para la citometría de flujo. Todas ellas se diluyeron 1:10 con leucocitos de SP de

individuos sanos, con el fin de generar muestras con EMR en torno a 10-5.

A. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD


44

Tabla 4: Descripción del grupo de pacientes.

ID Sexo Edad Diagnóstico

MM1 V 69 MM

MM2 V 47

MM3 M 73

MM4 V 59

MM5 V 85

MM6 V 80

MM7 M 73

MM8 V 62

LLC-B1 V 62 LLC- B

LLC-B2 V 62

LLC-B3 M 82

LLC-B4 M 55

LLC-B5 M 65

LLC-B6 V 64

LLC-B7 V 74

LLC-B8 M 65

SLPC-T1 M 63 SS

SLPC-T2 M 28

SLPC-T3 V 61 LLGG-T

SLPC-T4 V 73 SLP post-Tx

LLA1 M 56 LLA BII Phi+

LLA2 V 45 LLA BII

LMA1 M 31 LMA M2

2. ANTICUERPOS MONOCLONALES

La caracterización inmunofenotípica de las células tumorales en las diferentes muestras se realizó

por citometría de flujo de 6 colores, utilizando las combinaciones de anticuerpos monoclonales

que se detallan en la Tabla 5.

Las muestras con MM se analizaron siguiendo el consenso internacionalmente establecido

(CLSI., 2007b; Rawstron y col., 2008). Las células plasmáticas se identificaron por la alta

expresión de CD38 y CD138, que caracteriza tanto a células plasmáticas normales como

patológicas. Se incluyeron los marcadores CD19 y CD56 en todos los casos para los que las

células mielomatosas fueron negativas y positivas respectivamente. Además, para ayudar a la

detección de EMR, se incluyó un marcador de expresión aberrante, específico de cada caso. Los


45

casos 1, 3, 7 y 8 se caracterizaron por expresar de manera aberrante el marcador CD33; los

casos 2, 5, y 6 expresaban CD117 y el caso 4 tenía como marcador asincrónico CD20 (Tabla 6).

Las células de LLC-B se identificaron según el fenotipo consenso (CLSI., 2007b; Rawstron y

col., 2007). Son células CD19+, con baja intensidad de CD20 y CD22. Muestran además

positividad para otros marcadores como CD5 y CD23. Se incluyó en el análisis CD3 para excluir

linfocitos T del cluster tumoral (Tabla 6).

Con respecto a los SLPC-T, los casos 1 y 2 (SS) se caracterizaron por ser negativos para CD3

y CD8 a la vez que expresaban CD4+, CD2++, CD7+d y CD25+ (Willemze y col., 2005). El caso 3

(LLGG-T) expresaba CD3+d, CD8++, CD16+, CD56+ y CD57++ siendo negativo para CD4 (O'Malley,

2007). Por último, el caso 4 (SLP post-Tx) fue positivo para CD3+, TCR+, CD8+d, CD16+d y

CD57+ y negativo para CD5 (Taylor y col., 2005) (Tabla 6).

Las muestras con Leucemias Agudas (LA) se clasificaron de acuerdo a los criterios del Grupo

Europeo para la Caracterización Inmunológica de Leucemias (EGIL) (Bené y col., 1995).

Las células blásticas de LLA1 (LLA BII) presentaban el siguiente inmunofenotipo: CD45d+, CD34++,

CD38-, CD19+, CD10-/+ (40%), CD20+ (60%), CD22cito+, TdT+, µcito-, HLA-DR++, CD123+d, CD15-/+

(34%). El resto de marcadores mieloides y los marcadores T fueron negativos. Además, dicha

muestra se caracterizaba por la presencia del Cromosoma Philadelphia (Phi+), resultado de la

translocación t(9;22).

LLA2 (LLA BII) se caracterizaba por la presencia de células blásticas CD45+d, CD34+, CD38-,

CD19+, CD10++, CD20+het (75%), CD22+, CD22cito+, TdT+, µcito

-, CD33+ (49%). Esta muestra fue

negativa para el resto de marcadores mieloides y para marcadores T.

Por otro lado, la muestra LMA1 presentaba el siguiente inmunofenotipo: CD34+, CD38+, CD33++,

CD117+, CD56++, CD7+d, HLA-DR-, MPO+/- (59%), Lisozima+d. El resto de marcadores mieloides y

los marcadores T fueron negativos. Este fenotipo planteaba el diagnóstico diferencial entre

Leucemia Aguda Mieloblástica/NK y Leucemia Mieloblástica Aguda HLA-DR- no monocítica

“cuplike” (Kussick y col., 2004).


46

Tabla 5a: Combinaciones de anticuerpos monoclonales utilizados en la puesta a punto de la

técnica de citometría de flujo de alta sensibilidad.

FITC PE PCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7

MM Casos 1,3,7,8 Casos 2,5,6 Caso 4

anti-CD38 anti-CD38 anti-CD38






LLC-B Casos 1-8 anti-CD20 anti-CD23 anti-CD5 anti-CD19 anti-CD22 anti-CD3

SLPC-T Casos 1,2 Caso 3 Caso 4


anti-CD25 anti-CD56 anti-TCRγδ





LA Caso 1 Caso 2 Caso 3



anti-HLA DR anti-CD19 anti-CD33

anti-CD19 anti-CD34 anti-HLA DR



Tabla 5a: Lista detallada de los anticuerpos monoclonales utilizados.

Anticuerpo Monoclonal

Fluorocromo Fabricante Clon

MM anti-CD38 FITC Pharmingen, BD HIT2 anti-CD56 PE Dako C5.9 anti-CD20 PE BD L27 anti-CD138 PCP-Cy5.5 BD MI15 anti-CD19 PE-Cy7 BD SJ25C1 anti-CD117 APC BD 104D2 anti-CD33 APC BD P67.6 anti-CD56 APC BD NCAM16.2 anti-CD45 APC-H7 BD 2D1

LLC-B anti-CD20 FITC BD L27 anti-CD23 PE BD EBVCS-5 anti-CD5 PCP-Cy5.5 BD L17F12 anti-CD19 PE-Cy7 BD SJ25C1 anti-CD22 APC BD S-HCL1 anti-CD3 APC-H7 BD SK7

SLP-T anti-CD2 FITC BD S5.2 anti-CD57 FITC BD HNK-1 anti-CD25 PE BD 2A3 anti-CD56 PE Dako C5.9 anti-TCRγδ PE BD 11F2 anti-CD4 PCP-Cy5.5 BD SK3 anti-CD3 PCP-Cy5.5 BD SK7 anti-CD16 PCP-Cy5.5 BD 3G8 anti-CD8 PE-Cy7 BD SK1 anti-CD7 APC Immunostep HIT7 anti-CD5 APC BD L17F12 anti-CD3 APC-H7 BD SK7 anti-CD8 APC-H7 BD SK1

LA anti-CD38 FITC Pharmingen, BD HIT2 anti-CD10 PE BD HI10a anti-CD34 PE BD 8G12 anti-CD56 PE Dako C5.9 anti-CD19 PCP-Cy5.5 BD SJ25C1 anti-CD33 PCP-Cy5.5 BD P67.6 anti-HLA DR PCP-Cy5.5 BD L243 anti-CD19 PE-Cy7 BD SJ25C1 anti-CD34 PE-Cy7 BD 8G12 anti-HLA DR PE-Cy7 BD L243 anti-CD14 APC BD MɸP9

anti-CD22 APC BD S-HCL1 anti-CD34 APC BD 8G12 anti-CD20 APC-H7 BD L27 anti-CD45 APC-H7 BD 2D1

FITC, fluorescein-isotiocianato; PE, ficoeritrina; PCP-Cy5, proteína peridinin clorofila-cianina 5; PE-Cy7, ficoeritrina-cianina 7; APC, aloficocianina; APC-H7, aloficocianina- análogo de cianina 7.


47

Tabla 6: Caracterización inmunofenotípica de las células tumorales.

Inmunofenotipo

MM Caso 1

Casos 2,5,6

Casos 3,7,8

Caso 4

CD38++

CD38++

CD38++

CD38++

CD138++

CD138++

CD138++

CD138++

CD56+/++

CD56++

CD56+/++

CD56++

CD19-

CD19-

CD19-

CD19-

CD33+

CD117+

CD33+

CD20++

CD45+

CD45-

CD45-

CD45+

LLC-B Casos 1-8 CD19+ CD20+d CD22+d CD5+ CD23+ CD3-

SLPC-T Casos 1,2

Caso 3

Caso 4

SS

LLGG-T

SLP post-Tx

CD4+

CD8++

TCRγδ+

CD3-

CD3+d

CD3+

CD2++

CD57++

CD8+d

CD25+

CD56+

CD57+

CD7+d

CD16+

CD16+d

CD8-

CD4-

CD5-

LA Caso 1

Caso 2

Caso 3

LLA BII

LLA BII

LMA DR-/NK

CD34++

CD34+

CD34+

CD38-

CD38-

CD38++

CD19+

CD19+

CD56+++

CD45+d

CD10++

CD33++

HLA DR++

CD20+/+d

HLA DR++

CD14-

CD22+

CD45++

++, positivo fuerte; +, positivo; +d, positivo débil; -,negativo.

3. PROTOCOLO DE MARCAJE

Se incubaron 2106 células/tubo (MO) o 100μL de muestra (SP) con la combinación de

anticuerpos monoclonales elegidos para cada caso (Tabla 5) durante 15 minutos a temperatura

ambiente y en oscuridad. Posteriormente se añadieron 2 mL de solución lisante de hematíes

(FACS-lysing Solution, Becton-Dickinson) y se incubaron a temperatura ambiente y en oscuridad

durante 10 minutos. Por último se centrifugaron a 1800 r.p.m durante 8 minutos tras lo cual, se

decantaron los sobrenadantes y se resuspendieron las células en 500 µL de PBS.

4. PROTOCOLO DE CALIBRACIÓN DEL CITÓMETRO

Se utilizó un citómetro digital FACSCantoTM (BD).

4.1. Ajuste del voltaje de los fotomultiplicadores

Se determinó el rango de voltaje de los fotomultiplicadores (PMT) utilizando microesferas

Rainbow de 8 picos (Spherotech, BD) y CompBeads sin marcar (BD) según el protocolo de

Perfetto (Perfetto y col., 2006).

Se realizaron 9 adquisiciones sucesivas, tanto de Rainbow como de CompBeads, desde un

voltaje de 350V en todos los detectores hasta 750, realizando incrementos sucesivos de 50V. De

los 8 picos Rainbow se eligieron 2 picos para cada detector que estuvieran mayoritariamente en


48

escala para todos los voltajes utilizados y se analizó su MFI (intensidad media de fluorescencia).

Al pico con menor intensidad se le denominó M1 y al de mayor intensidad M2. Los tres

parámetros que se analizaron fueron:

Coeficiente de variación (CV) de M1

Ratio señal-ruido o M1/B (considerando como B la MFI de las CompBeads)

Linealidad del detector o M2-M1/M1

La Figura 7 muestra las gráficas con los resultados de linealidad, ratio señal-ruido y CV para

cada detector. La zona sombreada marca el rango de voltajes elegido inicialmente, es decir,

aquel en el que la ratio señal/ruido es mayor, el CV de M1 es menor y el detector se comporta de

forma lineal.

Con el objetivo de evaluar el ruido de fondo de muestras reales a diferentes voltajes, se

adquirieron leucocitos de SP sin marcar y marcados con anti-CD8 conjugado con los distintos

fluorocromos, a 3 voltajes diferentes dentro del rango previamente establecido (Figura 8).

Se eligió el voltaje mínimo con el que se conseguía la máxima separación señal-ruido y el

mínimo CV de M1, dentro del rango lineal del detector. Con lo realizado hasta el momento se

estableció el voltaje de FL1 (500), FL2 (480) y FL6 (600).

Para decidir el voltaje de los restantes detectores se realizaron comprobaciones adicionales. Se

adquirieron leucocitos marcados con diferentes anticuerpos monoclonales a dos voltajes

diferentes y se analizó la ratio M1/B (Figura 9). Con todo ello se decidió que 580, 650 y 520 eran

los voltajes definitivos para FL3, FL4 y FL5, respectivamente.

Finalmente, se compararon los voltajes elegidos con los adjudicados por el módulo CS-T del

aparato, utilizando las microesferas CS-T. Como se puede observar en la Tabla 7, CS-T adjudica

voltajes más altos que los elegidos según el método de Perfetto.

Tabla 7: Comparación de los voltajes elegidos según el método de Perfetto con los voltajes

adjudicados por el módulo CS-T.

PMT Voltajes

definitivos Voltajes

CS-T

FL1 500 538 FL2 450 477 FL3 580 611 FL4 650 735 FL5 520 610 FL6 600 595


49

a. FL1 500V

500300 400 600 700 8005000

1

2

3

4M

2-M

1/M

1

500300 400 600 700 8005000

5

10

15

CV

500300 400 600 700 8005000

200

400

600

800

1000

M1

/B

b. FL2 450V

300 400 500 600 700 8000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

M2

-M1

/M1

300 400 500 600 700 8000

100

200

300

400

500

600

700

M1

/B

300 400 500 600 700 8000

5

10

15

CV

c. FL3 580V

300 400 500 600 700 8000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

M2

-M1

/M1

300 400 500 600 700 800200

300

400

500

600

700

M1

/B

300 400 500 600 700 8000

5

10

15

CV

d. FL4 650V

300 400 500 600 700 8000

1

2

3

4

5

M2

-M1

/M1

300 400 500 600 700 800400

500

600

700

M1

/B

300 400 500 600 700 8000

5

10

15

CV

e. FL5 520V

300 400 500 600 700 8001

2

3

4

M2

-M1

/M1

300 400 500 600 700 8000

500

1000

1500

2000

2500

3000

M1

/B

300 400 500 600 700 8000

5

10

15

20

CV

f. FL6 600V

300 400 500 600 700 8000

1

2

3

4

M2

-M1

/M1

300 400 500 600 700 8000

500

1000

1500

2000

2500

3000

M1

/B

300 400 500 600 700 8000

5

10

15

20

25

CV

Figura 7 (a-f): Representación gráfica de linealidad (izquierda), ratio señal-ruido (centro) y CV (derecha),

para cada uno de los detectores a diferentes voltajes (Eje X). La zona sombreada marca el rango de

voltajes elegido inicialmente. El voltaje finalmente elegido para cada PMT está indicado en verde.


50

a. b.

Figura 8: Adquisición de leucocitos de SP sin marcar (a) y marcados con anti-CD8 (b) a tres

voltajes distintos dentro del rango previamente definido con microesferas.

480V 500V 550V 480V 500V 550V

450V 480V 500V 450V 480V 500V

500V 520V 550V 500V 520V 550V

550V 600V 650V 550V 600V 650V

550V 580V 600V 550V 580V 600V

600V 630V 650V 600V 630V 650V


51

a. b. c.

FL3 FL4 FL5

580V 600V 600V 630V 500V 520V

anti-CD8 236 233 anti-CD8 425 427 anti-CD8 770 715



Figura 9: Leucocitos sin marcar (1ª fila, gris) y marcados con diferentes anticuerpos

monoclonales conjugados con PCP-Cy5.5 (a), PE-Cy7 (b) y APC (c), adquiridos a dos voltajes

diferentes en cada detector. La tabla muestra la ratio M1/B para cada marcador y voltaje.

580V 600V 600V 630V 500V 520V





52

4.2. Comprobación diaria del funcionamiento del equipo

Diariamente se comprobó el funcionamiento del citómetro con la adquisición de microesferas CS-

T. El módulo de calibración reajusta los voltajes CS-T para que los tres picos de las microesferas

se mantengan en el mismo canal de fluorescencia. Dicho reajuste debe estar dentro del

denominado Rango de Tolerancia, definido como una variación de voltaje inferior al 5%.

4.3. Compensación de fluorescencias

Se calculó la compensación para cada combinación de anticuerpos monoclonales. Para ello, se

marcaron en cada caso células con cada uno de los seis anticuerpos por separado,

adquiriéndose 100000 células y calculando la matriz de compensación de manera automática

con el software FACSDiva. En la Tabla 8 se muestra un resumen del rango de compensaciones

utilizado.

Tabla 8: Rango de compensaciones utilizado.

FL1-A FL2-A FL3-A FL4-A FL5-A FL6-A

FL1-A 1-2 0-1 0-0.3 0-3 -

FL2-A 17-19 0-0.4 2-3 0-6 -

FL3-A 3 20 17-19 3-9 -

FL4-A - 0.7 7-8 0.5 1

FL5-A - - 0.8 0 1

FL6-A - - 3 9-10 17

5. ADQUISICIÓN DE MUESTRAS

Las muestras se adquirieron en un citómetro FACSCanto con el software FACSDiva v6.1.3 (BD).

El protocolo de adquisición varió en función de la sensibilidad que se pretendía alcanzar.


53

5.1. Adquisición estándar (muestras con una infiltración en torno a 10-4)

5.1.1. Se adquirieron 30000 eventos para seleccionar la región de gateo:

. CD38++ en MM

. CD19+ en LLC-B

. CD4+ en SS

. CD8+ en LLGG-T

. TCR+ en SLP post-Tx

. CD34+ en LLA

5.1.2. Una vez seleccionada la región de gateo, se adquirieron 3105 leucocitos para

obtener un cluster tumoral de unos 30 eventos tumorales, 5105 leucocitos para

50 eventos y 1106 para 100 eventos.

La tasa de flujo fue de unos 2000 eventos/seg.

