f

Dimonta, Ltd and Research Computing Center of Lomonosov Moscow State University

И.В. Оферкин, Е.В. Каткова, А.В. Сулимов, В.Б. Сулимов

Программа прямого обобщенного докинга FLM: валидация и исследование спектра энергетических минимумов комплексов

белок-лиганд

210.03.2010 В.А.Садовничий, В.Б.Сулимов, НИВЦ МГУ

Действие лекарства

Болезнь

Блокировка работы

активного центра

Белок

Активный Центр Белка

Белок Человека Белок Вируса

Органическая

молекула -

ингибитор

2

Работа фермента3

𝜐=𝜐𝑚𝑎𝑥 [𝑆]𝐾𝑚+[𝑆]

Enzyme Substrate

Product

ES

(Белок Человека Белок Вируса)

концентрация субстратаскорость реакции

константа Михаэлиса

Работа фермента в присутствии ингибитора:competitive inhibition

4

𝜐=𝜐𝑚𝑎𝑥 [𝑆 ]

𝐾𝑚(𝟏+[ 𝑰 ]𝑲 𝒊

)+[𝑆 ]

Inhibitor𝐾 𝑖=

[𝐸 ] [ 𝐼 ][𝐸𝐼 ]

[E] - концентрация свободного фермента[I] - концентрация свободного ингибитора[EI] - концентрация заингибированного фермента

510.03.2010 В.А.Садовничий, В.Б.Сулимов, НИВЦ МГУ

Для многих болезней известны белки-мишени, блокирование работы которых лечит болезнь

Ингибитор

Активный Центр Белка-Мишени

Белок

Блокирование работы белка осуществляется молекулами – ингибиторами

Основа нового лекарства – новые ингибиторы

15 Лет!

$500 M

50% временизатрачиваетсяна разработкуингибиторов:экспериментальнометодом проб и ошибок

Суперкомпьютеры ускоряют разработку ингибиторов

5

610.03.2010 В.А.Садовничий, В.Б.Сулимов, НИВЦ МГУ

Стадии разработки нового лекарства

Разработка базового соединенияLead compound

Доклинические испытания базового соединения на животных

Клинические испытания на людях

Ключевой Самый дешевый этап

10-15 лет $ 500 000 000

Начальный этап

6

710.03.2010 В.А.Садовничий, В.Б.Сулимов, НИВЦ МГУ

Докинг, скоринг и скрининг – основа конструирования лекарств

• Докинг – позиционирование лиганда в активном центре белка

• Скоринг – оценка энергии связывания лиганда с белком• Скрининг – перебор больших баз данных молекул с

целью поиска кандидатов в ингибиторы – нужны суперкомпьютеры

Молекулярное МоделированиеПомогает быстрее и дешевле

выполнять начальную стадию разработки

7

Влияние ингибитора на скорость реакции8

𝜐=𝜐𝑚𝑎𝑥 [𝑆 ]

𝐾𝑚(𝟏+[ 𝑰 ]𝑲 𝒊

)+[𝑆 ]

𝜐

[𝑆]0

1¿ [ 𝐼 ]=02¿ [ 𝐼 ]=𝐾 𝑖

3¿ [𝐼 ]=3𝐾 𝑖

Задача: найти ингибитор с низкой Ki9

𝐾 𝑖=[𝐸 ][ 𝐼 ][𝐸𝐼 ]

𝑅𝑇 ∗𝐿𝑛 (𝐾 𝑖 )=∆𝐺=𝐺𝐸𝐼−𝐺𝐸−𝐺 𝐼

𝐺=𝐻−𝑇𝑆

газовая постоянная (8.31 Дж/К*моль)

температура(310 К)

константа ингибирования

свободная энергия связывания белка с ингибитором

энтальпия энтропия

ΔG = -10 ккал/моль лучше, чем ΔG = -5 ккал/моль

10

nn

kTWU

ndpdpdxdxZ e 3131

/)(

3......

)2(

1

𝐺=−𝑅𝑇 ∗𝐿𝑛(𝑍 )

Движение лиганда в белке-мишени

статистическая сумма (configuration integral)

