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7/27/2019 2011_2 Cultivo de Tejidos I
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Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
AgrobiotecnologaCurso 2011
Cultivo de tejidos vegetales IMara Mercedes Rivero
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7/27/2019 2011_2 Cultivo de Tejidos I
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Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales
Micropropagacin vegetal
Consideraciones tcnicas de la propagacinclonal masiva de plantas
Etapas del cultivo in vitrode plantas superiores
Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis
Sistemas de micropropagacin vegetal.Proliferacin de yemas axilares o apicales
Sistemas de micropropagacin vegetal.Proliferacin de yemas axilares o apicales
Sistemas de micropropagacin vegetalCultivo de meristemas
Sistemas de micropropagacin vegetalLiberacin de patgenos
Sumario
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Referencias
Conservacin de germoplasma
Sumario
Semillas sintticas
Cultivo in vitrode clulas haploides y de embriones
-Cultivo de anteras-Cultivo de polen-Cultivo de vulos-Cultivo de embriones
Cultivo de protoplastos
Variacin somaclonal
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Tcnicas del cultivo de clulas
y tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Existen tres conceptos bsicos quefundamentan el cultivo in vitrode clulasy tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciacin / Rediferenciacin
- Balance de reguladores del crecimientovegetal
Principales
conceptosfisiolgicosaplicablesa los cultivos
in vitro
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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La teora de la totipotencialidad celular, enunciadapor Haberlandt a principios del siglo XX, postula que todaclula vegetal individual es capaz de regenerar una plantaentera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado dediferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones
especficas referidas al medio del cultivo, relacioneshormonales, temperatura, fotoperodo, etc.
La desdiferenciacin consiste en la transformacin yprdida de las caractersticas de especializacin de un tipocelular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico.El siguiente paso involucrado en la regeneracin de unaplanta es la redifereciacin de las clulas previamentedesdiferenciadas.
Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balanceentre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Fundamentos
tericos yprcticosdel cultivode tejidos
vegetales
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Cultivo de tejidosvegetales
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Micropropagacin vegetal
Regeneracin de plantas(embriognesis y organognesis)
Cultivo de meristemas
Cultivo de suspensiones de clulas vegetales
Cultivo de protoplastos
Cultivo de anteras
Cultivo de vulos y embriones
Tcnicas
del cultivode clulasy tejidosvegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Micropropagacin vegetal
Agrobiotecnologa
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Propagacin vegetativa rpida y a gran escala
Uniformidad seleccionada del material clonado
Multiplicacin de plantas recalcitrantes
a las tcnicas convencionales
Reduccin en el tiempo de multiplicaciny en el espacio requerido para tal fin
Mayor control sobre la sanidad del materialpropagado
Introduccin rpida de nuevos cultivares
Conservacin de germoplasma
Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal
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Alcances
de la micro-propagacinvegetal
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Consideraciones tcnicas de la propagacin
clonal masiva de plantas
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Laboratorio
- Area de preparacin de medios- Area de lavado y esterilizacin- Cuarto estril- Cmara de cultivo
- Area de rusticacin
Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas
(preacondicionamiento)- Explantos (eleccin, diseccin,esterilizacin, etc.)
Condiciones de cultivo
- Asepsia- Recipientes- Temperatura- Luz y fotoperodo
La micro-
propagacinrequiere unainfraestructuramnima
especializaday condicionescontroladas
de cultivo
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Compuestos inorgnicosMacronutrientes: NO4
- , PO43- , K+, Ca2+,
Mg2+, SO4
2-
Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+,Mo2+, Co2+, I-
CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol
VitaminasTiamina (B1)
PiridoxinaAcido nicotnico (C)
Biotina
AminocidosGlicina
Reguladores del crecimientoAuxinas
CitocininasGiberelinas
Soporte inerte (medios semislidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite
pH5,6 5,8
Esterilizacin1 atmsfera, 15 a 20 min en autoclave
Medios de cultivo: composicin general
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Soluciones concentradas de macroelementos (100x)
Soluciones concentradas de microelementos (100x)
Vitaminas grupo B (500 1000x)
Mio-inositol (100 mg/L)
Azcares: sacarosa o glucosa en concentracionesde aproximadamente 30 g/L
Agar-agar: hidrato de carbono de alto pesomolecular extrado a partir de algas. Se usa entre
5 y 10 g/L
Formulacin
bsica deun mediode cultivopara tejidos
vegetales
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El metabolismo de los tejidos puede modificarsedependiendo de las caractersticas del medio decultivo (lquido o semi-slido).