5.2. Adquisición para alta sensibilidad (muestras con una infiltración en torno a 10-5)

5.2.1. Tras adquirir los primeros 30000 eventos y seleccionar la región de gateo, se

adquirió el tubo entero.

5.2.2. A continuación se adquirió otro tubo, marcado con la misma combinación de

anticuerpos monoclonales que el anterior, agregándolo al fichero anteriormente

generado.

De este modo, se fueron agregando más tubos al mismo fichero, hasta adquirir un total

de 6 millones de leucocitos.

Se utilizó la tasa de adquisición habitual en nuestro laboratorio, 2000 eventos/seg. Con

esta tasa se tardó aproximadamente 1 hora en adquirir 6 millones de leucocitos.

Es importante destacar que la grabación de los datos de cada tubo en el fichero se inició

pasados unos 10 segundos de adquisición, con el fin de evitar las turbulencias del frente de la

muestra.


54

En la Figura 10a se muestra la intensidad de fluorescencia del marcador CD38 frente al tiempo

total de adquisición de 6 millones de leucocitos de una muestra de médula ósea del paciente

MM1 en que se ha realizado gateo CD38. Se observa cómo se mantiene estable a lo largo de la

adquisición de los diferentes tubos, sin fluctuaciones entre tubo y tubo. Lo mismo se observa en

la Figura 10b, que representa la intensidad de fluorescencia de CD19 a lo largo del tiempo total

de adquisición de 6 millones de leucocitos en el paciente LLC-B1.

a. b.

Figura 10: Estabilidad de la intensidad de fluorescencia del marcador CD38 frente al tiempo total

de adquisición de 6 millones de leucocitos del paciente MM1 (a) y del CD19 frente al tiempo total

de adquisición de 6 millones de leucocitos del paciente LLC-B1 (b).


55

6. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS

Las muestras se analizaron con el software Paint-A-Gate 3.0.2 PPC (BD), tras la exportación del

fichero “.fcs” en versión 2.0, excluyendo el parámetro “tiempo”.

Hay que destacar que muestras y controles se intercalaron y se codificaron durante la

adquisición, de modo que el análisis se realizó en cada caso de forma ciega.

7. COMPARACIÓN CON RQ-PCR DE BCR-ABL

La técnica se validó comparando el estudio de citometría de la muestra LLA1 (LLA-BII Phi+) con

RQ-PCR de BCR-ABL.

Para ello se utilizó la muestra con una infiltración en torno a 10-2 y se hicieron tres diluciones

sucesivas 1:10 con sangre periférica normal, de manera que se generaron muestras con

infiltraciones en torno a 10-3, 10-4 y 10-5. La muestra original y las tres diluciones resultantes se

analizaron en paralelo por citometría de flujo y RQ-PCR.

La cuantificación de EMR por RQ-PCR de BCR-ABLp190 fue realizada por la Unidad de Biología

Molecular/HLA del Servicio de Hematología del Hospital Clínico Universitario de Salamanca.

8. COMPARACIÓN CON PCR DE BCL2-JH EN PACIENTES CON LINFOMA FOLICULAR

Entre Enero del 2006 y Mayo del 2011 se diagnosticaron en la Clínica Universidad de Navarra

(CUN) 82 pacientes de linfoma folicular (39 mujeres y 43 hombres con edades comprendidas

entre 33 y 78 años; media de edad 58 años. Tabla 9) procediéndose a buscar infiltración en MO

por la técnica de citometría de flujo estándar (CFe) y por biología molecular.

El análisis molecular fue realizado por el Departamento de Genética de la Universidad de

Navarra. Analizaron el ADN de las muestras de MO para detectar la presencia del gen de fusión

BCL2-JH, tanto en la major breackpoint región (mbr) como en la minor cluster región (mcr). Este

gen es consecuencia de la t(14;18)(q32;q21).


56

En aquellos pacientes que presentaban infiltración en MO y realizaron su tratamiento en la CUN,

se aplicó la técnica de citometría de alta sensibilidad para cuantificar EMR tras el tratamiento, así

como análisis molecular.

Tabla 9: Descripción del grupo de pacientes con Linfoma Folicular (LF).

ID Sexo Edad Grado Estadío

F1 V 62 II IIA F2 M 73 II IVA F3 V 74 II IA F4 V 54 II IIIA F5 M 50 III IVA F6 V 57 II IVE-B F7 V 47 II IV F8 V 50 I IIIA F9 M 59 II IIA F10 M 68 III IVA F11 M 78 II IVA F12 V 39 III IIIA F13 M 53 II IVB F14 M 77 I IVA F15 M 51 III IA F16 M 40 I IIIA F17 M 48 II III-IV F18 V 69 II IVA F19 M 45 II II F20 V 42 I IVB F21 V 61 II IVB F22 M 64 III IE-B F23 V 72 III IIIB F24 M 33 I IV F25 M 69 III IIIA F26 V 42 II IVA F27 M 57 III IIIA F28 M 43 I III F29 M 51 III IVB F30 V 72 II IVA F31 M 60 I IVB F32 V 54 I IV F33 M 60 III IVA F34 M 61 II IIIA F35 M 38 I IA F36 M 58 I IVA F37 M 36 II IIIB F38 M 72 I IVA F39 V 62 II IIA F40 M 52 II IVA F41 M 49 II IA

ID Sexo Edad Grado Estadío

F42 V 56 I IIA F43 V 41 I IV F44 V 73 III IIB F45 V 59 II IIA F46 V 65 I IVA F47 V 67 III IIA F48 V 47 I IA F49 V 62 I IV F50 M 72 III IVS-A F51 V 48 II IV F52 M 61 II IVA F53 V 57 II IIA F54 M 49 I IV F55 M 69 II IIIB F56 V 62 I-II IVB F57 M 70 III IA F58 V 59 II IVB F59 V 42 I-II IIA F60 M 56 I IV F61 V 54 II III F62 M 59 II IV F63 V 72 I IVA F64 M 57 II IVA F65 M 46 I IIIA-S F66 M 62 I IVA F67 V 54 II IVA F68 V 54 I IIIA F69 M 39 II-III IA F70 V 65 I IA F71 V 74 II IVA F72 V 57 III IVA F73 V 72 III IIIA F74 M 50 III IVB F75 V 49 I IIIA F76 V 70 I IA F77 V 72 III IIA F78 V 74 III IA F79 V 72 III IVE-A F80 M 56 I IV F81 V 63 III IVA F82 V 53 II IVA


57

9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico se llevó a cabo con los programas SPSS versión 15.0 y GraphPad Prism

4.

En el análisis de precisión el CV se calculó según la fórmula (SD/ )×100. Se calculó también el

CV según la fórmula de la distribución de Poisson (CV=100/√n).

Para calcular el intervalo de confianza del 95% (IC95) del número de eventos del cluster se aplicó

la fórmula:

IC95: (n-1,96n) - (n+1,96n), siendo n el nº de eventos del cluster.

Cada medición se realizó 5 veces, “n” correspondía a la suma total de eventos tumorales

detectados en las 5 determinaciones. El resultado final se dividió entre 5 (Harvey Motulsky,

2010).

Para el cálculo del IC95 del porcentaje de EMR detectado en cada caso, se dividió el IC95 del

número de eventos del cluster calculado anteriormente, entre la media de leucocitos analizados

en las 5 determinaciones y se multiplicó el resultado por 100.

Para la comparación de la citometría con la RQ-PCR en la muestra LLA1 se aplicó el test de

correlación de Spearman.

Se comparó el grado de contaminación con sangre periférica de las muestras de MM vs SLPC-B

mediante el test U de Mann-Whitney.

La correlación entre la ratio MG/CF y el porcentaje de CD10 en la población granulocítica se

estudió por el test de correlación de Spearman

En todos los casos el límite de significación se estableció en 0,05.


58

La técnica de citometría de alta sensibilidad se aplicó a la cuantificación de EMR en pacientes

con leucemia aguda (LA) y mieloma múltiple (MM) entre Enero 2006 y Mayo 2011.

1. LEUCEMIA AGUDA

De los 53 pacientes diagnosticados de leucemia aguda en este periodo (29 varones y 24 mujeres

con edades comprendidas entre los 9 y 85 años), sólo 17 realizaron el seguimiento en la CUN

(Tabla 10).

El estudio genético y molecular fue realizado por el Departamento de Genética de la Universidad

de Navarra:

- El cariotipo de bandas G se realizó en todos los pacientes.

- La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) para estudiar la reordenación del gen MLL.

- El análisis molecular a partir de ARN, para detectar la presencia de los siguientes

transcritos quiméricos:

. MLL-AF4, consecuencia de la t(4;11)(q21;q23)

. EA2-PBX1, consecuencia de la t(1;19)(q23;p13)

. TEL-AML1, consecuencia de la t(12;21)(p13;q22)

. BCR-ABL, consecuencia de la t(9;22)(q34;q11), M-bcr o m-bcr

. AML1-ETO, consecuencia de la t(8;21)(q22;q22)

. PML-RAR, consecuencia de la t(15;17)(q24;q21)

- El análisis molecular a partir de ADN, para detectar la presencia de duplicaciones internas

en tándem (ITD) y/o de la mutación puntual D835 del gen FLT3, así como para detectar la

presencia de deleciones y/o inserciones en el Exón 12 del gen NPM-1.

B. APLICACIÓN CLÍNICA DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD


59

2. MIELOMA MÚLTIPLE

Con respecto a los pacientes con mieloma múltiple, se diagnosticaron 93 pacientes (60 varones

y 33 mujeres; edad media, 64 años; rango de edad, 34-85 años), de los cuales 37 realizaron

seguimiento en la CUN (Tabla 11).

El medulograma fue realizado por la Unidad de Morfología del Servicio de Hematología de la

Clínica Universidad de Navarra. Se tiñeron las extensiones con May Grünwald Giemsa y se

analizaron por microscopía óptica.

El proteinograma y la inmunofijación se realizaron en el laboratorio de Proteínas del Servicio de

Bioquímica de la Clínica Universidad de Navarra, mediante los kits HYDRAGEL PROTEIN (E)

15/30 e HYDRAGEL 4 IF (Sebia, Lisses, Francia) respectivamente. Las electroforesis se llevaron

a cabo con el equipo HYDRASYS Focussing (Sebia).

La técnica de cadenas libres en suero (sFLC), incorporada en Febrero de 2009, se realizó con el

kit Freelite (The Binding Site Ltd, Birmingham, Reino Unido), también en el laboratorio de

Proteínas.


60

Tabla 10: Descripción del grupo de pacientes diagnosticados de Leucemia Aguda (LA).

Identificación del paciente

Sexo Edad Diagnóstico Seguimiento

en CUN

LA-1 M 19 LLA pre-B (B-III) LA-2 M 46 LLA pre-B (B-III) Si LA-3 M 56 LLA común (B-II) Si LA-4 V 60 LLA pre-B (B-III) LA-5 V 49 LLA pre-B (B-III) LA-6 V 72 LLA común (B-II) LA-7 V 9 LLA común (B-II) Si LA-8 M 43 LLA pre-B (B-III) LA-9 V 11 LLA común (B-II) Si LA-10 M 13 LLA común (B-II) Si LA-11 V 59 LLA pro-B (B-I) LA-12 M 53 LLA B madura (B-IV) LA-13 V 46 LLA común (B-II) Si LA-14 V 48 LLA pre-B (B-III) LA-15 M 18 LLA pre-T (T-II) LA-16 M 30 LLA pre-T (T-II) Si LA-17 V 69 LA Bifenotípica T-Mieloide Si LA-18 M 15 LA Bifenotípica T-Mieloide Si LA-19 V 69 LA Bifenotípica T-Mieloide LA-20 V 72 LMA M2 Si LA-21 M 9 LMA M2 LA-22 V 69 LMA M5 LA-23 V 70 LMA M2 LA-24 M 19 LMA M4 LA-25 V 45 LMA M2 LA-26 V 79 LMA M0 LA-27 V 49 LMA M1 LA-28 M 70 LMA secundaria a SMD LA-29 M 58 LMA M2 Si LA-30 V 81 LMA M2 LA-31 V 51 LMA M2 Si LA-32 M 31 LMA secundaria a SMD Si LA-33 M 79 LMA M2 LA-34 M 71 LMA M1 LA-35 V 68 LMA M2 LA-36 V 74 LMA M4 LA-37 M 78 LMA M5 LA-38 M 85 LMA M1 LA-39 M 69 LMA M2 LA-40 M 75 LMA M0 LA-41 V 21 LMA M2 Si LA-42 V 75 LMA secundaria a SMD LA-43 V 77 LMA M5 secundaria a SMD LA-44 V 80 LMA M2 Si LA-45 V 55 LMA M3 LA-46 M 69 LMA M4 LA-47 V 16 LMA M3 LA-48 M 53 LMA M1 Si LA-49 V 68 LMA M2 LA-50 V 22 LMA M5 LA-51 V 76 LMA M7 secundaria a SMD LA-52 M 55 LMA M4 LA-53 M 45 LMA M1 Si


61

Tabla 11: Descripción del grupo de pacientes diagnosticados de Mieloma Múltiple (MM).


Sexo Edad Diagnóstico Estadio

Durie-Salmon Estadio

ISS Seguimiento

en CUN

MM-1 V 69 MM IgG L IIA I

MM-2 V 56 MM Q IgG K IIA I Si

MM-3 M 70 MM IgG K IIIB III Si

MM-4 V 63 MM IgG K IIIA II Si

MM-5 V 55 MM IgG K IIIA I Si

MM-6 V 62 MM BJ K IIIA I Si

MM-7 V 54 MM K IIA I Si

MM-8 M 68 MM IgA K IIIA II Si

MM-9 V 55 MM IgG K IIA I Si

MM-10 V 48 MM IgG K IIA I Si

MM-11 M 53 MM L IIIA II Si

MM-12 M 70 MM BJ K IIIA I Si

MM-13 M 64 MM BJ K IIIB III Si

MM-14 V 54 MM IgG K IIIA II Si

MM-15 V 68 MM IgA K IIIA I Si

MM-16 V 60 MM BJ K IIIA II Si

MM-17 V 70 MM BJ K IIIA III Si

MM-18 V 54 MM IgG L IIIA III Si

MM-19 M 64 MM IgG K IIIA I Si

MM-20 V 53 MM IgA K IIA III Si

MM-21 V 69 MM IgG L IA I Si

MM-22 M 59 LCP

Si

MM-23 V 52 LCP

Si

MM-24 M 49 MM IgG L IIIA III Si

MM-25 M 51 MM IgA K IIA I Si

MM-26 V 63 MM IgA K IA I

MM-27 V 62 MM IgG L IIIA I

MM-28 M 68 MM IgA K IA I

MM-29 V 62 MM IgG L IIIA II

MM-30 V 65 MM IgG L IIA I

MM-31 V 60 MM IgG K IIIA I

MM-32 V 55 MM IgG L IA I

MM-33 V 63 MM IgG K IIIA III

MM-34 V 34 MM BJ L IIIA I

MM-35 M 69 MM BJ K IIIA I

MM-36 V 63 MM BJ L IA I

MM-37 V 80 MM IgA L IA I

MM-38 V 47 MM IgG K IA II

MM-39 V 68 MM IgA L IIIA I

MM-40 M 80 MM IGA K IA I


MM-42 V 68 MM IgG K IIB I-II

MM-43 V 67 MM Q IgG L IA II

MM-44 M 73 MM IgG L IIIA I Si

MM-45 V 59 MM IgA L IIIA I Si

MM-46 V 69 MM IgG K IIIA I Si

MM-47 V 63 MM IgA K IIIA I

MM-48 M 81 MM IgG K IIA II


62

Tabla 11: (continuación)


Sexo Edad Diagnóstico Estadio

Durie-Salmon Estadio

ISS Seguimiento

en CUN

MM-49 V 79 MM IgG K IIIA III

MM-50 V 65 MM IgG K IIIA II

MM-51 M 64 MM IgA K IA I

MM-52 M 71 MM IgA K IIIA III

MM-53 V 62 MM BJ L IIIA II

MM-54 M 62 MM IgG K IIA II

MM-55 M 49 MM IgA L IIA I

MM-56 M 73 MM IgA K IIIA I

MM-57 V 73 MM IgA K IIIA III

MM-58 M 73 MM IgG K IIIA I

MM-59 M 58 MM Q IgG K IA I

MM-60 V 50 MM Q IgA L IA I Si

MM-61 V 60 MM IgG L IA I Si

MM-62 V 59 MM IgG K IA III

MM-63 V 59 MM IgA L IIA I

MM-64 V 71 MM IgA K IIIA I

MM-65 M 65 MM IgA L IA I

MM-66 M 65 MM IgG L IIA II


MM-68 M 64 MM BJ K IIIB III Si

MM-69 V 69 MM IgG K II A II

MM-70 V 80 MM IgG L IIIA III

MM-71 M 63 MM IgA K IIIA III

MM-72 V 73 MM IgG L IA I

MM-73 M 70 MM IgG K IIA I

MM-74 V 67 MM IgG K IIB III

MM-75 V 73 MM IgG L IB III

MM-76 V 77 MM BJ L IIIB III

MM-77 V 70 MM Q IgG K IA I

MM-78 V 62 MM IgG K IIA I

MM-79 V 65 MM BJ L IA I

MM-80 M 73 MM IgG K IIIA II Si

MM-81 M 46 MM Q K IA I Si

MM-82 V 85 MM IgG K IIIA II

MM-83 V 65 MM Q IgA K IA II

MM-84 V 64 MM IgA L IIA I Si

MM-85 V 78 MM IgG K IA II

MM-86 M 54 MM IgA K IIIA II Si

MM-87 M 57 MM L IIA I

MM-88 V 58 MM IgG K IA I

MM-89 M 79 MM IgA L IA II Si

MM-90 M 46 MM IgG L IA I Si

MM-91 V 69 MM BJ L IIIA I Si

MM-92 M 63 MM IgA K IIIA II

MM-93 H 71 MM IgG K IIA III

MM Q, Mieloma múltiple quiescente; LCP, Leucemia de células plasmáticas; BJ, Bence-Jones; K, cadena ligera Kappa; L, cadena ligera Lambda.

