dna revolution dna revolution i marcatori molecolari e il

26/03/2019

1

DNA Profiling e Genetica Forense

DNA revolutionI marcatori molecolari e il

loro contributo alle scienze forensi (II parte)

DNA

revolution

Sequenziamento massivo

(Next Generation

Sequencing – NGS)

Microsatellites

SNPs

DNA Barcoding

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Il passato, il presente e il futuro

del sequenziamento∗ del DNA

∗ Sequenziamento del DNA:

Determinare il N° e l’ordine dei nucleotidi che

costituiscono una molecola di DNA.

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SEQUENZIAMENTO DEL DNA

1977 – Il DNA è sequenziato per la prima volta da Fred Sanger, Walter Gilbert e Allan

Maxam in maniera indipendente.

1977 1982: lambda virus

DNA stretches up to 30-40Kbp

(Sanger et al.)

1994: H. Influenzae

1.8 Mbp (Fleischmann et al.)

2001: Homo Sapiens

Metodi di sequenziamento

• Maxam e Gilbert (chimico)

• Sanger (enzimatico)

• Sequenziamento automatico del DNA in

fluorescenza

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Questo metodo prevede la marcatura del ssDNA alle estremità 3’

con 32P, il taglio del DNA e la separazione dei due filamenti identici

marcati ad un’estremità.

Si suddivide la miscela in 4 parti, ciascuna delle quali viene

sottoposta ad un diverso trattamento chimico per metilare o

rimuovere specificamente 1 o 2 basi.

Si producono in questo modo frammenti marcati di dimensione

specifica e tramite una elettroforesi è possibile determinare

l’ordine dei nucleotidi �la sequenza.

Utilizzato in passato:

1) non adatto al sequenziamento automatico;

2) composti chimici dannosi alla salute

Maxam-Gilbert Sequencing (CHIMICO)

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DMS

G

GG

G

FA

GA

GG

AG

AA

H

CTT

C

TC

CT

H+S

CC

CC

Maxam-Gilbert Sequencing(metodo chimico)

Es. metilazione delle Gcon dimetilsolfato (DMS)

ssDNA marcato ad una estremità: poi 4 reazioni di modificazi one base-specifiche come segue….

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Sequencing gels are read from bottom to top (5′ to 3′).

G G+A T+C C

3′AAGCAACGTGCAG5′

Longer fragments

Shortest fragmentsG

A

Maxam-Gilbert Sequencing

Gel di poliacrilammide

Metodi di sequenziamento

•Sanger (enzimatico)

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Nobel Prize Chemistry (1958) amino acid sequence (insulin)

Nobel Prize Chemistry (1980) dideoxy method of DNA

sequencing

Frederick Sanger (13. 8. 1918 – 19. 11. 2013)

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (December 1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463–7.

DEOSSI-NUCLEOTIDE e DIDESOSSI-NUCLEOTIDE

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The Chain Terminator

Adapted From Berg et al: Biochemistry 5th ed. Freeman+Co, 2002

dideoxyH3’

5’

base base base

PO3

5’3’

base base base base

• Dideoxy nucleotides cannot be further extended, and so terminate the sequence chain

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Analisi di sequenza e PCR

1) DNA polimerasi;

2) Miscela di deossi-nucleotidi (dNTPs marcati con 32P o 35S = dATP, dCTP, dGTP,

dTTP); ddNTP a concentarzione più bassa

3) filamento DNA a singolo filamento (stDNA)

DNA stampo a singolo filamento (stDNA)

Filamento copiaPrimer marcato

Sequenziamento: metodo Sanger

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Expose gel to x-ray film (to make an “auto-radiogram”)

Original Sanger Sequencing with Radioactive Signal

Template (stDNA)

A nested series of DNA fragments ending in the base specified by the terminator-ddNTP

very lowconcentration ofddNTPs vs dNTPs

Cycle sequencing (PCR)

94°C: DNA denatures�ssDNA(stDNA )

45°C: 1 primer (marcatocon 32P o 35S) anneals +dNTPs + ddNTP)

60-72°C: Taq DNA pol extendsprimer

Repeat: 25-35 times

Advantages: don’t need a lotof template DNA

Disadvantages: DNA pol mayincorporate ddNTPs poorly

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https://www.youtube.com/watch?v=qr6A4eXZOWs

