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Page 1: Determinación de las características aromáticas de

Universidad de La Salle Universidad de La Salle

Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle

Ingenieriacutea de Alimentos Facultad de Ingenieriacutea

1-1-2009

Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de

Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten

de Dalmacia Croacia de Dalmacia Croacia

Diana Rociacuteo Urrea Blanco Universidad de La Salle Bogotaacute

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DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS

AROMATICAS DE BrettanomycesDekkera AISLADO

EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

DIANA ROCIO URREA BLANCO

UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD

TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF

TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES

BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA

2009

DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE

BrettanomycesDekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

DIANA ROCIO URREA BLANCO

Trabajo de grado para optar al tiacutetulo de Ingeniera de Alimentos

Asesores de investigacioacuten

LEO GRACIN

PhD Senior Scientific Assistant

PATRICIA CHAPARRO GONZALES

Ingeniera de Alimentos

UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD

TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF

TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES

BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA

2009

CONTENIDO

paacuteg

RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8

1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10

11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10

111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12

112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12

113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13

12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13

121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16

132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21

14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21

15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23

151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24

152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25

16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE

BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27

2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29

3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31

4

4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32

41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32

42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32

5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33

6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34

7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39

711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39

712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42

721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42

722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE

LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44

731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44

732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO

BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46

741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46

742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55

5

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL

VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE

ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

SOLIDO 82

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO

DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE

AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL

METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al

dioxido de azufre en vinos

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alternativas-al-dioxido-de-azufre-en-el-vino

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999

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AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de

levadura para la inactivacioacuten de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los

91

olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu

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A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe

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E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de

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Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en

fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 2: Determinación de las características aromáticas de

DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS

AROMATICAS DE BrettanomycesDekkera AISLADO

EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

DIANA ROCIO URREA BLANCO

UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD

TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF

TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES

BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA

2009

DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE

BrettanomycesDekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

DIANA ROCIO URREA BLANCO

Trabajo de grado para optar al tiacutetulo de Ingeniera de Alimentos

Asesores de investigacioacuten

LEO GRACIN

PhD Senior Scientific Assistant

PATRICIA CHAPARRO GONZALES

Ingeniera de Alimentos

UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD

TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF

TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES

BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA

2009

CONTENIDO

paacuteg

RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8

1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10

11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10

111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12

112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12

113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13

12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13

121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16

132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21

14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21

15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23

151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24

152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25

16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE

BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27

2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29

3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31

4

4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32

41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32

42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32

5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33

6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34

7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39

711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39

712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42

721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42

722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE

LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44

731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44

732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO

BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46

741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46

742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55

5

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL

VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE

ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

SOLIDO 82

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO

DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE

AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL

METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de

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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 3: Determinación de las características aromáticas de

DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE

BrettanomycesDekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

DIANA ROCIO URREA BLANCO

Trabajo de grado para optar al tiacutetulo de Ingeniera de Alimentos

Asesores de investigacioacuten

LEO GRACIN

PhD Senior Scientific Assistant

PATRICIA CHAPARRO GONZALES

Ingeniera de Alimentos

UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD

TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF

TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES

BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA

2009

CONTENIDO

paacuteg

RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8

1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10

11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10

111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12

112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12

113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13

12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13

121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16

132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21

14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21

15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23

151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24

152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25

16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE

BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27

2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29

3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31

4

4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32

41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32

42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32

5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33

6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34

7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39

711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39

712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42

721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42

722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE

LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44

731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44

732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO

BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46

741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46

742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55

5

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL

VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE

ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

SOLIDO 82

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO

DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE

AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL

METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de

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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 4: Determinación de las características aromáticas de

CONTENIDO

paacuteg

RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7

INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8

1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10

11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10

111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12

112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12

113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13

12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13

121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16

132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21

14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21

15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23

151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24

152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25

16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE

BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27

2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29

3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31

4

4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32

41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32

42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32

5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33

6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34

7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39

711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39

712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42

721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42

722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE

LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44

731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44

732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO

BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46

741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46

742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55

5

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL

VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE

ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

SOLIDO 82

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO

DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE

AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL

METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en

fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 5: Determinación de las características aromáticas de

4

4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32

41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32

42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32

5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33

6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34

7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39

711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39

712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42

721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42

722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE

LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44

731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44

732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO

BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46

741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46

742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55

5

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL

VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE

ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

SOLIDO 82

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO

DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE

AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL

METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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beer flavor J Inst Brew 1961

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levadura para la inactivacioacuten de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los

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Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en

fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 6: Determinación de las características aromáticas de