En el caso de un medio slido, la concentracin
y calidad del gar pueden tener importantes efectosen el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad,crecimiento lento, etc.)
El cultivo en medio lquido resulta imprescindible
cuando la propagacin in vitroes desarrolladaa travs de las siguientes vas:
- Induccin de embriognesis- Cultivo de protoplastos- Cultivo de suspensiones celulares
Consistenciadel medio
Semislido
Lquido
Propiedades
fsicas delos mediosde cultivo
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Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo se tapan con un film depolietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambiode gases. La organognesis puede verse modificadasi el intercambio de gases se ve dificultado.
- La induccin de yemas a partir de callos
de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno
- La acumulacin de etileno puede inhibir
la regeneracin de brotes
pH:
- Constituye un factor crtico- Se ajusta en el rango 5,5-5,8
- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos
Propiedades
fsicas delos mediosde cultivo
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Composicin de medios de cultivo comnmente usados
8,6121-ZnSO4.7H20
--0,0250,2-CuSO4
6,2135-H3BO3
--1010-MnSO4.H2O
-600---NaNO31.900-3002.50081KNO3
----142Ca(NO3)2
--134--(NH4)2SO4
---300-NH4H2PO4
1.650----NH4NO3
-750--65KCl
44075150200-CaCl2.2H2O
37025050040074MgSO4.7H2O
22,30,1---MnSO4.4H
2O
-125150--NaH2PO4.H2O
170---12KH2PO4
Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto
-
0,03
0,01
Heller
0,250,250,1-NaMoO4.2H2O
0,025---CuSO4.5H2O
0,830,751-KI
Murashige ySkoog
Gamborg(B5
Schenk yHildebrandt
(SH)White
8,6121-ZnSO4.7H20
--0,0250,2-CuSO4
6,2135-H3BO3
--1010-MnSO4.H2O
-600---NaNO31.900-3002.50081KNO3
----142Ca(NO3)2
--134--(NH4)2SO4
---300-NH4H2PO4
1.650----NH4NO3
-750--65KCl
44075150200-CaCl2.2H2O
37025050040074MgSO4.7H2O
22,30,1---MnSO4.4H
2O
-125150--NaH2PO4.H2O
170---12KH2PO4
Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto
-
0,03
0,01
Heller
0,250,250,1-NaMoO4.2H2O
0,025---CuSO4.5H2O
0,830,751-KI
Murashige ySkoog
Gamborg(B5
Schenk yHildebrandt
(SH)White
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Reguladores del crecimiento comnmente usadosen medios de cultivos vegetales
10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina
(kinetina)
10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolbily no debera ser
autoclavada
Las citoquininasson normalmente
disueltas enNaOH diludas oen etanol acuoso
10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas
10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-actico
10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-
diclorofenoxiacticoEl AIA puede seroxidado por clulas
vegetales. Esfrecuentemente usadocomo nica fuente deauxinas en el medio
de cultivo
Las auxinas sonusualmentetituladas ensolucin con
NaOH
10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacticoAuxina
10-7-10-5202,2NOAAcido -naftoxiactico
10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoactico
10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutrico
10-7-5x10-6
10-7-10-5
Rango deconcentracin
(M)
Soluble en agua
Preparacin desolucin stock
Es termolbil, no debeser autoclavada. Es
comnmente necesariopara la iniciacin o elmantenimiento decallos y cultivos en
suspensin. Algunasveces necesario para la
regeneracin deplntulas.
