19/04/2013

1

Differenziazione di cellule ossee in condizioni

fisiologiche e patologiche Osteoblasti

Cellule ossee

Formazione di

matrice ossea

Meccanocettori

Riassorbimento

osseo

Osteociti

Osteoclasti

5%1%

94%

OsteoclastPrecursors

Osteoblasts

DifferentiatedOsteoclast

RIMODELLAMENTO OSSEO IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE

Osteo-deposizione

Riassorbimento osseo

Seeman E and Delmas P. N Engl J Med 2006;354:2250-2261

Differenziamento da precursori midollari

• Cellule osteoclastiche

e

• Cellule osteoblastiche

clinicaloptions.com/oncologySkeletal Integrity in Oncology

cellula progenitrice monocita macrofagica (GM-CFU)

Preosteoclasto Cluster di preosteoclasti

Osteoclasto maturo

TRAP +

CTR +

ααααvββββ3+

M-CSF M-CSF

RANKL RANKL

OSTEOCLASTOGENESI

OPG OPG

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2

c-FMS

of macrophage

RANK

c-FMS

of macrophage

RANK

Pre OCs

DAP12 FcRγ

NFAT2

DC-STAMP FUSIONE

Nature Reviews Immunology 7, 292-304 (April 2007)

Potential mechanism of fusion of preosteoclasts and of macrophages.

Vignery A J Exp Med 2005;202:337-340

Anandarajah, 2009

•Acidificazione–Anidrasi carbonica–Pompa H+/ATPasi•Proteolisi–Catepsina

MCSF e RANKL

Dopo 24 ore di coltura si recupera la frazione cellulare non aderente e si coltiva con

TRAP+ Osteoclasts in culture

Osteoclasta coltivato su

fettina di osso

Lacuna di riassorbimento scavata dalla cellula

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3

OsteoblastogenesisBone Marrow Stromal Cells

Osteoblasts

WntPre-Osteoblasts

ALP+Coll I+

ALP++Coll I++

OsteocalcinBSP

Runx2

OsterixFra-2JunD

Wnt

AP1

Runx2Fra-1JunDAP1

Early phase of osteoblastogenesis

Late phase of osteoblastogenesis

Osteocytes BMSCCbfa1/Runx2

Wnt

Wnt

PPARγγγγ

PPARγγγγ

OSTEOBLASTFORMATION

ADIPOCYTE FORMATION

C/EBPα

OSTEOBLASTI E ADIPOCITI HANNO UN PROGENITORE COMUNE

Cbfa1/Runx2

Frat-1

sFRPWIF-1

Dsh

WNT

Axin

Frizzled

GSK-3

β-Cateninβ-Catenin

β-CateninNucleo TCF/LEF

WNTWNT

Citoplasma

FrizzledSclerostin

P

RUNX2, AP-1

β-Catenin

DKK-1

APC

GSK-3

Axin

β-Catenin

Activation of canonical Wnt signalingInhibition of canonical Wnt signaling

OsteoclastPrecursors

Osteoblasts

DifferentiatedOsteoclast

RIMODELLAMENTO OSSEO IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE

Osteo-deposizione

Riassorbimento osseo

DifferentiatedOsteoclasts

OsteoblastsActivated Osteoclasts

RIMODELLAMENTO OSSEO IN CONDIZIONI PATOLOGICHE

Osteo-deposizione

Riassorbimento osseo

Mieloma Multiplo

OSSO NORMALE OSSO OSTEOPOROTICO

Osteoporosi indotta da glucocorticoidi

Cellular mechanisms of myeloma bone disease

The original relationship between myeloma cells and osteoclasts

Current understanding of mechanisms of myeloma bone disease

Inhibition of

Wnt signaling

Pathogenesis of Multiple Myeloma Bone Disease

Alteration of RANK/RANKL/OPG

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4

Osteoblast suppression in MM bone disease has been related to the inhibition of the canonical Wnt signaling

Tian E. et al. The role of the Wnt-signaling antagonist DKK1 in thedevelopment of osteolytic lesions in multiple myeloma. N Engl J Med349(26):2483-94; 2003.