Resultados

Esther Domingo Rodríguez Resultados

65

1. ANÁLISIS DE EXACTITUD

Se analizaron cuatro muestras de MO de pacientes con MM, con EMR en torno a 10-4 y cuatro

muestras de SP de pacientes con LLC-B también con EMR en torno a 10-4. Cada una de estas

muestras se analizó cinco veces, en cinco procedimientos independientes de marcaje,

adquisición y análisis, considerándose como valor real de infiltración de la muestra la media de

las cinco determinaciones (Tabla 12a). En cada procedimiento se adquirieron 500000 leucocitos

y se detectaron alrededor de 100 células tumorales.

Las ocho muestras se diluyeron 1:10 con leucocitos de SP de individuos sanos, con el fin de

generar muestras con EMR en torno a 10-5. Se analizó la EMR en las muestras diluidas por

medio de la adquisición de 3 y 6 millones de leucocitos.

Como muestra la Tabla 12b, los resultados obtenidos en las muestras diluidas son los esperados

±10%, tanto para clusters en torno a 100 eventos como para clusters menores.

La exactitud, por tanto, se mantiene en la técnica de alta sensibilidad.

A. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD


66

Tabla 12a: Cuantificación de EMR por CF en muestras de MO de MM y LLC-B con infiltración en

torno a 10-4

Caso Determinación

D1 D2 D3 D4 D5

MM1 EMR (%) 0,0143 0,0128 0,0122 0,0121 0,0124 0,0127

Nº eventos cluster 91 99 94 98 87 94

MM2 EMR (%) 0,018 0,0176 0,0178 0,017 0,0168 0,017


MM3 EMR (%) 0,013 0,0129 0,013 0,0106 0,0116 0,012


MM4 EMR (%) 0,025 0,02 0,021 0,02 0,022 0,02


LLC-B1 EMR (%) 0,0151 0,0149 0,0135 0,0159 0,0159 0,015


LLC-B2 EMR (%) 0,024 0,022 0,025 0,026 0,023 0,024


LLC-B3 EMR (%) 0,022 0,025 0,0287 0,0255 0,022 0,025


LLC-B4 EMR (%) 0,0263 0,0197 0,0236 0,022 0,0197 0,022


Cada muestra se sometió a 5 procedimientos independientes de marcaje, adquisición y análisis (D1-D5).

Tabla 12b: Cuantificación de EMR en dichas muestras, diluidas 1:10 con leucocitos de SP de

individuos sanos.

Muestra Muestra diluida 1:10

Leucocitos adquiridos (millones) 0,5 3 6

MM1

EMR (%) Nº eventos cluster

0,0127 78

0,00125 35

0,00127 54

MM2


0,017 87

0,0018 41

0,0017 100

MM3


0,012 82

0,00117 35

0,00118 87

MM4


0,02 107

0,0019 58

0,0018 99

LLC-B1


0,015 78

0,0015 62

0,0014 114

LLC-B2


0,024 124

0,0024 105

0,0022 181

LLC-B3


0,025 139

0,0024 77

0,0024 151

LLC-B4


0,022 122

0,0023 68

0,0024 157

Las muestras diluidas se analizaron adquiriendo 3 ó 6 millones de leucocitos, detectando por tanto dos tamaños diferentes de cluster tumoral.


67

2. ANÁLISIS DE ESPECIFICIDAD

Para comprobar si la adquisición de 6 millones de leucocitos implica un aumento del ruido de

fondo que pueda repercutir en la especificidad de la técnica, se procedió a la búsqueda de

células con fenotipo tumoral en muestras de donantes sanos, adquiriendo un número aún más

elevado de leucocitos totales.

Se adquirieron 10 millones de leucocitos de médula ósea de individuos sanos y se procedió a la

búsqueda de células con fenotipo de MM (n=3) y análogamente, se adquirieron 10 millones de

leucocitos de sangre periférica de individuos sanos para buscar células con fenotipo de LLC-B

(n=3). Realizamos también controles negativos de otras entidades como linfoma folicular y

tricoleucemia, analizando sangre periférica de controles sanos en busca de células con el

fenotipo de cada una de estas entidades (Figuras 11 y 12).

Estos controles negativos se codificaron durante su adquisición, entremezclándose con muestras

de pacientes, también codificadas, para garantizar que el análisis fuera realmente ciego.

Los resultados se muestran en las Figuras 11-14. Como se puede observar, en ningún caso

identificamos un cluster de eventos con fenotipo patológico.

Concluimos, por tanto, que la especificidad se mantiene en la técnica de citometría de alta

sensibilidad.

a. b.

Figura 11: Análisis de EMR en una muestra de SP de un paciente con tricoleucemia (a) y en una

muestra de SP control (b). En rojo están representadas las células tumorales (CD20+ CD103+) y

en gris los leucocitos normales. No se observan células con fenotipo de tricoleucemia en la

muestra control.

CD

10

3

3

CD

10

3

3

CD20 CD20


68

a. b.

Figura 12: Análisis de EMR en una muestra de MO de un paciente con linfoma folicular (a) y en

una muestra de MO control (b). En rojo están representadas las células tumorales (CD38-

CD10d+) y en gris los leucocitos normales. No se observan células con fenotipo de linfoma

folicular en la muestra control.

a. b.

Figura 13: Análisis de EMR en una muestra de SP del paciente LLC-B3 (a) y en una muestra de

SP de un control sano (b). En rojo están representadas las células LLC-B (CD20d+ CD22d+ CD5+

CD23+) y en gris los linfocitos B normales. No se observan células con fenotipo de LLC-B en la

muestra control.

CD

38

8

CD

38

8

CD10 CD34


69

a. b.

Figura 14: Análisis de EMR en una muestra de MO del paciente MM2 (a) y en una muestra de

MO de un control sano (b). En rojo están representados los eventos mielomatosos (CD38++

CD138++ CD56++ CD19- CD117+ CD45-). En verde observamos las células plasmáticas normales

(CD38+++ CD138++ CD56- CD19+ CD117- CD45+). No se observan células con fenotipo de la

enfermedad en la muestra control.


70

3. ANÁLISIS DE PRECISIÓN

3.1. Coeficiente de variación

Analizamos cinco muestras de MO de pacientes con MM, cinco muestras de SP de pacientes

con LLC-B y cuatro de SP de pacientes con SLPC-T, todas ellas con una infiltración en torno a

10-4. De cada muestra se realizaron tres tipos de análisis: uno en el que se adquirieron 300000

leucocitos totales, necesarios para obtener un cluster de unos 30 eventos tumorales; otro en el

que se adquirieron 500000 leucocitos, para que el tamaño del cluster tumoral fuera de 50

eventos, y por último, un tercer análisis en el que se adquirió 1 millón de leucocitos detectando

unos 100 eventos tumorales. Cada determinación se realizó cinco veces, calculándose el CV a

partir de la media y la desviación típica de las cinco mediciones.

Como muestran los resultados de la Tabla 13, tanto las muestras de LLC-B como los SLPC-T

parecen seguir la distribución de Poisson. El CV disminuye a medida que aumenta el número de

eventos del cluster. En general basta con 50 eventos para que el CV sea aceptable, en torno al

15%. Sin embargo, no ocurre lo mismo con las muestras de MM, en las que el CV es siempre

≤10% independientemente del tamaño del cluster.

Una posible explicación a este hecho son las características inmunofenotípicas de las células

plasmáticas mielomatosas. Su alta intensidad de expresión de CD38, su negatividad para CD45

y su homogeneidad en la expresión de marcadores, hacen que se sitúen en un espacio

especialmente vacío, libre de ruido de fondo y que se identifiquen y diferencien del resto de

células de la MO de una manera más inequívoca que el resto de hemopatías estudiadas. Esto

podría implicar que se requirieran menores tamaños de cluster para conseguir una misma

precisión.


71

Tabla 13: Coeficiente de variación (CV) del porcentaje de EMR de muestras de MO de cinco

pacientes con mieloma múltiple (MM) y de SP de cinco pacientes con leucemia linfática crónica B

(LLC-B) y cuatro con síndrome linfoproliferativo crónico T (SLPC-T), en relación al número de

eventos del cluster.

Nº eventos del

cluster EMR (%)

CV (%)

CV Poisson (%)

MM Caso 1 19 0,0127 9 23

43 0,013 10 15

94 0,0127 10 10

Caso 2 30 0,018 10 18

44 0,017 10 15

87 0,017 9 11

Caso 3 25 0,012 10 20

38 0,011 10 16

82 0,012 10 10

Caso 4 39 0,021 8 16

54 0,02 10 14

107 0,02 10 10

Caso 5 22 0,0027 9 21

42 0,003 10 15

91 0,003 8 10

LLC-B Caso 1 26 0,016 20 20

36 0,014 19 17

78 0,015 11 11

Caso 2 37 0,023 18 16

60 0,023 14 13

124 0,024 7 9

Caso 3 37 0,022 13 16

55 0,023 9 13

139 0,025 10 9

Caso 4 36 0,021 9 17

62 0,023 12 13

122 0,022 10 10

Caso 5 31 0,049 3 18

55 0,051 7 13

130 0,05 9 9

SLPC-T Caso 1

30 0,04 12 18

50 0,038 12 14

272 0,04 4 6

Caso 2 25 0,025 20 20

47 0,024 13 15

79 0,026 11 11

Caso 3 48 0,031 12 14

86 0,032 8 11

186 0,032 8 7

Caso 4 57 0,031 12 13

106 0,031 8 10

193 0,03 2 7

CV corresponde al coeficiente de variación del grado de EMR observado, calculado como (desvío

estándar/media)×100. CV Poisson es el CV predicho por la distribución de Poisson en función del número de

eventos del cluster (n): CV=100/√n.


72

Con el objetivo de testar esta hipótesis, se eligieron dos muestras de LA (LLA1 Y LMA1) con

EMR en torno a 10-4 con características fenotípicas similares en cuanto a homogeneidad del

cluster y colocación en espacios libres de ruido de fondo (Figura 15; Material y Métodos,

apartado A.2).

Se diluyeron 1:10 con leucocitos de SP de controles sanos para generar infiltración en torno a

10-5. Las muestras diluidas se analizaron por triplicado para tamaños diferentes de cluster

tumoral, calculando el CV del porcentaje de EMR obtenido. Como se puede observar en la Tabla

14, ambas muestras se comportaron según lo predicho por la distribución de Poisson, y por tanto

de manera diferente al MM.

Figura 15: Características inmunofenotípicas de las células tumorales de LMA1 que las sitúan

en un espacio totalmente vacío (izquierda) y homogeneidad del cluster tumoral de LLA1

(derecha).


73

Tabla 14: Coeficiente de variación (CV) del porcentaje de EMR en dos muestras de LA, en

relación al número de eventos del cluster.

EMR (%) Nº eventos cluster (n)

CV (%)

CV Poisson (%)

LLA2 0,002 28 21 18,9 45 14 14,9 78 14 11,3

LMA1 0,001 23 25 21 35 14 17

CV corresponde al coeficiente de variación del grado de EMR observado, calculado como (desvío estándar/media)×100. CV

Poisson es el CV predicho por la distribución de Poisson en función del número de eventos del cluster (n): CV=100/√n.

3.2. Intervalo de confianza

Aunque el CV es el parámetro estadístico de uso más extendido para calcular precisión, en la

distribución de Poisson el estadístico que mejor define la precisión es el intervalo de confianza

(IC95) (Harvey Motulsky, 2010), que se calculó tal y como se explica en Material y Métodos

(apartado 9, pag.57). Los resultados se muestran en la Tabla 15.

Como cabría esperar, la amplitud del IC disminuye al aumentar el número de eventos del cluster

tumoral. Sin embargo, se observa que a partir de un tamaño de cluster de aproximadamente 50

células tumorales, la ganancia de precisión que se produce al aumentar el tamaño del cluster no

es significativa.

En resumen, el análisis de la precisión permite concluir que es suficiente la detección de 50

células tumorales. Esto implica que se alcanza una sensibilidad de10-5 en cuanto se analizan 5

millones de leucocitos.


74

Tabla 15: Intervalo de confianza del 95% del número de eventos del cluster y del porcentaje de

EMR en muestras de cinco pacientes con mieloma múltiple (MM), cinco con leucemia linfática

crónica B y cuatro con síndrome linfoproliferativo crónico T (SLPC-T).

Nº eventos del cluster (n) IC95

de n

IC95

del % EMR D1 D2 D3 D4 D5

MM Caso 1

19 18 18 21 21 19 16 - 23 0,0101 - 0,0152

43 48 35 57 33 43 37 - 49 0,0149 - 0,0195

91 99 94 98 87 94 85- 102 0,0167 - 0,0200

Caso 2 25 28 36 32 29 30 25 - 35 0,0187 - 0,0259

54 41 37 46 42 44 38 - 50 0,0152 - 0,0199

90 84 85 88 86 87 78 - 95 0,0158 - 0,0191

Caso 3 27 23 21 28 26 25 21 - 29 0,0100 - 0,0142

45 34 45 36 32 38 33 - 44 0,0096 - 0,0128

87 88 89 70 74 82 74- 90 0,0111 - 0,0135

Caso 4 37 43 37 41 37 39 33- 44 0,0221 - 0,0294

59 56 48 47 61 54 45 - 61 0,0191 - 0,0243

114 102 104 105 110 107 98- 116 0,0205 - 0,0242

Caso 5 24 22 20 21 25 22 18 - 26 0,0022 - 0,0032

49 35 43 45 38 42 36- 48 0,0026 - 0,0034

82 95 98 83 97 91 83 - 99 0,0030 - 0,0036

LLC-B Caso 1 30 30 19 30 19 26 21- 30 0,0135 - 0,0191

45 38 40 32 27 36 31 - 42 0,0120 - 0,0160

68 77 70 93 83 78 70 - 86 0,0136 - 0,0166

Caso 2 36 32 26 41 48 37 31- 42 0,0197 - 0,0263

71 65 53 51 60 60 53 - 67 0,0204 - 0,0257

124 113 130 135 119 124 114 - 134 0,0221 - 0,0259

Caso 3 40 30 38 42 34 37 31 - 42 0,0188 - 0,0251

60 53 47 56 57 55 48 - 61 0,0177 - 0,0225

141 138 136 140 141 139 129– 149 0,0234 – 0,0272

Caso 4 36 38 30 38 36 36 30- 41 0,0179 - 0,0241

53 66 59 60 73 62 55- 69 0,0201 - 0,0252

144 108 129 121 108 122 112 - 132 0,0205 - 0,0241

Caso 5 32 32 30 32 28 31 26 - 36 0,0742 - 0,1020

54 58 49 58 55 55 48- 61 0,0740 - 0,0939

131 141 106 126 148 130 120 - 140 0,0927 - 0,1081

SLPC-T Caso 1 32 27 25 34 30 30 25- 34 0,2531 - 0,3503

47 57 43 46 59 50 44- 57 0,2321 - 0,2975

284 271 280 269 259 273 258- 287 0,2743 - 0,3051

Caso 2 34 31 23 17 21 25 21- 30 0,0210 - 0,0299

53 38 46 47 52 47 41- 53 0,0209 - 0,0271

76 73 72 93 80 79 71 - 87 0,0240 - 0,0292

Caso 3 52 45 51 40 53 48 42- 54 0,0274 - 0,0353

83 98 86 82 80 86 78 - 94 0,0288 - 0,0349

185 202 184 149 210 186 174- 198 0,0330 - 0,0375

Caso 4 48 54 62 64 58 57 51 - 64 0,0281 - 0,0355

113 97 106 103 113 106 97- 115 0,0335 - 0,0397

187 192 189 203 193 193 181- 205 0,0570 - 0,0646

Cada muestra se sometió a 5 procedimientos independientes de marcaje, adquisición y análisis. IC95 del número de

eventos del cluster se calculó según la fórmula IC= [(n-1,96n)/5] - [(n+1,96n)/5], siendo n la suma del número de

eventos del cluster de las 5 determinaciones. IC95 del porcentaje de EMR se calculó dividiendo cada término del

intervalo anterior entre la media de leucocitos adquiridos en las 5 determinaciones y multiplicando el resultado por

100.


75

4. TIEMPO DE ADQUISICIÓN

Como se explicó en Material y Métodos, la adquisición de 6 millones de leucocitos con la tasa de

flujo que habitualmente usamos en nuestro laboratorio (2000 eventos/seg) cuesta prácticamente

1 hora. Parece un tiempo excesivo, teniendo en cuenta que en cada estudio de EMR se utiliza

más de una combinación de anticuerpos monoclonales. Por este motivo, quisimos explorar la

posibilidad de aumentar la tasa de flujo en la adquisición de las muestras, mediante un aumento

en la concentración celular del tubo de adquisición (sin modificar la concentración de marcaje).

Se adquirieron 6 muestras, 3 de SP y 3 de MO con concentraciones celulares crecientes en el

tubo de adquisición, consiguiendo tasas de flujo también crecientes y se calculó el porcentaje de

abortos electrónicos, es decir, eventos coincidentes que pasan conjuntamente delante del láser y

que el aparato elimina al no poder reconocer las características individuales de cada célula

(Tabla 16). Con la tasa habitual de 2000 eventos/seg, el porcentaje de abortos electrónicos fue

de 1,5%. Este porcentaje aumentó a medida que aumentó la tasa de adquisición, alcanzando

valores en torno al 5% para una tasa de 7500 eventos/seg.