Вычисление ΔG [1]11• Белок состоит из 103-104 атомов, лиганд из 101-102 атомов

• Точность вычисления ΔG должна быть лучше, чем 1 ккал/моль = 0.04 эВ

• Она не достигнута в существующих программах докинга

• Многие программы докинга используют подгоночные коэффициенты в

функции скоринга

• Хорошие результаты получаются только для определенных белков и лигандов,

но не для произвольно взятого белка и лиганда

• Правильное позиционирование лиганда еще не означает правильное

вычисление ΔG

Вычисление ΔG [2]12

• Обычно используется силовое поле, которое плохо описывает

межмолекулярные взаимодействия, в частности, водородные связи

• Взаимодействие с растворителем не описывается или описывается весьма

грубо, в то время как оно весьма существенно: ε=78.5

• Находится только одно положение связывания лиганда

• Сложно учесть подвижность не только атомов лиганда, но и атомов белка,

хотя бы водородов белка в активном центре

• Должен производиться поиск минимума(ов) и комплекса лиганд-белок, и

свободного белка, и свободного лиганда

В программах докинга слишком много разных допущений и приближений, возможно, компенсирующих друг друга

SOL: программа классического докинга13поиск потенциальной энергии глобального минимума

расчет свободной энергии <--

силовое поле MMFF94

торсионно подвижный лиганд

жесткий белок, представленный сеткой потенциалов

Силовое поле MMFF94

E(r1, ..., rN) = [valence interactions] + [nonvalence interactions]

r1

r2

r3

EBij + EAijk + EBAijk + ETijkl + EOOPijkl EQij + EvdWij

EBij = Aij*Δrij

2 + Bij*Δrij

3 + Cij*Δrij

4

Δrij

EQij = Aqiqj/(Δrij+0.05)

Δrij

EAijk = Aijk*αijk

2 + Bijk*αijk

3

αijk

14

Ограничения SOL

1. расчет потенциальной энергии вместо свободной

2. использование сетки потенциалов

3. очень упрощенная модель растворителя

4. упрощенная MMFF-типизация

5. учет энтропии через число торсионов, что неправильно

[Chang, C.A.; Chen, W.; Gilson, M.K. Ligand configurational

entropy and protein binding. PNAS, 2007, 104, 1534-1539]

15

CSAR benchmark 201216

17

nn

kTWU

ndpdpdxdxZ e 3131

/)(

3......

)2(

1

𝐺=−𝑅𝑇 ∗𝐿𝑛(𝑍 )

Аппроксимация U(x) независимыми гармоническими ямами

Z = Z1 + Z2

G = -kT*ln(Z)

18

jkT

kT

kT

E

i

eee i

j

iji

Z/

2/

1*

0

22 комплекса для тестирования FLM1C5YQ=+1NA=20NT=2

1SQOQ=+1NA=34NT=4

1VJAQ=+1NA=61NT=17

- 4 complexes of CHK1 (4FT0, 4FT9, 4FSW, 4FTA);- 2 complexes of ERK2 (4FV5, 4FV6);- 3 complexes of PIN1 (3IKD, 3IKG, 3JYJ);- 3 complexes of RNase A (3D6O, 3D6P, 3D8Z);- 2 complexes of thrombin (1DWC, 1TOM);- 6 complexes of urokinase (1C5Y, 1F5L, 1O3P, 1SQO, 1VJ9, 1VJA);- 2 complexes of factor Xa (2P94, 3CEN).

19

22 комплекса для тестирования FLM20экспериментально известно

положение связывания лиганда (нативное положение лиганда)

константа ингибирования Ki

∆𝐺=𝑅𝑇 ∗𝐿𝑛 (𝐾 𝑖 )

Геометрическая близость (RMSD) к нативному положению

Корреляция теоретических энергий связывания с логарифмом констант ингибирования

Программа FLM [1]Выбор системы: комплекс, свободный белок или свободный лиганд

Анализ торсионных и декартовых степеней свободы

Задание случайных начальных конфигураций в торсионах (~108)

c1 c2 c3 c5

Локальная оптимизация LBFGS в декартовых (~106)

m1 m2 m3

Проверка на совпадение

m1 m2

Пересчет пот. энергии с растворителем, расчет частот, Gi, Hi, TSi

c4

m4

(всего ~103)

21

Программа FLM [2]22

Программа FLM [3]23

• силовое поле MMFF94

• отсутствует учет растворителя

• задание начального положения лиганда - в торсионных

координатах

• локальная оптимизация начального положения лиганда - в

декартовых координатах - методом L-BFGS: квазиньютоновский

градиентный метод, критерий остановки - неубывание энергии

вдоль градиента на шаге > 10-5 Å

Быстродействие FLM

Эффективность на 8192 ядрах ~90%

Докинг 1 комплекса 25 000 CPU*hours

3*105 пробных оптимизаций3*106 пробных оптимизаций

Докинг 1 свободного лиганда 100 CPU*hours

1C5Y (NA = 20, NT = 2) 1VJ9 (NA = 74, NT = 19)3*105 пробных оптимизаций9*105 пробных оптимизаций

Всего затрачено на 22 комплекса ~500 000 CPU*hours

24

Одна пробная оптимизация лиганда в комплексе: 1-10 минутСравнимо с single point MOPAC-расчетом или mcbhSOLV-расчетом

