Naciones Unidas NTIMICROBIAL La SEÑORES Y C Hemoterapia,octubre de 2008, p. 3648-3663 Vol. 52, N ° 10
0066-4804 / 08 / $ 08,00 0 doi: 10.1128 / AAC.01230-07 Copyright © 2008, Sociedad Americana de Microbiología. Todos Los Derechos Reservados.
Efectos de los antibióticos sobre Quorum Sensing en
Pseudomonas aeruginosa
Mette E. Skindersoe, 1 † Morten Alhede,
1 Richard Phipps,
1 Liang Yang,
1 Pedro O. Jensen,
3
Thomas B. Rasmussen, 2 Thomas Bjarnsholt, 1 Tim Tolker-Nielsen, 1
Niels Høiby, 3 y Michael Givskov
1 *
Biomédica Microbiología, BioSys, Bldg. 227, de la Universidad Técnica de Dinamarca, Kgs. Lyngby DK-2800,
1 Fisiología, culturas y División de enzimas, Chr-Hansen A / S, Bøge Alle' 10-12, Hørsholm DK-2970,
2 y el
Departamento de Microbiología Clínica, Rigshospitalet, Universidad de Copenhague, Copenhague DK-2100, 3
Dinamarca
Recibido 19 de septiembre 2007 / devueltos para el 23 de octubre de 2007 de modificación / Aceptado 11 de
junio 2008
Durante la Infección, Pseudomonas aeruginosa Emplea la Comunicación bacteriana (deteccion de quórum [QS]) Parr Coordinar la Expresión de Factores Que Danan los Tejidos. La expresión génica controlada-QS juega un papel fundamental en la virulencia de P. aeruginosa, y los mutantes-QS deficientes causan infecciones menos graves en modelos de
infección animal.El tratamiento de la fibrosis quística (FQ) infección crónica con P. aeruginosa con el antibiótico azitromicina macrólido (AZM) se ha demostrado para mejorar el resultado clínico.Varios estudios indican que AZM puede cumplir su acción beneficiosa en los pacientes con FQ al impedir QS, reduciendo así la patogenicidad de P. aeruginosa. Esto nos llevó a investigar si
la inhibición de QS es una característica común de los antibióticos. Se presentan los resultados de una investigación de 12 antibióticos por sus actividades QS-inhibitorias mediante un selector descrito previamente inhibidor QS 1 cepa. Tres de los antibióticos probados, AZM, ceftazidima (CFT) y ciprofloxacina (CPR), eran muy activos en el ensayo y se examinaron más por sus efectos
sobre la producción de factor de virulencia regulados por QS en P. aeruginosa.Los efectos de los tres antibióticos administrados a concentraciones subinhibitorias se investigaron mediante el uso de micromatrices de ADN. Resultados consistentes de las pruebas de factor de virulencia, transcriptasa reversa-PCR, y los microarrays de ADN apoyan la conclusión de que AZM, CFT, y
RCP disminuir la expresión de una serie de factores de virulencia regulados por QS. Los datos sugieren que el mecanismo subyacente puede ser mediada por cambios en la permeabilidad de la membrana, lo que influye en el flujo de N -3-oxo-dodecanoyl- lactona L -homoserina.
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El patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa causa infecciones graves, sobre todo en inmunodeprimidos indi-
UALs y pacientes con fibrosis quística (FQ).El progresivo deterioro de los pulmones causada por P. crónica infecciones
aeruginosa y, por lo tanto, la inflamación persistente son actualmente las principales causas de morbilidad y mortalidad
en los pacientes con FQ (55).Tratamiento antipseudomónica Intensivos (mantenimiento del ther-APY) ha mejorado en
gran medida las perspectivas de los pacientes con FQ (26, 29, 72). Un efecto secundario grave de la terapia antibiótica es
el desarrollo de resistencia a los antibióticos utilizados (3, 15, 28, 54). P. aeruginosa biofilms forma durante el proceso
de infección, que se suma a las dificultades de la erradicación de las infecciones por la intervención anti-bióticos, ya que
las células bacterianas que viven como biopelículas son mucho más tolerantes a los antibióticos que sus contrapartes ses-
planctónicos (4, 14, 17).Cuando la infección entra en un estado crónico, los domina, el fenotipo de alginato
superproductoras mucoides (22). Los macrólidos tales como eritromicina, claritromicina, eritromicina y la azitromicina
derivado (AZM) han sido demostrado que inhibe la actividad enzimática de guanosina-diphosphoman nariz
deshidrogenasa en la ruta biosintética de alginato de mucoide P. aeruginosa cepas en concentraciones muy por debajo de
la MIC (44, 49).Alginato induce una reacción antígeno-anticuerpo continua localmente en las vías respiratorias pequeñas.
Por lo tanto, un menor nivel de
* Autor para correspondencia. Dirección postal: Biomédica Microbiología, BioSys, Bldg 227, de la Universidad Técnica de
Dinamarca, Kgs. Lyngby DK-2800, Dinamarca. Teléfono: 45 4525 2769. Fax: 45 4593 2809. E-mail: [email protected].
† Dirección actual: ChemoMetec A / S, Gydevang 43, DK-3450 Al-leroed, Dinamarca. Publicado antes de impresión el 21 de julio de 2008.
la producción de alginato no sólo reduce la viscosidad de la SPU-tum, pero también puede conducir a una menor
inflamación y, por lo tanto, la mejora de la función pulmonar (8, 41, 49). Varios estudios clínicos han demostrado que el
tratamiento a largo plazo con AZM mejora la función pulmonar y el peso corporal en los pacientes con FQ (27, 43, 76).
AZM generalmente no se considera que muestra una actividad antipseudomónica debido a su MIC para P. aeruginosa en
el intervalo de 128 a 512 g / ml (43).Las mayores concentraciones de AZM se encuentran en el esputo de los pacientes
que recibieron terapia de dosis alta (250 mg diarios AZM) es 0,6 a 79,3 g / ml, con la concentración AZM mediana de 9,5
g / ml (6). Se ha sugerido que el tratamiento AZM inhibe el reclutamiento de neutrófilos al pulmón mediante la reducción
de los niveles de expresión de citoquinas proinflamatorias y la inhibición de la migración neu-trophil, resultando en una
reducción significativa en la inflamación de las vías respiratorias-específico (88).
También se ha sugerido que la inhibición de la célula-célula com-municación es el modo de acción por el cual AZM
ejerce su actividad en P. infecciones aeruginosa (60, 84).En las bacterias gram-negativas, la comunicación celular,
también conocido como quórum sens-ción (QS), se basa en pequeñas moléculas señalizadoras difusibles (lactonas N acilo
L -homoserina [AHL]), que interactúan con activadores-TRANSCRIP cional a pareja la expresión de genes con la
densidad de población de células.El sistema QS de P. aeruginosa se organiza JERAR-chically, con los componentes
RhlI-RHLR estar subordinada a los componentes Lasi-LASR.LASI dirige la síntesis de N -3-oxo-dodecanoyl- lactona L -
homoserina (OdDHL), mientras que RhlI sintetiza N -butanoil-L-homoserina lactona (BHL).P. células aeruginosa son
permeables a BHL, que se difunde libremente a través de la membrana celular, se requiere mientras que el eflujo activo
para el transporte de OdDHL (67).Además de la AHL
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moléculas señal BHL y OdDHL, tercera señal intercelular, 2-heptil-hidroxi-4-quinolona (designado la señal de quinolona
Pseudomonas [PQS]), se ha encontrado para ser parte del regulón QS en P. aeruginosa (70).Todos ellos función en
concierto para controlar la expresión de una serie de genes, incluidos los genes que codifican exoproductos que dañan los
tejidos (31, 51, 62, 66). En ad-condición para el control de la producción de factores de virulencia, se ha informado de las
moléculas señal QS PQS y OdDHL poseer efectos inmunomoduladores, y de esta manera, contribuyen directamente a la
patogénesis de P. aeruginosa (24, 42, 85).
Varios estudios han demostrado los efectos de AZM en la ex-presión de los genes de virulencia regulados por QS in
vitro (40, 60, 84). La aplicación de un modelo de ratón CF, hemos demostrado recientemente que el tratamiento AZM
mejoró significativamente el aclaramiento de bacterias pulmonares, reduce el grado de abscesos pulmonares y la
disminución de la gravedad de la patología pulmonar, y reducido el nivel de la producción de alginato in vivo y también
en experimentos in vitro , a pesar de que no tuvo efecto sobre el crecimiento de las bacterias que infectan (40). Desde QS
parece jugar un papel clave en la expresión de la virulencia y la interacción con la protección del huésped, los inhibidores
de QS se han sugerido para ser componentes importantes de terapias antipseudomonal futuros (37). Ejemplos de
compuestos que pueden bloquear QS en P. aeruginosa son los halofuranones (32, 38), que se originan a partir de un
macroalgas bentónicas y el de hongos metabolitos patulina y ácido penicillic (74).Furanona C-30 inhibe específicamente
QS durante un intervalo de concentración de 1 a 10 M; pero cuando se administra en exceso, es decir, en Concentra-ciones
10 veces mayor, el compuesto afecta el crecimiento y Exhib-sus propiedades antibióticas. Además de QS-inhibitoria
actividad (QSI), los halofuranones bioactivos exhiben una multitud de actividades, incluidas las propiedades antibióticas y
anti-incrustantes, y por lo tanto pueden considerarse compuestos multifuncionales en-amordazada en la comunicación, así
como la competencia (para una revisión reciente, véase la referencia 21). Se ha demostrado recientemente que en las sub-
MICS antibióticos afectan ampliamente los patrones de-la trascripción en las bacterias y parecen funcionar como
mediadores de señalización en lugar de la función por la orientación del crecimiento de rivales (35). Esto plantea la
cuestión de si otros compuestos identificados previamente por sus propiedades antibióticas pueden llegar a propiedades-
pos sess que interfieren con la comunicación y, poten-cialmente, la actividad QSI. Para tratar de responder a esta pregunta,
se presentan los resultados de una investigación de 12 antibióticos para sus activ-dades QSI. Se identificaron tres
antibióticos, AZM, ciprofloxacina (CPR), y ceftazidima (CFT), que presentan fuertes QSI activ-dades en el ensayo de
selección. Los efectos de estos tres antibi-antibióti- se investigaron adicionalmente por medio de ensayos de transcriptoma
anal-analysis y fenotipo.
MATERIALES Y METODOS
Cepas bacterianas aplicadas en este estudio. El secuenciado P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje cepa se obtuvo del Genetic Stock Center
Pseudomonas (cepa PAO0001; www.pseudomonas.med.ecu.edu).El mutante lasI-rhlI se construyó mediante el uso de un sistema de eliminación se informó
anteriormente (7).El QSI selector QS deformación selector inhibidor 1 (QSIS1) fue descrito previamente (73). Pantalla bacteriana para la inhibición de QS. QSIS1 Strain se ha descrito previamente en detalle (73).El elemento de QS se deriva del sistema QS
regulado LuxR de Vibrio fischeri y se clonó en Escherichia coli, donde se responde a una amplia gama de AHL y los inhibidores de QS (2, 73, 74).QSIS1
alberga plásmido pUC18Not- luxR- P luxI -RBSII- pHLA T -T 0 1 Ap r mantenido en CSH37 (59), una E. coli cepa que constitutivamente expresa galactosidasa.El concepto general de la
selector
sistema implica la presencia de un regulador de QS (luxR o un homólogo) gen y un promotor QS-controlado fusionado a un gen que codifica un producto
génico tóxico.En la presencia de moléculas de señal, el gen bajo control QS se expresa, causando la muerte celular. Sin embargo, en presencia de un
compuesto QSI, la producción del producto del gen tóxico está apagado y las bacterias son rescatados y capaz de crecer normalmente. El producto del gen
tóxico del sistema selector QSIS1 es citolítica fosfolipasa A, que se origina a partir de Serratia liquefaciens MG1 (33, 34).Ser causa moléculas señal se
añaden al ensayo de una fuente externa, QSIs dirigidas a la sintetasa AHL no están identificados, mientras que los compuestos que en-Hance la degradación
de AHL, impide la absorción de AHL, o bloquear la interacción de AHL con la proteína luxR son encontrado.