A la vista de los resultados, consideramos que 4000 eventos/seg podría ser una tasa de

adquisición razonable, ya que el porcentaje de abortos electrónicos fue tan sólo del 2,6%.

Con el fin de determinar si una tasa de adquisición de 4000 eventos/seg pudiera afectar al

porcentaje de EMR obtenido, analizamos muestras de MO de tres pacientes con mieloma

múltiple (MM) y tres de SP de pacientes con leucemia linfática crónica B (LLC-B) y cuantificamos

su porcentaje de EMR adquiriendo las muestras a 2000 y 4000 eventos/seg. Como se puede

observar en la Figura 16, los resultados obtenidos fueron similares con ambas tasas de flujo

(r=0,99).

Por tanto, se puede aumentar la tasa de flujo a 4000 eventos/seg, lo que reduce el tiempo de

adquisición aproximadamente a media hora por cada 6 millones de leucocitos, haciendo

aplicable la técnica de alta sensibilidad a la práctica diaria.


76

Tabla 16: Medida del porcentaje de abortos electrónicos para tasas de flujo crecientes en la

adquisición de las muestras.

Concentración celular *

(millones /mL)

Tasa de adquisición

(eventos/seg)

Abortos electrónicos

(%)

0,25 600 0,4

0,5 1200 0,8

1 2250 1,5

2 3800 2,6

4 6300 4,3

5 7500 5,3

* en el tubo de adquisición.

Figura 16: Análisis de EMR en muestras adquiridas a 2000(□) y 4000() eventos/segundo.

MM 6 MM 7 MM 8 LLC 6 LLC 7 LLC 80.000

0.005

0.010

0.0150.03

0.04

0.05

EM

R (

%)

EMR (%)

Tasa de adquisición

2000 (eventos/seg)

4000 (eventos/seg)

MM6 0,001 0,00098

MM7 0,01 0,01

MM8 0,04 0,04

LLC-B6 0,01 0,0097

LLC-B7 0,01 0,0087

LLC-B8 0,006 0,006


77

5. COMPARACIÓN CON RQ-PCR DE BCR-ABL

Tal y como se explica en Material y Métodos, se comparó el análisis de EMR realizado por

citometría de flujo de alta sensibilidad y PCR cuantitativa a tiempo real (RQ-PCR).

Se utilizó una muestra de médula ósea, del paciente LLA1 (LLA-BII Phi+) (ver Material y

Métodos, apartado A.2, pag. 44).

La muestra original, que mostraba una infiltración de 1,5% (10-2) y sus tres diluciones sucesivas

1:10 con leucocitos de SP de un control sano, se analizaron por citometría de flujo (CF) y RQ-

PCR de BCR-ABLp190 (Figura 17 y Tabla 17).

Como se puede observar, con ambas técnicas se obtienen resultados similares (r=0,99).

Muestra original

Dilución 1/10 Dilución 1/100 Dilución 1/1000

1,5%

0,16% 0,016% 0,001%

Figura 17: Porcentaje de infiltración de la muestra LLA1 (arriba) y de sus tres diluciones

sucesivas 1:10 (abajo), detectado por citometría de flujo.


78

Tabla 17: Cuantificación de EMR por CF (□) y RQ-PCR () en una muestra de MO del paciente

LLA1 y en sus tres diluciones sucesivas 1:10.

M 10-3 10-4 10-5

0.000

0.0010.010.060.110.160.210.260.31

12345

EM

R (

%)

Muestra Diluciones sucesivas

1:10 1:100 1:1000

% EMR por CF 1.5 0.16 0.016 0.001

% EMR por RQ-PCR 4.9 0.33 0.025 0.001


79

6. COMPARACIÓN CON PCR DE BCL2-JH EN PACIENTES CON LINFOMA FOLICULAR

En 82 pacientes con diagnóstico de Linfoma Folicular (LF), se realizó estudio de citometría

estándar (CFe) en MO con el fin de detectar infiltración en el momento del diagnóstico. Como se

muestra en la Tabla 18, se observó infiltración en el 48% de los pacientes (mediana=0,55%;

rango: 0,01-36%).

Tabla 18: Infiltración en MO de pacientes con linfoma folicular en el momento del diagnóstico,

detectado por CF estándar.

ID CFe (%)

F1 0,14 F2 1 F3 - F4 - F5 3,7 F6 5,5 F7 - F8 - F9 - F10 36 F11 3,3 F12 - F13 - F14 0,11 F15 0,06 F16 - F17 - F18 1,6 F19 - F20 3,4 F21 0,053 F22 - F23 - F24 0,17 F25 - F26 - F27 - F28 - F29 - F30 1,6 F31 0,4 F32 - F33 - F34 - F35 - F36 7,4 F37 0,5 F38 7 F39 - F40 6,5 F41 -

ID CFe (%)

F42 - F43 22 F44 - F45 0,01 F46 - F47 - F48 - F49 0,017 F50 0,02 F51 - F52 - F53 - F54 7 F55 - F56 6 F57 4 F58 - F59 0,28 F60 10,8 F61 36 F62 0,11 F63 0,11 F64 - F65 2 F66 0,46 F67 0,5 F68 0,12 F69 - F70 0,04 F71 - F72 - F73 - F74 0,07 F75 0,14 F76 - F77 - F78 - F79 1,8 F80 0,55 F81 - F82 0,26


80

En 36 pacientes que presentaban la t(14;18) se comparó el resultado obtenido por CFe con el

análisis molecular del gen de fusión BCL2-JH. Como se observa en la Tabla 19, la concordancia

entre citometría de flujo estándar y PCR fue del 55,5%. La CFe presentó 39% de falsos

negativos, y el PCR 5,5%.

Tabla 19: Comparación de la infiltración detectada en MO de pacientes con linfoma folicular por

CF estándar y por PCR de BCL2-JH.

ID CFe (%) BCL2-JH

Concordancias F6 5,5 + F10 36 + F14 0,11 + F18 1,6 + F20 3,4 + F24 0,17 + F40 6,5 + F49 0,017 + F56 6 + F59 0,28 + F61 36 + F63 0,11 + F70 0,04 + F74 0,07 + F75 0,14 +

F28 - - F35 - - F48 - - F52 - - F71 - -

Discordancias F3 - + F9 - + F16 - + F19 - + F22 - + F26 - + F29 - + F41 - + F46 - + F53 - + F55 - + F64 - + F78 - + F81 - +

F21 0,053 - F45 0,01 -

(n=36) CFe + CFe -

BCL2-JH+ 15 14 BCL2-JH- 2 5


81

De 11 pacientes que presentaban infiltración linfomatosa en MO al diagnóstico, se recibió

muestra tras el tratamiento, realizándose estudio de citometría de alta sensibilidad. Como se

observa en la Tabla 20, la concordancia entre CF de alta sensibilidad (CFa) y PCR fue del 91%.

Únicamente se observó una discordancia, correspondiente al paciente F75, en el cual no se

detectó infiltración linfomatosa por citometría a pesar de haber analizado 5,4 millones de

leucocitos.

Tabla 20a: Comparación de la infiltración detectada en MO por CF de alta sensibilidad (CFa) y

PCR de BCL2-JH durante el seguimiento de pacientes con linfoma folicular.

ID CFa (%)

BCL2-JH

F14 - -

F14 - -

F18 - -

F40 - -

F40 - -

F56 - -

F59 - -

F61 - -

F63 - -

F70 0,03 +

F75 - +

En azul se muestra el resultado discrepante.

Tabla 20b: Resumen de la comparación entre PCR y CFa.

(n=11) CFa + CFa -

BCL2-JH+ 1 1

BCL2-JH- 0 9


82

1. PACIENTES CON LEUCEMIA AGUDA

La técnica de citometría de alta sensibilidad se aplicó a aquellos pacientes diagnosticados de

leucemia aguda entre Enero del 2006 y Mayo del 2011, cuyo seguimiento se realizó en la CUN.

Sus datos demográficos se detallaron en Material y Métodos.

1.1. Leucemia Linfoblástica Aguda

Paciente LA2: Leucemia Linfoblástica Aguda pre-B (B-III)

- Fenotipo: CD45-, CD34+d, CD38+d, CD19+, CD10++, CD20+, CD22cito+, TdT+, µcito

+, HLA-DR++,

resto de marcadores T y mieloides negativos.

- Ventana de adquisición: CD19+/SSC

- Análisis molecular: presencia del transcrito quimérico BCR-ABLp210 (Phi+).

ID Diagnóstico Determinación Citometría Análisis

molecular (%) S

LA 2 LLA pre-B (B-III) Diagnóstico 1. 76 Phi+

Inducción

2. Post-Ind 0,005 nd

Reinducción

3. Post-Reind NEG 10-4-10-5 +

S, Sensibilidad; nd, no determinado

B. APLICACIÓN CLÍNICA DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD


83

Paciente LA3: Leucemia Linfoblástica Aguda B común (B-II)

- Fenotipo: CD45++, CD34++, CD38-, CD19+, CD10-/+, CD20+ (60%), CD22cito+, TdT+d, µcito

-, HLA-

DR+++, CD15-/+ (34%), CD123+d, resto de marcadores T y mieloides negativos.


- Análisis molecular: presencia del transcrito BCR-ABLp190 (Phi+).


molecular (%) S

LA 3 LLA común (B-II) Diagnóstico 1. 44 Phi+

Inducción

2. +14d 0,02 nv

3. Post-Ind NEG 10-4-10-5 NEG

Consolidación

4. +28d NEG 10-4-10-5 NEG

5. +2m NEG 10-5 NEG

Mantenimiento

6. +3m NEG 10-5 NEG

Alo-Tx (+8m)

7. +16d NEG 10-4-10-5 NEG

8. +89d NEG 10-5 NEG

9. +167d NEG 10-5 NEG

10. +347d NEG 10-5-10-6 NEG

nv, no valorable; d, día; m, mes; Alo-Tx, trasplante alogénico


- Fenotipo: CD45-, CD34+, CD38+, CD19+, CD10++, CD20-, CD22cito+, TdT+d, µcito

-, HLA-DR+++,

CD123+, CD33+, CD13+ y CD117+d, resto de marcadores T y mieloides negativos.


- Análisis molecular: presencia del transcrito quimérico TEL-AML1.


84


molecular (%) S

LA 7 LLA común (B-II) Diagnóstico 1. 59 TEL-AML1+

Inducción

2. +14d 8,5 +

3. +28d 0,26 nd

4. Post-Ind 0,0017 nd

Consolidación

5. Post-Cons NEG 10-5-10-6 NEG

Reind/Cons

6. +35d NEG 10-4-10-5 NEG

Mantenimiento

7. +6s NEG 10-4-10-5 NEG

8. +7m NEG 10-5 NEG

9. Post-Mant NEG 10-4-10-5 NEG

s, semana.


- Fenotipo: CD45-, CD34-, CD38++, CD19+, CD10+, CD20-, CD22cito+d, TdT+d, µcito

-, resto de

marcadores T y mieloides negativos.

- Fenotipo recaída: CD45+d (84%), CD34+ (38%), CD38- , CD22cito+d, CD19+, CD10-, CD20-,

TdT+, µcito-, MPO+ (66%), resto de marcadores T y mieloides negativos.


- Análisis molecular: ausencia de los transcritos quiméricos rastreados.


85


molecular (%) S

LA 9 LLA común (B-II) Diagnóstico 1. 78 NEG

Inducción

2. +14d 5,4

3. Post-Ind 0,001

Consolidación

4. Post- Cons NEG 10-5-10-6

Reind/Mant

5. Post-Mant NEG 10-4-10-5

Mantenimiento

6. Post- Mant NEG 10-4-10-5

7. +30m NEG 10-5

Recaída (+4a) 89

Inducción

8. +21d 2

9. Post-Ind 0,015

Consolidación

10. +28d NEG 10-5

11. +10s NEG 10-4-10-5

12. +4m NEG 10-5

Mantenimiento

13. +7d NEG 10-5-10-6

14. +10m NEG 10-4-10-5

15. +14m NEG 10-5

a, años. En rojo se muestra el fenotipo al diagnóstico y en azul el fenotipo de la recaída.


- Fenotipo: CD45+d, CD34-, CD38++, CD19+, CD10-, CD20+het (81%), CD22+d, CD22cito+, TdT-/d,

µcito-, CD33+d (41%), CD25+, resto de marcadores T y mieloides negativos.


- Análisis molecular: ausencia de los transcritos quiméricos analizados.


86


molecular (%) S

LA 10 LLA común (B-II) Diagnóstico 1. 96 NEG

Inducción

2. +14d 15,4

3. +35d 0,04

4. Post-Ind 0,02

Consolidación

5. Post-bloque 1 NEG 10-5

6. Post-bloque 2 NEG 10-5

Reind/Mant

7. Post-Mant NEG 10-4-10-5

Mantenimiento

8. Post-Mant NEG 10-5

Paciente LA13: Leucemia Linfoblástica Aguda B Común (B-II)

- Fenotipo: CD45+d, CD34+, CD38-/d, CD19+, CD10++, CD20+het (75%), CD22+d, CD22cito+, TdT+,

µcito-, CD33+d (49%), resto de marcadores T y mieloides negativos.

- Ventana de adquisición: CD34+/SSC (El tratamiento incluía Rituximab)

- Análisis molecular: ausencia de los transcritos quiméricos analizados.


molecular (%) S

LA 13 LLA común (B-II) Diagnóstico 1. 84,5 NEG

Inducción

2. +14d 59

Inducción

3. +28d 1,5

4. Post-Ind NEG 10-5-10-6

Consolidación

5. +6s NEG 10-5

6. Post-Cons NEG 10-5

Alo-Tx

7. +28d NEG 10-5


87

Paciente LA16: Leucemia Linfoblástica Aguda pre-T (T-II)

- Fenotipo: CD45+d, CD34+, CD38+, TdT+/- (53%), CD3cito+, CD3-, CD7++, CD2+/-, CD5+, CD1a-,

CD8-, CD4-, CD56+/- (49%), HLA-DR-, MPO-, CD33-/+ (45%), CD117+, CD11b-/+ (45%), resto de

marcadores B y mieloides negativos.

Los blastos de la primera recaída muestran cambios inmunofenotípicos, como la pérdida de

expresión de CD3cito, CD5, CD2, CD10 y TdT, el aumento de intensidad de CD56, CD33 y

CD117 y la expresión de MPO. En la segunda recaída no se observan cambios

inmunofenotípicos relevantes, aunque el análisis citogenético mostró un cariotipo complejo:

del(2)(p13),-9,-18,+mar.


- No se observaron alteraciones genéticas rastreables por biología molecular.


molecular (%) S LA 16 LLA pre-T (T-II) Diagnóstico 1. 24 NEG

Inducción

2. Post-Ind 0,03

Alo-Tx (+4m)

3. +28d NEG 10-4-10-5

4. +92d NEG 10-5

5. +185d 0,01

6. +311d NEG 10-5

7. +16m NEG 10-5-10-6

8. +22m NEG 10-4-10-5

Recaída 1(+2a) 9. 69

Inducción

10. Post-bloque 1 0,55

11. Post-bloque 2 0,06

Mantenimiento

12. Post-Mant 0,89

Consolidación

13. +21d 0,16

14. +2m 0,23

Recaída 2 (+9m) 15. 90 C+

Inducción

16. +14d 19,7

17. +28d NEG 10-5

En rojo se muestra el fenotipo al diagnóstico y en azul el fenotipo de la recaída. C+, presencia de alteraciones citogenéticas (ver texto).


88

1.2. Leucemia Aguda Bifenotípica

Paciente LA17: Leucemia Aguda Bifenotípica T-Mieloide

- Fenotipo: CD45+d, CD34+, TdT+ (79%), CD3cito+ (77%), CD7+, CD4+d (74%), HLA-DR-, MPO-/+

(24%), CD33+, CD13+d, CD117+, CD11b-/+ (34%), resto de marcadores estudiados negativos.

Es decir, tres puntos del score EGIL para linaje mieloide (CD13, CD33 y CD117) y 3 para linaje

T (CD3cito, CD7 y TdT) (Béné y col., 1995).




molecular (%) S

LA 17 LA Bifenotípica T-Mieloide Diagnóstico 1. 42 NEG

Inducción

2. Post-Ind 0,05

Consolidación

3. +14d NEG 10-5

4. +6s NEG 10-4-10-5

Mantenimiento

5. +1m NEG 10-5

Paciente LA18: Leucemia Aguda Bifenotípica T-Mieloide

- Fenotipo: CD45+d, CD34+, CD38++, CD3cito+d, CD3-, CD7+, CD2+, HLA-DR+, TdT+d, CD13+

(71%), CD117+, CD15+d/- (63%), CD11b-/+ (50%), resto de marcadores estudiados negativos.

Es decir, cuatro puntos del score EGIL para linaje T (CD3cito, CD7 y CD2) y 2,5 puntos para

linaje mieloide (CD13, CD117 y CD15) (Béné y col., 1995).




