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Submitted on 1 Jan 1990

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Diagnostic du sexe des embryons bovins par biologiemoléculaire

M Kirszenbaum, Corinne Cotinot, M Leonard, M Vaiman, M Fellous, S Ruffini

To cite this version:M Kirszenbaum, Corinne Cotinot, M Leonard, M Vaiman, M Fellous, et al.. Diagnostic du sexe desembryons bovins par biologie moléculaire. Reproduction Nutrition Development, EDP Sciences, 1990,30 (Suppl1), pp.125s-132s. �hal-00899316�

Article de recherche

Diagnostic du sexe des embryons bovinspar biologie moléculaire

M Kirszenbaum C Cotinot2 M Leonard2M Vaiman1 M Fellous3

S Ruffini2

1 Laboratoire de Radiobiologie Appliquée, CEA-IPSN-DPS-SPE, 78350 Jouy-en-Josas;2 Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, INRA, 78350 Jouy-en!losas;

3 Institut Pasteur, INSERM U276, 75015 Paris, France

(28e réunion de la Société Française pour l’Étude de la Fertilité; Paris, 19-21 octobre 1989)

Résumé ― Grâce à la construction d’une bibliothèque génomique bovine enrichie en séquencesmâles, nous avons obtenu une sonde spécifique du chromosome Y, répétée environ 2 000 fois dansle génome mâle des animaux du genre Bos et Bison. Pour être compatible avec le transfert et/ou lacongélation des embryons, la détermination du sexe doit être effectuée sur une biopsie de 10 à 20cellules prélevée sur un blastocyste de 7 j. L’hybridation in situ avec la sonde BC 1.2 biotinée suiviede la révélation immunocytochimique a permis de visualiser le signal d’hybridation sur le noyau dechaque cellule mâle. Cependant, à cause de ces nombreuses étapes, cette technique est apparuedifficile d’application en routine. Pour cette raison, nous avons développé la technique de l’amplifica-tion enzymatique dirigée (PCR). A partir de la séquence BC 1.2, nous avons déterminé les amorceset les sondes dans le but d’amplifier des séquences spécifiques du chromosome Y. Cette technique,facile d’utilisation et d’automatisation, a permis d’obtenir un fort signal d’hybridation spécifique dumâle à partir de fADN génomique et des cellules embryonnaires.

sexage / embryon bovin / chromosome Y / hybridation In sltu l amplification enzymatique diri-gée

Summary ― Sexing of bovine embryos. Thanks to a bovine genomic library enriched with Y chro-mosome-specific sequences, a probe specific to this chromosome of genera Bos and Bison and re-peated on about 2 000 copies in the male genome was isolated. To be compatible with embryotransfer and/or freezing, sex determination has to be done on a 10-20 cell embryo biopsy from aday-7 bovine blastocyst The in situ hybridization with biotinylated BC 1.2 probe and immunocyto-chemical revelation permitted the visualization of the hybridization signal on the nucleus of each cell.Because of the numerous steps required, this technique was difficult to apply routinely. For that rea-son we worked out the polymerase chain reaction technique. From the BC 1.2 sequence, we deter-mined several oligonucleotide primers and probes with the aim of amplifying the Y chromosome-specific sequences. This technique, which is easy to perform and to automate, enabled us to obtaina strong male-specific hybridization signal on genomic DNA and embryo cells.

sexing / bovine embryo / Y chromosome / In situ hybridization / PCR amplification

INTRODUCTION

Depuis la généralisation de l’inséminationartificielle chez les bovins. le transfert

d’embryons représente la seconde étapedécisive dans l’évolution des techniquesde reproduction de cette espèce. Parmiles multiples applications que l’on peut at-tendre du transfert, citons la possibilitéd’accroître de manière significative le

nombre de descendants femelles d’unevache sélectionnée par son haut potentielgénétique. Une vache ayant en moyenne1,5 à 2 descendantes au cours de sa vie,les traitements hormonaux de superovula-tion associés au transfert d’embryons per-mettraient de décupler ce nombre et cecid’autant plus facilement que le sexe desembryons serait connu. De même, la pos-sibilité pour les éleveurs de faire naîtred’une façon régulière des veaux de sexedésiré représente un gain de productiviténon négligeable.