5

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL

VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE

ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

SOLIDO 82

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO

LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO

DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE

AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL

METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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beer flavor J Inst Brew 1961

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Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en

fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 7: Determinación de las características aromáticas de

6

RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de

la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de

medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y

AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de

esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20

grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida

(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como

antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como

precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza

en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y

liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado

diariamente micro y macroscoacutepicamente

Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura

BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron

monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de

azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una

concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del

comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se

evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las

muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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beer flavor J Inst Brew 1961

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AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de

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Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en

fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de

Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y

sincero

A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional

A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa

A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por

ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal

A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y

colaboracioacuten oportuna

A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las

alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)

A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el

maravilloso paiacutes de Croacia

A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme

tan maravillosas personas en mi camino

Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me

and give me the opportunity to meet so many wonderful people

To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo

To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology

and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the

project and learn a lot more

To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija

Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to

meet in this great trip) for give me the best of your hearts

I only have one thing to say hellipTHANK YOU

Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS

  • Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
    • Citacioacuten recomendada
      • TESIS
      • GRACIAS
Page 8: Determinación de las características aromáticas de

7

ABSTRACT

This experiment presents the development and testing of a simple way to detect

BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid

phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red

wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective

enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as

carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces

ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a

precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar

compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine

contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection

also with the liquid medium

A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies

and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no

addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of

them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in

following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this

wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic

and chemical analysis before addition and 15 days after

8

INTRODUCCION

Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que

reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia

formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por

Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1

Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la

industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria

enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente

Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero

Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken

1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha

sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos

contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura

BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El

crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas

ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3

1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew

1961

2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996

3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from

hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast

9

El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes

entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y

ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-

etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino

como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como

acido salado amargo o picante 4

Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute

asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos

nitroacutegenos vitaminas y minerales

Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con

el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura

alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4

etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser

tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg

4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos

10

1 MARCO TEORICO

Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la

industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea

imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de

levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva

o negativamente5

Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican

basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos

morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en

medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo

en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas

fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un

determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de

nitroacutegeno como los nitratos6

11 REPRODUCCION

Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como

Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas

5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture

World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm

11

representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su

tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten

vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula

madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo

bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente

entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria

para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la

replicacioacuten7

Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un

valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino

se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8

La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula

progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto

perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto

una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto

pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha

llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando

el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los

aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas

respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre

y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la

gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y

ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se

completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula

madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de

7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States

of America

8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures

edi Springer second edition Fresno California United States of America

12

24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en

sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9

111 Gemacioacuten multilateral

La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre

la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las

levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se

reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular

ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales

replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la

fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es

BrettanomycesDekkera10

112 Gemacioacuten Polar

A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o

dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en

ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11

113 Fisioacuten

Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la

formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los

casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular

ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12

9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y

fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml

10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic

Publishers GmbH United States of America and Canada

13

114 Pseudomycelium

Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de

una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de

las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija

de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea

dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son

levaduras 13

12 TAXONOMIA

Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no

los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente

la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente

diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son

DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima

Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida

colliculosa 14

Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten

de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema

informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas

Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo

tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto

de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula

Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son

llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en

13

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

14

la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque

esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna

forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El

teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras

presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15

Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son

asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la

principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras

fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas

levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en

presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a

deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de

peliacuteculardquo16

121 DekkeraBrettanomyces

La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos

antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que

Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero

Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B

anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17

Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B

lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo

que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este

geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)

15

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4

th Edition Amsterdam

Holanda

17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

15

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman

respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma

perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus

y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la

especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B

bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega

estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces

como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a

DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el

vino18 y 19

La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con

gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de

este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19

18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

19

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

16

Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de

tamantildeo celular b) forma filamentosa

Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia wwwacenologiacom

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen

mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia

fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy

lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre

todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas

de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo

suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil

limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso

despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la

capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20

13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS

S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy

adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S

cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales

20

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

17

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas

concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera

continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido

consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21

Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran

diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los

principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de

las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el

vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente

a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los

nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el

nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa

rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece

el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno

Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico

tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen

BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a

concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de

energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse

cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no

consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22

21

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

18

Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto

Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista

VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles

El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de

dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que

19

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede

observarse en la figura 2

Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera

Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom

El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten

tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin

embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos

tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi

Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24

Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y

el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-

vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y

raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso

23

Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de

Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

20

condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y

especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con

aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26

El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47

μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores

como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por

lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27

Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera

Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea

25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the

formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana

26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

21

132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera

Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas

entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de

produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y

bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28

En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la

identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten

del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la

morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre

otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos

grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida

para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es

requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los

microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de

la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la

identificacioacuten de este29

14 Medios soacutelidos selectivos

Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del

vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se

examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las

caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias

en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o

2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

22

rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)

topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de

pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa

lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier

cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3

respectivamente)30

Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo

conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes

utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no

es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de

Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten

30

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action

of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France

23

de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y

presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos

Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios

selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del

laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene

cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces

El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la

inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32

Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros

medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993

Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo

mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio

fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado

recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM

(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para

Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el

maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera

actualmente33

15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos

32

33

Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers

GmbH United States of America and Canada

24

El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente

conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34

Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy

importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico

Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha

disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo

microbioloacutegico35

El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una

concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos

que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta

porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los

vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el

proceso36

151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)

Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2

molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del

pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito

tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara

34

Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos

httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-

azufre-en-el-vino

3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

25

con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales

como Acido Hydroxysulfonico 37

Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que

reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona

diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38

152 Inhibidor Microbiano

El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad

de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La

concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del

vino basaacutendose en la siguiente foacutermula

Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la

cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o

08 mgl de SO2 molecular 39

El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes

bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten

reacciona con ATP

3739

Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and

procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America

38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

26

Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2

molecular

Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007

La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de

microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y

diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech

1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad

necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de

cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24

horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la

27

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth

1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40

16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de

BrettanomycesDekkera

Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers

Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para

reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41

Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados

enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-

etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el

vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42

Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la

transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en

los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a

BrettanomycesDekkera 43

40

Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi

Springer New York United States

41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -

Armainvilliers France

424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten

de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-

groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf

28

El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los

que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la

calidad olfativa del vino44

29

2 PROBLEMA

La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente

en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la

produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4

etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas

caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus

caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus

propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil

entre otros)

En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se

encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por

ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado

alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que

se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la

regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido

afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al

respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre

sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol

30

15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido

AceticoL Azucar residual 47 grLt)45

La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la

identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de

accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria

vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son

complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se

realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera

llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente

podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de

gran popularidad

45

Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

31

3 JUSTIFICACION

Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67

de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos

estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con

indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este

nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas

de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten

nacional46

Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades

propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha

produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura

BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida

de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de

denominacioacuten de origen

Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida

identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el

desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento

yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido

de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter

Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia

46

Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm

32

4 OBJETIVOS

41 General

Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera

en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto

Babic

42 Especiacuteficos

Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para

BrettanomycesDekkera

Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos

Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto

Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto

Babic 2007

Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces

bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace

solid-phase microextraction (SPME)rdquo

33

5 ALCANCES

En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en

donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la

produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de

esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en

adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su

adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas

(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis

cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y

4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea

comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben

o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto

AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)

34

6 ESTADO DEL ARTE

Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la

industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de

caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el

crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de

dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos

en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al

ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera

evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de

nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la

levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino

entre otros

Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos

importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en

cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios

Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo

realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza

algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su

crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y

desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia

algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino

35

(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros

dimetil dicarbonato Aditivos)47

Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento

se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja

Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en

las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios

para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos

Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las

bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48

El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones

cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de

etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores

fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada

BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta

levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos

grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de

control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables

fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones

manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el

uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la

levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones

47

A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de

BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la

Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea

48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-

24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts

of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid

Espantildea

36

existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja

claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para

una pequentildea industria

El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de

BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre

Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50

vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟

al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido

isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas50

De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios

selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea

Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de

Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar

un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura

BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de

detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-

guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue

realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica

Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas

50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory

and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence

France

51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development

and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal

37

usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en

maquinarias52

En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la

Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio

solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos

como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los

compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de

antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes

de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo

diario en el medio53

Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera

estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4

viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la

identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente

con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica

Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el

uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis

cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol

Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos

responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue

satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos

52

JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto

Portugal

53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac

Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia

38

blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz

en muestras de vino54

De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten

enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S

cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un

mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones

de aireacioacuten y a temperatura controlada55

54

C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible

compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography

No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea

55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos

obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana

39

7 MATERIALES Y METODOS

A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten

Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la

Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas

Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia

Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los

laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia

71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

711 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura

agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)