364,4GA3Acido giberelicoGiberelina
219,2ZeaZeatina
ComentariosPeso
MolecularAbreviaturaNombreClase
10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina
(kinetina)
10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolbily no debera ser
autoclavada
Las citoquininasson normalmente
disueltas enNaOH diludas oen etanol acuoso
10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas
10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-actico
10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-
diclorofenoxiacticoEl AIA puede seroxidado por clulas
vegetales. Esfrecuentemente usadocomo nica fuente deauxinas en el medio
de cultivo
Las auxinas sonusualmentetituladas ensolucin con
NaOH
10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacticoAuxina
10-7-10-5202,2NOAAcido -naftoxiactico
10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoactico
10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutrico
10-7-5x10-6
10-7-10-5
Rango deconcentracin
(M)
Soluble en agua
Preparacin desolucin stock
Es termolbil, no debeser autoclavada. Es
comnmente necesariopara la iniciacin o elmantenimiento decallos y cultivos en
suspensin. Algunasveces necesario para la
regeneracin deplntulas.
364,4GA3Acido giberelicoGiberelina
219,2ZeaZeatina
ComentariosPeso
MolecularAbreviaturaNombreClase
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Grupos bsicos de reguladores del crecimiento:
- Auxinas- Citoquininas- Giberelinas- Acido abscsico- Etileno
Generalidades:
- Actan a bajas concentraciones
- Interactan unos con otros (los resultadosestn determinados por las concentracionesrelativas entre las diferentes fitohormonas).
- Los reguladores endgenos del crecimientoestn presentes en la planta durante todosu ciclo de vida pero su concentracin flucta.
Su concentracin relativa vara en funcindel estado fisiolgico de la planta y en cadauno de los rganos de sta.
- Estn involucrados en numerosos procesosfisiolgicos.
Reguladores
del crecimiento
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partirde bioensayos realizados para caracterizar el mensajero
responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpicadel coleoptile de gramneas.
- Alargamiento y divisin celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos- Formacin de races adventcias- Dominancia apical- Accin herbicida- Estimulacin de la produccin de etileno
Se sintetizan en las yemas, hojas jvenes, frutos y en elembrin. La concentracin endgena en la planta varaentre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
Su transporte es polar Auxinas sintticas:
- Acido indol butrico (IBA)- Acido naftalen actico (ANA)- 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
NOH
O
Acido indol actico (AIA)
(auxina endgena)
Las auxinas se
emplean comopromotores dela proliferacincelular y la
induccin de lamorfognesis
Agrobiotecnologa
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Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias
promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas:
- Promocin de la divisin celular
- Promocin de la organognesis (relacinauxinas/citoquininas)
- Retardo de la senescencia- Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
Citoquininas endgenas:
- Zeatina (Zea)
- Isopenteniladenina (2iP)
Citoquininas sintticas:
- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)
Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentranen todos los tejidos. La concentracin endgena enplantas vara entre 0,1 y 500 g/Kg.
Su transporte es no polar.
Las citoquininas
determinandiferentesrespuestasmorfogenticas
en combinacincon las auxinas
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir deplantas de arroz infectadas. Estas plantas presentabanmarcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayosse llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.
El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada.
En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinasdiferentes.
Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos
o plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes- Germinacin de semillas en dormicin- Floracin- Movilizacin de reservas en la semilla
Se sintetizan en hojas jvenes, en yemas y en el embrin.
Su transporte no es polar.
Las giberelinas
favorecenel crecimiento yel alargamientode los
entrenudosde los brotes
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
O
HCH3 H COOH
H
HO OH
CH3
C O
Acido giberlico (GA3)
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Etapas del cultivo in vitro
de plantas superiores
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Eleccin de una plantamadre selecta
Explantos
Desinfeccin superficial
Establecimiento en mediode cultivo apropiado
Transferencia a unmedio de multiplicacin
Formacin debrotes o embrioides
Transferencia a un medio
para el enraizamiento delos brotes
Pasaje a maceta enun invernculo
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 4
El proceso
de micro-propagacinde especiesvegetales
consta devarias etapas
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Cultivo de tejidosvegetales
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7/27/2019 2011_2 Cultivo de Tejidos I
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Eleccin del explanto inicial
Escarificacin
Esterilizacin
Semillas estriles
Germinacin
% de germinacin?
Diseccin bajo lupa
EsterilidadMedio de Hoagland
Tritn X-100 3%, 10 min
Hipoclorito de Na 15%, 20 min
M. apical
Hoja
M. axilarTalloRaz
M. radicular
MS + 2,4-D
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Protocolo tipo de esterilizacin superficialde material vegetal:
- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
- Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO)de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este pasopuede ser reemplazado por el uso desoluciones diludas de bicloruro de mercurio
(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.