Se añadió BT me-Dium (medio B [16] más 2,5 mg de tiamina por litro) que contiene 2% de agar (peso / vol) se fundió, 10% A10 tampón (16):
Brevemente, la preparación de pantallas de QSIS1 se realizó como sigue , y la mezcla se enfrió a 45 ° C. Para el agar ABT resultante entonces se añadieron
N -3-oxo-hexanoil- lactona L -homoserina (Sigma-Aldrich, Alemania), ampicilina (VepiDan, Dinamarca), 5-bromo-4-cloro-3-indoxyl- - D -
galactopiranósido (X-Gal; Apolo Scientific, Reino Unido), y 1-metil-2-pyrrelidon (Merck, Alemania) a concentraciones finales de 100 nM, 100 g / ml, 40 g /
ml, y 0,2% (vol / vol ), respectivamente; y el medio fue suplementado con 0,5% (peso / vol) de glucosa y 0,5% (peso / vol) casaminoácidos.Un cultivo de
una noche de QSIS1 (cultivados en medio ABT-sup complementado con 0,5% [peso / vol] de glucosa, 0,5% [peso / vol] Casamino Acids, y 100 g / ml de
ampicilina) se añadió a una concentración final de 0,4%.
Placas para el ensayo de selección fueron posteriormente hicieron vertiendo la mezcla en una caja para dar un espesor de 5 mm de agar. Wells con
diámetros de 5 mm se hicieron en las placas de agar. Tras la solidificación, 50 l de un 1 a 10 g / ml solución del antibiótico a ser probado para la actividad
QSI se añadió a los pocillos. La placa se incubó a 30 ° C durante 16 h. La aparición de una zona circular de crecimiento (que apareció azul debido a la
presencia de hidrolizado X-Gal) indicó la presencia de compuestos con actividad QSI en la muestra ensayada.
Preparación de la muestra para P. análisis aeruginosa GeneChip.Se inoculó ABT medio sup-complementado con 0,5% de casaminoácidos con
crecimiento exponencial Células de P. aeruginosa PAO1 a una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,05, y el las células se cultivaron a 37 ° C y 200 rpm en cinco matraces de
500 ml que contenían 100 ml cada uno. Cuando el OD 600 fue de 0,3, AZM (8 y 2 g / ml; Zithromax, Pfizer), CPR (0,04 g / ml; Fluka), o CFT (0,25 g / ml; Fortum, GlaxoSmithKline) se
añadió.Estas concentraciones de antibióticos no afectaron el crecimiento de P. aeruginosa. Se recuperaron muestras cuando el OD 600 alcanzó 2,0,
inmediatamente transferido a 2 volúmenes de RNAlater (Ambion), y se almacenaron a 80 ° C. Se aisló el ARN con un kit de purificación RNeasy Mini
(Qiagen), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante, incluyendo el tratamiento de ADNasa en columna.La síntesis de ADNc se realizó con
12 g de RNA, 300 ng / l cebadores aleatorios (Invitrogen), 1500 U superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen), y 30 U SUPERase En inhibidor de
RNasa (Ambion), de acuerdo con el análisis Affymetrix expres-sion protocolo. El ADNc sintetizado se purificó con un kit de purificación QIAquick PCR
(Qiagen), y de 3 a 4 g de cDNA fue fragmentado con 0,2 U FPLC puro DNasa I (Amersham Bioscience) por g de ADNc. El cDNA fragmentado se marcó en
el extremo con biotina-ddUTP (Enzo kit de marcaje terminal de Bioarray) y se hibridó durante 18 h a 55 ° C a una P. aeruginosa microarrays genoma
GeneChip (Affymetrix).Los chips se lavaron y se tiñeron según el protocolo de Affymetrix. La intensidad de la señal de microarrays de hibridación se redujo
a un promedio general de la señal de 500; y el microarray se evaluó la presencia, la presencia marginal, o la ausencia de la sonda fija (en representación de
diferentes genes o marcos de lectura abiertos) por el uso de Affymetrix GeneChip sistema (versión 1.4) de software que operan. Los valores de la expresión
única de la sonda fija esti acoplado-como "presente" se incluyeron en los análisis posteriores. Los experimentos de microarrays se llevaron a cabo dos veces
por los cultivos tratados con antibióticos (dos matrices de 2 g / ml AZM, dos conjuntos de 8 g / ml AZM, dos matrices de 0,04 g / ml CPR, y dos matrices de
0,25 g / ml CFT) , mientras que los controles no tratados (referencias) se ensayaron en cuatro repeticiones. Los datos aquí p resentados están basados en el
promedio de cada serie.
La cuantificación de mRNA por PCR en tiempo real. (I) Primer diseño. Los cebadores usados para la amplificación del ARNm (Tabla 1) fueron
diseñados por el uso de software integrado de ADN Tecnologías Primer Quest (http://www.idtdna.com). Brevemente, los tamaños del amplicón diseñados
variaron de 80 a 200 pb, y las temperaturas de fusión de cebadores fueron diseñados para 60 ° C, con una diferencia de temperatura de fusión de menos de 2
° C para cada par de cebadores.Las secuencias de los cebadores también se sometieron a un análisis BLAST contra la P. aeruginosa PAO1 secuencia del
genoma para eliminar la posibilidad de unión no específica.
(Ii) PCR en tiempo real. Cada tiempo real mezcla de PCR (volumen final, 20 l) con-contenida 9 l de ADNc, 10 l de verde SYBR 2 cuantitativa mezcla
maestra de PCR (Fermentas), y 0,5 M de cada uno hacia adelante y cebador inverso.PCR en tiempo real se realizó con un detector en tiempo real Chromo4
(Bio-Rad [anteriormente MJ Research
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TABLA 1. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo
real Gene Adelante Reverse
rhlA 5 -TCT GTT GGT ATC 5 -ACA GCA CCA CGT GGT TTG CAA GGG-3 TGA CGG AAT GTT-3 PPRA 5 -TGC TGT TGG GCA 5 -AGA CGC GAA AGG TGG ACA TCT-3 ATC AGC TT-3 ppRb 5 -TCA AGT ACG AGG 5 -TAT CTG GTA GTT TAC ACG ACG ACA-3 GGT CAG GCC CTT-3 rpoD 5 -ACA TGC GTG AAA 5 -ATG CGC TTG GCG TGG GTA CCG T-3 ATT TCG ATC T-3
búsqueda]) utilizando los siguientes parámetros de ciclación: una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min antes de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s,
60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Los datos se analizaron por el método de cuantificación relativa eficiencia corregida (71). La expresión de los
genes diana se normalizó a la expresión de referirse-cia gen rpoD, como el análisis de microarrays de ADN mostró que la expresión de este gen era estable
en todas las condiciones.Además, Savli et al. (77) han encontrado que entre los genes de limpieza, este gen tiene la expre-sión más estable. Para controlar las
variaciones entre carreras, la limpieza de genes y los diversos genes diana para cada tratamiento individual se amplificaron al mismo tiempo en una placa de
96 pocillos. Los cambios en los niveles de expresión de los genes diana en las muestras tratadas se calcularon en relación con el nivel medio de expresión del
gen respectivo en la muestra no tratada. La eficiencia de la transcripción inversa-PCR (RT-PCR) para los pares de genes (bajo tratados frente a condiciones
no tratados) varió de menos de 5%.
Por consiguiente, las eficiencias promedio de cada gen en este estudio fueron muy similares para las condiciones en comparación, lo que permite un
análisis preciso. Los sobrenadantes de pruebas de factor de virulencia. P. aeruginosa Culturas PAO1 eran
crecido ya sea para 16 a 20 h (para el ensayo de hemólisis) o a un OD 600 de 2,0 (para la proteasa, quitinasa, y los ensayos de elastasa), como se describe
anteriormente, con 8 o 2 g / ml AZM, 0,04 g / ml CPR, 0,25 g / ml CFT, o ningún antibiótico (control). Las P. aeruginosa PAO1 QS mutante lasI - rhlI también se cultiva junto con el
tratado y sin tratar P. culturas aeruginosa PAO1.Las células se recogieron por-ción centrifuga, y los sobrenadantes se filtraron esterilizados (filtro de jeringa
de TPP; tamaño de poro, 0,22 m). Los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 20 ° C.
Ensayo de hemólisis. Los sobrenadantes de filtro esterilizado se trataron en autoclave para destruir actividad enzimática y se mezcla con la sangre venosa
de un individuo sano en una relación volumétrica de 30: 1 (sobrenadante a la sangre), observado para la hemólisis después de 20 min, y se dejó a temperatura
ambiente durante 4 h para permitir la sedimentación de eritrocitos intactos.Actividad hemolítica se observó como un claro y una coloración rojo-ing
nonprecipitat de la solución de sangre, mientras que la falta de actividad hemolítica se caracteriza por la precipitación de los eritrocitos intactos. El
experimento se llevó a cabo cuatro veces con sobrenadantes de cuatro crecimiento individual expe-mentos.
Ensayo de la proteasa. Los sobrenadantes de filtro esterilizado (300 l cada uno) se añadieron a los pocillos de placas de agar (medio ABT ABT
suplementado con 2% de agar) 5% de leche desnatada con-que contiene, y las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las zonas de aclaramiento
(radios) se midieron en las fotografías de las placas mediante el uso de una regla.El experimento se realizó tres veces como cuatro repeticiones con los
sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento individuales. Los valores de las cuatro réplicas se promediaron y se utilizan como un valor para
representar cada uno de los tres experimentos.
Ensayo de elastasa. Los sobrenadantes de filtro esterilizado se mezclaron 2: 1 con tampón de phos-fosfato (0,1 M, pH 6,3), y se añadieron 2 mg / ml
elastina rojo Congo (Sigma). La mezcla se incubó a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 1 semana. Después de la centrifugación, la absorbancia del
sobrenadante a 495 nm se midió con un espectrofotómetro a cero en una muestra de rojo Congo elastina se incubaron con medio solo. El procedimiento se
modificó del descrito previamente (63). El experimento se realizó tres veces por triplicado con los sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento
individuales. Los valores de los experimentos por triplicado se promediaron y se utilizan como un valor para representar cada uno de los tres experimentos.