La détermination du sexe des em-

bryons bovins n’est envisageable qu’àl’âge où s’effectue le transfert, soit 7 à 8 jde gestation, âge lui-même conditionné

par le fait qu’il s’agit du stade optimumpour la congélation de l’embryon en vuede sa conservation (Heyman, 1988).

Les premières tentatives de sexage desembryons de mammifères avant leurtransfert remontent aux années 1980.Elles étaient basées sur les possibilitésoffertes par l’analyse chromosomique (Pi-card et al, 1985), ou sur la détection immu-nologique d’une molécule de membrane,l’antigène H-Y, considéré comme étant

spécifiquement exprimé par les cellulesmâles (Wachtel et al, 1988; Booman et al,1989).

La difficulté des techniques cytogénéti-ques réside dans le fait que même en sa-crifiant la moitié d’un embryon le nombre

de cellules en division reste faible et ne

permet de déterminer le sexe que dans60% des cas. De plus, l’hemisection réduitconsidérablement les chances de dévelop-pement ultérieur de la moitié congelée.Les essais de sexage réalisés à partir debiopsies de 10 à 20 cellules permettent undiagnostic dans seulement 30% des cas(Picard et al, 1985). Néanmoins, l’intérêtde l’analyse cytogénétique réside dans lefait qu’elle fournit un résultat fiable à 100%.La technique de détection de l’antigèneH-Y ne semble pas être suffisamment per-formante pour être utilisée en routine chezles bovins.

Face à ces difficultés, nous avons envi-sagé une nouvelle approche du sexagedes embryons bovins. Les résultats obte-nus sur l’organisation moléculaire des

chromosomes sexuels humains et murins

(Bishop et ai, 1985) nous ont conduits àproduire des sondes moléculaires spécifi-ques du chromosome Y des bovins. Pource faire, nous avons construit une biblio-thèque génomique bovine enrichie en sé-quences mâles par la technique d’hybrida-tion-sélection (Lamar et Palmer, 1984).Parmi les clones analysés, l’un d’entre euxBC 1.2 (brevet n° 8602811) a fait l’objetd’une analyse approfondie afin de pouvoirêtre utilisé pour le sexage des embryons.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Extraction de l’ADN

L’ADN est extrait à partir de lymphocytes dusang périphérique provenant d’animaux mâleset femelles bovins.

Blots génomiques, hybridationTous les blots génomiques sont préparés à par-tir de 10 !g d’ADN totalement digérés parles différentes enzymes de restriction utilisées

(6 unités/pg d’ADN). Les fragments sont sépa-rés sur des gels d’agarose 0,8% (w/v) et transfé-

rés sur des membranes de nylon (Southern,1979).

Les blots ainsi obtenus sont préhybridés pen-dant 4 h à 42°C dans un tampon contenant 50%(v/v) de formamide desionisée, 5 x Denhardt, 5x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCI, 0,015 M citratede sodium, pH 7,4) 0,02 M phosphate de so-dium, pH 6,7, 0,5% (w/v) SDS et 100 gg/mld’ADN de sperme de saumon, puis hybridés enprésence de 4 x 106 cpm/ml de sonde radioac-tive marquée au 3zp.

Après l’hybridation, les membranes sont la-vées pendant 15 min à dans un tampon 2 xSSC, 0,1% SDS puis deux fois 30 min en 0,2 xSSC, 0,1% SDS 65°C. Les autoradiographiessont effectuées sur des films Kodak XAR-5 ex-

posés à -70°C en présence d’écrans intensi-fiants pendant 1 à 48 h.

Synthèse et marquage des oligonudéotidesTous les oligonucléotides de synthèse sont mar-qués en extrémité 5’ avec du y32P adenosinetriphosphate à l’aide de l’enzyme T4 polynucléo-tide kinase.