89


molecular (%) S

LA 18 LA Bifenotípica T-Mieloide Diagnóstico 1. 49 NEG

Inducción

2. +14d 8

3. +35d 0,7

4. +6s 0,08

5. +2m 0,007

Intensificación

6. +14d NEG 10-5

7. Post-Int 0,006

Reinducción

8. +28d 0,02

9. +6s 0,006

10. +3m NEG 10-4-10-5

11. Post-Reind 0,002

Mantenimiento

12. +2m NEG 10-5

13. +3m NEG 10-4-10-5

14. +5m NEG 10-5

15. Post-Mant NEG 10-5

Reinducción

16. +2m NEG 10-4-10-5

17. +4m NEG 10-5

18. +7m NEG 10-4-10-5

Fin Tratamiento

19. +1m NEG 10-4-10-5

20. +4m NEG 10-5

21. +6m NEG 10-4-10-5

22. +10m NEG 10-5

23. +14m NEG 10-5

1.3. Leucemia Mieloblástica Aguda

Paciente LA20: Leucemia Mieloblástica Aguda con maduración (M2)

- Fenotipo: CD45+d, CD34-, HLA-DR-, MPO+, CD33++, CD117+ (62%), CD13+d, CD15-, CD14-,

CD11a+d, CD11b-, CD11c+d, CD4-/+, CD65-, CD64-, CD36-, el resto de marcadores B y T

negativos.

- Ventana de adquisición: CD45+d/SSC


90

- Los análisis realizados, tanto al diagnóstico como en la recaída, no detectaron alteraciones

genéticas rastreables.


molecular (%) S LA 20 LMA M2 Diagnóstico 1. 93 NEG

Inducción

2. +28d 0,13

Consolidación

3. +28d 0,04

4. Post-Cons 0,01

Recaída (+3m) 5. 50 NEG

Inducción

6. Post-Ind NEG 10-4

7. +2m NEG 10-4

Alo-Tx (+2m)

Recaída 8. +28d 18


- Fenotipo: CD45+, CD34++, HLA-DR+, MPO-, CD33+, CD117+, CD13+, CD15- (15%), CD14-,

CD11b-, CD64-, CD65-, CD36-, CD38+, CD22+ (49%), CD2+ (71%), resto de marcadores B y T

negativos.


- No se observaron alteraciones genéticas rastreables por biología molecular. Los estudios

citogenéticos revelaron la presencia de un clon con el siguiente cariotipo:

45,XX,t(3;3)(q22;q29),-7.

ID Diagnóstico Determinación Citometría

(%) Análisis

molecular

LA 29 LMA M2 Diagnóstico 1. 24 C+

Inducción

2. +28d 12,5 C+

3. Post-Ind 3,7 C+

Progresión 4. +4m 10,2 C+

2ª Línea

5. +5m 60

nv, no valorable; C+, presencia de alteraciones citogenéticas (ver texto).


91


- Fenotipo: CD45+d, CD34-, HLA-DR-/+ (46%), MPO+, CD33+, CD117+ (72%), CD13-, CD15+d,

CD14-, CD11b-, CD65-, CD64-/+ (25%), CD36-, CD2-/+ (19%), CD4+/- (54%), resto de

marcadores B y T negativos.




molecular (%) S

LA 31 LMA M2 Diagnóstico 1. 27 NEG

Inducción

2. Post-Ind NEG 10-4-10-5

Consolidación

3. +15d *NEG 10-4

4. +21d 0,04

Alo-Tx (+3m)

5. +21d NEG 10-4

6. +97d NEG 10-4

7. +180d NEG 10-4

8. +385d NEG 10-4-10-5

* muestra contaminada con SP.

Paciente LA32: Leucemia Mieloblástica secundaria a SMD

- Fenotipo: CD45+d, CD34+, CD33+d, HLA-DR+, MPO-/+ (40%), CD117+, CD13+, CD15-, CD14-,

CD11b-, Lisozima-/d, CD65-, CD64-, CD36-, el resto de marcadores B y T negativos.




92


molecular (%) S

LA 32 LMA secundaria a SMD Diagnóstico 1. 18 NEG

Inducción

2. +21d 4

Consolidación

3. Post-Cons NEG 10-4-10-5

Alo-Tx (+3m)

4. +28d NEG 10-4-10-5

5. +105d NEG 10-4-10-5

6. +180d NEG 10-4

7. +279d NEG 10-4-10-5

8. +391d NEG 10-5

9. +2,5a NEG 10-4-10-5


- Fenotipo: CD45+d, CD34+, HLA-DR+, CD33+d, CD13+, CD117+, CD15-/+ (22%), CD14-, CD11b-,

CD11c+d (65%), CD65+, CD64-, CD36-, CD7+, CD56-/+d (48%), CD38+het, el resto de marcadores

B y T fueron negativos.




molecular (%) S


Inducción

2. Post-Ind 0,04

Consolidación 1

3. Post-Cons1 NEG 10-5

Consolidación 2

4. Post-Cons2 NEG 10-4-10-5


93


- Fenotipo: CD45+d, CD34+d, HLA-DR+, MPO-/+ (18%), CD33-/+d (40%), CD13+, CD117+, CD14-,

CD11b-, CD11c- (19%), CD65+, CD64-, CD36-, CD38++, resto de marcadores B y T negativos.


- El análisis citogenético de la MO al diagnóstico desveló la existencia de un 4% de células con

del(11)q(23). El análisis mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH), confirmó la

reordenación del gen MLL en el 5% de las células. En las determinaciones siguientes no se

observaron alteraciones en el cariotipo.


molecular (%) S


Inducción

2. +2m 28

3. +4m 0,5

4. +5m 15

5. +7m 16

6. +9m 6,7

7. +12m NEG 10-5

8. +15m NEG 10-4-10-5

9. +24m NEG 10-4-10-5

Paciente LA48: Leucemia Mieloblástica Aguda sin maduración (M1)

- Fenotipo: CD45+d, CD34-, HLA-DR- (9%), MPO+, CD33++, CD13+d (47%), CD117+/- (63%),

CD15+/- (51%), CD14-, CD11b-, CD11c+ (60%), CD123+d, Lisozima+d, CD65-, CD64-, CD36-,

CD4+d (81%), resto de marcadores T y B negativos.




94


molecular (%) S


Inducción

2. Post-Ind NEG 10-4

Paciente 53: Leucemia Mieloblástica Aguda sin maduración (M1)

- Fenotipo: CD45+d, CD34-, HLA-DR-, MPO+, CD33+, CD117+, CD13-, CD15-, CD14-, CD11b-,

CD11c-/+ (47%), Lisozima+, CD65-, CD64-, CD36-, CD4+d, resto de marcadores T y B negativos.


- Análisis molecular: presencia de duplicaciones internas en tándem (ITD) del gen FLT3.


molecular (%) S

LA 53 LMA M1 Diagnóstico 1. 43 FLT3/ITD

Inducción

2. Post-Ind 0,014 NEG

Consolidación

3. +28d 0,009 NEG


5. +4m NEG 10-4-10-5 NEG

6. +6m NEG 10-5 NEG


95

Citometría de flujo vs biología molecular en el seguimiento de pacientes con

leucemia aguda

En nuestra serie de pacientes con leucemia aguda, la citometría fue aplicable al seguimiento del

100% de los casos, mientras que la biología molecular sólo pudo aplicarse al 23% (Tabla 21).

Por este motivo, sólo se realizaron 20 análisis de EMR de forma paralela por citometría y

biología molecular. Como muestra la Tabla 22, en 17 de ellas se obtuvo el mismo resultado

(concordancia del 85%).

Con respecto a las 3 discordancias, dos de ellas se produjeron en el paciente LA53, que

presentaba la mutación FLT3/ITD. En ambas, la citometría detectó EMR (0,014 y 0,009%,

respectivamente), mientras que el análisis molecular fue negativo.

La tercera discordancia se produjo en el paciente LA2, en que la citometría no alcanzó la

sensibilidad suficiente por falta de muestra.

En el resto de los pacientes, el seguimiento se realizó únicamente por citometría de alta

sensibilidad (CFa). Se realizaron 80 análisis de EMR, de los cuales 21 fueron positivos (Tabla

23). Como se puede observar, en 7 de las 21 determinaciones (33%) no se hubiera detectado

enfermedad con la técnica de citometría de flujo estándar (CFe).

Tabla 21: Aplicabilidad de la citometría de flujo vs biología molecular al seguimiento de pacientes

con leucemia aguda.

Citometría Análisis

molecular

LLA-B (n=6) 100% 50%

LLA-T (n=1) 100% 0%

LA Bifenotípica (n=2) 100% 0%

LMA (n=8) 100% 12,5%

Total (n=17) 100% 23%


96

Tabla 22: Comparación de resultados obtenidos por citometría y biología molecular en el

seguimiento de pacientes con leucemia aguda.

ID Determinación Citometría Análisis

molecular (%) S

LA 2 3. Post-Reind NEG 10-4-10-5 +

LA 3 3. Post-Ind NEG 10-4-10-5 NEG

4. Cons +28d NEG 10-4-10-5 NEG

5. Cons +2m NEG 10-5 NEG

6. Cons +3m NEG 10-5 NEG

7. AloTx +16d NEG 10-4-10-5 NEG

8. AloTx +89d NEG 10-5 NEG

9. AloTx +167d NEG 10-5 NEG

10. AloTx +1347d NEG 10-5-10-6 NEG

LA 7 2. Ind +14d 8,5 +


6. Reind/Cons +35d NEG 10-4-10-5 NEG

7. Mant +6s NEG 10-4-10-5 NEG

8. Mant +7m NEG 10-5 NEG

9. Post-Mant NEG 10-4-10-5 NEG

LA 53 2. Post-Ind 0,014 NEG

3. Cons +28d 0,009 NEG


5. Post-Cons +4m NEG 10-4-10-5 NEG

6. Post-Cons +6m NEG 10-5 NEG

Se señalan en rojo las discordancias entre ambas técnicas.


97

Tabla 23: Determinaciones EMR+ en pacientes con leucemia aguda en que no se pudo realizar

análisis molecular.

ID Determinación CFa (%)

LA2 2. Post-Ind 0,005




10. Post-Ind 0,015

LA10 3. Ind +35d 0,04

4. Post-Ind 0,02


5. Post-AloTx +185d 0,01

11. Post-Ind 0,06


LA18 4. Ind +6s 0,08

5. Ind +2m 0,007

7. Post-Int 0,006

8. Reind +28d 0,02

9. Reind +6s 0,006

11. Post-Reind 0,002

LA20 3. Cons +28d 0,04

4. Post-Cons 0,01

LA31 4. Cons +21d 0,04


Se muestran en rojo aquellas determinaciones con EMR por debajo del límite de detección estándar de la citometría.


98

2. PACIENTES CON MIELOMA MÚLTIPLE

Se aplicó la técnica de citometría de alta sensibilidad a los pacientes con MM cuyo seguimiento

se realizó en la CUN, entre Enero 2006 y Mayo 2011. Sus datos demográficos, su diagnóstico y

estadío se detallaron en Material y Métodos.

Identificación del Paciente

Determinación MG PG IF CF

(%) (gr/dL) s/o (%)

MM-2: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117++

Diagnóstico

1. +7m 4 2,47 + 0,37

Auto-Tx

2. +95d 8 1,16 nd 0,24

Alo-Tx

3. +28d 2 0,92 nd 0,038

4. +35d B 1,25 nd 0,025

5. +118d 3 1,5 nd 1,04

Recaída 11 2,85 nd 1,9

6. +350d 30 1,7 nd 15

7. +7m B 1,18 nd 1,08

8. +10m 8 0,87 nd 1,3

9. +11m 4 0,49 nd 7,5

MM-3: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45- CD33+

Diagnóstico 1. 70 3,95 + 16

2. +7m 1 0,41 + 0,019

Auto-Tx

3. +3m 3 <0,1 - 0,002

4. +6m 6 0 - 0,05

Recaída 60 1,92 + 11,3

5. +4m 100 1,44 + 40

MM-4: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+ CD45- CD117+ CD28+/- CD33+/-


2. +7m 1 0,71 + NEG

MM-5: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117-/+ CD28+d

Diagnóstico 1. 80 1,71 nd 13

Auto-Tx

2. +53d 4 0,44 + 0,05

Recaída 3. +5m 32 2,34 + 28,5

MG, medulograma; PG, proteinograma; IFs/o, inmunofijación en suero o en orina; CF, citometría; B, punción blanca; Auto-Tx, trasplante autólogo; Alo-Tx, trasplante alogénico; d, día; m, mes; nd, no determinado.


99



(%) (gr/dL) s/o (%)

MM-6: CD38+++ CD138+ CD19- CD56++ CD45- CD13+d

Diagnóstico 1. 28 0 + 12

2. +6m 4 0 - 0,26

Auto-Tx

3. +3m 2 0 - NEG

MM-7: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45- CD117+ CD28+

Diagnóstico 1. 10 0 + 2,5

2. +9m <1 0 + NEG

Auto-Tx

3. +2m 2 0 - NEG

MM-8: CD38++ CD138+ CD19-/+ CD56+ CD45- CD28+


2. +6m 4 0,1 + 0,07

Progresión 3. +12m 5 1,7 + 2

MM-9: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+++ CD45-


2. +5m 18 1,78 + 2,02

3. +9m 9 1,61 + 0,8

4. +13m 15 1,2 + 0,18

5. +19m 8 2,1 + 0,05

MM-10: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+++ CD45+d CD20+/-

Diagnóstico 1. 12 5,3 + 1,4

Progresión 2. 20 8,05 + 1,8

3. +7m 4 1,51 + 0,09

Auto-Tx

4. +3m 6 1,13 + 0,12

MM-11: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117+


2. +8m 3 0 - 0,015

3. +13m 8 0 + 0,39

MM-12: CD38++ CD138+ CD19- CD56++ CD45- CD117+ CD28+/-

Diagnóstico

1. +2m 5 0 + 0,05

2. +5m 6 0 + 0,04

Recaída 3. 50 0,47 + 7,3

MG, medulograma; PG, proteinograma; IFs/o, inmunofijación en suero o en orina; CF, citometría; Auto-Tx, trasplante autólogo; m, mes.


100



(%) (gr/dL) s/o (%)

MM-13: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+/- CD45- CD117+/- CD20+/- CD13+/-

Diagnóstico

1. +2m 25 0,3 + 12

2. +4m 12 0 + 3

Auto-Tx

3. +3m 13 <0,1 + 1,57

MM-14: CD38++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117+d


Recaída 2. 100 2,36 + 60,5

3. +8m 3 0 - NEG

MM-15: CD38++ CD138++ CD19- CD56+ CD45- CD28-/+

2ª Opinión (en Tto) 1. 4 0,66 + 0,18

Progresión 2. +24m 10 0,35 + 0,04

MM-16: CD38++ CD138++ CD19- CD56- CD45- CD28+

Diagnóstico 1. 72 0,14 + 8,3

2. +6m 8 0 + 0,64

Auto-Tx1

3. +3m B 0 + 0,006

Auto-Tx2

4. +28d 3 <0,1 + 0,0005

5 +9m 4 0 + 0,009

MM-17: CD38+++ CD138++ CD19- CD56-/+ CD45- CD33-/+ CD13-/+


2. +3m 4 0 + 0,01

3. +9m 2 0 - NEG

4. +14m 3 0 - NEG

Recaída 5. 5 0 + 0,77

MM-18: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117+


2. +5m 7 1,44 + 5,5

Auto-Tx

3. +2m 6 0,74 + 0,55

MM-19: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD33-/+


2. +6m 2 0,34 + 0,057

Auto-Tx

3. +3m 7 0,56 + 2,3

MG, medulograma; PG, proteinograma; IFs/o, inmunofijación en suero o en orina; CF, citometría; B, punción blanca; Auto-Tx, trasplante autólogo; Tto, tratamiento; d, día; m, mes.


101



(%) (gr/dL) s/o (%)

MM-20: CD38++ CD138+d CD19- CD56- CD45- CD33+

Diagnóstico 1. 26 0,38 + 13,4

2. +7m B 0 - 0,005

Recaída

MM-21: CD38+++ CD138+ CD19- CD56++ CD45-

Recaída 1. 40 2,11 + 0,06

2. +6m 46 3,46 + 1,7

3. +15m B 0,64 + 0,06

MM-22: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117-/+


2. +5m 25 0 + 10

3. +6m 3 0 + 0,03

Auto-Tx

4. +3m 4 0 + NEG

5. +6m 4 0 + NEG

6. +12m 11 0 + 5

7. +17m 3 0 nd 0,273

8. +21m 3 0 + 0,0016

9. +24m 7 0,18 + 0,39

Recaída 31 0 + 13,3

10. +2m 40 0 + 14,5

11. +6m 87 0 + 36

MM-23: CD38++ CD138++ CD19- CD56+ CD45-


Auto-Tx

2. +12m 3 0 - NEG

Recaída 3. 44 <0,1 + 6

4. +5m 5 <0,1 + 0,016

MM-24: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45- CD28+

Auto-Tx

1. +1m 2 2,04 + 0,06

2. +13m 14 0,64 + 0,0078

3. +6a 3 0 - NEG

MM-25: CD38+++ CD138++ CD19- CD56-/+ CD45+ CD33+

Recaída 1. 7 <0,1 + 0,34

2. +36m 3 0 - NEG

3. +50m 2 0 - NEG

4. +55m 2 0,19 + NEG

MG, medulograma; PG, proteinograma; IFs/o, inmunofijación en suero o en orina; CF, citometría; B, punción blanca; Auto-Tx, trasplante autólogo; m, mes; a, año; nd, no determinado.