Ensayo de quitinasa. La quitinasa se midió mediante un ensayo de azul de quitina modificado (30, 36).Los sobrenadantes de filtro esterilizado se
mezclaron 2: 1 con tampón de citrato de sodio (0,1 M, pH 4,8), y se añadieron 0,5 mg / azul quitina ml (Sigma). Las mezclas azules-quitina sobrenadantes se
incubaron a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 1 semana. Las muestras se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min, y la absorbancia a 570 nm se
determinó.Las muestras se compararon con espacios en blanco incubadas con medio solamente. El experimento se realizó tres veces por triplicado con los
sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento individuales. Los valores de la Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.
experimentos por triplicado se promediaron y se utilizan como un valor para representar cada uno de los tres experimentos.
Cuantificación de ramnolípido. Una curva estándar para B ramnolípido (concen tración frente a la corriente total de ionización) se calculó a partir de
datos líquidos chromatogra-PHY-electrospray-espectrometría de ionización de masas (MS). Para reducir al mínimo las posibles diferencias en los niveles de
ionización de ramnolípido entre las muestras, los estándares ramnolípido utilizados para calcular la curva de concentración se analizaron inmediatamente
antes, así como después se analizaron las muestras. La corriente total de ionización se determinó sobre la ion [M NH 4] a lo largo de los 7 668,4 s sobre el
cual ramnolípido B se eluyó.Cromatografía líquida de alta presión (LC) -MS análisis se realizó con una serie 1100 cromatógrafo líquido de alta presión
Agilent conectado a un tiempo de vuelo de masa spec-espectrómetro Micromass LCT. La concentración de ramnolípido en el cultivo sin tratar se ajusta igual
a un valor de índice de 100.
Soporte de AZM, CFT, y RCP en contra del LBD de la proteína LasR. La De rayos X estructura cristalográfica del dominio de unión al ligando
(LBD) de la proteína LasR (Protein Data Bank adhesión no.2UV0) se utilizó para el atraque de AZM, CFT, y RCP para el sitio receptor LasR mediante el
programa Molegro Docker virtual (86) y el modelo de acoplamiento plantilla con la configuración predeterminada. OdDHL se estableció como el ligando
plantilla en el LBD de la proteína LasR. Los ligandos se clasificaron mediante el uso de la puntuación rerank func-ción Molegro Docker virtual.
Análisis de datos y estadísticas. Se utilizó el análisis unidireccional de varianza seguido por la prueba de Dun-Nett para evaluar los efectos de AZM,
CFT, y el tratamiento CPR y el efecto de la mutación lasI-rhlI sobre la expresión de las elastasas, quitinasa, y proteasa en comparación con su expresión en
sin tratar cepa de tipo salvaje P. aeruginosa PAO1.Las pruebas se realizaron con el programa de software Graph-Pad InStat (versión 3) (San Diego, CA).
Las diferencias se consideraron significativas si el valor de p fue de 0,05 o menos.
Microarray número de acceso de datos. Los datos de microarrays de ADN (CHP, CEL, y archivos CAD) se han presentado a la base de datos de la
Expresión Génica Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y puede ser encontrado con el número serie de experimentos GSE8953.
RESULTADOS
La detección de actividad QSI. AZM se ha demostrado que inhibe la expresión de una subfracción de genes
controlados QS-(60, 84).Junto con AZM, hemos investigado otros 11 antibióticos (incluyendo un compuesto antifúngico,
griseofulvina) por sus habilidades para interferir con QS bacterianas utilizando una sencilla pantalla de difusión en placa
basado en QSIS1 (73). Mediante el empleo de nuestras condiciones stan-dard (73), se encontró que el cloranfenicol,
genta-micin, griseofulvina, kanamicina, piperacilina, spectinamycin, tet-racycline, tobramicina y la estreptomicina mostró
bajos niveles de o ninguna actividad QSI, mientras AZM, de conformidad con investigaciones previas, era muy activo. La
CPR fluoroquinolona y la cefalosporina CFT también mostraron actividades QSI fuertes en el ensayo con QSIS1 (Fig. 1).
RCP y CFT se emplean en la clínica como tratamientos antipseudomonas, mientras AZM exhibe un bajo nivel de, en su
caso, bactericida o efecto bacteriostático contra P. aeruginosa.RCP apunta ADN girasa (topoisomerasa II) y por lo
tanto inhibe la síntesis de ADN bacteriano.CFT es una beta-lactama y funciones mediante la interrupción de la síntesis de
la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana. El modo de acción de AZM es para unirse a la subunidad 50S del
ribosoma bacteriano, inhibiendo así la traducción de ARNm. Por tanto, estos tres antibióticos exhiben diversos
mecanismos de acción antimicrobiana, y que son estructuralmente muy diferente. Elegimos seguir investigando los
efectos en P. aeruginosa QS-gen regulado ex-presión y la producción de factor de virulencia con AZM, CPR, y CFT
como representantes de estos muy diversos grupos de antibióticos.Las curvas de crecimiento para P. aeruginosa PAO1
cultivar en la presencia o ausencia de AZM, CPR, y CFT a diferentes concentraciones (incluyendo concentraciones con
efectos ligeramente inhibidoras del crecimiento) y para el mutante lasI rhlI se presentan
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FIG. 1. Proyección de los antibióticos por el ensayo QSIS1. (A) Piperacil-lin; (B) la azitromicina; (C) cloranfenicol; (D)
ciprofloxacina; (E) gen-tamicin; (F) spectinamycin; (G) griseofulvina; (H) a la kanamicina; (I) tetra-ciclina; (J) tobramicina; Ceftazidima
(k); (L) estreptomicina.
en la Fig. 2. Hemos encontrado que la adición de 8 g / ml AZM, 0,25 g / ml CFT, o 0,04 g / ml CPR no afectó el
crecimiento de P. culturas aerugi-nosa cuando se añadió la droga cuando el OD 600 fue de 0,1. Se encontró que las CIMs
de los tres antibióticos para ser 800 g / ml (AZM), 8 g / ml (CFT), y 12.5 g / ml (CPR) en las condiciones de crecimiento
especificados. Por lo tanto, para la siguiente serie de experimentos, las concentraciones aplicadas fueron de 30 a 300 veces
menor que las MICs.
Termoestable hemolisina. Se investigaron los efectos de AZM, CPR, y CFT en la producción de hemolisina
termoestable.P. aeruginosa produce al menos dos hemolisinas, el calor-lábil fosfolipasa C (PHLC, PA0844) y el ramno
lípidos termoestable (rhlA, RHLB, rhlC y rhlG; PA3479, PA3478, PA1130 y PA3387, respectivamente) (9, 46,
83).Síntesis ramnolípido está activado en fase estacionaria temprana de P. culturas aeruginosa PAO1 (62, 89).Después
de 14 a 20 h de crecimiento (bajo las con-diciones descritas en Materiales y Métodos), la concentración de ramnolípido en
el sobrenadante excede 50 g / ml, que es suficiente para lisar los eritrocitos dentro de 20 min (Ob-observa- no publicados).
La lisis de los eritrocitos por ramnolípido puede ser utilizado como un simple ensayo para la detección de ramnolípido por
FIG. 2. Las curvas de crecimiento para el lasI - mutante rhlI () y PAO1 cepa cultivadas sin antibióticos () o PAO1 cultivaron en
presencia de 2 g / ml AZM (), 8 g / ml AZM (‰), 16 g / ml AZM (OE) , 0,04 g / ml CPR (E), 0,08 g / ml CPR (F), 0,25 g / ml CFT (), o
0,5 g / ml CFT (}).
FIG. 3. La hemólisis de los sobrenadantes de autoclave de P. culturas aeruginosa PAO1 cultivaron durante 20 h.PAO1 se cultivó sin
antibióticos (a) y en presencia de 2 g / ml AZM (b), 8 g / ml AZM (c), 0,25 g / ml CFT (d), o 0,04 g / ml CPR (e). También se muestran
mutante rhlI de PAO1 (f) - Los resultados para la lasI.
la mezcla de sobrenadante en autoclave con sangre e incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min. El
autoclave elimina la actividad de la enzima fosfo-lipasa lábil al calor. Un claro y una coloración rojo nonprecipitating de
la solución de sangre sobrenadante indica que ramnolípido está presente a una concentración muy por encima de 50 g /
ml, mientras que una falta de actividad hemolítica (caracterizado por la precipitación de células de la sangre intactas)
indica que poco (menos de 50 g / ml) o no ramnolípido está presente en el sobrenadante. La investigación de los
sobrenadantes de automóviles-claved de P. aeruginosa cultivar en la presencia o la ausencia de AZM, CPR, y CFT y los
sobrenadantes a partir del mutante QS lasI - rhlI, se encontró que sólo el tipo salvaje sin tratar produce suficiente
ramnolípido para causar la rápida hemólisis de los glóbulos rojos.Sin embargo, el tratamiento con CFT no abolió
completamente la actividad hemolítica (Fig. 3).
AZM en sub-PRM ha sido previamente informado para afectar a una fusión de genes rhlAB :: lacZ (84).Decidimos
cuantificar directamente el efecto de AZM así como los efectos de CFT y CPR en la producción de ramnolípido.De este
modo se determinó la concentración-ción de ramnolípido en los sobrenadantes de P. tratada y tratada por la ONU células
aeruginosa por LC-MS. Cuando las células se cultivaron en presencia de 8 g / ml AZM, la concentración de ramnolípido
se redujo en un 85% en comparación con el que en los cultivos no tratados, y 2 g / ml AZM redujo el contenido de
ramnolípido de los sobrenadantes por 80% en comparación con que en los cultivos no tratados, mientras que la RCP (0,04
g / ml) y CFT (0,25 g / ml) redujo la concentración de ramnolípido de 55 a 65% de que en los cultivos no tratados.El
mutante QS lasI - rhlI no produjo ninguna cantidad medible de ramnolípido (Fig. 4).
Proteasa. La producción de proteasa extracelular en P. culturas PAO1 aeruginosa cultivan en la ausencia o la pres-cia
de AZM, CPR, o CFT y en lasI - rhlI cultivos mutantes se ensayó mediante la adición de sobrenadantes de filtro
esterilizado de más-noche culturas para pozos realizados en placas de agar que contienen 5% de leche desnatada .La
actividad de la proteasa se redujo por AZM, CPR, y CFT (Fig. 5).
Elastasa. Las actividades de elastasa extracelular en los super-sobrenadantes de P. culturas aeruginosa PAO1 (no
tratados o cultivados con AZM, RCP o CFT) se cuantificaron mediante el uso de un procedimiento descrito Previ-ormente
(63).El QS mutante lasI - rhlI fue ensayada por el mismo procedimiento.AZM tratamiento redujo la actividad de la
elastasa de PAO1 casi hasta el nivel de que para la
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3652 SKINDERSOE ET AL. Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.
FIG. 4. Contenidos ramnolípido, en unidades relativas (RU), en Superna-tantes de P. culturas aeruginosa crecen bien sin
antibióticos (barra de color negro) o en presencia de 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales), 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).El lasI - mutante rhlI de PAO1 también fue incluido en el experimento, pero no produjo una concentración medible de ramnolípido (última ranura [ninguna columna-visi ble]).La concentración de ramnolípido en el cultivo sin tratar se ajusta igual a un valor de índice de 100. El gráfico está basado en el promedio de
los índices de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de Dunnett).
lasI - rhlI mutante.RCP y CFT también redujeron la elastasa actividad (Fig. 6). Quitinasa. Las actividades de quitinasa en los sobrenadantes de P. culturas aeruginosa PAO1 (no tratados o
cultivados con AZM, CPR, o CFT) y QS mutantes lasI - culturas rhlI se quan-tificado mediante la medición de la
degradación de la quitina azul.AZM y CPR reducción de la actividad quitinolítica de PAO1 casi hasta el nivel de que para
el lasI - mutante rhlI.CFT no disminuir la actividad quitinasa tanto como lo hicieron AZM y RCP, aunque todavía tenía un
efecto (Fig. 7).