Dot-blots

Des différents échantillons d’ADN sont dénatu-rés avec 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA pendant 15 5min à température ambiante puis déposés àl’aide d’un appareil à dot sur des membranes denylon. Les filtres sont neutralisés dans du tam-pon phosphate 1,5 M, pH 5,5, pendant 2 fois 10 0min.

EmbryonsLes embryons sont collectés à 7-8 j de gesta-tion, à partir de génisses superovulées. Du mi-lieu PBS (phosphate buffered saline) contenant1% de SAB (serum albumine bovine) est utilisépour rincer les cornes utérines. Les embryonssont ensuite transférés dans du milieu PBS ad-ditionné de 10% de SVF (serum de veau foetal)où ils sont disséqués grâce à l’utilisation de mi-cromanipulateurs. Les biopsies embryonnairessont rincées dans du PBS seul, puis déposéessoit sur une lame histologique en vue de leuranalyse par hybridation in situ, soit dans un tubede 0,6 ml contenant 20 ul d’eau distillée stérileen vue de l’amplification enzymatique (PCR).Dans ce dernier cas, les tubes sont immédiate-ment plongés dans l’azote liquide puis stockés à- 80 °C.

Hybridation in situLes lymphocytes bovins ou les biopsies em-bryonnaires sont fixées sur des lames histologi-ques avec une solution de Carnoy (éthanol,chloroforme, acide acétique, 6:3:1 ).

Un fragment de 350 paires de bases du plas-mide pUC9 contenant l’insert BC 1.2 est utilisécomme sonde. Le marquage de la sonde s’ef-fectue par nick-translation avec de l’UTP biotiné.La sonde marquée est diluée dans le liquided’hybridation (4 x SSC, 1 mM EDTA, 25 mM TrispH 7,3; 5 x Denhardt, 10% dextran, 50% forma-mide) et déposée sur chaque lame. Les ADNsont dénaturés à 100°C pendant 10 min puis hy-bridés à 42°C pendant 4 à 16 h.

Après l’hybridation, les lames sont lavéesdans 2 x SSC, 0,1 x SSC puis dans du PBS,avant d’être incubées 1 h à 37°C avec un anti-

corps de chèvre antibiotine. Elles sont de nou-veau lavées puis incubées avec un anticorps delapin antichèvre couplé à la peroxydase.

Après les lavages avec le PBS, les lamessont incubées avec 10 pg/ml de diaminobenzi-dine pendant 5 à 8 min. Pour amplifier le précipi-té de la diaminobenzidine, les lames sont trai-tées successivement avec le chloroaurate de

sodium, le sulfate de sodium puis le nitrate d’ar-gent (Burns et al, 1985). Entre chaque traite-ment, les lames sont soigneusement rinçéesavec de l’eau distillée pour éviter la précipitationnon spécifique de l’argent. Elles sont ensuite sé-chées et montées pour l’observation au micro-

scope optique.

Amplification enzymatique dirigée de I ADN etdes cellules

L’ADN ou les cellules sont placés dans destubes siliconés de 0,6 mi sous un volume de50 ul puis introduit dans l’appareil DNA ThermalCycler (Perkin Elmer Cetus). Après 10 min à95°C, chaque échantillon reçoit 50 ul d’un mé-lange réactionnel contenant 200 pM de chaquedesoxynucléotide, 0,5 !M de chacun des oligo-nucléotides-amorces, 4 unités d’enzyme TaqADN polymérase, 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI,pH 8,3, 7 mM MgC’21 0,01% de gélatine.

Chaque tube reçoit ensuite 100 MI d’huile mi-nérale pour éviter l’évaporation, et est soumis à40 cycles d’amplification. Chaque cycle com-prend 3 étapes : 1 min à 95°C, 1 min à 60°C, 1min à 72°C (Saiki et al, 1985).

RÉSULTATS

Obtention et caractérisation de lasonde spécifique du chromosome Y

A partir de la banque génomique bovineenrichie en séquences spécifiques du

mâle, nous avons obtenu 200 clones re-combinants dont 131 contenant un insert.Tous ces inserts ont été analysés par l’hy-bridation des blots génomiques contenantde l’ADN mâle et femelle. Trois types deprofil d’hybridation ont été observés : 1)non spécifique du sexe (121 inserts); 2)partiellement spécifique du mâle (8 in-

serts); 3) entièrement spécifique du mâle(2 inserts) .