Run each reaction mixture on electrophoresis gel

Short fragments go to bottom, long fragments on

top

Read the "sequence" from bottom of gel to top

Convert this "sequence" to the complementary

sequence

Now read from the other end and you have the

sequence you wanted - read 5' to 3'

Sequenziamento: metodo Sanger

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SEQUENZIAMENTO DEL DNA – Sanger sequencing (MANUALE-

autoradiografia)SEQUENZIAMENTO DEL DNA – Sanger sequencing

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Analisi di sequenza e PCR

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Each of the 4 ddNTPs is labeled with a different fluorescent dye (instead of

radioactivity)

Fluorescent Sanger Sequencing: “Dye-terminators” Fluorescent Sanger Sequencing: “Dye-terminators”

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Le molecole ottenute da ogni reazione vengono caricate su gel in 4

corsie parallele; la corsa viene letta per autoradiografia grazie alla

presenza del primer marcato in ogni frammento

SEQUENZIAMENTO DEL DNA (Sanger) (SEMI-AUTOMATIZZATO) SEQUENZIAMENTO DEL DNA (Sanger) (SEMI-AUTOMATIZZATO)

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Sequenziamento automatico del DNA in

fluorescenza

Fluorescent Sanger Sequencing: “Dye-terminators”

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Fluorescent Sanger Sequencing (automatizzato)

1-tube sequencing reaction(cycle sequencing with modified Taq Polymerase)

dGTP

dATP

dTTP

dCTP

+

Direction of electro-phoresis

Load on gel(modern machines use

capillaries, not slab gels)

�Il fluorocromo viene

eccitato dal laser

emette luce nel visibile,

in un determinato

intervallo di λ

�La luce emessa viene

filtrata per determinati

range di λ e convertita

in un segnale elettrico

che viene misurato in

RFUs

(RelativeFluorescence

Units).

Argon ion LASER (488

nm)

Color SeparationFluorescence

ABI Prism spectrograph

Processing with GeneScan/Genotyper software

Sample Interpretation

CCD Panel (with virtual filters)

Sample Detection

Capillary (filled with

polymer solution)

tradotto nei

tipici picchi

colorati

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Recombinant DNA: Genes and Genomes. 3rd Edition (Dec06). WH Freeman Press.

Fluorescent Sanger Sequencing Trace

Lane signal

Trace

(Real fluorescent signals from a lane/capillary are much uglier than this).

A bunch of magic to boost signal/noise, correct for dye-effects, mobility differences, etc, generates the ‘final’ trace (for each capillary of the run)

�Minor quantità di DNA stampo

� Ridotta introduzione di impurità nella miscela di reazione

Fluorescent sequencing

288,000 bp/day

Progress of Sanger Sequencing Technology

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AB capillary sequencers

1-2 million bp/day

Progress of Sanger Sequencing TechnologyConfronto metodi di sequenziamento

� Sanger

� rapida e semplice

attuazione

� disponibilità di kit

� necessità di primer

� sensibile a strutture

secondarie

� Maxam e Gilbert

� lunga preparazione del DNA

� reazioni da mettere a punto

� relativamente economico

� strutture non influenti

� utilizzabile per oligonucleotidi

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Sequenziamento

Vantaggi:

Svantaggi:

Sequenziamento

Vantaggi:

• Alta riproducibilità e affidabilità

• Utile negli screening genomici e per isolamento e

caratterizzazione di microsatelliti e SNPs

• Strumento base per il DNA barcoding

Svantaggi:

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Sequenziamento

Vantaggi:

• Alta riproducibilità e affidabilità

• Utile negli screening genomici e per isolamento e

caratterizzazione di microsatelliti e SNPs

• Strumento base per il DNA barcoding

Svantaggi:

• Time-consuming and expensive

• Richiede informazioni a priori (primer)

• possibilità di sequenziare 1 sequenza per volta

• Difficoltà nell’interpretazione di alcuni risultati ambigui

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Probe 1

D1S7

Probe 2

D2S44

Probe 3

D4S139

Single-Locus

ProbeMulti-Locus

Probe

Joh

n M

. B

utl

er

(20

09

) Fu

nd

am

en

tals

of

Fore

nsi

c D

NA

Ty

pin

g, F

igu

re 3

.3

(Originally developed

by Alec Jeffreys)

Better for forensic samples containing mixturesComplex patterns

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Microsatelliti (STR)

• Durante gli anni il numero di loci STR selezionati è >>>

• Attualmente il CODIS USA: 13 microsatelliti selezionati a

partire da 17 loci candidati sulla base della loro

variabilità e facilità di interpretazione.