El análisis de microarrays de ADN de la expresión génica en presencia de AZM, CFT, y CPR. Con el fin de
obtener el conocimiento de la mecanismo por el cual la producción del factor de virulencia fue alterada por la presencia de
los tres antibióticos, se realizó análisis de microarrays de ADN con P. culturas aeruginosa tratados con AZM, CPR, y
CFT en concentraciones que no afectan
FIG. 6. Actividades elastolíticas de sobrenadantes de cultivos PAO1 cultivaron hasta una DO 600 de 2,0, ya sea sin antibióticos (bar
negro) o en la presencia de: 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales) , 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).La actividad elastolítico del lasI - mutante rhlI de PAO1 también se muestra
(barra blanca).El gráfico está basado en los resultados medios de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de
Dunnett).
crecimiento. El medio con crecimiento exponencial P. culturas aeruginosa (OD 600, 0,1) se suplementó con cualquiera
AZM (2 y 8 g / ml), CFT (0,25 g / ml), o CPR (0,04 g / ml) o el medio se dejó sin tratar como un control.Mediante la
aplicación de las condiciones de crecimiento se describe en Materiales y Métodos, una DO 600 de 2,0 corresponde a la
transición de la fase exponencial a la fase estacionaria, y en este punto una fracción sustancial de genes regulados-QS
están regulados al máximo (inducido o re- presionado) (80). Por lo tanto, una DO 600 de 2,0 fue elegido como el punto de muestra para el análisis transcriptómica.ARN total fue extraído de las muestras y se sometió a síntesis de ADNc. Los valores absolutos de expresión de cultivos crecidos en
presencia de antibióticos se compararon con los de los cultivos tratados con la ONU, y se presentan los cambios en la
expresión. Como se ha descrito previamente (38, 89), se tuvieron en cuenta cambios en la expresión de menos de cinco
veces. Sonda fija Sólo que estaban presentes, como validado con Affymetrix GeneChip operativo sys-tem (versión 1.4) de
software, se incluyeron en los análisis. Ac-acuerdo con estos criterios, las concentraciones no inhibidoras del crecimiento
de AZM alterada la expresión de 477 (8 g / ml) y 323 (2 g / ml) genes, con la mayoría de genes (419 y 277,
respectivamente) se downregulated. Concentraciones no inhibidoras del crecimiento de
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FIG. 5. Actividades de proteasa de los sobrenadantes de P. aeruginosa cul-turas cultivan ya sea sin antibióticos (barras negro) o en
presencia de 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales), 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro ), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).El lasI - mutante rhlI de PAO1 también se incluyó en el experimento, pero no produjo una concentración medible de la proteasa (última ranura [columna no visible]).El gráfico está basado en los resultados medios de tres
experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (prueba de Dunnett).
FIG. 7. Actividades quitinasa de sobrenadantes de cultivos PAO1 cultivaron hasta una DO 600 de 2,0, ya sea sin antibióticos (bar
negro) o en la presencia de: 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales) , 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).La actividad quitinasa del lasI - mutante rhlI de PAO1 también se muestra
(barra blanca).El gráfico está basado en los resultados medios de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de
Dunnett).
V OL. 52, 2008 EFECTOS ANTIBIÓTICOS EN DETECCIÓN DE QUORUM EN P. AERUGINOSA 3653
TABLA 2. Efecto sobre la expresión génica
No. de genes No. de No. (%) de
genes Genes QS un
Especificidad Compuesto
(concentracion) downregulated
upregulated afectado
más que (%) B
cinco veces más que más que
cinco veces cinco veces
AZM (8 g / ml, 427 61 121 (70) 28
11 M)
AZM (2 g / ml, 227 49 81 (47) 35
2,7 M)
CFT (0,25 g / ml, 136 10 49 (28) 36
0,4 M)
CPR (0,04 g / ml, 223 58 89 (51) 40
0,1 M)
C30 c (2,5 g / ml, 260 0 125 (72) 48
10 mM)
un Genes pertenecientes a la regulon QS, tal como se define en otra parte (74).
b Especificidad está indicado por el número de genes reprimidos QS / número total de genes reprimidos.
c Los datos para el QSI furanona C30 se obtuvieron a una DO 600 de 2,0 y se incluyen para la comparación.Los datos provienen de un informe anterior
(38).
CFT (0,25 g / ml) y la RCP (0,04 g / ml) afectó a la expre-sión de 122 (114 reprimidos) y 271 genes (215 reprimidos),
respectivamente (Tabla 2).
AZM, CFT, y RCP afectan a la expresión de los genes regulados por QS. El regulón QS ha sido definido por (entre
otros) Rasmussen et al.(74). Genes que estudio en particular (74) considera que ser regulados por QS si sus niveles de
expresión en tanto lasI- rhlI y LASR - mutantes RHLR fueron alterados constantemente más de cinco veces en
comparación con los niveles de expresión en su homólogo de tipo salvaje.La mayoría de todos los genes regulados-QS
definidas de esta manera son inducibles con AHLs exógenos en un lasI - fondo rhlI.Sólo un gen (PA1556, un probable
citocromo c oxidasa subunidad) es upregulated constantemente tanto en la lasI - rhlI y la LASR - mutantes RHLR y es así
reprimible QS.El uso de este regulon QS, analizamos la frac-ción de los genes regulados por QS entre los genes
reprimidos por los tres antibióticos. Estos análisis mostraron que AZM (8 g / ml) reprimida 71% de los 174 genes QS-
regulada en P. aeruginosa PAO1 y que el 29% de todos los genes están reprimidos por AZM eran miembros de la
regulon QS.La reducción de la concentración de AZM a 2 g / ml provocó un alivio en la inhibición de QS de los genes
regulados (47% de todos los genes reprimidos QS), y el número total de genes downregulated cayó a 277, mientras que el-
dad específica hacia la QS regulon aumentó ligeramente a 30%. CPR tuvo la mayor especificidad para el regulón QS
(48%) y dirigido 49% de todos los genes QS en P. aeruginosa, mientras que la especificidad para CFT fue de 39% y
CFT reprimida sólo el 25% de todos los genes QS.Para la comparación, la especificidad de C30 fue del 48%, y el regulado
72% de todos los genes QS en P. aeruginosa (datos brutos de C30 son de un informe anterior [38] y han sido sometidos
al mismo tratamiento de datos y criterios que los datos en bruto para AZM, CFT, y RCP).Los efectos de AZM, CFT, y
CPR en la expresión de genes pertenecientes a la regulon QS se muestran en la Tabla 3.
Los datos de la matriz de ADN muestran que los miembros de la regulon QS están sobrerrepresentados entre los genes
reprimidos por sub-CIM de AZM, CFT, y RCP. Esto sugiere que estos antibióticos presentan alguna especificidad para
QS-regula la expresión génica a través de una interacción con o un efecto sobre QS regulador
componentes. La investigación de los perfiles de expresión de genes REG-ulados por LasR, RHLR o LasR-RHLR, que
tuvo como objetivo más para dilucidar el destino QS potencial (s) de los antibióticos. Los genes QS-regulada se pueden
dividir en cuatro grupos. Grupo A contiene 44 genes LasR-dependientes, es decir, genes downregulated tanto en un
mutante LASR y LASR - RHLR mutante.Grupo B consta de genes-RHLR dependientes (14 genes), es decir, genes
regulados tanto en un mutante RHLR y LASR - RHLR mutante.Grupo C comprende la fracción principal de QS-
regulados los genes (102 genes en total) y se compone de los genes que son downregu-RELAClONADAS en los tres tipos
de mutantes:. LASR, RHLR y LASR - RHLR Por último, el grupo D se compone de 14 LasR -RhlR-dependiente genes,
que sólo se downregulated si tanto LasR y RHLR son eliminados, como en el LASR - mutante RHLR.Curiosamente,
parece que AZM, CFT, y RCP tenían menos de una preferencia por los genes del grupo B (los genes RHLR específicos)
(Fig. 8).
A pesar de que todos los tres antibióticos exhiben un mayor grado de especificidad para los genes-LASR regulado que
para los genes RHLR-dependientes, ninguno de estos antibióticos downregulated los genes de la sintetasa de AHL. AZM,
sin embargo, causó la downregu-mento de siete veces LASR, que también puede contribuir al efecto de QSI AZM. Esto
está de acuerdo con la observación de que AZM (2 g / ml) ha sido reportada para disminuir el nivel de expresión de un
gen de fusión LASR :: lacZ (84).
Entre los genes afectados por AZM, CFT, y RCP, muchos codificar previamente identificado genes QS-regulados como
chiti-nase (Chic, PA2300) y la proteína de unión a quitina (CBPD, PA0852) (30, 80, 89).Otros genes conocidos QS-
inducidas, tales como los genes que codifican la proteína osmóticamente inducible (OSMC, PA0059) y citocromo c
oxidasa (coxAB y COIII, PA0105 a PA0108), son downregulated por la presencia de los tres antibióticos (38, 80).El gen
de PIV endoproteasa
(también conocido como prpl [PA4175]) también se downregulated por AZM, CFT, y RCP. Esta proteasa es capaz de
elastina degradantes, decorina, y la familia de la transferrina de las proteínas, incluyendo lactoferrina (92).PA5099 (un
transportador probable), que pertenece a la regulon QS, se downregulated más de 300 veces por AZM y CPR y 50 veces
por CFT. El regulón contiene sólo un gen, PA1556, que está reprimida por QS. Este gen, que codifica el citocromo c
oxidasa, se reguló por los tres antibióticos, y así fue el PA1557 gen vecino, un probable cito-cromo oxidasa
subunidad.Muchos de los genes de la región de PA2134 a PA2190 del genoma se downregulated por AZM, CFT, y RCP.
Esta región se ha encontrado que sea tan-ciado con crecimiento estacionario y estar bajo QS / rpoS con-trol (79, 80, 89,
90).De los 57 genes en esta región 60,69 kpb, 46 se encontró que estar presente en todos los arrays. De los 46 genes, 35
genes fueron reprimidos más de cinco veces por AZM y RCP. RCP y especialmente AZM parecía exhibir mayor objetivo
especí-ficities para genes QS que CFT, que está de acuerdo con los resultados de los ensayos de factores de virulencia
descritos anteriormente en esta sección. Muchos factores de virulencia QS-regulados, como la metaloproteinasa alcalina
(APRA, PA1249), la proteasa PfpI (pfpI, PA0355), la proteasa LASA (LASA, PA1871), elastasa B (lasB, PA3724), el
citotóxico lectina galactophilic (PA -IL; Leca, PA2570) y ramnolípido (rhlA y RHLB; PA3478 y PA3479,
respectivamente), fueron reprimidos más de cinco veces por AZM y RCP pero no por CFT. Estos resultados fueron
confirmados por RT-PCR, que demostró que AZM downregulated expresión rhlA 45 veces,
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TABLA 3.Efectos de la sub-CIM de AZM, CFT y RCP en P. aeruginosa genes
pertenecientes a la regulon QS una
Génica en
P. Regulació
n
Expresión
relativa
Gene ppR
b
b Reg
.
d Descripció
n
AZM AZM
aeruginos
a por AZM c CF
T RC
P LASL
-rhlI LASR-RHLR
LASR
RHLR
(2 g /
ml) (8 g /
ml)
PA0059 OSMC C
19.