Un insert dénommé BC 1.2 spécifiquedu génome mâle a été séquence et analy-sé en détail.

L’hybridation in situ sur chromosomesen métaphase (Popescu et al, 1988) et

l’utilisation des hybrides somatiques hams-ter-bovins ont permis de localiser la sé-

quence BC 1.2 sur le chromosome Y dutaureau. D’autre part cette sonde s’est ré-vélée uniquement spécifique des animauxdu genre Bos et Bison, répétée environ2 000 fois dans le génome mâle et nontranscrite.

Hybridation in situ

Cette technique appliquée à la cellule em-bryonnaire en interphase permet d’identi-fier l’hybridation de la sonde BC 1.2 au ni-veau de chaque noyau. Nous avons utiliséla sonde BC 1.2 marquée à la biotine suivid’une révélation immunocytochimique.

Dans un premier temps, nous avonstesté cette technique sur les cellules lym-phocytaires provenant de taureau et devache. Dans le cas des lymphocytes dutaureau, nous avons obtenu un marquage

du noyau dans 85% des cellules contre8% de marquage avec des lymphocytesfemelles. Il semble que dans certaines cel-lules mâles l’ADN ne soit pas accessible àla sonde soit à cause de l’état physiologi-que de la cellule (condensation en relationavec les différentes phases du cycle cellu-laire), soit à cause d’une dénaturation in-

suffisante de l’ADN. Pour les cellules fe-melles il s’agit d’une précipitation non

spécifique survenue au cours des diffé-rentes étapes immunocytochimiques cons-tituant le bruit de fond inhérent à la techni-

que. Ces deux valeurs représentent leslimites de précision de l’hybridation in situ.

Après la microdissection de l’embryon,la biopsie de 10 à 20 cellules est sexéepar l’hybridation avec la sonde BC 1.2 bio-tinée. Les résultats du sexage ont été com-

parés avec ceux de l’analyse cytogénéti-que effectuée sur la partie restante de

l’embryon (environ 100 à 120 cellules) (fig1 ).

Sur 19 résultats de sexage par hybrida-tion in situ, 18 ont été corroborés par l’ana-lyse cytogénétique. L’application de cettetechnique sur un nombre importantd’échantillons révèle les limites de son utili-sation en routine. Environ 38% des biop-sies ont été perdues pendant les diversesétapes de l’hybridation et de la révélation.D’autre part, 34% des biopsies n’ont paspu être correctement interprétées soit àcause de l’importance du bruit de fond, soitde l’état physique de la biopsie. Parmi lesembryons sexés, 9 ont été transférés chezdes vaches receveuses et 6 gestations ontété obtenues. Le sexe des foetus détermi-né in visu à 60 j s’est révélé correct dans 5cas sur 6.

Amplification enzymatique dirigée

A partir de la séquence BC 1.2, nous

avons déterminé celle des amorces et des

sondes pour leur application au sexagedes biopsies embryonnaires. Nous avonsmis au point les conditions d’amplificationsur l’ADN génomique purifié du taureau etde la vache correspondant à un très faiblenombre de cellules (50 à 200 pg d’ADNcorrespondant à 10-40 cellules). Après 40cycles d’amplification, l’hybridation avec lasonde radiomarquée nous a permis d’obte-nir un fort signal d’hybridation seulementavec l’ADN mâle.

Afin de démontrer la faisabilité du testdirectement à partir d’un faible nombre decellules, une série de 10 échantillonscontenant chacun de 50 à 70 cellules em-

bryonnaires a été soumise à l’amplificationenzymatique. Nous avons observé un fortsignal d’hybridation dans le cas de 4échantillons et aucun signal pour les 6autres (fig 2). Par comparaison avec lesrésultats obtenus à partir d’ADN lymphocy-taire mâle et femelle, nous avons attribué

l’obtention du signal d’hybridation à la pré-sence du chromosome Y.