Быстродействие MOPAC25

Быстродействие MOPAC in vacuo [PM7 MOZYME]

комплекс оптимизация по лиганду

свободный лиганд оптимизация

свободный белок single point

1C5Y 1VJ94 sec 2 min

14 min 12 min

7 hours 8 hours

ω102 = 4.7*1012 Hz, ω102 = 3.3*1012 Hz

Пример нижних мод 1sqo в двух минимумах

26

Пример результатов FLM для урокиназы 1vja27

22 комплекса - "8" хороших и "14" плохих

Protein PDBID

Protein-ligand complex Free ligand

∆E, kcal/mol NN ENN-E1,

kcal/mol

Eopt.nat.-E1,

kcal/mol

∆E, kcal/mol Nminima

CHK1

4FT0 70.5 38 24.8 29.5 1.08 324FT9 44.7 30 15.1 18.3 28.2 254FSW 264 7 14.8 15.4 0.00 14FTA 69.7 Ø Ø 91.2 17.4 56

ERK24FV5 39.8 419 33.0 36.6 14.8 > 10244FV6 15.8 Ø Ø 19.3 5.07 > 1024

PIN13IKD 16.5 9 2.08 2.25 20.3 > 10243IKG 15.9 29 6.72 19.4 18.8 > 10243JYJ 15.1 Ø Ø 15.2 13.3 > 1024

RNase A3D6O 25.2 Ø Ø 49.2 33.7 1973D6P 25.9 Ø Ø 30.9 34.3 1213D8Z 44.8 Ø Ø 55.6 33.4 122

thrombin1DWC 27.0 958 26.4 41.5 12.8 > 10241TOM 15.3 Ø Ø 62.3 9.76 > 1024

urokinase

1C5Y 670 1 0.00 0.00 0.00 41F5L 76.3 1 0.00 0.00 20.4 101O3P 20.8 45 5.09 5.20 20.6 1041SQO 99.2 1 0.00 0.08 2.96 321VJ9 14.2 1 0.00 6.60 4.87 > 10241VJA 11.3 7 1.18 4.66 6.30 > 1024

factor Xa2P94 20.3 3 0.92 9.55 15.1 > 10243CEN 20.2 1 0.00 14.0 17.4 > 1024

28

Пример результатов FLM для урокиназы 1vja~4*105 пробных оптимизаций, ~3*104 CPU-часов

E G H TS-275.046 -19.4813 60.22173 79.70305-275.052 -19.444 60.21667 79.66067-272.593 -18.5788 62.55772 81.13655-272.597 -18.5334 62.5546 81.08802-274.507 -18.4823 60.87013 79.35244-273.159 -18.4117 62.10252 80.51422-273.164 -18.3745 62.09804 80.47256-272.248 -17.679 62.82974 80.50879-273.446 -17.6338 62.02548 79.6593-272.245 -17.6104 62.83353 80.44392

29

Результаты FLM для урокиназы и фактора Xa (6+2)(сравнение с экспериментом)

30ра

счет

эксперимент

MMFF94, PM7, PM7 COSMO сравнение с экспериментом

31

MMFF94, PM7, PM7 COSMO энергии минимумов 4FT032

MMFF94 PM7 PM7 COSMO

Выводы [1]

1. Получен валидационный набор минимумов

2. Нативное положение может быть далеко от

глобального минимума (как по RMSD, так и по энергии)

3. Парадигма докинга неточна: глобальный минимум

энергии может лежать далеко от нативного положения

4. Основную роль играет потенциальная энергия

глобального минимума

33

Выводы [2]

1. Теоретические энергии связывания на порядок

превосходят экспериментальные

2. Диапазон изменений PM7 COSMO энергий связывания

существенно меньше, чем у MMFF94 и PM7 энергий

3. PM7 COSMO чаще получает близкое к нативному

положению в глобальном минимуме

4. Изменение способа расчета энергии существенно

переупорядочивает минимумы

34

Перспективы развития

• Уточнение расчета потенциальной энергии• Учет растворителя (PCM)• Ускорение PCM-расчетов (MCBHSOLV)

• Более адекватное силовое поле• Квантово-химические расчеты межмолекулярного

взаимодействия• Учет подвижности белка• Учет ангармонизма колебаний?• Ускорение вычислений (требуется по крайней мере в

1000 раз):– Более направленный, чем Монте-Карло, алгоритм поиска

низкоэнергетичных минимумов (TTDOCK?)– Неполная оптимизация– Иерархический расчет энергий (MMFF94 -> PCM -> PM7)

35

Спасибо за внимание