8 63.
4 8.6 16.8 22.0 31.8 44.0 25.8 Proteínas osmóticamente
inducible OSMC
PA0105 coxB C 20.
0 25.
3 8.3 10.5 11.5 13.5 18.7 7.9 El citocromo c oxidasa, subunidad II
PA0107 C 91.
9 29.
0 11.0 17.0 17.4 14.1 18.6 11.4 Hipotética proteína
conservada
PA0108 colII C 14.
2 33.
8 13.2 12.2 27.8 8.5 15.8 6.3 Citocromo oxidasa,
subunidad III
PA0122 C 3.0 14.
2 1.5 2.9 44.8 26.1 7.1 6.0 Hipotética proteína
conservada
PA0188 C 2.9 32.
5 4.8 4.6 8.1 21.3 28.2 8.8 Hipotética proteína
PA0355 pfpl C 7.5 12.
5 3.6 6.6 11.8 21.5 17.7 11.6 Proteasa Pfpl
PA0567 C 9.2 22.
0 3.5 9.1 249.4 25.2 22.1 9.5 Hipotética proteína
conservada
PA0572 La 3.5 6.0 2.3 3.4 10.4 13.7 8.2 1.1 Hipotética proteína
PA0737 C 3.3 3.4 4.1 4.3 9.4 7.7 94.4 5.8 Hipotética proteína
PA0843 PLCR La 4.7 7.8 2.7 3.3 7.1 6.2 25.0 4.6 Proteína accesoria
fosfolipasa PLCR
7.0 35.
0 5.0 10.1 63.7 74.4 33.2 8.3
precursor
PA0852 CBPD C
Proteína precursora
CBPD vinculante
quitina-
PA0990 La 7.0 9.3 3.3 5.9 5.7 19.9 6.6 4.4 Hipotética proteína
conservada
PA0996 pqsA La 2.0 1.7 1.3 1.3 7.0 20.8 34.5 3.3 Coenzima A Probable
ligasa
PA0997 pqsB La 1.2 1.2 1.1 1.0 12.6 15.4 59.2 3.1 Homóloga a beta-ceto-
acil-acilo
1.3
1.1 8.2 13.9 29.9
proteína transportadora
sintasa
PA0998 pqsC La 1.2 1.2 2.8 Homóloga a beta-ceto-
acil-acilo
proteína transportadora
sintasa
PA0999 PQSD La 1.6 1.2 1.0 1.3 8.2 9.8 20.2 2.6 3-Oxoacyl- proteína
portadora de acilo
7.9 12.0 28.9
sintasa III
PA1000 pqsE La 2.1 1.1 1.4 1.3 3.6 Proteína de respuesta de
señal quinolona
PA1001 phnA La 1.9 1.0 1.0 1.6 6.6 9.7 20.9 3.2 Componente antranilato
sintasa I
PA1002 phnB La 1.5 1.1 1.2 1.3 7.3 5.2 6.3 5.5 Componente antranilato
sintasa II
PA1131 B 1.9 5.2 1.4 2.4 5.9 11.1 2.9 6.
6 Probables gran
superfamilia facilitadora
6.5 8.1 3.8 3.3 21.5 19.1 26.6 3.9
transportador
PA1168 La Hipotética proteína
PA1190 C 19.
2 26.
3 9.8 8.9 14.6 12.4 12.5 10.4 Hipotética proteína
conservada
PA1242 C 5.7 10.
1 5.5 18.7 19.6 21.3 6.7 9.2 Hipotética proteína
PA1249 ap D 23.
5 54.
2 3.5 5.3 7.3 8.4 4.1 2.7 Precursor de
metaloproteinasa alcalina
PA1250 Aprl D 1.2 1.5 1.1 1.5 9.7 5.5 3.0 1.0 Inhibidor de proteinasa
alcalina Aprl
PA1323 C 11.
2 35.
6 4.3 9.6 25.3 39.3 56.5 15.5 Hipotética proteína
PA1324 C 10.
5 23.
4 4.8 8.1 22.1 26.7 39.2 17.0 Hipotética proteína
PA1412 C 5.5 11.
2 22.3 7.0 5.7 5.6 8.8 6.6 Hipotética proteína
PA1431 Rsal La 2.6 2.2 1.3 2.2 3,619.
1 3,441.
9 3,038.0 1.9 Rsal proteína reguladora
PA1432 LASL La 1.9 1.2 1.8 1.7 97.0 133.1 39.0 1.5 Autoinductora síntesis de
proteínas Lasi
PA1471 C 4.5 5.8 2.0 2.9 7.8 5.6 10.3 9.7 Hipotética proteína
PA1556 C 15.6 17.
5 9.9 9.2 7.9 6.0 7.8 5.3 C citocromo oxidasa
subunidad probable
PA1625
C
Hipotética proteína conservada
3.7 5.1 3.7 7.4 6.6 9.0 6.5 5.5
PA1657 C 1.6 1.5 1.5 3.5 12.7 15.4 12.7 5.2 Hipotética proteína
conservada
PA1662 D 1.5 3.5 2.3 1.4 5.7 9.0 4.3 4.4 Probables ClpA / tipo B
proteasa
PA1664 C 1.6 2.4 1.3 1.1 5.2 11.0 15.5 8.7 Hipotética proteína
PA1665 La 1.1 2.7 2.5 1.1 5.6 46.9 15.1 2.8 Hipotética proteína
PA1667 La 1.5 4.1 1.1 1.1 5.5 5.1 5.0 3.1 Hipotética proteína
PA1669 B 6.3 2.8 2.0 1.4 28.6 12.7 3.8 10.3 Hipotética proteína
PA1784 La 5.5 14.
6 2.4 4.4 9.4 11.2 9.9 1.4 Hipotética proteína
PA1869 C 1.2 3.2 1.0 2.7 137.1 287.9 23.6 25.1 Proteína portadora de
acilo probable
PA1870 C 4.3 11.
8 6.9 4.8 22.0 12.7 8.8 13.8 Hipotética proteína
PA1871 Lasa C 10.
3 32.
9 2.9 9.0 105.4 147.8 31.3 7.1 Lasa proteasa precursora
3654 S
KIN
DE
RS
OE
ET
AL
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Un N
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ICR
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HE
MO
TH
ER
SE
ÑO
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S C.
Descargado de org.asm.aac por el 18 de octubre 2009
PA1874 La 7.8 9.3 6.0 6.6 8.0 6.4 7.9 1.9 Hipotética proteína
PA1875 La 7.5 16.7 12.3 20.5 34.2 9.0 6.7 1.1 Probables proteína de
membrana externa
1.4 27.6 3.1 4.1 21.8 25.3 19.1 51.2
precursor
PA1901 phzC2 C Biosíntesis de proteínas
fenacina PhzC
PA1902 phzD2 C 1.3 42.9 3.5 4.5 133.5 132.0 97.7 91.0 La biosíntesis de
proteínas fenacina PhzD
PA1903 phzE2 C 1.3 20.0 2.7 4.5 17.2 24.4 18.6 19.7 La biosíntesis de
proteínas fenacina PhzE
PA1904 phzF2 C 1.1 20.8 3.5 3.8 134.0 61.6 77.4 44.7 Biosíntesis fenacina
probable
proteína
PA1905 phzG2 C 1.2 15.9 2.6 4.4 14.1 32.7 20.8 30.0 Piridoxamina probable
5-fosfato
24.0 31.9 5.5 6.8 92.8 15.1 100.0 1.4
oxidasa
PA1914 La Hipotética proteína
conservada
PA2021 C 12.2 14.1 5.0 11.5 8.6 12.1 12.2 13.2 Hipotética proteína
PA2046 C 5.9 25.2 5.9 8.6 32.6 22.1 38.7 45.5 Hipotética proteína
PA2067 La 3.5 13.4 2.1 5.9 6.0 5.7 5.3 4.2 Hidrolasa probable
PA2068 C 3.2 13.4 1.8 5.5 8.5 19.4 18.5 25.0 Probables gran
superfamilia facilitadora
4.2 70.4 2.3 6.7 29.3 72.9 26.1 26.8
transportador
PA2069 C Transferasa carbamoíl
probable
PA2137 C 29.3 107.3 50.3 20.8 11.4 15.9 46.4 71.3 Hipotética proteína
PA2139 C 28.3 20.2 14.1 20.7 9.5 10.0 7.7 24.3 Hipotética proteína
PA2141 C 31.2 23.4 8.2 33.2 5.8 45.3 80.1 69.0 Hipotética proteína
PA2142 C 27.1 18.9 12.3 19.5 13.4 16.4 18.2 26.8
Probables
deshidrogenasa de
cadena corta
PA2143 C 82.1 43.2 23.0 42.5 67.1 60.1 191.3 83.7 Hipotética proteína
PA2144 glgP
La 11.0 22.1 6.9 7.4 7.3 20.8 11.4 4.8 La glucógeno fosforilasa
PA2146 C 8.5 11.4 8.0 7.4 6.9 10.8 15.5 9.7 Hipotética proteína
conservada
PA2148 La 5.3 8.0 4.5 5.5 8.1 8.1 6.4 4.0 Hipotética proteína
conservada
PA2149 C 6.7 10.6 4.5 12.3 6.3 7.0 39.5 11.2 Hipotética proteína
PA2151 C 47.9 71.1 11.2 13.5 39.3 124.4 41.2 30.6 Hipotética proteína
conservada
PA2153 glgB C 15.0 30.0 4.2 6.4 6.9 11.3 19.1 9.2 Enzima de ramificación
de 1,4-alfa-glucano
PA2158 C 23.8 68.3 12.3 43.9 65.0 10.3 35.9 52.4 Probable alcohol
deshidrogenasa (Zn
9.0 9.6 3.9 7.9 8.2 8.2 6.9 5.3
dependiente)
PA2163 C Hipotética proteína
PA2165 C 16.5 19.7 7.5 14.4 8.7 5.4 6.2 7.5 Glucógeno sintasa
probable
PA2166 C 15.8 19.0 6.7 14.8 15.4 38.5 24.4 19.2 Hipotética proteína
PA2167 C 11.0 86.2 7.4 18.1 8.7 8.1 7.1 15.4 Hipotética proteína
PA2170
C 4.1 5.1 3.1 8.6 8.2 14.1 5.4 6.5 Hipotética proteína
PA2171 C 10.1 9.9 7.0 21.7 27.6 109.9 58.6 22.5 Hipotética proteína
PA2176 C 50.5 112.3 10.0 14.8 19.2 25.2 30.0 12.0 Hipotética proteína
PA2178 D 7.0 3.6 3.6 21.9 11.2 6.3 4.3 4.9 Hipotética proteína
PA2184
C 5.0 6.7 4.7 7.3 15.5 13.9 17.5 20.8 Hipotética proteína
conservada
PA2190 C 13.3 60.5 6.3 11.3 17.0 14.9 9.9 6.9 Hipotética proteína
conservada
PA2193 HCNA B 3.5 1.5 1.7 1.4 262.2 256.6 3.0 9.1 El hidrógeno de cianuro
sintasa HCNA
PA2194 hcnB B 2.3 3.9 1.1 1.3 123.1 43.1 2.3 8.3 El hidrógeno de cianuro
sintasa HcnB
PA2195 HCNC
B 1.7 4.3 1.1 1.5 20.5 38.9 2.7 6.9 El hidrógeno de cianuro
sintasa HCNC
PA2300 elegante C 20.2 45.4 8.1 20.7 33.8 66.7 82.8 34.0 Quitinasa
PA2302 La 3.3 9.6 1.8 3.3 13.2 17.5 10.1 1.2 Péptido no ribosomal
probable
3.1 10.5 1.5 2.1 87.9 212.8 59.2 1.3 sintetasa
PA2303 La Hipotética proteína
PA2304 La 2.8 6.9 1.5 2.3 18.1 23.2 9.2 1.1 Hipotética proteína
PA2305 La 1.7 2.8 1.1 1.5 6.5 16.7 8.8 1.1 Péptido no ribosomal
probable
12.2 51.7 4.6 11.3 32.2 17.6 16.4 7.7
sintetasa
PA2414 C L -Sorbosone
deshidrogenasa
PA2415 C 5.1 8.6 2.9 6.4 13.8 9.3 9.2 5.2 Hipotética proteína
Continúa en la página siguiente V O
L. 5
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Descargado de org.asm.aac por el 18 de octubre 2009
TABLA 3 Continuación
Génica en
P.