102



(%) (gr/dL) s/o (%)

MM-44: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117+

Recaída 1. 8 0,84 nd 2,5

2. +28m 11 1,19 nd 1,9

3. +35m 9 2,14 + 0,8

MM-45: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117+

Diagnóstico 1. 50 4,04 nd 1,7

2. +3m 16 1,12 + 0,33

3. +4m 17 0,79 + 0,18

Auto-Tx

4. +2m B <0,1 + 0,03

MM-46: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45- CD20+

Diagnóstico

1. +2m 5 1,03 + 0,7

2. +12m 3 1,23 + 0,15

MM-60: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+ CD45- CD20-/+

Diagnóstico 1. B 0,77 + 0,136

2. +24m 20 0,67 + 3,5

Progresión 3. +30m 46 0,55 nd 1,8

MM-61: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45-


2. +4a 15 3,19 + 2,94

MM-68: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117+

Diagnóstico

1. +7a 7 0,18 + 5

Progresión 2. +8a 36 0,21 + 7

3. +5m 25 0,71 + 4,7

MM-80: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+++ CD45+ CD117-/+ CD33-/+ CD20-/+

Diagnóstico

1. +6m 5 0,2 + 0,03

Recaída 2. 100 4,79 nd 64

MM-81: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+++ CD45- CD13+d

Diagnóstico 1. 9 0 + 3,6

2. +5m 1 0 - NEG

Auto-Tx

3. +2m 1 0 + NEG

MG, medulograma; PG, proteinograma; IFs/o, inmunofijación en suero o en orina; CF, citometría; B, punción blanca; Auto-Tx, trasplante autólogo; m, mes; a, año; nd, no determinado.


103



(%) (gr/dL) s/o (%)

MM-84: CD38+++ CD138++ CD19- CD56+ CD45- CD28-/+

Recaída 1. 14 2,61 nd 3,7

2. +6m 20 2,42 nd 2,22

Auto-Tx

3. +2m 9 0,94 + 0,37

MM-86: CD38+++ CD138++ CD19- CD56++ CD45- CD117-/+ CD33-/+

2ª Opinión (en Tto) 1. 10 1,3 + 0,81

2. +3m 6 0,14 + 0,21

MM-89: CD38+++ CD138++ CD19-/+ CD56- CD45-

Diagnóstico 1. 28 1,08 + 0,87

2. +18m B 1,03 + 0,096

MM-90: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45- CD117+ CD13+ CD28+


2. +3m 14 2,6 + 1,53

MM-91: CD38+++ CD138++ CD19- CD56- CD45-/+ CD20+


2. +6m 2 0 + 0,048

MG, medulograma; PG, proteinograma; IFs/o, inmunofijación en suero o en orina; CF, citometría; B, punción blanca; Auto-Tx, trasplante autólogo; Tto, tratamiento; m, mes; nd, no determinado.

Citometría de flujo vs inmunofijación en el seguimiento de pacientes con

mieloma múltiple

De todas las determinaciones realizadas, se seleccionaron aquellas en que el medulograma fue

normal o en que la infiltración detectada por citometría fue inferior a 0,1% (n=54), y se analizó el

grado de concordancia entre los resultados obtenidos por citometría de alta sensibilidad (CFa) e

inmunofijación. Como se observa en la Tabla 24a, en 43 de las 54 muestras (80%) los resultados

fueron concordantes.


104

Tabla 24a: Comparación entre inmunofijación y citometría de alta sensibilidad en el seguimiento

de pacientes con MM.

ID Determinación IF

s/o CFa (%)

Observaciones

Concordancias MM-2 1. Dco +7m + 0,37

3. AloTx +28d nd 0,038 BM en PG=1,16 g/dL



10. Recaída +11m nd 7,5 BM en PG=1,50 g/dL

MM-3 2. Dco +7m + 0,019

MM-5 2. AutoTx +53d + 0,05

MM-8 2. Dco +6m + 0,07

3. Progresión + 2

MM-9 5. Dco +19m + 0,05

MM-10 3. Progresión +7m + 0,09

MM-12 1. Dco +2m + 0,05

2. Dco +5m + 0,04

MM-15 2. Progresión + 0,04

MM-16 3. AutoTx1 +3m + 0,006

4. AutoTx2 +28d + 0,0005

5. AutoTx2 +9m + 0,009

MM-17 2. Dco +3m + 0,01

5. Recaída + 0,77

MM-19 2. Dco +6m + 0,057

MM-21 1. Recaída + 0,06

3. Recaída +15m + 0,06

MM-22 3. Dco +6m + 0,03

7. AutoTx +17m nd 0,273 sFLC=2,52 *

8. AutoTx +21m + 0,0016

MM-23 4. Recaída +5m + 0,016

MM-24 1. AutoTx +1m + 0,06

2. AutoTx +13m + 0,0078

MM-45 4. AutoTx +2m + 0,03

MM-46 1. Dco +2m + 0,7

2. Dco +12m + 0,15

MM-80 1. Dco +6m + 0,03

MM-91 2. Dco +6m + 0,048

MM-6 3. AutoTx +3m - NEG


MM-14 3. Recaída +8m - NEG

MM-17 3. Dco +9m - NEG

4. Dco +14m - NEG


MM-24 3. AutoTx +6a - NEG

MM-25 2. Recaída +36m - NEG

3. Recaída +50m - NEG

MM-81 2. Dco +5m - NEG

IFs/o, inmunofijación en suero u orina; CFa, citometría de alta sensibilidad; Dco, diagnóstico; BM, banda monoclonal; PG, proteinograma; sFLC, cociente de cadenas ligeras libres en suero; * rango normal= 0,26-1,65.


105

Tabla 24b: Comparación entre inmunofijación y citometría de alta sensibilidad en el seguimiento

de pacientes con MM.

ID Determinación IF

s/o CFa (%)

Observaciones

Discordancias MM-3 3. AutoTx +3m - 0,002

4. AutoTx +6m - 0,05 Recayó 4 meses después

MM-6 2. Dco +6m - 0,26 Se negativizó 3 meses después, tras AutoTx

MM-11 2. Dco +8m - 0,015 Progresó 5 meses después

MM-20 2. Dco +7m - 0,005 Recayó 3 meses después y falleció

MM-4 2. Dco +7m + NEG No se dispone de seguimiento posterior.

MM-7 2. Dco +9m + NEG La IF se negativizó a los 2 meses

MM-22 4. AutoTx +3m + NEG Se alcanzó únicamente sensibilidad estándar por falta de muestra.

5. AutoTx +6m + NEG Recayó a los 6 meses

MM-25 4. Recaída +55m + NEG La IF se negativizó dos meses después, y permaneció negativa los 21 meses siguientes.

MM-81 3. AutoTx +2m + NEG

IFs/o, inmunofijación en suero u orina; CFa, citometría de alta sensibilidad; Dco, diagnóstico.

Se observaron 5 resultados discrepantes en los que la citometría detectó EMR mientras que la IF

fue negativa (Tabla 24b). Dos de ellos corresponden a las dos primeras determinaciones post-

AutoTx (+3m y +6m) del paciente MM-3, en que se detectó 0.002% y 0.05% de EMR

respectivamente. El paciente recayó 4 meses después, en el décimo mes post-Tx (det. 5).

La tercera discrepancia corresponde a la determinación previa al trasplante del paciente MM-6

(det. 2), en que se detectó 0.26% de células mielomatosas por citometría, siendo la IF negativa.

La citometría se negativizó a los 3 meses del trasplante.

Las dos últimas discrepancias corresponden a los pacientes MM-11 (det. 2) y MM-20 (det. 2), en

que se detectó 0.015 y 0.005% de EMR, respectivamente. En ambos casos los pacientes

progresaron poco tiempo después (Tabla 24b).

En cuanto a las discordancias en las que la IF fue positiva y la CF de alta sensibilidad negativa,

la determinación 2 del paciente MM-7 no puede considerarse una discrepancia verdadera, ya

que la IF se negativizó 2 meses después. Presumiblemente la positividad de la IF se debía a

persistencia de las inmunoglobulinas debido a su mayor vida media, y no a EMR. Un caso similar

sería el paciente MM-25, cuya IF también se negativizó 2 meses después, permaneciendo


106

negativa los 21 meses siguientes. Posteriormente se positiviza (+6,3a), y se mantiene positiva

hasta la actualidad (7 meses), sin que en ningún momento se produzca progresión de la

enfermedad. En los 2 últimos años de seguimiento se han analizado sFLC, que han sido siempre

normales.

La determinación 3 del paciente MM-81 se realizó a los 2 meses del AutoTx. Cabe la posibilidad

de que se trate de bandas oligoclonales comúnmente observadas durante la recuperación de la

producción de inmunoglobulinas tras el trasplante, y no propiamente de persistencia de la

enfermedad (Mitus y col., 1989).

Sin embargo, la determinación 2 del paciente MM-4 y la determinación 5 de MM-22 sí

constituyen verdaderas discrepancias. En ambos casos se alcanzó alta sensibilidad, incluso

mayor que 10-5, y sin embargo el resultado de la CF fue negativo. No disponemos de datos de

seguimiento del paciente MM-4, pero el paciente MM-22 recayó 6 meses después (det. 6).

En resumen, en nuestra serie de pacientes con MM la aplicabilidad de la CF fue del 100%. La

concordancia entre CF de alta sensibilidad e IF teniendo en cuenta tan sólo las discordancias

documentadas (n=50) fue del 86%, con un 10% de falsos negativos para la IF y un 4% para la

CF (Tabla 25).

Tabla 25: Comparación de los resultados obtenidos con CF de alta sensibilidad e IF en el

seguimiento de pacientes con MM.

(n=50) CFa + CFa -

IF + 33 2

IF - 5 10

Se han excluido las 4 discordancias “aparentes”, explicadas en el texto (det. 2, MM-7; det. 4, MM-25; det. 3, MM-81; det. 4, MM-22).


107

Hay que destacar que de las 38 determinaciones en que se detectó EMR, 7 presentaban

enfermedad <0,01%, no detectable por CF estándar. Esto significa que con la técnica estándar el

grado de concordancia entre ambas técnicas hubiera sido del 80% y el porcentaje de falsos

negativos para la CF pasaría de un 4% a un 14% (Tabla 26).

Tabla 26: Comparación de los resultados obtenidos con CF estándar e IF en el seguimiento de

pacientes con MM.

(n=50) CFe + CFe -

IF + 28 7 *

IF - 3 12 **

Se consideran CFe- aquellas determinaciones con infiltración <0,01. * Las det. 3, 4 y 5 de MM-16, la det. 8 de MM-22 y la det. 2 de MM-24 pasan a ser negativas y por tanto a las discordancias CFe- IF+. ** La det. 3 de MM-3 y la det. 2 de MM-20 pasan a ser negativas, convirtiéndose en concordancias CFe- IF-.

Contaminación con SP de muestras de MO de pacientes con MM

Como hemos explicado en el apartado anterior, se produjo un 4% de falsos negativos en

citometría de alta sensibilidad (det. 2, MM-4 y det. 5, MM-22), a lo que se añade el hecho de que

en 5 muestras IF+/CF+ la citometría hubiera sido negativa si se hubiera realizado un estudio

fenotípico estándar (det. 3, 4 y 5, MM-16; det. 8, MM-22; det. 2, MM-24). Una posible explicación

sería que estas muestras presentaran un grado de contaminación con sangre periférica mayor

de lo habitual. Se dice que es posible que las muestras de médula ósea de pacientes con MM

presenten un grado de contaminación con sangre periférica significativamente superior a las

muestras de pacientes con otras neoplasias hematológicas, debido a la destrucción de

trabéculas óseas que produce la enfermedad.

Para comprobarlo, analizamos el porcentaje de neutrófilos (células CD10+) en granulocitos de

MO de 78 pacientes con MM al diagnóstico (51 varones y 27 mujeres con edades comprendidas

entre 34 y 85 años; media, 64 años) y de 78 pacientes con SLPC-B (42 varones y 36 mujeres,

19-84 años, media, 55 años) diagnosticados en las mismas fechas.


108

Como se puede observar en la Figura 18, el porcentaje de CD10 en los granulocitos de MO fue

significativamente mayor en muestras de MM que en muestras de SLPC-B (55,18 ±21,97 y

46,29 ±21,29 respectivamente; p=0,01).

MM SLPC-B0

20

40

60

80

100

p=0,01

%C

D1

0

Figura 18: Porcentaje de CD10 en granulocitos de MO al diagnóstico de pacientes con MM y

SLPC-B en el momento del diagnóstico.

Podemos concluir, por tanto, que la contaminación con sangre periférica es significativamente

mayor en muestras de MO de pacientes con MM que de pacientes con SLPC-B.

Cabe plantearse que esto influya en las discrepancias que habitualmente se observan entre el

porcentaje de células plasmáticas cuantificado en el medulograma y por citometría. Como

muestra la Tabla 27, en nuestra serie se cuantificó un porcentaje de células plasmáticas totales

4,4 veces superior (media; SD±2,9) en el medulograma que por citometría (ratio MG/CF). Para

establecer si existía algún tipo de relación entre la infraestimación de células plasmáticas en MO

por citometría y el grado de contaminación de las muestras con SP, estudiamos la correlación

existente entre la ratio MG/CF y el porcentaje de CD10 en granulocitos de MO (Figura 19).

Observamos una correlación significativa entre ambos parámetros (p = 0,02), con una R de 0,42.

Es decir, a mayor contaminación de la muestra con sangre periférica, mayor discrepancia entre

la cuantificación realizada en el medulograma y por citometría.

En resumen, la contaminación con sangre periférica es un problema que afecta más a las

muestras de MM que a las de otras neoplasias hematológicas, y puede ser causa de falsos

negativos en citometría.


109

Tabla 27: Relación entre el porcentaje de células plasmáticas en el medulograma y por citometría, y su correlación con la expresión de CD10 en granulocitos.

ID MG (%)

CF (%)

Ratio MG/CF

% CD10 en granulocitos

MM-1 20 13 1,54 48 MM-3 70 16 4,38 77 MM-5 80 13 6,15 43 MM-6 28 12 2,33 26 MM-7 10 2,5 4,00 72 MM-8 48 28 1,71 35 MM-9 53 10 5,30 47 MM-10 12 1,4 8,57 58 MM-11 14 5 2,80 55 MM-13 25 12 2,08 35 MM-14 84 18 4,67 52 MM-17 62 16 3,88 78 MM-18 50 5 10,00 83 MM-19 14 3 4,67 65 MM-20 26 13,4 1,94 45 MM-22 75 69 1,09 47 MM-27 92 68 1,35 96 MM-29 36 1,5 24,00 51 MM-30 24 4,6 5,22 57 MM-31 13 6 2,17 42 MM-32 10 1,4 7,14 49 MM-33 100 4,4 22,73 90 MM-34 20 2,37 8,44 54 MM-35 10 5,4 1,85 46 MM-36 14 5,1 2,75 30 MM-37 10 0,79 12,66 88 MM-38 38 1,7 22,35 89 MM-39 30 20 1,50 15 MM-40 32 13 2,46 35 MM-41 49 7,5 6,53 56 MM-42 20 1,98 10,10 91 MM-43 18 4,6 3,91 37 MM-45 50 1,7 29,41 89 MM-47 15 6,7 2,24 67 MM-48 90 16 5,63 24 MM-49 12 2 6,00 56 MM-50 88 38 2,32 76 MM-51 19 1,27 14,96 83 MM-54 11 0,52 21,15 51 MM-56 25 10,3 2,43 38 MM-57 26 5,5 4,73 63 MM-58 13 9 1,44 30 MM-59 25 5,27 4,74 70 MM-61 15 2,94 5,10 45 MM-62 20 1,1 18,18 29 MM-63 46 1,8 25,56 30 MM-64 25 4,44 5,63 63 MM-65 23 4,6 5,00 70 MM-66 85 23,34 3,64 29 MM-69 34 12 2,83 64 MM-70 90 2,79 32,26 73 MM-71 36 18 2,00 25 MM-72 40 9 4,44 31 MM-73 46 20 2,30 64 MM-74 56 19 2,95 45 MM-75 30 7 4,29 26 MM-76 100 26 3,85 84 MM-77 20 5,5 3,63 57 MM-78 10 0,47 21,28 72 MM-79 15 0,9 16,67 52


110

0 2 4 6 8 10

0

20

40

60

80

100

20 30 40

R=0,42

Ratio MG/CF

% C

D10

en

Gra

nulo

cito

s

Figura 19: Correlación entre la ratio MG/CF y el porcentaje de CD10 en granulocitos de MO de

pacientes con MM.

Influencia de la latencia en el procesamiento de las muestras sobre los

resultados de citometría

Nos llamó la atención que en las muestras MM-62 y MM-63 la ratio MG/CF fue 18,2 y 25,6

respectivamente, es decir más de 3SD por encima de la media, no siendo muestras

especialmente contaminadas con SP (29% y 30% de CD10 en los granulocitos, respectivamente;

Tabla 27). Comprobamos que en ambos casos se produjo un retraso de más de 12 horas entre

la extracción de la muestra y su procesamiento y marcaje.

Está descrito que las células plasmáticas son frágiles y se ven especialmente afectadas por el

retraso en el procesamiento (Craig y Foon., 2008). Con el fin de evaluar exactamente cuánto

influye este tipo de factores en el porcentaje de células plasmáticas detectado por citometría, se

analizó una muestra de MO del paciente MM-92 recién extraída, al día siguiente y a los dos días.

Como se puede observar en la Figura 20, el porcentaje de células plasmáticas disminuye un

37% con un día de almacenamiento de la muestra, y un 52% con dos días. Este efecto no se

observa en otros tipos celulares, como los linfocitos B o las células CD34+, cuyo porcentaje se

mantiene estable a lo largo del tiempo (Figura 20).


111

a.

b.

c.