DKK1

Oshima T et al. Myeloma cells suppress bone formation by secreting asoluble Wnt inhibitor, sFRP-2. Blood 106(9):3160-5; 2005.

sFRP2

Giuliani N. et al. Production of Wnt inhibitors by myeloma cells: potentialeffects on canonical Wnt pathway in the bone microenvironment. CancerRes. 67(16):7665-74; 2007.

DKK1, sFRP3

WNTFrizzled

sFRPWIF-1 WNTWNT

SclerostinaDKK

osteoblastdifferentiation

Terpos E et al., Circulating levels of the Wnt inhibitors Dickkopf-1 andsclerostin in different phases of multiple myeloma: alterations post-therapywith lenalidomide and dexamethasone with or without bortezomib. (ASHAnnual Meeting Abstracts) Blood 2010; 116: (Abstract 2963).

What is known about sclerostin involvement in MM bone disease?

Terpos E et al., High Serum Sclerostin Correlates with Advanced Stage,Increased Bone Resorption, Reduced Osteoblast Function, and Poor Survivalin Newly-Diagnosed Patients with Multiple Myeloma. (ASH Annual MeetingAbstracts) Blood 2009; 114: (Abstract 425).

van Bezooijen et al Cytokine & Growth factor Rev 2005

•Sclerostin, encoded by SOST gene, is the most importantnegative regulator of bone formation and its production isrestricted to bone tissue

•Mutations in the SOST gene cause sclerosing bonedysplasia, such as Sclerosteosis and Van Buchen disease

Proliferation(osteoblastProgenitors) Matrix formation

(early osteoblasts)

Matrix maturation& mineralization

(mature osteoblasts)

Lining cells

Apoptosis

Osteocytes

Sclerostin

Benzooijen et al Cytokine & Growth factor Rev 2005

Sclerostin represents a negative regulatorof osteoblast differentiation

Sclerostin alteration could be involved in bone diseases including MM

�Investigate the expression of Sclerostin by myeloma cells

� Study the Sclerostin involvement in osteoblast differentiation in a co-colture system between Bone Marrow Stromal

Cells and myeloma cells

Aim of the work

Sclerostin expression by CD138+ cells from MM patients and HMCLs

MGUS

Sclerostin

Total ERK

no osteolysis osteolysis

0

0,4

0,8

1,2

1,6

0

0,1

0,2

0,3

0,4

OD RATI

OSclerostin/To

tal E

RK

Myeloma cells

…Co-coltures between bone marrow stromal cells (BMSCs)

and H929/CD138+ cells

anti-SclerostinmAb

BMSCs

H929/CD138+

0481216

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

CFU-F CFU-F

- + + + - + + +- - 50 500 - - 50 500

CD138+ cellsanti-Sclerostin (ng/ml)

CFU-F

*

CFU-F/w

ell

(Mean ±SE)

*

0481216

*

CFU-F/w

ell

(Mean ±SE)

*

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

CFU-OB CFU-OB

CFU-O

B/well

(Mean ±SE)

0

5

10

15

20

CFU-O

B/well

(Mean ±SE)

0

5

10

15

20

CD138+ cellsanti-Sclerostin (ng/ml)

- + + + - + + +- - 50 500 - - 50 500

- + + + - + + +- - 50 500 - - 50 500

- + + + - + + +- - 50 500 - - 50 500

**

**

Formation of CFU-F and CFU-OB in BMSCs co-coltured with H929 or CD138+ cells from the patients

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5

Effect of human myeloma cells on ß-catenin accumulation into the nucleus of BMSCs