Regulación
Expresión
relativa
Gene ppRb b
Reg. d
Descripción
AZM AZM
aeruginosa por AZM c CFT RCP
LASL-rhlI
LASR-RHLR LASR RHLR
(2 g /
ml) (8 g /
ml)
PA2423 La 1.2 1.2 1.1 1.6 5.8 5.9 7.6 1.6 Hipotética proteína
PA2433 C 25.6 70.7 6.4 24.8 25.9 67.3 70.0 32.8 Hipotética proteína
PA2485 C 7.9 8.1 2.3 7.0 12.0 18.0 15.5 12.3 Hipotética proteína
PA2486 C 9.3 18.4 2.3 4.5 8.9 10.6 8.5 5.7 Hipotética proteína
PA2566 La 4.2 6.8 1.1 3.3 9.6 7.1 6.3 1.7 Hipotética proteína
conservada
PA2570 Leca C 25.9 76.4 4.5 14.9 45.4 49.2 27.2 30.3 Leca
PA2587 pqsH La 1.6 2.1 1.6 2.3 46.1 36.1 20.4 1.3 FAD dependientes
probable mono
3.3 4.5 2.4 4.3 6.7 34.3 87.8 2.4
oxigenasa
PA2588 La Regulador transcripcional
probable
PA2591 D 1.1 1.2 1.1 1.3 7.1 14.8 2.2 1.1 Regulador transcripcional
probable
PA2592 D 1.3 1.2 1.4 1.1 6.7 17.9 3.8 1.6 Espermidina periplásmico
probable /
4.1 4.7 4.2 6.1 5.8 7.8 8.7 12.5
proteína de unión
putrescina-
PA2708 C Hipotética proteína
PA2747 C 3.8 7.2 2.6 7.7 32.6 37.3 37.5 10.3 Hipotética proteína
PA2751 C 3.4 4.4 2.4 4.3 8.5 7.0 10.3 6.0 Hipotética proteína
conservada
PA2754 C 5.0 9.2 2.4 3.5 11.5 7.3 9.1 5.4 Hipotética proteína
conservada
PA2777 C 4.4 26.5 4.6 10.1 8.4 6.2 10.5 8.9 Hipotética proteína
conservada
PA2873 D 1.2 7.8 1.3 3.1 13.2 5.8 1.6 1.3 Hipotética proteína
PA2937 C 23.3 45.2 5.2 13.2 6.9 8.6 9.1 5.4 Hipotética proteína
PA2939 La 10.6 38.6 3.5 6.5 39.8 9.1 12.7 1.8 Aminopeptidasa probable
PA3231 C 17.7 21.9 6.4 41.9 33.7 13.2 27.7 10.0 Hipotética proteína
PA3273 C 10.2 20.7 4.0 19.7 13.3 13.2 13.2 27.1 Hipotética proteína
PA3274 C 11.5 49.1 7.0 27.4 45.1 37.5 112.5 17.5 Hipotética proteína
PA3326 D 1.5 4.2 1.3 1.0 12.3 11.0 2.4 4.1 Probables dependiente de
ATP familia Clp
1.4 5.0 1.0
5.4 12.7 5.0 9.8
proteasa
PA3327 C 1.3 Péptido no ribosomal
probable
1.3 4.5 1.1 1.2 6.5 26.0 3.2 12.4
sintetasa
PA3328 B FAD dependientes
probable mono
3.8
54.9 173.5 6.1 69.3
oxigenasa
PA3329 C 1.3 1.9 1.3 Hipotética proteína
PA3330 B 4.3 1.1 1.7 1.3 62.4 179.6 4.4 19.5 Probables deshidrogenasa
de cadena corta
PA3331 B 1.1 4.1 1.8 1.6 19.8 62.0 3.8 23.8 Citocromo P450
PA3332 B 1.3 4.3 1.3 1.2 10.2 18.7 5.0 17.7 Hipotética proteína
conservada
PA3333 fabH2 B 1.3 7.4 1.0 1.2 17.0 33.4 4.1 10.4 3-Oxoacyl- proteína
portadora de acilo
3.8
42.8 17.4 5.1 11.2
sintasa III
PA3334 C 1.2 1.8 1.7 Proteína portadora de acilo
probable
PA3335 D 1.1 3.9 1.8 1.2 18.4 9.4 2.3 3.9 Hipotética proteína
PA3336 B 9.3 2.4 1.5 1.3 8.2 9.3 4.3 22.8 Probables gran
superfamilia facilitadora
1.4 12.3 1.6 2.5 22.4 28.9 13.2 15.3
transportador
PA3361 lecB C Lectina de unión a PA-IIL
fucosa
PA3369 C 7.1 11.9 4.2 12.7 19.9 42.2 36.5 14.2 Hipotética proteína
PA3370 C 12.9 26.1 8.7 37.1 39.0 66.4 87.1 31.2 Hipotética proteína
PA3371 C 6.7 11.7 7.4 18.8 23.8 51.7 69.2 25.7 Hipotética proteína
PA3460 La 12.9 28.0 2.0 3.2 5.0 6.0 7.0 4.7 Acetiltransferasa probable
PA3476 rhIL D 1.6 2.0 1.2 1.6 19.0 41.4 2.4 1.8 Autoinductora síntesis de
proteínas RHLL
PA3478 RHLB C 7.3 31.7 2.4 6.3 120.2 122.7 19.5 53.0 Ramnosiltransferasa
cadena B
PA3479 rhlA C 5.0 28.3 1.8 5.3 320.2 196.0 14.5 55.0 Una cadena de
ramnosiltransferasa
PA3520 C 3.7 8.9 2.7 4.4 28.3 18.3 13.9 7.4 Hipotética proteína
3656 S
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Descargado de org.asm.aac por el 18 de octubre 2009
PA3581 GlpF C 163.4 43.8 14.0 99.3 61.0 88.9 19.1 35.1 Proteína facilitador
captación glicerol
PA3584 glpD C 9.2 12.2 8.1 6.3 5.7 20.4 12.0 8.4 El glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa
PA3691 C 5.1 13.3 2.0 3.1 11.6 19.2 28.8 12.3 Hipotética proteína
PA3692 C 7.9 26.7 3.1 4.4 30.7 16.8 37.5 12.3 Probables proteína de
membrana externa
3.5 22.8 2.5 6.1 167.2 224.3 15.1 5.2
precursor
PA3724 lasB C Elastasa LasB
PA3734 C 5.0 9.3 3.5 4.9 7.2 21.3 6.6 8.5 Hipotética proteína
PA3788 La 4.7 6.5 2.7 4.8 9.2 5.8 6.1 4.0 Hipotética proteína
PA3819 C 3.5 5.0 3.7 3.6 6.3 7.0 9.7 7.1 Hipotética proteína
conservada
PA3888 La 2.5 3.2 2.1 3.5 5.8 10.2 10.5 4.6 Permeasa probable de
ABC transportador
PA3890 C 3.8 5.1 2.6 6.7 17.8 87.2 64.7 31.8 Permeasa probable de
ABC transportador
PA3904 La 1.9 1.5 1.5 1.6 68.3 40.7 172.1 1.0 Hipotética proteína
PA3906 La 1.1 1.2 1.2 1.1 7.5 176.5 9.5 1.4 Hipotética proteína
PA3907 La 1.4 1.1 1.2 2.0 5.8 13.4 5.2 1.0 Hipotética proteína
PA3908 D 1.0 2.6 1.5 1.2 6.2 49.8 4.5 1.1 Hipotética proteína
PA4078 * La 6.2 15.8 4.3 6.4 5.6 11.0 7.4 4.8 Péptido no ribosomal
probable
1.9 1.3
9.6 6.2 3.3
sintetasa
PA4130 D 1.4 1.1 1.5 Sulfito probable o nitrito
reductasa
PA4133 La 2.6 1.8 2.1 1.1 57.4 13.0 6.1 1.6 El citocromo c oxidasa
subunidad (cbb3
3.3 3.3 1.8 12.0 5.6 18.0 1.2
Tipo)
PA4134 La 1.9 Hipotética proteína
PA4139 La 9.2 11.6 4.3 3.2 6.1 10.2 7.0 4.2 Hipotética proteína
PA4141 C 2.0 12.2 1.1 1.6 73.1 105.0 27.6 57.6 Hipotética proteína
PA4142 C 2.1 11.7 2.1 4.2 27.2 71.7 25.6 26.4 Proteínas de secreción
probable
PA4143 C 2.6 14.4 2.1 3.4 8.1 15.3 7.3 9.0 Transportador de toxina
probable
PA4171 C 7.4 10.0 4.9 6.3 5.4 15.5 13.6 9.5 Proteasa probable
PA4175 prpl La 12.0 25.4 6.7 15.8 28.4 47.1 30.4 1.6 PVDS reguladas
endoproteasa, lisil
10.8 1.9 1.9 9.8 18.8 11.9 7.5
clase
PA4209 phzM C 1.8 -Fenacina específica
probable
1.0 11.8 2.3 5.6 65.1 123.9 79.7 20.2
metiltransferasa
PA4210 phzA1 C Biosíntesis fenacina
probable
15.5 2.2 2.3 51.0 61.2 59.7 46.1
proteína
PA4211 phzB1 C 1.4 Biosíntesis fenacina
probable
9.6 2.2 2.2 11.4 12.9 8.9 10.9 proteína
PA4217 phzS C 1.4 Flavin que contienen
mono-oxigenasa
PA4290 C 23.4 19.0 26.8 25.3 7.2 6.0 14.2 15.9 Transductor quimiotaxis
probable
PA4345 C 5.3 7.4 3.9 6.9 10.6 9.1 7.7 6.6 Hipotética proteína
PA4377 La 13.9 12.2 3.5 6.2 10.1 7.0 7.8 3.2 Hipotética proteína
PA4677 La 6.8 4.2 3.1 5.1 17.0 40.0 22.5 1.1 Hipotética proteína
PA4738 C 6.8 22.5 5.2 11.5 39.6 54.4 58.1 16.6 Hipotética proteína
conservada
PA4739 C 4.8 12.9 3.4 5.7 34.3 34.3 43.8 16.6 Hipotética proteína
conservada
PA4876 osme C 5.3 10.4 3.4 4.8 18.2 9.1 10.8 6.7 Lipoproteína
osmóticamente inducible
6.8 17.3 4.5 4.4 6.0 29.6 12.9 12.9
Osme
PA4880 C Bacterioferritina probable
PA5097 D 4.2 18.2 12.5 5.8 9.5 5.2 3.4 4.8 Permeasa de aminoácidos
probables
PA5099 C 188.0 353.2 54.1 450.6 16.2 14.7 40.5 39.9 Transportador probable
PA5212 C 3.1 5.6 1.7 2.5 8.8 8.7 12.1 5.7 Hipotética proteína
PA5220 B 2.1 5.5 1.7 2.3 7.7 8.9 4.2 6.9 Hipotética proteína
PA5235 GLPT B 4.3 2.7 2.6 5.0 15.2 32.4 2.8 13.9 Transportador de glicerol-
3-fosfato
PA5297 poxB D 3.1 9.4 2.0 3.5 17.8 6.0 3.8 2.8 Piruvato deshidrogenasa
(citocromo)
PA5480 B 10.6 2.6 1.0 4.2 14.2 19.9 2.5 6.1 Hipotética proteína
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Descargado de org.asm.aac por el 18 de octubre 2009
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b c d
Regulación byAZM c
b
Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.
mientras que la RCP y CFT reducen el nivel de expresión rhlA de 10 y 3 veces, respectivamente.