- Enjuagues con abundante H2O estril(4 5 veces).
- En el caso del HgCl2, el material se debeenjuagar sucesivas veces pues es difcilde eliminar.
Los explantos
deben seresterilizadosantes de serestablecidos
en condicionesde cultivo
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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7/27/2019 2011_2 Cultivo de Tejidos I
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Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro
Explanto(asepsia)
Ambiente
Cultivo
Sin respuesta
Cultivo infectado
Regeneracin indirecta
Regeneracin directa
Respuesta
Explanto(asepsia)
Ambiente
Cultivo
Sin respuesta
Cultivo infectado
Regeneracin indirecta
Regeneracin directa
Respuesta
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7/27/2019 2011_2 Cultivo de Tejidos I
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Vas morfogenticas:
organognesis y embriognesis
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Posibles vas morfogenticas:
- Organognesis
- Embriognesis
Diferencias entre las dos posibles vas:
- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo oclusterde clulas del explanto inicial se desdiferenciainicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a unrgano vegetal. No se obtienen por esta va plantascompletas.
- La embriognesis se presupone de origen unicelular.
Una clula del explanto se asla y constituye el punto
de partida para la obtencin de un embrin somtico.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrin cigtico. El resultadoes una planta completa.
Existen dos
posibles vasmorfogenticaspara ladiferenciacin
de novodebrotes o plantascompletas
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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EmbriognesisOrganognesis
Fotomicrografas de las dos vas morfogenticas
d
pfpf
av
arcv
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Propagacin vegetativa por embriognesis somtica
Explanto(disco de hoja)
Explanto
(clulasvegetales)
REGENERACIN
Suspensin celular
Embriones somticos
ENCAPSULACINGERMINACIN
GERMINACIN Semillaartificial
Callo
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Sistemas de micropropagacin vegetal
Proliferacin de yemas axilares o apicales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Proliferacin de yemas apicales o axilares
- Consiste en la multiplicacin de plantas a partirde las yemas axilares preexistentes. Representa
la aceleracin in vitrodel crecimiento natural de
dichos meristemas.
- La tasa de multiplicacin (tm) se calcula en baseal nmero de brotes o vstagos obtenidos a partirde un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes,dependiendo de la especie en cuestin, entre otrasvariables.
- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podranobtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao
a partir de una nica yema inicial.
- El cultivo de meristemas es un caso especial deluso de esta tcnica.
Propagacin
vegetativa apartir de yemaspreexistentes
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Sistemas de micropropagacin vegetalProliferacin de tejidos desdiferenciados
Agrobiotecnologa
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Consideraciones generales:
- Callo: masa de clulas desdiferenciadasobtenidas a partir de un explanto cultivado
in vitro(disco de hoja, meristema,clulas en suspensin, etc.)
- Es posible regenerar brotes o vstagos a partirde estos callos.
- Las plantas diferenciadas puedenno ser uniformes, debido al posible desarrollo
de variantes somaclonales. Esto debe tenerseen cuenta, especialmente cuando se trabaja enpropagacin clonal a gran escala.
Resulta posible
regenerar broteso yemas a partirde tejidosvegetales
desdiferenciadosin vitro
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Sistemas de propagacin vegetativa in vitroRegeneracin directa e indirecta
Explanto(disco de tejido)
Explanto(suspensin de clulas)
Regeneracindirecta
Regeneracinindirecta
CalloFormacin
directade brotes
Formacinindirectade brotes
Planta regenerada
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Sistemas de
propagacinvegetativain vitro
Propagacin vegetativa in vitroRegeneracin directa e indirecta
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Sistemas de micropropagacin vegetalCultivo de meristemas
Agrobiotecnologa
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Cultivo de meristemasEl empleo demeristemascomo explantoses una posibleherramienta parael saneamientode plantasinfectadas
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Meristema apical
Meristema axilar
Domomeristemtico
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Posibilitan la micropropagacin de diferentes especiesvegetales.
Constituyen el explanto ideal para liberar de patgenosin vitroa plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.
Son ampliamente utilizados como explantos para lacriopreservacin y conservacin de germoplasma.