Figura 20: Porcentaje de células plasmáticas (CD38++ CD138+) en una muestra de MO del

paciente MM-92 (a), y de células CD19+ (b) y CD34+ (c) en una muestra de MO control,

inmediatamente tras la extracción de la muestra (día 0) y 1 ó 2 días después.

Día 0

(4,34%)

Día 1

(4,39%)

Día 2

(4,55%)

Día 0

(1,21%)

Día 1

(1,21%)

Día 2

(1,36%)

Día 0

(7,5%)

Día 1 (4,7%)

Día 2

(3,6%)

Discusión

Esther Domingo Rodríguez Discusión

115

FACTORES PRINCIPALES QUE DETERMINAN LA SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA

Tal como se explicó en la Introducción, la sensibilidad de la citometría de flujo depende

básicamente de dos factores: el número de leucocitos totales analizados y el número de células

tumorales detectadas.

Número de leucocitos adquiridos

En un estudio estándar de cuantificación de EMR por citometría se adquieren entre 500000 y 1

millón de leucocitos (Craig y Foon, 2008; Borowitz y col., 2008; Holowiecki y col., 2008; Itälä y

col., 2008; Martínez-Sánchez y col., 2008; Motwani y col., 2008; Rawstron y col., 2008; Béné y

Kaeda, 2009; Irving y col., 2009; Kröger y col., 2010a; Wilson y col., 2010; Peters y Ansari,

2011), llegándose en algunos estudios a adquirir 2 millones, que es el máximo número de células

que suelen marcarse en cada tubo (San Miguel y col., 2002; Sarasquete y col., 2005; Paiva y

col., 2011). La implantación de la citometría digital en los laboratorios diagnósticos permite

plantearse la posibilidad de adquirir conjuntamente en un único fichero varios tubos

independientes, marcados con la misma combinación de anticuerpos monoclonales, a razón de 2

millones de células por tubo. De este modo, el número total de células adquiridas puede

aumentar de forma muy significativa, manteniéndose la calidad de la adquisición. Para ello es

imprescindible ignorar los primeros segundos de la adquisición de cada tubo, para evitar las

turbulencias del frente de la muestra, iniciando la grabación sólo cuando el flujo se ha

estabilizado. Como se muestra en la Figura 4, la intensidad de fluorescencia se mantiene estable

a lo largo del tiempo total de adquisición, sin que se aprecie ninguna diferencia con respecto a

los ficheros que proceden de la adquisición de un solo tubo.

Utilizando esta estrategia, nos propusimos la adquisición de 6 millones de leucocitos. En primer

lugar comprobamos que el aumento de ruido de fondo derivado de la adquisición de un número

tan elevado de leucocitos no interfería con la exactitud de la técnica (Tabla 12b).

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA DE CITOMETRÍA CON ALTA SENSIBILIDAD PARA

LA CUANTIFICACIÓN DE EMR


116

Para realizar el estudio de especificidad, analizamos un número aún más elevado de leucocitos

(10 millones) de MO o SP control y procedimos a buscar células con fenotipo de diversas

neoplasias hematológicas. Pacientes y controles se codificaron durante la adquisición, de modo

que el análisis se realizó siempre de forma ciega. Hay que destacar que en ningún caso

detectamos el más mínimo cluster con fenotipo neoplásico, para ninguna de las entidades

analizadas (Figuras 11-14). Esto es importante porque algunos autores establecen un umbral en

el número de eventos del cluster tumoral a partir del cual la muestra debe considerarse EMR+

(Krampera y col, 2006; Damm-Welk y col, 2007; Dworzak y col, 2008; Irving y col, 2009; Thörn y

col 2009). Como subraya Mario Roederer, es un criterio erróneo (Roederer, 2008). Si se observa

un cluster de eventos con características compatibles con células tumorales, por mínimo que

sea, la muestra debe considerarse positiva. Bastaría con adquirir más células para que el cluster

alcanzara un tamaño significativo, como demostraron Dworzak y col. (Dworzak y col., 2008). Por

eso es importante resaltar que en ninguno de los controles que realizamos observamos ningún

cluster tumoral, ni siquiera inferior a 10 eventos.

Número de células tumorales detectadas

Como explicamos en la Introducción, en un plano teórico se acepta que es necesario detectar un

mínimo de 100 células tumorales para que la cuantificación de EMR sea precisa, ya que se trata

de eventos raros, que supuestamente siguen una distribución de Poisson (CLSI., 2007a;

Rawstron y col., 2008; Yuan y Stetler-Stevenson, 2011). Sin embargo, en la práctica la gran

mayoría de los autores cuantifica utilizando tamaños inferiores de cluster tumoral (Rawstron y

col., 2007; Ritgen y col., 2008; Böttcher y col., 2009; Irving y col., 2009; Stark y col., 2009; Thörn

y col., 2009; Wilson col., 2010), aparte del hecho de que nadie ha analizado el CV del porcentaje

de EMR obtenido para distintos tamaños de cluster tumoral.

En este trabajo nos propusimos analizar el CV de la medición de EMR en función del número de

células tumorales detectadas, para determinar cuál es realmente el tamaño mínimo que debe

tener el cluster tumoral para que su cuantificación sea precisa. Analizamos el CV para clusters

de aproximadamente 30, 50 y 100 eventos tumorales en tres tipos de entidades diferentes, MM,

LLC-B y SLPC-T. Tanto las muestras de LLC-B como los SLPC-T se comportaron según la


117

distribución de Poisson. El CV disminuyó a medida que aumentaba el número de eventos del

cluster. En ambos casos bastó con detectar 50 células tumorales para obtener un CV aceptable.

No ocurrió lo mismo con las muestras de MM. El CV fue siempre ≤10%, incluso para clusters de

30 eventos. Inicialmente pensamos que esto podría deberse a las particulares características

fenotípicas de las células plasmáticas mielomatosas, en cuanto a homogeneidad y a colocación

en un espacio especialmente vacío en varios histogramas. Para testar esta hipótesis, elegimos

dos muestras de leucemia aguda en que los blastos se comportaban de modo análogo en las

dos características comentadas. En ambos casos los resultados fueron similares a los predichos

por Poisson y distintos a lo observado en el mieloma. A un cluster de 30 eventos le correspondía

un CV de aproximadamente 20%.

No es posible averiguar con certeza la razón por la que la EMR del MM no sigue la distribución

de Poisson, teniendo en cuenta que se trata de eventos igual de raros que en las otras

neoplasias hematológicas. Si repasamos las tres condiciones que deben cumplirse para que una

distribución de eventos raros se ajuste a Poisson - cada evento debe contarse una sola vez,

cada evento debe identificarse de manera inequívoca, y los eventos deben dispersarse al azar,

es decir, no deben formar agregados -, cabe plantearse que las células mielomatosas no

cumplan exactamente esta tercera condición. En esta enfermedad la infiltración se produce de

forma parcheada, acumulándose las células tumorales en nichos enriquecidos en lípidos (Nadav

y col, 2006).

Además del CV, calculamos en todos los casos el intervalo de confianza del 95% (IC95) del

porcentaje de EMR, ya que es el estadístico que mejor define la precisión en la distribución de

Poisson (Harvey Motulsky, 2010). Como era de esperar, la amplitud del IC disminuyó al

aumentar el número de eventos del cluster tumoral. Sin embargo, a partir de 50 eventos, la

ganancia de precisión que se conseguía aumentando el tamaño del cluster tumoral no era

relevante.

En resumen, es suficiente la detección de 50 células tumorales para que el análisis de EMR

tenga una precisión adecuada, a excepción del mieloma múltiple en que este número podría

reducirse a 30 sin pérdida significativa de precisión.


118

Si sólo hace falta detectar 50 células tumorales para alcanzar una precisión suficiente, basta con

adquirir 5 millones de leucocitos para alcanzar una sensibilidad de 10-5. El siguiente problema

que esto plantea es su aplicabilidad a la práctica clínica en términos de tiempo total de

adquisición. En un intento de mantenerlo dentro de un marco razonable, probamos a aumentar la

tasa de flujo por encima de lo que hasta ahora es habitual en este tipo de análisis (2000 ev/seg).

Comprobamos que esta tasa puede duplicarse sin que los resultados se afecten, de lo que se

deriva un tiempo de adquisición razonable para la rutina diaria.

Validamos la técnica comparándola con RQ-PCR en un paciente con LLA BII Phi+. Asimismo,

comparamos los resultados de la CF de alta sensibilidad con los obtenidos por PCR de BCL2-JH

en muestras de médula ósea de pacientes con linfoma folicular después de recibir tratamiento.

La concordancia entre ambas técnicas fue del 91%, mientras que la de la CF estándar con el

PCR fue del 55%.

En conclusión, la adquisición de 5 millones de leucocitos en un citómetro digital permite

cuantificar enfermedad mínima residual con alta sensibilidad, manteniéndose la exactitud y

especificidad, con una técnica aplicable a la práctica diaria. La detección de 50 células tumorales

es suficiente para una precisión razonable.


119

OTROS FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA

Tras la experiencia de haber aplicado la técnica de alta sensibilidad a una variedad de

neoplasias hematológicas, quisimos analizar otros factores que influyen en la técnica, además de

los dos principales, explicados en el apartado anterior.

Número de marcadores analizados simultáneamente

Todos los casos presentados en este trabajo se analizaron con el máximo número de colores

disponibles en cada momento (4 en la etapa inicial y 6 en el resto). Con el objetivo de comprobar

si un aumento en el número de colores mejora la sensibilidad de la técnica, seleccionamos una

serie de casos de características diferentes y reflexionamos sobre la influencia del número de

marcadores analizados simultáneamente sobre el resultado del análisis de EMR.

En primer lugar analizamos el paciente LA16. Sus blastos (CD34+) se caracterizaban por

expresar en su totalidad CD56 con alta intensidad, lo que los colocaba en lo que se denomina un

“espacio vacío”, es decir, un espacio en el que no existen células normales en médula ósea

(Figura 21).

LA16 MO control

Figura 21: Células tumorales del paciente LA16 (rojo) (izquierda), frente a una muestra de MO

control (derecha). Se observa que los blastos tumorales se sitúan en un espacio vacío.


120

Comprobamos que utilizando tan sólo 3 marcadores (CD34, CD45 y CD56) se identificaban con

total precisión las células blásticas del paciente (CD34+, CD56++, CD45+/d), de modo que añadir

marcadores servía solamente para comprobar el resto del fenotipo de los blastos (HLA-DR-

CD13- CD33+), pero no añadía precisión a la medición.

Obtuvimos el mismo resultado cuando analizamos LA13: sus células blásticas eran CD19+

CD10++ CD38-/d CD34+ CD45+/d. Solamente con los marcadores CD38, CD10 y CD45 se

cuantificaba con exactitud la enfermedad residual, por la misma razón que en el caso anterior, su

ubicación en un espacio vacío en el histograma CD38 vs CD10 (Figura 22).

LA13 MO control

Figura 22: Células tumorales del paciente LA13 (rojo) (izquierda) frente a una muestra de MO

control (derecha). Se observa que las células tumorales se sitúan en un espacio vacío.

Sin embargo las leucemias mieloblásticas mostraron una mayor heterogeneidad

inmunofenotípica y se comportaron de manera diferente, tal y como ya han observado otros

autores (Al-Mawali y col., 2009a). Para buscar EMR en el paciente LA53, cuyos blastos eran

CD34- CD33+ CD117+ CD13- HLADR- CD15- CD11b- CD4+/d, fue necesario utilizar los 6 colores

disponibles (CD34, CD33, CD117, CD13, HLADR y CD45) y hubiera sido deseable poder añadir

dos más (CD15 y CD4). En ningún histograma individual se colocaban las células blásticas en un

espacio vacío, de modo que fue necesario analizar la combinación de los seis marcadores para

conseguir diferenciarlas de las células normales de la médula. Lo mismo ocurre en muchos otros


121

casos de LMA, como por ejemplo el paciente LA45. Sus promielocitos al diagnóstico eran CD34-

CD33++ CD117+ CD13+ HLADR- CD15+/d CD11b- CD4+/d y no expresaban ninguna aberración que

permitiera identificarlos con facilidad. Un estudio óptimo de EMR requeriría analizar

simultáneamente los marcadores CD45, CD34, CD33, CD117, CD13, HLADR, CD15 y CD11b.

Ambas LMA se diferencian de las dos LLA anteriormente citadas en que no expresan

aberraciones que coloquen las células patológicas en espacios vacíos, por lo que es

imprescindible utilizar combinaciones con un amplio número de marcadores, que permitan

identificar inequívocamente las células patológicas de su equivalente normal en médula (Figura

23).

CD45

CD45

CD34

CD34

CD33

CD33

CD64

CD64

CD15

CD15

SSC

SSC

CD117

CD117

HLA-DR

HLA-DR

CD13

CD13

CD11b

CD11b

MO control

LA53

CD45 CD34 CD33 CD64 CD15

SSC CD117 HLA-DR CD13 CD11b

LA45

Figura 23: Células tumorales de los pacientes LA53 (arriba) y LA45 (abajo) respecto de una

muestra de MO control (centro). En ningún histograma las células tumorales de ambos pacientes

se sitúan en un espacio vacío.


122

Por lo que respecta a los mielomas, en la mayoría de los casos las células patológicas

sobreexpresan CD56, lo cual, unido a su intensa y homogénea expresión de CD38 y CD138

facilita mucho el estudio de EMR (Figura 24). De hecho, en muchos casos bastaría simplemente

con estos tres marcadores para cuantificar con exactitud las células mielomatosas. Otros casos,

sin embargo, no expresan CD56, por lo que es necesario añadir CD19, además de alguna otra

molécula que expresen aberrantemente para poder identificar las células mielomatosas con

exactitud.

FSC

SSC

FSC

SSC

FSC

SSC

MM-9

MO control

MM-3

CD38 CD56

CD56

CD38

CD38

CD56

CD56

CD56

CD19

CD19

CD56

CD19 CD33

CD38

CD33

CD38

Figura 24: Células mielomatosas (rojo) de los pacientes MM-9 (arriba) y MM-3 (abajo) respecto

de una muestra de MO control (centro) en la que se observan las células plasmáticas normales

(verde). La sobreexpresión de CD56 por parte de las células tumorales del paciente MM-9 hace

que se sitúen en un espacio totalmente vacío facilitando su detección. En el paciente MM-3 las

células mielomatosas no expresan CD56 y no se sitúan en un espacio vacío, pero la expresión

aberrante de CD33 ayuda a su identificación.


123

Por último, tenemos que referirnos al caso del linfoma folicular, ya que la búsqueda de infiltración

en médula constituye un ejemplo muy gráfico de la ventaja que supone disponer de 6 colores

con respecto a 4. Cuando sólo se disponía de 4 colores, la combinación que se utilizaba para

identificar células de linfoma folicular en médula ósea era CD38/CD10/CD19/CD45. Como se

observa en la Figura 25, existe una presencia mínima de linfocitos B normales en la región en la

que se colocan las células linfomatosas (CD38-/d CD10+ CD19+ CD45++). De este modo, la

infiltración por linfoma folicular se hace evidente cuando el cluster sospechoso tiene un cierto

tamaño, como es el caso del paciente F82 (1300 eventos; 0.26% de infiltración; 500000

leucocitos analizados), pero puede pasar desapercibida cuando es mínima (80 eventos en el

paciente F54). En la época de los 4 colores, en caso de sospecha se completaba el estudio

analizando en tubos adicionales la clonalidad de los linfocitos de esta región, pero como hemos

señalado anteriormente, una infiltración mínima podía confundirse con el ruido de fondo habitual

en esta región. Actualmente utilizamos de entrada Kappa/Lambda/CD38/CD19/CD10/CD45, de

modo que somos capaces de identificar poblaciones clonales, si están presentes.

En conclusión, el número de colores que se necesitan para un análisis de enfermedad mínima

residual es variable de unos pacientes a otros. En cada caso existe un número mínimo de

marcadores que identifican inequívocamente las células patológicas. Aumentar el número de

marcadores por encima de esta combinación mínima no aumenta la sensibilidad de la técnica.


124

CD38 CD38 CD19

CD38

CD38 CD38 CD19

CD10 CD10 SSC

CD10 CD10 SSC

CD10

Kappa

Kappa

Lambda

CD10

MO control

F82

F54

CD38

CD10

CD19

SSC

Kappa

CD10

Figura 25: Identificación de las células linfomatosas en muestras de MO de los pacientes F82

(arriba) y F54 (abajo) respecto de una muestra de MO control (centro). Se observa que un cluster

tumoral de pequeño tamaño, como el detectado en el paciente F54, podría pasar desapercibido

si no se dispusiera del estudio de clonalidad, ya que en la MO control existen linfocitos B

normales (azul) que ocupan la misma región.


125

Imposibilidad de realizar doble adquisición

Para poder analizar con comodidad un número muy elevado de leucocitos en un estudio de EMR

de alta sensibilidad, es necesario realizar lo que se denomina “doble adquisición”. Tal como se

explicó en Material y Métodos, consiste en almacenar únicamente en el fichero la parte de la

muestra que expresa un marcador presente en la totalidad de las células tumorales. El objetivo

es evitar el almacenamiento de células normales para no generar ficheros de gran tamaño, de

imposible manejo en la práctica.