• UK e alcuni altri stati Europei: 10 STR, 8 dei quali in

comune con il CODIS

Microsatelliti (STRs–Short tandem repeat o SSR

Simple sequence repeat)

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Il microsatellite 'ideale' (scienze forensi)

1) Con elevata eterozigosità (>> discriminazione)

2) Amplificabile in corti prodotti PCR (x DNA degradato)

3) I cui alleli siano ben separabili

4) Che presenti un ridotto fenomeno di stuttering

5) Con tasso di mutazione contenuto (x paternità)

6) Situato su autosomi (�indipendenza statistica dei loci)

La comunità forense si è orientata principalmente su

microsatelliti del tipo tetranucleotide repeats autosomici

Microsatelliti (STRs o SSR –Short tandem repeat o

Simple sequence repeat)

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7 repeats

8 repeats

AATG

AATG= (tetranucleotide) core/repeats;

7 repeats= allele 7

8 repeats= allele 8

Eterozigote (7-8)= gli alleli aquel locusSTRsonodiversi


15 repeats

19 repeats

CA


CA= (dinucleotide) core/repeats;

15 repeats= allele 15

19 repeats= allele 19

Eterozigote (15-19)= gli alleli aquel locusSTRsonodiversi

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15 repeats

19 repeats

CA

Microsatelliti (STR) e PCR

Si determinano le sequenze UNICHE che fiancheggiano il microsatellite per

disegnare i PRIMERS per la PCR

Si amplifica il gDNA da saggiare con i primers selezionati e si analizza su gel di

agarosio

1 2Genotipizzazione: l’allele

15 è distinguibile

dall’allele 19

CODOMINANTI!

Distribuzione dei

microsatelliti nei

cromosomi umani

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Distribuzione dei microsatelliti nel genoma umano

STR: LENGTH OF REPEAT UNIT

Dinucleotides:

Trinucleotides:

Tetranucleotides:

Pentanucleotides:

Exanucleotide:

CACA

AATAAT

AGATAGAT

2

3

4

5

6

AATGTAATGT

AATGTT

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Distribuzione dei microsatelliti nel genoma umano

• Dinucleotide

• Trinucleotide

• Tetranucleotide

• Pentanucleotide

• Hexanucleotide

(CA)(CA)(CA)(CA)

(GCC)(GCC)(GCC)

(AATG)(AATG)(AATG)

(AGAAA)(AGAAA)

(AGTACA)(AGTACA)

Requires size based DNA separation to

resolve different alleles from one another

High stutter

Low stutter

YCAII

DYS448

~45%

<2%

Categories for STR Markers

Category Example Repeat Structure

13 CODIS Loci

Simple repeats – contain units of identical length and sequence

(GATA)(GATA)(GATA) TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539

Simple repeats with non-consensus alleles(e.g., TH01 9.3)

(GATA)(GAT-)(GATA) TH01, D18S51, D7S820

Compound repeats –comprise two or more adjacent simple repeats

(GATA)(GATA)( GACA) VWA, FGA, D3S1358, D8S1179

Complex repeats –contain several repeat blocks of variable unit length

(GATA)(GACA)(CA)(CATA) D21S11

These categories were first described by Urquhart et al. (1994) Int. J. Legal Med. 107:13-20

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GENERAL CRITERIA FOR SELECTING STR LOCI

4 Tetranucleotide repeats:

PD > 0.85

Allele range < 60 bps

Low stutter

Microsatelliti

Ancor oggi i marcatori molecolari più

utilizzati nelle scienze forensi!

Vantaggi:

• Elevata riproducibilità

• Marcatori frequenti nel genoma

• Loci molto polimorfici (elevato numero di alleli)

• CO-DOMINANTI

• EREDITA’ MENDELIANA

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1. Estrazione e quantificazione del DNA

2.Amplifcazione PCR multiplex

3. Separazione dei prodotti di PCR mediante elettroforesi capillare

4. Interpretazione del dato grezzo

Come si genera un profilo STR???