Formation of the LRP5/6-sclerostin immunocomplex

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

BMSCs

Sclerostin

- + + + - - 50 500

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

β-Catenin

Lamin B1

- + + + - - 50 500

BMSCs

OD RATI

Oβ-Catenin/LaminB1

- + + + - - 50 500

BMSCs

0

4

- + + + - - 50 500

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

BMSCs

BSP II

β-Actina

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

Coll I

β-Actina

- + + + - - 50 500

BMSCs

0

0,4

0,8

1,2

Osteocalcin mRN

A relative

fold change (M

ean ±SE)

H929anti-Sclerostina (ng/ml)

- + + + - - 50 500

BMSCs

**

Effect of myeloma cells on bone matrix protein expression by BMSCs

- + + + - - 50 500

BMSCs

BMSCs

Fra-2

Lamin B1

- + + + - - 50 500

H929anti-Sclerostin(ng/ml)

H929anti-Sclerostin(ng/ml)

BMSCs

- + + + - - 50 500

JunD

Lamin B1

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

Fra-1

Lamin B1

Effect of myeloma cells on transcription factor expression by BMSCs

Wnt3a over-expression up-regulated OPG

Wnt inhibitors down-regulated OPG expression

Osteoblasts

Osteoblasts

Osteoclasts

Osteoclasts

La via di WNT regola l’asse RANKL/OPG

J Cell Sci. 2006: 119:1283-96

BMSCs

BMSCs

H929anti-Sclerostina (ng/ml)

H929anti-Sclerostin (ng/ml)

- + + + - - 50 500

RANKL

β-Actin

OPG

β-Actin

- + + + - - 50 500

00,30,60,91,21,51,8

0

0,2

0,4

0,6

- + + + - - 50 500

BMSCs

- + + + - - 50 500

BMSCs

OD RATI

OOPG

/ β-actin

OD RATI

ORA

NKL

/ β-actin

Effect of human myeloma cells on RANKL and OPG expression by BMSCs

**

**

MM Cells

OBs

Sclerostin

Myeloma cells through sclerostin secretion contribute to

MM Cells

OBs

Sclerostin

RANKLOPG

1) Inhibit OB formation and activity directly

2) Induce OC formation and resorption indirectlySclerostin can be an attractive candidate for developing novel

targeted therapies for this diseaseX

Cortisolo Aldosterone

Deficit di 21-idrossilasi (21-OHD)Malattia ereditaria autosomica recessiva

Colesterolo

21-Idrossilasi

Terapia sostitutiva cronica con

Glucocorticoidi

Osteoporosi indotta da glucocorticoidi (GIO)

EFFETTO DEI GLUCOCORTICOIDI SUL TESSUTO OSSEO

OSSO NORMALE OSSO OSTEOPOROTICO

Glucocorticoidi

OsteoblastiOsteoblastiOsteoblastiOsteoblastiOsteocitiOsteocitiOsteocitiOsteociti OsteoclastiOsteoclastiOsteoclastiOsteoclasti

OPGRANKL

Apoptosi

Apoptosi

Numero cellule Sopravvivenza

Fragilità ossea Neoformazione ossea Riassorbimentoosseo

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6

Osteoblasti

GC

Ridotta

neo-deposizione

Aumentato

riassorbimento osseo

Osteoclasti

Osteoporosi indotta da glucocorticoidi

1a FASE

2a FASE

CONTROLLO 21-OHD

MCSF

RANKL

MCSF

RANKL

( - )

( + )

Aumentata osteoclastogenesi in soggetti in età pediatrica affetti da 21-OHD in trattamento cronico con GC

Aumentati precursori degli OCs circolanti in soggetti in età pediatrica affetti da 21-OHD in trattamento cronico con GC

CONTROLLO

21-OHD

ESPRESSIONE DI CITOCHINE IN CELLULE T DI PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME ADRENO GENITALE E TRATTATI CON GLUCOCORTICOIDI

