• 

• 

• 

• • 

• • 

• 

• 

• 

*** * *

Time (h)0 48 96 144 192 240 288

VCD

(x10

6 ce

ll/m

L)

0

4

8

12

16

20

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

( )

• • • 

0

3

6

9

12

15

18

21

24

12

34

56

7

30323436

38404244

46

Yx/

s(pg

GFP

/cel

l)

MOI

TOH (hpi)

0

3

6

9

12

15

18

21

24

12

34

56

7

30323436

38404244

46

Yx/

s (pg

GFP

/cel

l)

MOI

TOH (hpi)

Glucose (mM)Lactate (mM)

Viable Cell density (VCD) (x106 cell/mL)1Viability (%)

Time (h)0 48 96 144 192 240 288

VC

D (x

106

cell/

mL)

0

4

8

12

16

20

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

[Glu

cose

]/[La

ctat

e] (m

M)

0

10

20

30

40

50

1.14·106

4.78·106

0

10

20

30

40

50

60

1

2

3

4

5

48495051

52535455

YA

dV/X

(IP

U/c

ell)

MOI

TOH (hpi)

0

100

200

300

400

500

600

12

34

56

7

48495051

52535455

YA

dV/X

(IP

U/c

ell)

MOI

TOH (hpi)

TOI 1

MOI

7,25 5 2,75 0,5

IPU

R

0

25

50

75

100

125

150 TOI 5

MOI

7,25 5 2,75 0,5

IPU

R

0

25

50

75

100

125

150

TOH=48hpi TOH=56hpi

TOI=1e6 cell/mL

MOI7.25 5 2.75 0.5

Vira

l Tite

r (IF

U/m

L)

1e+6

1e+7

1e+8

1e+9

1e+10

TOI=5e6 cell/mL

MOI5 2,75 0,5

Vira

l Tite

r (IF

U/m

L)

1e+6

1e+7

1e+8

1e+9

*

44.6±4.7% 54.0±4.4%

41.7±3.2% 57.3±3.4% 30.2±0.2% % 68.6±0.2%

32.7±4.9% 64.2±6.7%

3033 337075 3431 46453

3117 26641 3056 35224

C

Time (hpi)

0 12 24 36 48 60

Viab

le C

ell D

ensi

ty (1

06 c

ell/m

L)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Viab

ility

(%)

0

20

40

60

80

100D

Time (hpi)0 12 24 36 48 60

Tota

l flu

ores

cenc

e (u

.a.)

0

2000

4000

6000

8000

10000

Intracellular fluorescence

A

0 12 24 36 48 60

Viab

ility

(%)

0

20

40

60

80

100

Viab

le C

ell D

ensi

ty (1

06 c

ell/m

L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0B

0 12 24 36 48 60

Tota

l flu

ores

cenc

e (u

.a.)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 12 24 36 48 60 0 12 24 36 48 60

[IFU]f INTRACELL[IFU]f Extracellular[IFU]0

[IFU

] (ifu

/mL)

2e+6

5e+6

2e+7

5e+7

2e+8

5e+8

2e+9

5e+9

1e+6

1e+7

1e+8

1e+9

1e+10

[IFU

] (ifu

/mL)

2e+6

5e+6

2e+7

5e+7

2e+8

5e+8

2e+9

5e+9

1e+6

1e+7

1e+8

1e+9

1e+10

3.81e9 (78.0%)

1.07e9 (22.0%)

5.43e8 (24.2%)

1.7e9 (75.8%)2.18e9 (76.8%)

6.06e8 (23.2%)2.43e9 (60.7%)

1.56e9 (39.3%)

Time (h)

0 48 96 144 192 240

[Lac

tate

] (m

M)

0

4

8

12

16

Time (h)

48 96 144 192 240

Time (h)

48 96 144 192 240

Time (h)

48 96 144 192 240[L

acta

te] (

mM

)0

4

8

12

16

[Cap

PC

V2]

(pg/

mL)

0

100

200

300

400

500

[Cap

PC

V2]

(pg/

mL)

0

100

200

300

400

500

[IFU]f INTRACELL[IFU]f Extracellular

pOPIN

G-Ca

pPCV

2-HisT

ag

pIRES

puro3

-Cap

PCV2

pIRES

puro3

-SSIL

2-Cap

PCV2

op

pOPIN

G-Ca

pPCV

2

0.75ug/mL [puromycin]0.5ug/mL [puromycin]0.0ug/mL [puromycin]

1.5ug/mL [puromycin]1.25ug/mL [puromycin]1.0ug/mL [puromycin]

A

Xv

(106

cel

l/mL)

0

2

4

6

8

10

C

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144

Xv

(106

cel

l/mL)

0

4

8

12

16

20

B

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

D

[Puromycin] (ug/mL)

0 0,5 0,75 1 1,25 1,5

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Xv (106 cell/mL)Viability (%)

pTAR-SBC-SS(IL2)_opCapPCV

4267 bps

NheI

SV40for_3978

NheI

PolRev1_3976

FRTwtpSV40

'MCS''

NheI

SS(IL2)

KpnI (2)