AZM, CFT, y CPR alterar la expresión de una variedad de genes. A pocos genes se upregulated consistentemente
por AZM, CFT, y RCP. El genes reprimibles QS PA1556 (cito-oxidasa subunidad cromo c) y PA1557 se indujeron más
de cinco veces.PA2260 (una proteína hipotética previamente identificados [89] para ser un gen represible QS) fue
inducida por AZM y CFT pero no por RCP.
Varios genes fueron inducidos solamente por AZM. Una alta proporción-ción de estos genes han previamente también
ha informado de que AZM inducible (60), aunque hubo una serie de diferir-cias en el montaje experimental entre el
estudio y el estudio anterior (60). Por ejemplo, el estudio anterior (60) utiliza la P. aeruginosa PAO1 cepa DSM 1707 en
lugar del P. aeruginosa cepa PAO1 del Pseudomonas genética Stock Center utiliza aquí.Por otra parte, el estudio de
Nalca et al. (60) también aplicó el medio de infusión cerebro corazón complejo y rico en vez de medio mínimo. Muchos
de los genes inducidos por subunidades ribosomales codifican AZM, tales como PA3742 (RPL) y PA4671 (proteína
ribosomal probable).La sobreexpresión de genes ribosomales puede ser un mecanismo que compensa el efecto de AZM,
que apunta a la subunidad ribosomal 50S. El factor de iniciación de
INFA (PA2619) también se indujo en la pres-cia de AZM, de acuerdo con los resultados anteriores (60).De acuerdo con
los resultados de dos estudios recientes (12, 53), se encontró que la RCP induce la expresión de los genes pyocin S
(PA0985 para pyocin S5, PA1150 para pyocin S2 y PA3866 para el pyocin proteína S3-like). Los piocinas de tipo S son
bacteriocinas sensibles a la proteasa y tienen estructuras colicina similares y modos de acción.
El factor de modulación ribosoma (RMF, PA4296) fue re-presionado por AZM pero no se vio afectada por el
tratamiento con CFT o CPR. Análisis del transcriptoma anteriores (60) también mostraron que rmf es reprimida por AZM.
El rmf de P. aeruginosa muestra alto grado de homología con el rmf de E. coli (similitud, 66%). rmf mutantes de E. coli
se ha demostrado que poco a poco pierden su viabilidad en cultivos de fase estacionaria (61); Sin embargo, un estudio
reciente concluyó que rmf (en E. coli) puede ser necesaria sólo en condiciones de crecimiento de la competencia (13).
AZM induce la expresión de genes relacionados con T3S. En Accor-dance con los resultados anteriores (60),
también encontramos que AZM induce la expresión de genes implicados en la secreción de tipo III (T3S).P. aeruginosa
utiliza su sistema T3S para entregar varios productos citotóxicos en el citosol de las células eucariotas.La expresión de
T3S incrementa la patogenicidad de P. aeruginosa y se asocia con infecciones más graves y mayores tasas de mortalidad
en modelos animales (1, 75, 78).QS se ha demostrado que modulan negativamente la expresión del sistema T3S en P.
aeruginosa (10), lo que significa que el sistema T3S es downregu-RELAClONADAS bajo condiciones de alta densidad
celular y por lo tanto presumiblemente juega un papel principalmente en las primeras etapas de la infección.Los genes en
el sistema T3S, como PA1700 y PA1701 (hipotético proteínas conservadas en T3S), pcrGV (regulador PA1705 en T3S y
PA1706), exsB (PA1712, S exoenzima síntesis de proteínas B), exsD (PA1714, parte de la JCSP a pscl operón), y la
proteína aparato de exportación pscBCEO (PA1715, T3S; PA1716, T3S proteína de membrana externa; PA1718,
proteína de exportación T3S; PA1696, proteína de translocación en T3S), se upregulated por
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FIG. 8. LASR, RHLR y LasR-RHLR especificidades de AZM (barras blancas), CFT (barras negras), CPR (barras de color gris claro) y
C30 (barras de color gris oscuro). Ver el texto para las definiciones de los grupos (Gr.) A, B, C, y D.
AZM. Ni CFT ni CPR, sin embargo, inducida por los genes en el grupo de genes sistema T3S de PA1690 a PA1725.
AZM, CPR, CFT, y la pprAB sistema regulador de dos componentes. El PA4290 transductor quimiotaxis inducida
QS-era downregulated por AZM, CFT, y RCP. AZM y RCP también reprimieron la parte principal de los genes en la
región de PA4290 a PA4306.Muchos de estos genes se ha demostrado en estudios previos para ser regulados por QS. En
esos estudios, los genes QS fueron identificados por la cartografía de genes downregulated en lasI - mutantes rhlI y
restaurados a niveles de tipo salvaje por adi-ción de moléculas de señal (38, 80, 89).El sistema de dos componentes
pprAB reg-lador (PA4293, PA4296) se downregulated por AZM y CPR pero no por CFT. PPRA se downregulated 16 y 6
veces por AZM y CPR, respectivamente, y ppRb el regulado 10 y 5 veces por AZM y RCP, respectivamente.Estos
resultados obtenidos por el análisis de microarrays de ADN fueron con-se afirmaron por RT-PCR, que mostró que AZM
reduce los niveles de PPRA y ppRb expresión 19 y 15 veces, respec-tivamente, mientras que la RCP downregulated el
nivel de PPRA expres-sion 11 -fold y el nivel de expresión ppRb 18 veces.RT-PCR confirmó también que el efecto de
CFT en la expresión pprAB era insignificante.
Soporte de AZM, CFT, y RCP en contra del LBD de la proteína LasR. Con el fin de explorar la posibilidad de que
AZM, CFT, y RCP interactúan directamente con la proteína LasR, se realizó in silico de acoplamiento de los tres
antibióticos con el LBD recientemente publicado de la proteína LasR (11).Ninguno de los tres antibióticos dio una
puntuación alta afinidad en el acoplamiento ex perimento. Por el contrario, se informó anteriormente compuestos QSI (por
ejemplo, C30, patulina, furanona, y 4-nitropyridine- N-óxido) marca ex-prohibida alta afinidad (Tabla 4).El análisis in
silico indica que AZM, CFT, y CPR no encajan dentro de la cavidad sitio-ción se unen de LasR debido a que presentan
enfrentamientos estéricos con el objetivo de proteínas. Esto sugiere que los efectos de AZM, CFT, y CPR en QS puede ser
debido a un mecanismo de acción distinto de una interacción directa con la proteína LasR.
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se presentan los resultados de la-ción de pantalla de 12 antibióticos para la actividad QSI
obtenido con QSIS1. Tres de los 12 antibióticos, AZM, CFT, y RCP, mostró fuertes resultados positivos en el sistema de
selección y se investigaron más por sus efectos sobre la producción de factores de virulencia en P. aeruginosa.AZM,
CFT, y RCP exhibir diversa
mecanismos de acción antimicrobiana y son estructuralmente muy diferente. Por tanto, es intrigante que los tres
antibióticos eran activos en QSIS1. Tanto CFT y piperacilina son lactámicos que se dirigen a la proteína de unión a la
penicilina (PBP 3 3); sin embargo, sólo CFT mostró que la actividad real en el sistema de cribado QSI, lo que indica que
la actividad QSI es probable que no PBP 3 dependiente. Nos preocupamos-totalmente seleccionaron las concentraciones
de los tres antibióticos que no tenían ningún efecto sobre el crecimiento. Nuestra experiencia de la proyección de un gran
número de compuestos a partir de bibliotecas de compuestos es que los compuestos tóxicos o inhibidores del crecimiento
pueden mostrar-QSI como ac-actividades (observaciones no publicadas). Esto es probable que sea causada por efectos
similares al estrés en lugar de "true" actividad QSI (tal como una interacción con el receptor de QS), ya que el efecto
sobre la QS-expresión de genes controlados desaparece cuando la concentración del compuesto se reduce a un nivel que
permite que las bacterias para alcanzar la tasa de crecimiento óptimo en un medio dado. Además, más, ya que la
obstrucción de la QS (ya sea por mutación o por las drogas antagónicas) no inhibe el crecimiento, consideramos que es
esencial para investigar las posibles actividades QSI de los tres antibióticos en condiciones que no afectan el crecimiento.
Cuando se administraron a tales concentraciones, AZM, CPR, y CFT inhibieron la producción de la virulencia importante
factores de quitinasa, proteasa, y la elastasa y la producción de la hemolisina ramnolípido estable al calor. Nuestra reciente
de datos sug-gest que ramnolípido funciona como un escudo para proteger contra las biopelículas el comportamiento
depredador de los neutrófilos, y ramnolípido pueden así ser un factor de virulencia pivote (45). Las investigaciones han
demostrado que los biofilms de P. mutantes aeruginosa QS han reducido la tolerancia a los antibióticos en comparación
con la de sus padres de tipo salvaje, y la inhibición de QS ha sido demostrado para promover la erradicación de
biopelículas por tratamientos antimicrobianos y hacer que el biofilm más susceptibles a la fagocitosis por los neutrófilos
(20, 38, 73 ).Ramnolípido y la lectina adhesiva Leca se downregulated más de cinco veces por AZM y RCP. Ambos
productos están regulados por QS y están involucrados en la biopelícula mat-ración (19, 23, 52, 65). La represión de estos
genes puede con-contribuir al desarrollo de la biopelícula sensible menos estructurado y más antibiótico visto en mutantes
QS. Por otra parte, se ha informado de rh-amnolipid y lectina Leca tener efectos cito-tóxicos en células de mamíferos,
incluyendo los neutrófilos y macrófagos, y también son importantes en la P. proceso aeruginosa en infecciosa (5, 45, 57,
58, 81, 82, 95).