Linfociti T

RANKL

GAPDH

CONTROLLO 21-OHD

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

OD RATI

ORA

NKL

/GAPD

H

Linfociti T

CONTROLLO 21-OHD

Linfociti T

OPG

GAPDH

CONTROLLO 21-OHD

0

0,5

1

1,5

2

OD RATI

OOPG

/GAPD

H

Linfociti T

CONTROLLO 21-OHD

Serum levels of RANKL and OPG in 21-OHD patients

OP

G (p

mol

/L)

0

2

4

6

8

10

12

14

Controls CAH

*

p < 0.004

J Clin Endocrinol Metab 2009;94 (7):2269-76

p<0.01 p<0.01

p<0.005

cellule T

OPG

RANKL

Riassorbimento osseo

pre-osteoclasti

osteoclasti

J Clin Endocrinol Metab 2009;94(7):2269-76

In soggetti in età pediatrica affetti da 21-OHD in trattamento cronico con GC le cellule T supportano l’aumentata osteoclastogenesi

Osteoblasti

GC

Ridotta

neo-deposizione

Aumentato

riassorbimento osseo

Osteoclasti

Osteoporosi indotta da glucocorticoidi

1a FASE

2a FASE Ohnaka K, Tanabe M, Kawate H, Nawata H, Takayanagi R Glucocorticoid suppresses the canonical Wnt signal in cultured human osteoblasts. Biochem Biophys

Res Commun 329:177-181, 2005

Ohnaka K, Taniguchi H, Kawate H, Nawata H, Takayanagi R Glucocorticoid enhances the expression of dickkopf-1 in human osteoblasts: novel mechanism of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biochem Biophys Res Commun 318:259-264,

2004

Glucocorticoidi & DKK1Dickkopf-1 (DKK1)

J. Bone Min Ris 2006; 21:934-945

Fenotipo osseo in topi eterozigoti (DKK1 +/-)

• È la glicoproteina capostipite della famiglia Dickkopf ed è coinvolta nell’inibizionedella via delle Wnt

• Agisce su cellule mesenchimali (MSC) con conseguente inibizionedell’osteoblastogenesi e induzione dell’adipogenesi

• Prove sperimentali hanno dimostrato che DKK-1 è particolarmente elevato nellepatologie quali Artrite Reumatoide, Mieloma Multiplo, Morbo di Paget

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WNTFrizzled

ββββ-Cateninββββ-Catenin

ββββ-CateninNucleoTCF/LEF

Citoplasma

FrizzledSclerostina

ββββ-Catenin

Dkk-1WNT

Differenziamento osteoblasti

X

Differenziamento osteoblasti

DKK-1 ha un ruolo nell’alterato rimodellamento osseo in soggetti in età pediatrica affetti da deficit di 21-OHD in

trattamento cronico con GLUCOCORTICOIDI? 21-OHD Controlli

DKK

-1 (p

g/ml)

0

1000

2000

3000

4000

p<0.001

Livelli di DKK-1 nei sieri di pazienti affetti da 21-OHD

Espressione di DKK-1 in pazienti affetti da 21-OHD

Effect of dexamethasone on DKK1 expression in human leukocytes

0

20

40

60

80

Num

ber of ALP+

hOBs

/field (Mean

±SE)

Anti-DKK-1 - + - +siero di controllo siero da 21-OHD

*

siero di controllo ± 5 µg/ml Anti-Dkk1 siero da 21-OHD ± 5 µg/ml Anti-Dkk1

Effetto dell’anticorpo anti-DKK-1 e del siero di pazienti affetti da 21-OHD sul differenziamento degli osteoblasti

Osteoblasti

siero di controllo

5 µg/ml Anti-Dkk1 _ _+ +

siero di 21-OHD

Osteoblasti

β−Actina

Coll-I

Wnt3a over-expression up-regulated OPG

Wnt inhibitors down-regulated OPG expression

Osteoblasts

Osteoblasts

Osteoclasts

Osteoclasts

La via di WNT regola l’asse RANKL/OPG

J Cell Sci. 2006: 119:1283-96

siero di controllo ± 5 µg/ml Anti-Dkk1 siero da 21-OHD ± 5 µg/ml Anti-Dkk1

Effetto dell’anticorpo anti-DKK-1 e del siero di pazienti affetti da 21-OHD sull’asse RANKL/OPG