Los meristemasson gruposde clulasindiferenciadasque retienenla capacidadde dividirsedurante todoel ciclo de vidade una planta
Los meristemas determinan el crecimiento de
la planta y dan origen a sus diferentes rganos
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Aplicaciones del cultivo de tejidos:Liberacin de patgenos
Agrobiotecnologa
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- El domo meristemtico no est vascularizado(muchos patgenos se translocan por los tejidosde conduccin).
- El nmero de partculas virales es menoren los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema
es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivode meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin
entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa yDahlia.
El cultivo demeristemasfacilita laeliminacin depatgenos
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
El l i d
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Mediante esta tcnica es posible sanear
plantas infectadas sistmicamente pordiferentes tipos de patgenos comobacterias, hongos, virus y viroides.
El cultivo detejidos posibilitael saneamientode las plantasmultiplicadas
vegetativamente Sntomas producidospor el Tomato mosaicvirus.
Partculas de Potatovirus Y
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Cultivo de tejidosvegetales
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El material vegetal infectado por virus,bacterias, hongos y/o micoplasmas puedeser tratado con diferentes tcnicas:
Termoterapia
Quimioterapia
Cultivo de meristemas
Estos tratamientos pueden usarse por
separado, pero incrementan su efectividadnotablemente cuando se los combina,trabajando in vivoe in vitro.
El tratamiento
de plantasmadres puedeefectuarsepor distintas
tcnicas
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
C id i
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Termoterapia
El tratamiento por calor es un mtodo eficaz parainactivar algunos virus y viroides. Se debe elegiruna temperatura y tiempo de tratamiento tales quela planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita
la inactivacin del virus.
Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanumtuberosuma 8C durante 4 meses permiten obtener un
30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid(PSTV).
Consideraciones
prcticas para elsaneamiento deplantas madrespor termoterapia
Sintomasinducidospor PSTVentubrculosde papa
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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L t d l
-
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Las plantas regeneradas in vitrodeben serevaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patgeno considerado.
Estas pruebas se denominan ensayos deindizacin (indexing) y difieren segn el sistemahuesped-patgeno de que se trate.
Se incluyen entre estas pruebas:
- Seleccin visual u observacin de sntomas
- Empleo de hospedantes indicadores
- Mtodos serolgicos
- Microscopa electrnica
La metodologa
de saneamientoempleada debeser evaluada
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Ob i
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Consiste en la observacin de sntomas.
Se trata de un mtodo impreciso. Resulta confiable en el caso de enfermedades
que inducen sntomas muy caractersticoso conspcuos.
PotatoVirus X
ColiflowerBlack Rot
Observacin
visual
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Enfermedades
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Mosaico clortico producido por Tomato mosaic virusen tomate
Sntomas de pie negro y podredumbre blanda causados porErwinia carotovoraen papa.
Enfermedadesbacterianasy/o viralescon sntomasdistintivos
Tubrculo inoculadocon E. carotovora
Tuberculo noinoculadoPie negro
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Antracnosis en Fragaria spp causada por ColletotrichumSntomas de
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Antracnosis en Fragariaspp. causada por Colletotrichum
Powdery MildewenSolanum tuberosumcausado por Erysiphe
spp.
Sntomas deenfermedades
causadas porhongos
Sntomas en estolones Sntomas en frutos
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Di i i d t d t d Sntomas de
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Disminucin de tamao causada por nematodes en maz
Micrografas de un nematode del gnero Trichodorus(tamao aproximado: 0,5 M de dimetro, 1 mm de largo).
Sntomas deenfermedadescausados pornematodes
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Empleo de
-
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Es una tcnica frecuentemente utilizadapara detectar virus que pueden transmitirsemediante el jugo infeccioso extrado deplantas enfermas.
Se usan como indicadoras variedadesmuy susceptibles de la especie estudiadau otras especies que desarrollan sntomascaractersticos en un corto tiempo.
Los sntomas inducidos en la planta
indicadora revelan la presenciadel patgeno y permiten identificarlo.
Empleo de
hospedantesindicadores
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Se basan en la alta especificidad de la reaccinMtodos
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Se basan en la alta especificidad de la reaccinantgeno-anticuerpo, por la cual un anticuerporeconoce y se combina slo con la porcin deantgeno que le dio origen.