Piccola parentesi (PCR e MULTIPLEX PCR)

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Make copies (extend primers )

Starting DNA Template

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Add primers (anneal ) 5’3’

3’5’

Forward primer

Reverse primer

Separate strands (denature )

5’

5’3’

3’

DNA Amplification with PCR (1 Locus)

Original DNA target region

Thermal cycleThermal cycleThermal cycle

http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/


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• Primer with fluorescent tagattaches to DNA and targetsregion of interest

• Individual is assigned adesignation for each of CODIS13 loci tested

• SAMPLE 1 (7,8)

• SAMPLE 2 (8,10)

MATERNAL

PATERNAL

LOCUS 1

Jelena A. Myers

MATERNAL

PATERNAL

LOCUS 1

8 repeats

10 repeats

SAMPLE 1

SAMPLE 2


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• Possono essere amplificati nellastessa reazione fino a 24 marcatorigenetici (24 Loci)

• A partire da 1 ng di DNA.

• Si usano fluorocromi diversiper distinguere gli alleli degli STR icui range di peso molecolare sisovrappongono

Multiplex PCR (+ Loci contemporaneamente)

Detection Methods

Fluorescence

Label one of the primers for each locus

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Fluorescence results when a fluorophore or

fluorescent dye absorbs incident light and in

response emits light at a different wavelength

excitation emission

excitation emission

excitation emission

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Le temperature di Tm dei vari primers devono essere simili

1. Software online per primer selection: “Primer3Plus” http://primer3plus.com/

2. Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli

primers è sempre necessaria


� PRESENZA DI INIBITORI:

I reperti biologici possono essere

mescolati con inibitori della PCR di

che non sempre vengono eliminati

efficacemente negli step di

purificazione del DNA.

• CONTAMINAZIONE IN LABORATORIO O

IN FASE DI REPERTAZIONE:

a causa della sua elevata sensibilità, la

PCR presenta un forte problema

legato contaminazione


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Multiplexing PCR con più coppie di primer con fluorofori differenti

Gel con un pattern di

bande non più

riconducibili al singolo

locus

Elettroferogramma

I kit commerciali (Applied Biosystems e Promega) permettono di coamplificare

(PCR multiplex) i 13 marcatori molecolari (STR) del CODIS

I kit commerciali sono in continua «evoluzione»: >> numero di loci (multiplex PCR):

STR, mini STR, Y-STR ecc.

Kit commerciali

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Fluorescent

dye-labeled

primer

GATA

3′5′

3′5′

(Maternal)

(Paternal)

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8

STR Repeat Region

forward primer

hybridization regionreverse primer

hybridization region

75….80….100….120….140….160….180….200….220….240.…260…..

(size in bp)

RFUs

1000

500

6

139bp

8

147bp

DNA Separation and Detection

Short Tandem Repeat (STR) Typing

Locus Dye Promega PP16 Primer SequencesD3S1358-F ACTGCAGTCCAATCTGGGTD3S1358-R FL ATGAAATCAACAGAGGCTTGCTH01-F FL GTGATTCCCATTGGCCTGTTCTH01-R ATTCCTGTGGGCTGAAAAGCTCD21S11-F ATATGTGAGTCAATTCCCCAAGD21S11-R FL TGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAGACD18S51-F FL TTCTTGAGCCCAGAAGGTTAD18S51-R ATTCTACCAGCAACAACACAAATAAACPentaE-F ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATAPentaE-R FL TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTTD5S818-F GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCCD5S818-R JOE AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCTD13S317-F ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGAD13S317-R JOE GGCAGCCCAAAAAGACAGAD7S820-F JOE ATGTTGGTCAGGCTGACTATGD7S820-R GATTCCACATTTATCCTCATTGACD16S539-F GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAGD16S539-R JOE GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATCCSF1PO-F JOE CCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGTCSF1PO-R ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTTPentaD-F JOE GAAGGTCGAAGCTGAAGTGPentaD-R ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAGAMEL-F TMR CCCTGGGCTCTGTAAAGAAAMEL-R ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTGvWA-F GCCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATGTGvWA-R TMR GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGGD8S1179-F TMR ATTGCAACTTATATGTATTTTTGTATTTCATGD8S1179-R ACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGTTTCTPOX-F GCACAGAACAGGCACTTAGGTPOX-R TMR CGCTCAAACGTGAGGTTGFGA-F TMR GGCTGCAGGGCATAACATTAFGA-R ATTCTATGACTTTGCGCTTCAGGA

DNA Profile

Multiplex PCR (+ Loci contemporaneamente) primer set

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ABI Prism 310 Genetic Analyzer

capillare

Siringa contenente il polimero

Tray di caricamento dei

campioni

Tampone di uscita

Elettrodo di iniezione

Tampone di

iniezione

3. Separazione dei prodotti di PCR mediante elettroforesi capillare

520 540 560 580 600 620 640

WAVELENGTH (nm)

100

80

60

40

20

0

310 Filter Set F with color contributions

5-FAM JOE NED ROX

Laser excitation(488 nm, 514.5 nm)

Norm

aliz

ed F

luore

scent In

tensi

ty

Spettri di emissione dei fluorocromi Applied B. in uso nel kit AmpFlSTR.