DISCUSSION

Grâce à l’obtention de sondes d’ADN spé-cifiques du chromosome Y dés bovins, ilest désormais possible de déterminer lesexe des embryons par hybridation molé-culaire (Leonard et al, 1987; Bondioli et al,1989). Les deux techniques décrites ici

permettent d’effectuer le diagnostic à partirde prélèvements contenant seulement 10à 50 cellules. L’hybridation in situ sur biop-sies nécessite la mise en oeuvre de réac-tions immunocytochimiques complexes quipermettent d’augmenter et de rendre vi-sible le signal d’hybridation au niveau dechaque noyau cellulaire. L’amplification en-zymatique dirigée (PCR) est utilisée pouraugmenter de façon considérable la quan-tité de matériel de départ et rendre la dé-tection du signal d’hybridation plus aisée.Bien qu’il soit indispensable de microdissé-quer les embryons, il n’est pas nécessaire,comme pour l’analyse cytogénétique, d’ef-fectuer des cultures cellulaires ni de tra-vailler à partir de cellules en métaphase; lediagnostic est donc réalisable en 24-48 h.

Chacune des deux techniques présentedes avantages et des inconvénients qui luisont propres. La possibilité d’automa-tisation offerte par la technique PCR cons-titue un progrès notable pour le traitementd’un grand nombre d’échantillons dans desconditions normalisées, tandis que la ma-nipulation de nombreuses lames en sériesapparaît comme délicate. De plus, les

étapes multiples de la révélation immuno-cytochimique sont peu adaptables à uneutilisation de la technique d’hybridation insitu en routine. Le problème de la sensibili-té se pose ici par défaut, à l’inverse de latechnique PCR ou l’extrême sensibilité

peut être l’inconvénient majeur de la mé-

thode. Des études récentes ont montré

qu’il était désormais possible d’appliquer latechnique PCR à une seule cellule (Li etal, 1988; Handyside et al, 1989); cette évo-lution technique est souhaitable, car moinsl’embryon sera endommagé, meilleuresera sa viabilité ultérieure. De plus, le faitd’utiliser le minimum de cellules permettrad’étudier à partir d’un même embryon plu-sieurs gènes marqueurs et de ce fait sélec-tionner les animaux les plus performantspour leurs compétences zootechniques(résistance aux maladies, haut potentielgénétique). Cependant, il faut soulignerque le fait de travailler à partir de très pe-tites quantités de matériel (1 à 10 cellules)nécessite un grand nombre de cyclesd’amplification, ce qui est la cause de nom-breuses complications telles que : l’amplifi-cation artéfactuelle des amorces ou del’ADN ainsi que l’augmentation des risquesde contamination par l’ADN amplifié. Cesproblèmes peuvent être minimisés en pre-nant de grandes précautions lors de la ma-nipulation des échantillons. La séparationphysique lors du traitement des tubesavant et après l’amplification devient alorsindispensable.

CONCLUSION

Les résultats présentés ici montrent qu’ilest possible de déterminer le sexe des em-bryons bovins à partir d’une biopsie à l’aidede sondes moléculaires par hybridation insitu ou l’amplification enzymatique. Bien

qu’importante sur le plan historique, la

technique d’hybridation in situ présente lesinconvénients inhérents à la manipulationde quelques cellules déposées sur unelame de verre et à l’utilisation d’une suc-cession de réactions complexes. D’autre

part, il est difficile d’envisager son automa-tisation, seule possibilité d’obtenir une

bonne reproductivité et une application à

grande échelle. Appliquée à notre projet, latechnique PCR a déjà permis l’obtentionde résultats tout à fait encourageants àpartir de 50 à 70 cellules embryonnaires.Les perfectionnements possibles devraientconduire à un sexage efficace et automati-sable à partir d’un nombre plus restreint decellules.

REMERCIEMENTS

Nous remercions Y Heyman, P Chesné et MGStinakre pour la collecte et la microdissectiondes embryons, Mme Hors-Cayla pour avoir misà notre disposition les lignées d’hybrides somati-ques hamster-bovins. Ce travail a été partielle-ment financé par un contrat ANVAR n° 3517A.

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