- Pruebas inmunoenzimticas(DAS-ELISA)
- Floculacin de ltex sensibilizado(partculas de ltex recubiertas por
anticuerpos especficos, se observaagregacin de partculas con formacin
de precipitado)
- Microprecipitacin (gotas de antisuero
y antgeno, se observa formacin deprecipitado)
Mtodosserolgicos
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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La metodologa
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Las plantas regeneradas in vitrodeben serevaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patgeno considerado.
Estas pruebas se denominan ensayos deindizacin (indexing) y difieren segn el sistemahuesped-patgeno de que se trate.
Se incluyen entre estas pruebas:
- Seleccin visual u observacin de sntomas
- Empleo de hospedantes indicadores
- Mtodos serolgicos
- Microscopa electrnica
La metodologade saneamientoempleada debeser evaluada
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Conservacin de germoplasma
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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C l i i iExisten diferentes
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Colecciones in vitro
Bancos de semillas
Crioconservacin
mtodos parala conservacinde germoplasma
www.cgiar.org
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Bancos de
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La conservacin de germoplasma medianteel cultivo de tejidos se basa en la limitacindel crecimiento del material vegetal.
Implementacin:
- Medios de cultivo de composicin subptima
- Baja intensidad lumnica (
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semillas se mantienen viables durante un largo
perodo de almacenamiento.
El material debe mantenerse bajo condicionescontroladas en una cmara de mantenimiento:
- Bajas temperaturas- Bajo contenido de humedad
Este mtodo no puede aplicarse a la conservacin
de plantas cuyas semillas presentan longevidad
reducida, especies autoincompatibles o especiesde propagacin vegetativa obligada
semilla permitenla conservacinde especiesvegetales que
se propagansexualmente
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Consiste en el mantenimiento de materialCrioconservacin
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Consiste en el mantenimiento de materialvegetal a temperaturas ultrabajas (-196 C),por inmersin en nitrgeno lquido
Diferentes explantos (pices de yemas,meristemas, anteras, embriones inmaduros)
as como callos y suspensiones celularespueden ser crioconservados a-196 C.
de germoplasma
www.science.siu.edu
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Etapas del
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Crioproteccin
Congelamiento
Almacenamiento
Descongelamiento
Pruebas de viabilidad
Recultivo
proceso decrioconservacinde materialvegetal
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Cultivo in vitrode clulas haploidesy embriones
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Mejoramiento vegetalAplicacionesd l l i
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Mejoramiento vegetal.
Estudios de gentica cuantitativa.
Estudios de diferenciacin celular y alternanciade generaciones.
del cultivoin vitro
de clulashaploides
Ttradas demicrosporas
Sacos polnicos(con granos de polen)
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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G ti d l l t d t
Condicionesf t
-
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- Genotipo de las plantas donantes
- Fisiologa de las plantas donantes
- Caracterizacin citolgica y bioqumica
de etapas muy tempranas del desarrollode los granos de polen
- Pretratamiento de las anteras con altas
o bajas temperaturas o con choqueosmtico
- Medios de cultivo con alto contenido enosmticos para la induccin de callos y
menores concentraciones de sacarosapara la regeneracin de plantas
que afectanel cultivode anteras
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
- Permite la expresin e identificacinde alelos recesivos
El cultivo deanteras ofrece
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de alelos recesivos
- Constituye una fuente til para el mejoramientointravarietal
- Permite la rpida introduccin de caracteres
citoplasmticos en un fondo genticohomocigtico
- Crea y acrecienta las reservas citogenticasy citoplasmticas de los cultivos
- La obtencin de haploides duplicados resulta
til para el desarrollo de nuevas variedadescon el fin de distribuirlas en ambientes ecolgicosmuy diversos y para ensayarlas en ellos.
- Las microsporas o clulas haploides puedenusarse para la induccin de mutantes y parala seleccin de caracteres esporofticos.
numerosasventajas para elmejoramientode plantas deinters comercial
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Estudio de requerimientos nutricionalesd b i d ll
El cultivode embriones
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de embriones en desarrollo.
Rescate de embriones hbridos derivadosde cruzamientos interespecficos e intergenricos.
Producin de monoploides.