I filtri virtuali sono rappresentati dalle quattro colonne nere centrate sul picco dello spettro di ciascuno dei 4 fluorocromi.

A causa della sovrapposizione degli spettri, una matrice di deconvoluzione (4 x 4) deve essere utilizzata per una corretta interpretazione dei dati.


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Raw data

•Il software GENESCAN divide I

dati grezzi in un

elettroferogramma separato per

ciascun colore

•Blue

•Green

•Yellow

•Red

•Il software GENOTYPER

identifica i differenti loci e per

ciascuno di essi riconosce gli alleli

facendo riferimento ad uno

standard di peso molecolare e ad

un ladder allelico


D3S13

58VWA FGA

8S1179D

21S11DD18S51

D5S818D13S317

D7S820

Ameloge nin

RAW DATA

PROCESSED DATA

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Microsatelliti

Dimensioni dei frammenti in paia di basi

• Grazie all’utilizzo di primers marcati con fluorofori la tecnica

del GENOTYPING (elettroforesi capillare e lettura della

fluorescenza) permette la genotipizzazione e l’analisi di loci

microsatellite

Conversione dei picchi in GENOTIPI

(utilizzo di SOFTWARE specifici)

Heterozygote Homozygote

GENOTYPING

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La tipizzazione degli alleli degli STR viene effettuata comparando il campione ad un ladder allelico ALLELIC LADDER

Il Ladder è l’insieme degli

alleli di un locus rilevati

nella popolazione

generale. Assegna ad un

determinato allele un

nome univoco.

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STR Analysis

13 loci STRs comunemente indagati

(PROFILO COMPLETO DI UN SOGGETTO) STR Profilo

D8S1179 9-14

D21S11 28-30

D7S820 12-12

CSF1PO 12-12

D3S1358 15-17

TH01 6-7

D13S317 9-12

D16S539 12-12

D2S1338 23-24

D19S433 14-14

VWA 17-19

TPOX 8-8

D18S51 16-16

ame XY

D5S818 11-12

FGA 20-22

PROFILO STR COMPLETO DI UN SOGGETTO

che si traduce in una coppia di numeri per ciascun m arcatore

rappresentativi del numero delle ripetizioni per ogn i allele

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Problemi interpretativi del

sequenziamento

No rumore di fondo

Tutti i picchi sono stati correttamente letti dal software

NORMAL STUTTER BANDS

LOW HETEROZYGOTE

PEAK HEIGHT RATIO

Come leggere l’elettroferogramma??

SPLIT PEAKS

Parziale adenilazione

dell’amplicone

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1. “pull up”:

2. “Dye blobs”:

3. Cristalli di urea e bolle d’aria:

4. Spikes:

5. Contaminanti

Problemi «tecnici»

Problemi nell’interpretazione di profili microsatellite Problemi interpretativi del sequenziamento

Pill-up peaksPresenza di picchi di altri colori sotto il

picco principale dovuti al

sequenziamento di un quantitativo

eccessivo di DNA

Dye blobsArtefatto dato da picchi ampi di

un colore sovrastanti il picco

corretto.

Dovuti a una non corretta

purificazione (residui di dNTPs)

SpikesArtefatti dati da picchi

multicolore alti e stretti che

mascherano il nucleotide

sottostante.

Dovuti a presenza di bolle d’aria nel

capillare di sequenziamento.

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Problemi nell’interpretazione di profili microsatellite

Problemi «biologici»

�Prodotti stutterScivolamento della polimerasi durante l’amplificazione di ripetizioni in tandem

(VNTR, STR)

In genere, il prodotto dello stuttering ha un’altezza < 15% del picco «reale»

-Differenze tra loci e tra alleli dellostesso locus-Differenze per lo stesso locus in esperimenti diversi e kit diversi-Negative and positive stutter-Possibili probleminell’interpretazione di traccemiste.