Otro componente importante de virulencia de P. aeruginosa es el sistema T3S, que está regulada negativamente por
QS en P. aeruginosa.Los datos de microarrays de ADN presentados aquí sugieren AZM que aumenta el nivel de
expresión de genes T3S, en
TABLA 4. En silico de acoplamiento
Nombre del ligando Puntuación
Rerank OdDHL (plantilla) ..............................................
....................... 107.3
3-Oxo-C 12 ............................................ .......................................... 94.5 2-Heptylthioacetyl homoserina lactona .................................... 88.8 BHL .................................................
.............................................. 82.2 La patulina .................................................
.......................................... 69.8 4-N-óxido Nitropyridine- ........................................... ................... 62.9 C30 .................................................
............................................... 50.4 RCP .................................................
.............................................. 317.3 CFT .................................................
.............................................. 373.5 AZM .................................................
............................................. 3,316.2
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acuerdo con las propiedades inhibidoras de QS-AZM re-portado aquí y por otros. Curiosamente, un estudio anterior (50)
mostró que el tratamiento de P. aeruginosa con sub-CIM de mac-rolides (AZM, claritromicina, eritromicina) anteriores
al desafío en-intranasal de ratones mejora de forma significativa la tasa de mortalidad (de 0% a 80 a 100%).En el mismo
estudio, sin embargo, los antibióticos macrólidos también fueron administrados a ratones después de la inoculación de P.
aeruginosa PAO1, y en ese caso, la tasa de mortalidad entre los ratones no aumentó (50).Por lo tanto, parece que la
activación de genes por los macrólidos causa virulencia mejorada sólo si los macrólidos se aplican de forma profiláctica y
no como una parte del tratamiento. Sin embargo, el riesgo potencial, junto con los beneficios potenciales, de la inducción
de la virulencia y la citotoxicidad a través del sistema T3S debe ser considerado cuando los pacientes infectados con P.
aeruginosa son tratados con AZM (y posiblemente otros macrólidos).
Como se mencionó anteriormente, el sistema de dos componentes regulador de pprAB (PA4293 y PA4296,
respectivamente) se downregulated más de cinco veces por AZM y RCP pero no por CFT; Estos resultados fueron
confirmados por RT-PCR. La expresión de pprAB ha demostrado ser regulada por QS (80, 89), pero los productos de los
genes también se han identificado a tener actividades que Ulate QS-mod, que representan todavía otro sistema
autofeedback de QS en P. aeruginosa (25).El golpe de gracia de ppRb conduce a afluencia reducida de la P.
aeruginosa QS señal OdDHL, por lo tanto globalmente influir en la expresión de genes regulados QS (25); pero ppRb
también está involucrada en la regulación de la sensibilidad a los antibi-antibióti-.La sobreexpresión de los resultados en
el aumento de ppRb-dad sensitiv a los antibióticos, especialmente aminoglucósidos, probablemente debido a una
disminución de la permeabilidad de la membrana (91).En vivo y en estudios in vitro han demostrado que P. aeruginosa
desarrolla aumentando tol-rancia a los aminoglucósidos tras el tratamiento previo con estos antimicrobianos (18, 47,
93).Curiosamente, las células de P. biofilms aerugi-nosa expuestos a sub- y Concentra-ciones suprainhibitory de CPR
han también recientemente se han demostrado para mostrar aumento de los niveles transitorios de resistencia a la RCP
(64).Nos Spec-Ulate que el mecanismo subyacente por el cual AZM y RCP (y quizás también CFT) ejercen su acción
sobre QS es por medio de una respuesta adaptativa que regula a la baja y por ppRb-quizás también otros reguladores o
transportadores de membrana, como PA5099.Esto hace que la permeabilidad de la membrana para disminuir,
proporcionando de ese modo las células con protección transitoria contra los efectos tóxicos de los antibióticos. Sin
embargo, al mismo tiempo, la permeabilidad de la membrana inferior disminuye el nivel de afluencia OdDHL, lo que
resulta en una reducción en los niveles de expresión de genes regulados-QS. El apoyo a esta hipótesis se puede encontrar
en la observación de que los tres antibióticos tienen mayores Spec-ificities para genes -regulated las que los genes -
regulated BSR (grupo B).La molécula señal rhl BHL es capaz de difundir libremente sobre la membrana y es, a diferencia
de OdDHL, no depende de transporte activo.
Un estudio anterior (25) identificó 53 genes que se redujeron reguladas más de cinco veces por una inserción Tn 5 en
ppRb. En comparación, tal como se describe en el presente informe, se encontró que los niveles de expresión de 38 de
esos ppRb -regulated genes que fueron regulados a la baja más de cinco veces en el estudio mencionado anteriormente
(25) se redujeron a la mitad de ese nivel o menos en presencia de AZM. Esto incluye 21 genes que se downregulated más
de cinco veces.Encontramos que la RCP el regulado 23 de los 53 genes más del doble, incluyendo 6
FIG. 9. Los inhibidores de la y moléculas de señal para P. aeruginosa QS. (A) N-óxido 4-Nitropyridine- (73); (B) C30 (38); (C) 2-
heptylthioacetyl homoserina lactona (69a); (D) 3-oxo-C 12 -2-aminofenol (83a); (E) BHL; (F) la patulina (74); (G) OdDHL.
genes que se downregulated más de cinco veces. CFT causó una regulación a la baja de 15 de los 53 genes downregulated
por la mutación ppRb, pero ninguno de los genes se-RELAClONADAS downregu más de cuatro veces.Los genes
reportados a ser afectados por ppRb incluyen genes de factores de virulencia como lasB, rhlAB, Leca, y prpl (25), que
también se downregulated por AZM y RCP. Los niveles de expresión de la QS transcripcional regu-lador RHLR y los
genes sintetasa AHL Lasi y rhlI también se redujeron por el JP-knockout mutación (25).Esto no es sorprendente, ya que
la BSR está subordinado al sistema de las y los genes sintetasa AHL están bajo control QS, que puede proporcionar una
retroalimentación negativa que aumenta el efecto QS-represoras de la mutación ppRb.
Se espera que QSIs construido con andamios AHL para enlazar con el homólogo LuxR sin activarlo, bloqueando así la
unión y la activación por AHLs. Por lo tanto, estos QS Antago-agonistas tienen un alto grado de similitud estructural con
AHL. Otros QSIs que comparten el (5 H) -furanona fracción 2, tales como las furanonas halogenados que ocurren-nat
ural, y las micotoxinas pat-Ulin y ácido penicillic parecen ejercer sus efectos por-destabi lizing LuxR y induciendo con
ello la rotación de QS proteínas reguladoras (56, 74).La Figura 9 muestra las estructuras de BHL, OdDHL, y compuestos
QSI previamente publicados.
Los tres antibióticos AZM, CFT, y CPR son estructuralmente muy diferente de todos QSIs descrito hasta ahora; por
otra parte, al igual que muchos otros antibióticos, son moléculas muy voluminosas (Fig. 10). En silico de acoplamiento de
AZM, CFT, y CPR a la LBD de la proteína LasR mostró que los antibióticos tienen una baja afinidad para el sitio receptor
LasR, debido principalmente a penas espaciales. Esto apoya la idea de que estos antibióticos pueden ejercer sus efectos
reguladores QS a través de mecanismos diferentes de los de la otra QSIs, abriendo así nuevas e interesantes posibili-dades
para la terapia de combinación con QSIs con diferentes modos de acción. La utilidad de la combinación de QSIs y
compuestos bactericidas-tradi cional ha sido demostrado por varios experimentos in vitro (20, 38, 74). La comprensión de
la doble línea de acción algunos antibióticos 'puede tener el potencial de
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FIG. 10. Estructuras de los tres antibióticos investigados para el potencial de percepción de quórum de actividades inhibidoras. (A)
AZM; (B) CFT; (C) RCP.
añadir además a terapias contra los agentes patógenos en la que el elemento clave atenúa en lugar de mata directamente
las bacterias. Esta estrategia tiene por objeto permitir que el sistema de defensa del huésped para eliminar las bacterias
atenuadas. La mayoría de los antibióticos se originan a partir de fuentes naturales, tales como los microorganismos del suelo, o son
derivados de compuestos procedentes de la naturaleza. Un punto de vista general ha sido que los efectos de eco-lógico de
los antimicrobianos en el medio ambiente es luchar contra los competidores. Sin embargo, las concentraciones de
antibióticos libres en el suelo es probable que sean muy por debajo de los PRM.
Como se describe en este documento y por otros (53, 94), sub-MIC de antibióticos pueden tener diversos efectos sobre
las bacterias que son totalmente diferentes a los efectos de dosis altas; por ejemplo, pueden mejorar la formación de
biopelículas, alterar los patrones de motilidad, aumentar la citotoxicidad, y provocar cambios en la expresión de factores
de virulencia (39, 53, 60). Se ha sugerido que los antibióticos en la naturaleza pueden funcionar como señales
intermicrobial no como balas destinadas a matar a los enemigos para defender nichos o los alimentos (53). Esta hipótesis
ofrece una explicación evolutiva de por qué algunos antibióticos pueden ser capaces de inter-sufri- con la expresión de
genes controlados por el QS. De acuerdo con los resultados presentados en el presente informe, se ha demostrado
recientemente que OdDHL (y otros 3-oxo-AHL), así como su producto de degradación del ácido tetrámico exhibe
actividades contra bacterias gram-positivas (48), lo que sugiere que la señal topo-cules, como algunos antibióticos, poseen
actividades duales. Además, más, nuestros datos sugieren que los antibióticos que funcionan para abajo-regulan QS en P.
aeruginosa puede administrarse en sub-MICs (donde hay una presión de selección reducido para la unificación de
desarrollar resistencia) para bloquear QS y con ello atenuar la actividad del patógeno.Tales propiedades interesantes
destacan el enorme potencial inexplorado de la utilización de compuestos derivados de los andamios naturales en la
búsqueda de nuevos fármacos con una variedad de objetivos (es decir, antimicrobianos multifuncionales). Parece que no
hemos explorado y explotado el po-tencial de las drogas que hoy conocemos.
Las actividades duales de algunos antibióticos (por ejemplo, AZM, CFT, y RCP, investigado aquí) puede ayudar a
explicar por qué CFT ha demostrado ser superior a la comparada, regímenes de antibi ótica antipseudomonas para los
pacientes con FQ en el centro CF danés (69). Se debe tener cuidado, sin embargo. El cambio posterior al CFT como el
antibiótico antipseudomónica predominante en el centro danés CF llevó a la propagación de la epidemia de una cepa
nonmucoid-multiresis tante (68). Un estudio anterior (35) mostró que la sub-CIM de antibióticos pueden todavía modular
la transcripción pat-charranes en los miembros de la flora humana beneficiosos, causando una
variedad de efectos no deseados. Asimismo, se ha demostrado que el uso a largo plazo de AZM por pacientes con CF y P.
crónica
infecciones aeruginosa pueden provocar resistencia a los macrólidos en Staphylococcus aureus en estos pacientes
(87).Esto pone de relieve la exigencia de un mayor desarrollo de QSIs sin bactericida clásica o actividad bacteriostática.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por becas de la ev alemán Mukoviszidose, Deutsche Forschungsgemeinshaft, y el Consejo Danés de
Investigación (STF concesión no. 2052-03-0013) para MG
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