Superacin de la latencia de las semillas.
de embrionesinmadurospermiterealizar
diferentesaplicaciones
Embrin cigtico
Corte longitudinal de una semilla de Brassica
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Rescate de embriones (mediante polinizacinAplicacionesdel cultivo
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Embriones somticos (es) obtenidos a partirdel cultivo de vulos de Arabidopsis.
y fertilizacin in vitro)
Induccin de la embriognesis somticaa partir de nucelos de diferentes especiesvegetales.
del cultivode vulos
es
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Semillas sintticas
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Semillassintticas
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sintticas
Embriones somticos de Pinus sp
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Cultivo de tejidosvegetales
Las semillasartificiales
Las semillasartificialesposeen una
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artificiales
reproducen laestructura deuna semilla de
origen sexual
poseen una
cubierta deproteccin,contienensustanciasde reserva yportan unembrin en
su interior.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
Procedimientopara
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para
encapsularembrionessomticos
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidosvegetales
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Cultivo de protoplastos
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Los protoplastosson clulas Suspensin de protoplastos
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vegetalesdesprovistasde pared celular
de mesfilo de tabaco
Protoplasto de mesfilo de tabacoProtoplastos de la lnea celular By2
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Esquema general de la manipulacin gentica de
Los protoplastosconstituyen un
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Esquema general de la manipulacin gentica de
protoplastos in vitropara la realizacin de tcnicasde mutagnesis, fusin o transformacin.
y
explanto idealpara diferentesfines
biotecnolgicos
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Mtodos parael aislamiento
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Mtodo mecnico- Bajo rendimiento
- Procedimiento tedioso- Aplicabilidad limitada
Choque osmtico para producir plasmlisis celulary ruptura de la pared. Los protoplastos se liberande las clulas rotas mediante el restablecimiento
de su nivel osmtico.
Mtodo enzimtico
Consiste en la incubacin de las clulas en una mezclade enzimas que degradan la pared celular: celulasas,
hemicelulasas y pectinasas. Las preparacionescomerciales de dichas enzimas contienen ademsproteasas, nucleasas y lipasas.
de protoplastos
Protocolo para la obtencin de protoplastos. de mesfilo de hoja de tabaco:
Pasosimplicados en
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- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jvenesde tabaco).
- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de
hoja. Disponer los explantos en un regulador
osmtico.
- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri
conteniendo la solucin mezcla de enzimas y medionutritivo para el cultivo de protoplastos en una
proporcin 1:1.
- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 hen oscuridad, a 22-25C, a 50 rpm.
Observar la liberacin de los protoplastos en unmicroscopio invertido.
- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizndolos
y centrifugndolos a 100 g. Usar las solucionesformuladas para tal fin.
- Remover el sobrenadante y resuspenderlos protoplastos en medio de cultivo.
el aislamientodeprotoplastosde mesfilode tabaco
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Cultivo de tejidosvegetales
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La variacinsomaclonal
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Entre otras causas:
Modificaciones genticas heredables porlas progenies de las plantas obtenidasmediante cultivo in vitro
Prevalencia del cariotipo especfico deplantas y tejidos quimricos y de mosaicos
Cambios en el cariotipo, debidos a unarespuesta diferencial a los procedimientosde cultivo (composicin del medio, etc.)
Aneuploides no separables en el cultivo
puede explicarla variacinfenotpica
de las plantasregeneradasin vitro
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Cultivo de tejidosvegetales
Otra posiblescausas de la
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Cese mittico que lleva a lneas poliploides
Mutaciones del cariotipo
Amplificacin o disminucin de genes
Reordenamiento de mutaciones en genomasde organelas
Transposones
Inversiones, traslocaciones y otrosaccidentes cromosmicos
variabilidad delas plntulasregeneradas
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Caractersticasde la variacin
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Indeseable en la micropropagacin deplantas de inters comercial (diversidadgenotpica)
Potencial para el mejoramiento vegetal
cuando se trata de verdaderasmodificaciones del material gentico(variabilidad)
somaclonal
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Cultivo de tejidosvegetales
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8. Roca, W. M., Nez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y
mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura.Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de AgriculturaTropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 294, 1991.
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York, U.S.A., 1998.
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Cultivo de tejidosvegetales