CapPCV2OPT

PmeI'

polio\IRES

F5-RTAmp\pro

pUCori

pTAR-EF1alfa-SS(Il2)-opCapPCV25224 bps

HindIII

NheI

HindIII

FRTwt

EF1-alfa

'MCS''SS(IL2)

opCapPCV2

Polio\IRESF5-RT

amp\pro

pUCori

pLV sspwv9188 bp

FRT-wtCMV

GFPloxL3inv

FRT-F5Dneo

WPRE

3´LTRampR

RSV5´LTR

RREcPPt

Age I (805)

pTAR-CMV-SS(IL2)-opCapPCV2-PuroR

6462 bps

'MCS'''SSPIL-2_CapPCV2OPT'

'MCSIVS

IRES

Puro(R)

Polio\IRES

F5-FRTamp\pro

pUCori

FRTwt

pCMV

48h post add

[puromycin] (ug/mL)

0,00

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

2,00

3,00

Xv

(x10

6 ce

ll/m

L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Attached viable cellsDeattached viable cellsViability attached cells

96h post add

[puromycin] (ug/mL)

0,00

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

2,00

3,00

Via

bilit

y at

tach

ed c

ells

(%)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

[Glu

cose

]/[La

ctat

e] (m

M)

0

10

20

30

40

50

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

VCD

(x10

6 ce

ll/m

L)

0

5

10

15

20

25

Viab

ility

(%)

0

20

40

60

80

100

Glu

cose

/Lac

tate

(mM

)

0

10

20

30

40

50

60

VCDViability

GlucoseLactate

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

0

40

80

120

160

200

pH

6,6

6,7

6,8

6,9

7,0

7,1

7,2

7,3

7,4

≈

[Glu

cose

]/[La

ctat

e] (

mM

)

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

pH

6,6

6,7

6,8

6,9

7,0

7,1

7,2

7,3

7,4

Lact

ate

(mM

)

0

10

20

30

40

50

Viability Glucose Lactate

AV

CD

(x1

06 c

ell/m

L)

0

5

10

15

20

25

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100B

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

P2

C

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144 168

VC

D (

x106

cel

l/mL)

0

5

10

15

20

25

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

D

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144 168

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

P1 P2 P2

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144

pH

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

Time (h)

24 48 72 96 120 144

Time (h)

24 48 72 96 120 144

[glu

c]/[l

ac] (

mM

)

0

10

20

30

40

50

B

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

C

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

60

Flu

ores

cenc

e (u

.a.)

0

100

200

300

400

500

600

pH

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

A

Time (h)

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

VC

D (

x106

cel

l/mL)

0

5

10

15

20

25

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

.

A

Asp Thr

Leu

Lys

His Ile

Phe Val

Asn Tyr

Ser

Met

Arg

Pro

Cys Glu

GLU

TA

MA

XN

.a.N

.G

lnA

laG

ly

[aa]

(m

M)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

f

B

Asp Thr

Leu

Lys

His Ile

Phe Val

Asn Tyr

Ser

Met

Arg

Pro

Cys Glu

GLU

TA

MA

XN

.a.N

.G

lnA

laG

ly

[aa]

(m

M)0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH 7.28

Time(h)

24 48 72

pH 7.4

Time(h)

0 24 48 72

pH

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

pH 7

Time(h)

24 48 72

pH 6.72

Time(h)

24 48 72

pH 6.6

Time(h)

24 48 72

pH

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

Time(h)

[lactate]0=12mM

[lactate]0=12mM

[lactate]0=0mM

[lactate]0=24mM

[lactate]0=3.51mM

[lactate]0=20.48mM[lactate]0=12mM

[lactate]0=3.51mM

[lactate]0=20.48mM

0

4

8

12

16

20

24

0

4

8

12

1620

24

6,66,7

6,86,9

7,07,1

7,27,3

Δla

ctat

e

[lact

ate] 0

pH0

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0

4

812

1620

24

6,66,8

7,07,2

μm

ax (

h-1

)

[lact

ate] 0

(mM

)

pH0

0,01 0,02 0,03

0

25

50

75

100

125

150

175

200

0

5

10

15

2025

6,66,8

7,07,2

q G

luc

(mm

ol/(

106

cel

l · h

)

[lact

ate] 0

(mM

)

pH0

20 40 60 80 125 150

-100

-50

0

50

100

150

200

250

0

4

812

1620

24

6,66,8

7,07,2

q La

c (m

mol

/(10

6 c

ell ·

h)

[lact

ate] 0

(mM

)

pH0

-50 0 50 100 150 200

0 4 8 12 16 20 24

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

i

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

VC

D (

x106

cel

ls/m

L)

0

5

10

15

20

OU

R (

mol

/L·h

-1)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Glu

cose

/Lac

tate

(m

M)

0

10

20

30

40

50

Via

bilit

y (%

)

0

20

40

60

80

100

Time (h)

Time (minutes)

0 10 20 30 40 50

D.O

: (%

air

satu

ratio

n)

0

20

40

60

80

100

Negative control 10 mM pyruvate 10 mM lactate

10 mM lactate + 5 mM cynn10 mM lactate (YSI kinetics)

Negative control10 mM lactate (YSI measurement)

Time (minutes)

0 10 20 30 40 50

D.O

: (%

air

satu

ratio

n)

0

20

40

60

80

100

Lact

ate

conc

entr

atio

n (m

M)

7,8

8,0

8,2

8,4

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