Alcuni prodotti di PCR più corti di un’unità

rispetto al numero di ripetizioni dell’allele

amplificato.

HOW STUTTER OCCURS

1 2 3 4 5 6

1 2

Template

Amplicon

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46

4

1 2 3 5 6Template

Amplicon

1 2 3 4 5

HOW STUTTER OCCURS

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5

HOW STUTTER OCCURS

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Problemi «biologici»

�Alleli nulli (Allele drop-out)

Mutazione nel sito di annealing di un primer (3’) che determina il suo mancato

attacco e la non amplificazione di uno dei due alleli in un eterozigote

*

*

8

Allele 6 amplicon has ‘dropped out’

Imbalance in allele peak heights

68

Mutation at 3’-end of primer binding site (allele dropout )

Mutation in middle of primer

binding site

(a)

(b)


Problemi dovuti a “campioni difficili”

A) DNA degradato

C) Campioni misti

Possibilità di n. di alleli per individuo > 2

Progressiva diminuzione dell’amplificato

B) DNA scarso (low concentration DNA)

Alternativa basarsi anche su mtDNACampioni di riferimentoReplicati

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0.5 ng

-A

+A

Troppo DNA• Picchi fuori scala• Picchi divisi• Difficile interpretazione

quantità di DNA

(log scale)

100 ng

10 ng

1 ng

0.1 ng

0.01 ng

2.0 ng

Troppo poco DNA• Sbilanciamento tra alleli

eterozigoti• Allele drop-out• Aumenta la possibilità di

errori di interpretazione

STR lavorano bene in questo Range

STR ben bilanciate

Quanto è importante la quantità di DNA che si può ricavare da u nreperto? MOLTO

Esempio di analisi di replicati

Replicate

#1

High stutter

14,19 7,9.3 12,13 11,13 24

14,19 7,9.3 12,13 11,13 18,24

Replicate

#2

Replicate

#3

Consensus Profile:

Correct Profile:

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Stretch omopolimerico e presenza di regioni ripetute

Caduta del segnale dopo lo stretch

Sequenze confuse dopo lo stretch

Slittamento della polimerasi (presenza di prodotti diversi di sequenziamento)

Sequenza microsatellite

Problemi interpretativi del sequenziamento

Contaminazione da DNA esogeno

Presenza di picchi sovrapposti e disordinati

Sequenza non interpretabile

Oppure…?


sequenziamento

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50


sequenziamentoPresenza di varianti alleliche

CLONAGGIO dei prodotti di PCR

SUMMARY

• STRs used today in forensics generally are characterized by tandem repeats of 4(or 5)bp units

• STR polymorphism is due to variation in the number of repeated units

• There are different repeat unit sequences (AATG, TCTA, CTTT, etc.)

• STR loci are either simple, compound or complex

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51

• Alleles are designated by comparison with an allelic ladder

• Offladder variants of tetramers usually have 1, 2, or 3 extra bases within the repeat array

• Offladder variants also can occur above and below the extremities of the ladder

SUMMARY

• STR loci “associated with” genes are typically in noncoding regions (i.e., introns or flanking regions)

• Many STR loci are “anonymous,” or not currently known to reside within a known gene

SUMMARY

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• STRs are amplified by the PCR. PCR primers bind to unique sequences that flank the repeat region

• Alleles that align with the allelic ladder have “plus A”

• “Minus A” may occur at some loci but is easily addressed

SUMMARY

• Stutter is inherent to STR (tetramers) amplification of some loci

• Loci with a simple repeat structure tend to stutter more

• Loci vary in the extent to which they exhibit stutter

• Small alleles show less stutter than larger alleles

• Stutter is generally predictable and general guidelines can be used for profile interpretation

SUMMARY

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• Interpreting electropherograms is faciltated, especially with software

SUMMARY

DNA revolution

Sequenziamento massivo

(Next Generation

Sequencing – NGS)

Microsatellites

SNPs

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2007 Scietific Brea�thr�ugh �f the YearS�Ps & IDe�s i HuRef Aut�s��es

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dbS�P at �CBIhttp$%%www'cbi'��'ih'g�v%S�P%

Single (Simple) Nucleotide Polymorphisms (SNPs)