La condición que deben cumplir las células patológicas para que podamos realizar doble

adquisición es la expresión de un marcador, o combinación de dos marcadores, no mayoritarios

en médula. De este modo, es posible adquirir muchos millones de leucocitos, almacenando sólo

la región seleccionada por dicho marcador. Por ejemplo, en las LLA de estirpe B la selección se

realiza por CD19+. En las de estirpe T, suele realizarse por CD7. En las LMA en que los blastos

expresan CD34, éste es el marcador que se utiliza para seleccionar la región a almacenar

(ejemplo, paciente LA29). En las LMA CD34- cuyas células blásticas expresan CD117 de forma

completa, se selecciona por CD117 para buscar EMR (ejemplo, paciente LA53). El problema lo

plantean las LMA CD34- con expresión parcial de CD117 o incluso CD117-, que tampoco

expresan de forma completa ningún otro marcador no mayoritario por el que se pueda hacer la

selección. Los pacientes LA20 y LA31 constituyen un ejemplo. Ambos corresponden a LMA

CD34- que no expresaban de forma completa CD117, por lo que la ventana de selección tuvo

que hacerse por CD45/SSC, limitando el número total de leucocitos adquiridos. En ninguno de

los dos casos se alcanzó alta sensibilidad.

En conclusión, la condición indispensable para un análisis de enfermedad mínima residual con

alta sensibilidad es que las células tumorales expresen un marcador, o combinación de dos

marcadores, que sea minoritario en médula, y permita por tanto la aplicación sin restricciones del

protocolo de doble adquisición.


126

PACIENTES CON LEUCEMIA AGUDA

Aplicamos la técnica desarrollada al seguimiento de pacientes con leucemia aguda, realizado

desde 2005 hasta la actualidad, y comparamos los resultados con los obtenidos por biología

molecular. La técnica de citometría estándar fue aplicable al 100% de pacientes, mientras que la

biología molecular sólo al 23%, cifra ligeramente inferior a lo descrito en la bibliografía

(Szczepanski y col., 2001; van der Velden y col., 2003; Chung y col., 2006; Al-Mawali y col.,

2009b; Coustan-Smith y Campana, 2010).

Se realizaron 100 análisis de EMR por citometría de flujo. En todos ellos se utilizaron, al menos,

dos combinaciones distintas de anticuerpos monoclonales. Para cada una de ellas se adquirió el

máximo número de leucocitos posible, siendo por tanto variable en función de la cantidad de

muestra recibida. En 37% de las determinaciones, el número de leucocitos adquirido permitió

alcanzar una sensibilidad superior a 10-4 pero inferior a 10-5. Una de ellas corresponde a la única

muestra en la que se detectó EMR por biología molecular y no por citometría (det. 3, paciente

LA2, pag.82). Esta discrepancia se debe, presumiblemente, a que la sensibilidad alcanzada por

la CF no fue suficiente para detectar enfermedad.

Como se ha explicado en el apartado anterior, para alcanzar una sensibilidad de 10-5 es preciso

adquirir 5 millones de leucocitos lo que requiere que la totalidad de las células tumorales

expresen un marcador minoritario en médula. Esto permite almacenar en el fichero únicamente

la población tumoral, seleccionada por dicho marcador. Esta estrategia fue aplicable al 100% de

pacientes con LLA, ya que todas las células blásticas expresaban CD19 en pacientes con LLA-B

y CD7 en pacientes con LLA-T, siendo ambas moléculas suficientemente minoritarias como para

permitir la adquisición de 5 millones de leucocitos. Con respecto a las dos LA bifenotípicas

incluidas en este estudio (LA17 y LA18), ambas fueron también susceptibles de análisis de alta

sensibilidad, realizándose la selección por CD34.

Sin embargo, en 25% de pacientes con LMA (LA20 y LA31) no fue posible alcanzar una

sensibilidad superior a 10-4, ya que las células blásticas eran CD34- y no expresaban CD117 de

APLICACION CLÍNICA DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE ALTA SENSIBILIDAD


127

forma completa. Esto limitó el número de leucocitos totales adquiridos, no pudiendo alcanzarse

los 5 millones necesarios.

De las determinaciones en que se alcanzó alta sensibilidad (10-5 o mayor), el 33% de las

muestras con enfermedad presentó un nivel de EMR entre 0.01% y 0.001%, es decir, hubieran

sido clasificadas como negativas por la técnica estándar (Tabla 23, pag. 97). Dichas muestras

incluyeron varias determinaciones de un paciente con LA bifenotípica (LA18), así como el

análisis realizado tras la inducción en tres pacientes con LLA-B (LA2, LA7 y LA9). Como se

explicó en la Introducción, hay datos en la bibliografía relativos a LLA que sugieren que la

persistencia de este nivel de EMR tras la inducción confiere peor pronóstico cuando se compara

con pacientes cuya EMR es <0.001% (Malec y col., 2004; Neale y col., 2004; Paganin y col.,

2008; Bassan y col., 2009; Stow y col., 2010). Teniendo en cuenta que en la mayoría de los

pacientes no es posible el seguimiento por biología molecular, parece recomendable realizar el

estudio de EMR post-inducción por citometría de flujo de alta sensibilidad.

Con respecto a los pacientes con LMA, hubo dos determinaciones en que se detectó EMR por

citometría (0.014% y 0.009%) pero no por biología molecular. Correspondían al mismo paciente

(LA53), cuyos blastos presentaban duplicaciones internas en tándem del gen de FLT3. Está

descrito que esta alteración es inestable y frecuentemente sufre cambios durante el transcurso

de la enfermedad. Varios estudios han observado que en algunos casos este marcador está

presente en las muestras al diagnóstico, pero se pierde en la recaída o viceversa, por lo que su

utilidad como marcador para la detección de EMR debe considerarse con cautela (Kottaridis y

col., 2002; Cloos y col., 2006).

En resumen, la citometría de flujo estándar fue aplicable al seguimiento del 100% de los

pacientes con leucemia aguda, frente al 23% para la biología molecular, por lo que en la mayoría

de los pacientes el seguimiento fue únicamente citométrico.

La aplicabilidad de la técnica de alta sensibilidad fue del 100% en pacientes con LLA y del 75%

en LMA. Una tercera parte de las muestras en que se detectó enfermedad hubieran sido

clasificadas como negativas por la técnica estándar.


128

PACIENTES CON MIELOMA MÚLTIPLE

Con respecto al seguimiento de pacientes con MM, la técnica de alta sensibilidad fue aplicable al

100% de los pacientes, ya que el CD138 es un marcador minoritario en MO y en todos los casos

se pudieron adquirir 6 millones de leucocitos, sin limitación.

Se observó que en el 20% de las muestras de médula ósea extraídas cuando la inmunofijación

(IF) en suero u orina era negativa, se detectaba enfermedad por citometría de flujo estándar.

Resultados similares han sido obtenidos por otros investigadores: San Miguel y col. observaron

que el 14% de los pacientes que alcanzaban la remisión completa presentaban EMR por

citometría (San Miguel y col., 2002). Sarasquete y col. detectaron un 21% de casos EMR+ por

citometría siendo la IF negativa. Observaron además, que un umbral de sensibilidad de 10-4 era

útil para estratificar a los pacientes según el riesgo de recaída, tanto por ASO-PCR como por

citometría, pero dicha estratificación no se lograba con la IF (Sarasquete y col., 2005). Paiva y

col. muestran resultados similares (Paiva y col., 2008).

Aplicando citometría de alta sensibilidad a nuestra serie, el porcentaje de pacientes CF+ IF-

aumentaba a un 33%. Los pacientes a los que correspondían estas determinaciones (MM-3,

MM-11 y MM-20) progresaron o recayeron entre 3 y 5 meses después. Es decir, la aplicación de

citometría de alta sensibilidad permite identificar, dentro de los pacientes con IF negativa, un

subgrupo que tienen enfermedad <0.01%. En un estudio reciente realizado por Paiva y col. en

pacientes ancianos no susceptibles de tratamiento a altas dosis, en que utilizaron CF con una

sensibilidad entre 10-4 y 10-5, comprobaron que la remisión inmunofenotípica se asocia a mayor

supervivencia libre de progresión que la remisión completa o la remisión completa estricta (Paiva

y col, 2011). La red italiana GIMEMA ha observado que la remisión molecular define un grupo de

pacientes con mejor pronóstico (Ladetto y col, 2010). Puesto que menos del 75% de los

pacientes son candidatos a estudio molecular (Sarasquete y col., 2005; Paiva y col., 2008 y

2011; Yuan y Stetler-Stevenson, 2011), es evidente que debe ser la CF la que proporcione alta

sensibilidad.

Observamos 4% de falsos negativos con la técnica de alta sensibilidad. En esta misma línea,

Paiva y col muestran un 7% de pacientes con IF+ y CF-. Sin embargo, en su caso todos los

pacientes negativizaron la IF en la siguiente determinación, atribuyéndose la discordancia inicial


129

a un aclaramiento prolongado de paraproteína residual (Paiva y col, 2011). También nosotros

observamos un fenómeno similar en los pacientes MM-7 y MM-25 (Tabla 24b). El 4% de falsos

negativos al que nos estamos refiriendo corresponde a dos pacientes, MM-4 (det. 2) y MM-22

(det. 5). No disponemos de datos de seguimiento de MM-4, pero MM-22 recayó 6 meses

después.

La explicación más probable para un falso negativo verdadero es que la muestra analizada no

sea representativa. Teniendo en cuenta el patrón parcheado de la enfermedad, cabe la

posibilidad de que se realice la punción en un área no afectada (Paiva y col., 2008). Un

fenómeno que desde nuestro punto de vista afecta con mucha mayor frecuencia a la calidad de

las muestras de médula en pacientes con MM es el grado de contaminación con sangre

periférica que presentan. Para evaluarla, elegimos como indicador el porcentaje de neutrófilos de

la población granulocítica, y comprobamos que era significativamente superior en muestras de

pacientes con MM que de SLPC-B. Esto es lógico, teniendo en cuenta la naturaleza osteolítica

de la enfermedad (Kristinsson y col., 2010; Korde y Maric, 2011) y ha sido también sugerido por

otros autores (Batiníc y col., 1990; Gupta y col. 2009).

La contaminación significativa de una muestra de médula ósea con sangre periférica conduce

inevitablemente a la infraestimación del porcentaje de EMR detectado. Esto explicaría los

resultados obtenidos en 5 muestras, en las que detectamos enfermedad sólo con la técnica de

alta sensibilidad y no con la técnica estándar, siendo la IF+ (det. 3, 4 y 5 de MM-16; det. 8 de

MM-22 y det. 2 de MM-24). Teniendo en cuenta que la CF estándar es más sensible que la IF, tal

y como hemos explicado anteriormente (San Miguel y col., 2002; Sarasquete y col., 2005; Paiva

y col., 2008), hay que suponer que la infiltración detectada (<0.01) estaba significativamente

infraestimada. Parece lógico suponer que este mayor grado de contaminación con sangre

presente en el MM contribuirá de forma decisiva al conocido grado de discrepancia que suele

existir entre el porcentaje de células plasmáticas cuantificado en el medulograma y por

citometría, aunque se sabe que existen otros factores implicados. Nadav y col. consideran que

las células mielomatosas se alojan en nichos trabeculares ricos en lípidos. La extracción inicial

del copo medular, que es la muestra que se utiliza para el medulograma, es representativa, a

diferencia del fluido medular que se aspira para el estudio de citometría. Son necesarios

sucesivos pases a través de la aguja para que las células plasmáticas se liberen de su

alojamiento sólido a la fase fluida (Nadav y col., 2006).


130

El grado de discrepancia observado en este trabajo entre el porcentaje de células plasmáticas

totales, del medulograma y de la citometría (ratio MG/CF), fue de 4.4±2.9, en consonancia con lo

observado por otros autores (Nadav y col., 2006; Rawstron y col., 2008; Bacher y col., 2010).

Con el fin de comprobar si este fenómeno estaba relacionado con la contaminación con sangre

de las muestras, realizamos un estudio de correlación entre la ratio MG/CF y el porcentaje de

neutrófilos de la población granulocítica, y observamos que era significativa (R= 0.42). Es decir,

a mayor contaminación de la muestra con sangre periférica, mayor discrepancia entre MG y CF.

Parece claro, por tanto, que hay que incluir un marcador de contaminación con sangre periférica

en el análisis de EMR por citometría de flujo en MM. El hecho de que el porcentaje detectado en

una muestra concreta esté infraestimado no invalida el estudio, siempre que sea posible realizar

algún tipo de evaluación del grado de infraestimación que se está produciendo.

En resumen, en pacientes con mieloma múltiple, la aplicabilidad de la técnica de citometría de

alta sensibilidad para cuantificar EMR fue del 100%. Una tercera parte de las muestras de

médula ósea extraídas en situación de inmunofijación negativa presentaba enfermedad

detectable sólo por citometría de alta sensibilidad. La cuantificación de EMR en muestras de

médula ósea de pacientes con mieloma múltiple debe incluir un marcador que evalúe el grado de

contaminación con sangre periférica, ya que ésta es superior a la observada en otras neoplasias

hematológicas y afecta significativamente al resultado.

Conclusiones

Esther Domingo Rodríguez Conclusiones

133

1. La adquisición de 5 millones de leucocitos en un citómetro digital permite cuantificar

enfermedad mínima residual con alta sensibilidad, manteniéndose la exactitud y

especificidad, con una técnica aplicable a la práctica diaria.

2. La detección de 50 células tumorales permite cuantificar enfermedad mínima residual con

precisión.

3. El aumento del número de marcadores analizados, por encima de la combinación mínima

que identifica en cada caso las células patológicas, no mejora la sensibilidad de la técnica.

4. La cuantificación de EMR con alta sensibilidad requiere que la totalidad de las células

tumorales exprese un marcador minoritario en médula, para que pueda aplicarse sin

restricciones el protocolo de doble adquisición.

5. La aplicabilidad de la técnica de citometría de alta sensibilidad para la cuantificación de EMR

fue del 100% en pacientes con leucemia linfoblástica aguda, y del 75% en leucemia

mieloblástica aguda.

6. En pacientes con leucemia aguda, una tercera parte de las muestras EMR+ presentaron un

nivel de enfermedad indetectable con la técnica estándar.

7. En pacientes con mieloma múltiple, la aplicabilidad de la técnica de citometría de alta

sensibilidad para cuantificar EMR fue del 100%. Una tercera parte de las muestras de

médula ósea extraídas en situación de inmunofijación negativa presentaba enfermedad

detectable sólo por citometría de alta sensibilidad.

8. La cuantificación de EMR en muestras de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple

debe incluir un marcador que evalúe el grado de contaminación con sangre periférica, ya que

ésta es superior a la observada en otras neoplasias hematológicas y afecta

significativamente al resultado.

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Abreviaturas

Esther Domingo Rodríguez Abreviaturas

151

ADN: Ácido desoxirribonucleico

APC: Aloficocianina (del ingés Allophycocyanin)

ARN: Ácido ribonucleico

ASO-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa- oligonucleótido alelo específica (del inglés

Allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction)

B: del inglés Background: Ruido de fondo, interferencia

BCL2-JH: Gen híbrido entre el protooncogén bcl- -lymphoma 2) y el gen que

codifica para los segmentos JH de las inmunoglobulinas

CD: del inglés Cluster of differentiation: grupo de diferenciación

CF: Citometría de flujo

CFa: Citometría de flujo de alta sensibilidad

CFe: Citometría de flujo estándar

CS-T: del inglés Cytometer Setup and Tracking

CUN: Clínica Universidad de Navarra

CV: Coeficiente de variación

Cy: Cianina

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético (del inglés Ethylenediaminetetraacetic acid)

EMR: Enfermedad mínima residual

FISH: Hibridación in situ con fluorescencia (del inglés Fluorescent in situ hybridization)

FITC: Isotiocianato de fluoresceína (del inglés Fluorescein isotiocyanate)

FL: Fluorocromo

FSC: Dispersión frontal de la luz (del inglés Forward light scatter)

GIMEMA: Grupo italiano para la hemopatías malignas del adulto

HLA: Antígeno leucocitario humano (del inglés Human leukocyte antigen)

IC: Intervalo de confianza

IF: Inmunofijación

ITD: Duplicaciones internas en tándem

LF: Linfoma folicular

LGL-T: Leucemia de células grandes granulares T (del inglés T cell large granular leukaemia)

LLA: Leucemia linfoblástica aguda

LLC-B: Leucemia linfática crónica B

LMA: Leucemia mieloblástica aguda

Esther Domingo Rodríguez Abreviaturas

152

LPA: Leucemia Promielocítica Aguda

mbr: del inglés major breakpoint region

mcr: del inglés minor cluster region

MG: Medulograma

MIF: Media de la intensidad de fluorescencia

MM: Mieloma múltiple

MO: Médula ósea

NCI-WG: del inglés National Cancer Institute-sponsored working group on chronic lymphocytic

leukemia

nd: No determinado

nv: No valorable

PBS: Tampón fosfato salino (del inglés Phosphate buffered saline)

PCP: proteína peridinin-clorofila (del inglés Peridinin chlorophyll protein)

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polymerase chain reaction)

PE: Ficoeritrina (del inglés Phycoerithrin)

PG: Proteinograma

PMT: Tubo fotomultiplicador (del inglés Photomultiplier tube)

RQ-PCR: PCR cuantitativa en tiempo real (del inglés Real-time quantitative PCR)

S: Sensibilidad

SD: desviación estándar

sFLC: Cadenas ligeras libres en suero ( del ingés serum Free Light Chains)

SLPC-B: Síndrome linfoproliferativo crónico-B

SLPC-T: Síndrome linfoproliferativo crónico-T

SMD: Síndrome mielodisplásico

SP: Sangre periférica

SS: Síndrome Sezary

SSC: Dispersión lateral de la luz (del inglés Sideward light scatter)

desarrollo de una técnica de citometría de flujo ...dadun.unav.edu/bitstream/10171/20687/1/tesis...

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