Osteoblasti

siero di controllo

5 µg/ml Anti-Dkk1 _ _+ +

siero di 21-OHD

Osteoblasti

β−Actina

RANKL

OPG DKK-1 (pg/ml)

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

RANKL (pg/m

l)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4r2= 0.95; p<0.0001

DKK-1 (pg/ml)

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

OPG

(pg/ml)

2

3

4

5

6

7

8r2= 0.83; p<0.0001

I livelli sierici di DKK-1 correlano con i valori di RANKL e OPG nei pazienti con 21-OHD

CONCLUSIONI

DKK-1 potrebbe essere uno dei mediatori chiave dell’alterato rimodellamento osseo che si osserva in soggetti in età pediatrica affetti da 21-OHD, con una azione diretta sul differenziamento degli osteoblasti e

indiretta sugli osteoclasti

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Novel bone agents

Pharmacology & Therapeutics. 2012; 134, 338–344

Denosumab Is the First Fully Human Monoclonal Antibody Targeting RANK Ligand

in Clinical Development

Fc-OPG OPG-Fc RANK-Fc Denosumab

Present1997

Fully human monoclonal antibody

Fusion proteins

OPG = osteoprotegerin.Simonet WS, et al. Cell. 1997;89:309-319. Data on file, Amgen.

Fc OPGRANK

•Omeostasi proteica è critica nei processi biologici Omeostasi proteica è critica nei processi biologici fondamentali per la sopravvivenza cellularefondamentali per la sopravvivenza cellulare

••••Particolarmente rilevante è la modulazione Particolarmente rilevante è la modulazione dell’omeostasi di quelle proteine critiche nella dell’omeostasi di quelle proteine critiche nella regolazione del ciclo cellulareregolazione del ciclo cellulare

••••••La via ubiquitinaLa via ubiquitina--proteosoma (UPP) è il proteosoma (UPP) è il principale meccanismo di degradazione delle principale meccanismo di degradazione delle proteine,comprese quelle coinvolte nella proteine,comprese quelle coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare.regolazione del ciclo cellulare.

••••••••Proteosoma è un bersaglio pertanto Proteosoma è un bersaglio pertanto rilevante nella terapia biologica “mirata” rilevante nella terapia biologica “mirata” delle neoplasie.delle neoplasie.

Omeostasi proteica e proteosoma

APOPTOSIAPOPTOSI

STABILIZZAZIONESTABILIZZAZIONE

PROLIFERAZIONEPROLIFERAZIONE MIGRAZIONEMIGRAZIONE

p21 p27p21 p27p53 Bid Baxp53 Bid Bax

Caveolina 1Caveolina 1

APOPTOSIAPOPTOSI

PROLIFERAZIONEPROLIFERAZIONE

ANGIOGENESIANGIOGENESI

APOPTOSIAPOPTOSI

JNKJNK

NFNF--kBkB

PROTEOSOMAPROTEOSOMA

Inibitori del proteosomaInibitori del proteosomaEffetti biologiciEffetti biologici

Inibitori del proteosoma e immunomodulanti

PROLIFERAZIONEPROLIFERAZIONE

CITOCHINE ANGIOGENICHECITOCHINE ANGIOGENICHE

MIGRAZIONEMIGRAZIONE

APOPTOSIAPOPTOSIAPOPTOSIAPOPTOSI

OSTEOCLASTOGENESIOSTEOCLASTOGENESI

OSTEOBLASTOGENESIOSTEOBLASTOGENESI

Effetti sia sulle plasmacellule mielomatose che sulle cellule ossee

RIASSORBIMENTO OSSEORIASSORBIMENTO OSSEO

DIFFERENZIAZIONEDIFFERENZIAZIONE