• S�Ps are used f�r idetificati� ad f�resics

• S�Ps are used f�r �appig ad ge��e)wide ass�ciati� studies �f c��p�ex diseases

• S�Ps are used f�r esti�atig predisp�siti� t� disease

• S�Ps are used f�r i��igrati� & citi+eship i the U-

• S�Ps are used t� predict specific geetic traits

• S�Ps are used f�r c�assifyig patiets i c�iica� tria�s

GCTGTATGACTAGAAGATCGATGCTGTATGACGAGAAGATCGAT

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Types �f S�Pshttp$%%www'cbi'��'ih'g�v%sites%etre+0db1sp

• ��c�dig S�Ps• 5’ UTR

• 3’ UTR

• Itr�s

• Itergeic Regi�s

• Regu�at�ry• Sp�icig

• Trascripti�a� regu�ati� (pr��ter & TF bidig sites)

• Tras�ati�a� regu�ati� (iitiati� �r ter�iati�)

• C�dig S�Ps• Sy�y��us S�Ps (third p�siti� variati�)

• Rep�ace�et S�Ps (chage A�i� acid)

SNPs

Ciclo vitale di uno SNP:

• Comparsa

• Sopravvivenza

• Aumento di frequenza

• FISSAZIONE

284 mila anni

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SNPs = Single Nucleotide Polymorphisms

• Silenti o Sinonime =

•

•

Sostituzione che NON altera la codifica di un aa

Non-sinonime o missenso = Sostituzione che altera la codifica di un aa

• Non-senso = Sostituzione che trasforma un codone per un aa in uno diSTOP

Frameshift = Indel nella regione codificante che causa lo slittamento della

lettura del codice genetico (le più dannose)

� GCTGTATGACTAGAAGATCGAT� GCTGTATGACGAGAAGATCGAT


• Polimorfismo più abbondante

Basso tasso di mutazione: prevalentemente loci biallelici

• Sono meno variabili se comparati ai microsatelliti ma questo

limite è compensato dalla loro frequenza e dalla

facilità di isolamento.

� GCTGTATGACTAGAAGATCGAT� GCTGTATGACGAGAAGATCGAT

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Genotyping Technologies

1. RFLP

2. PCR (allele specific primers)

3. Oligonucleotide ligation

4. Primer extension (incorporate labeled nucleotides)

5. Hybridization (microarray)

6. Taqman (RT-PCR)

7. Sequencing (whole genome or targeted)

8. Genotyping by sequencing

……and many other ones !!!

SNPs SNP: PCR e Restriction Fragment Length Polymorphisms

The presence of RFLP is inferred from changes in fragment sizes.

1 2

A B C

+ -AGATCT A TATCTTCTAGA TATAGA

1 2 Size Number+ + A,B,C 3+ - A, (B+C) 2- + (A+B), C 2- - (A+B+C) 1

+/+ +/- -/+ -/-

Polymorphism

Restriction site

Gel band

pattern

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SNP: PCR and

sequencing

N

Sito di

eterozigosi

C/G

individuo

omozigote CC

individuo

eterozigote

SNP: PCR and sequencing

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5′ AGTCTG 5′ AG(T/A)CTG 5′ AGACTG

T/T T/A A/A

SNP Detection by Sequencing1. Elevata riproducibilità

2. CO-DOMINANTI

3. EREDITA’ MENDELIANA

4. Molto frequente nel genoma e presenti in tutte le

regioni

5. Elevate potenzialità con NGS

1. Svantaggi: problemi si sequenziamento

1. Richiede informazioni a priori (seq.fiancheggianti)

2. Poco variabili

Vantaggi:SNPs

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Types of Polymorphic DNA Sequences

•RFLP: restriction fragment length polymorphisms

•VNTR: variable number tandem repeats (8 to >50 base pairs)

•STR: short tandem repeats (1–8 base pairs)

•SNP: single-nucleotide polymorphisms

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Identificazione delle persone disperse nel World trade

center (NYC) in seguito all’attacco terroristico del 11/9

• Sono stati generati

– 52,000 profili STR

– 44,000 profili mtDNA

– 17,000 profili SNPs

• 850/1594

• vittime identificate

grazie all’analisi del

DNA

Test di parentelaMini STR: MiniFiler PCR

AmpFℓSTR® MiniFiler ™ PCR Amplification

The primers amplify the STR

loci:

1. D13S317,

2. D7S820,

3. D2S1338,

4. D21S11,

5. D16S539,

6. D18S51,

7. CSF1PO,

8. FGA,

9. Amelogenin

Convalidato secondo le norme FBI

dna revolution dna revolution i marcatori molecolari e il

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