Balanza electroacutenica de precisioacuten

Microscopio oacuteptico

712 Metodologiacutea

Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de

medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin

40

Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces

bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-

117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha

investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos

Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute

compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl

de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas

Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura

BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de

los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de

BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten

facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es

utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la

tabla mencionada anteriormente

Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL

Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y

darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-

cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten

del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera

Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega

despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este

igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5

Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una

concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros

compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona

10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como

56

Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas

41

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la

levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver

tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de

BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor

concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57

Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier

microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el

meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034

kPa)

Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos

contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos

Universidad de Zagreb Croacia

Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman

observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios

en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas

muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas

La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos

57

Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21

Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea

42

72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera

721 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Frascos de vidrio esteacuteriles

Autoclave de laboratorio

Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura

cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)

Microscopio oacuteptico

Balanza electroacutenica de precisioacuten

722 Metodologiacutea

En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten

de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad

por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo

para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis

de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia

Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente

carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su

estado liquido

43

La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente

20 gL Glucosa

20 gL peptona

10gL extracto de levadura

30mgL de cicloheximida

100mgL acido p-cumarico

10 mgL ampicilina

Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se

antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso

de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos

De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el

medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina

en una concentracioacuten de 10mgL

En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes

cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al

respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo

tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad

aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios

anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58

58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of

Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4

pag 345-359 Greenford

44

Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten

de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del

ldquocaraacutecter Brettrdquo

Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos

ensayos

73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN

VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA

731 Materiales

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera

Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera

Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)

Vino Babic 2007

Anallizador infrarojo Bacchius II microdom

732 Metodologiacutea

Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del

dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura

BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia

Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de

tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere

determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera

presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic

45

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se

inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute

glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de

adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)

Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de

BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el

paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a

mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3

Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba

Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente

diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar

(SO2 y Antibrettreg)

Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una

concentracioacuten de 40 mgl

Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100

ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de

BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de

AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl

Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de

almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el

contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15

diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento

Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento

de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten

Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio

del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos

46

SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los

efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control

74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

741 Materiales

Cromatografo de Gas HP5890 Serie II

Microextractor de fase solida (SPME)

Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el

departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de

Zagreb Croacia

Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-

acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo

acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol

geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-

etilguaiacol)

Vino Tinto Babic

Agua destilada

742 Metodologiacutea

El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y

Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de

la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el

desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten

47

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II

Programa HP-chem

a) Condiciones para analisis SPME-GC

Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)

25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente

Tiempo de adsorcion 30 minutos

SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo

previsto

b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)

La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)

30m id=025mm 025μm

Gas portador Nitrogeno

Flujo del Nitrogeno 5 mlmin

Temperatura del inyector 240 C

Temperatura del detector 250 C

Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C

10Cmin 190 C 5 Cmin

Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen

necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos

compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de

vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten

48

8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS

81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para

BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten

microscoacutepica

1 Negativo Negativo - No se realiza

2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras

3 Negativo Negativo - Presencia de

Levaduras

4 Aparicioacuten de

algunas colonias

Negativo Transparente Presencia de levaduras

5 Colonias definidas Positivo-

Fenoles

Amarillo Presencia positiva de

BrettanomycesDekkera

49

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de

crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al

antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay

presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras

BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron

inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por

revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

50

Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en

incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y

bacterias

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras y

algunas bacterias

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera y

bacterias

El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de

carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura

BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro

microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente

antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una

concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias

Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la

levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas

51

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las

siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

52

Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para

Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C

Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica

1 Ninguno Negativo - -

2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras

9 Diminutas

colonias

transparentes

Negativo Transparentes Presencia de levaduras

10 Positivo Positivo-

Fenoacutelicos

Amarillo Presencia de levaduras

BrettanomycesDekkera

El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de

carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias

bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de

aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C

53

Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo

para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las

presentadas anteriormente y son las siguientes

Forma Circular

Dimensiones 5-6 mm

Topografiacutea convexa

Color Amarillo

Opacicidad oscuro

Superficie lisa y suave

Borde entero

El agar no presenta cambios de color ni turbidez

82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO

Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el

tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido

Nuacutemero de ceacutelulas ml

(concentracioacuten final)

Tiempo necesario para obtener resultados

positivos (diacuteas)

1 Experimento

32x106 le 3

3 X 104 3

33x102 7

40 No detectado

2 Experimento

43x106 le3

39x104 le3

37x102 8

62 No detectado

54

El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado

usando contador de ceacutelulas Chamber

Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el

medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del

ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de

BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros

compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos

tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera

En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un

medio sin presencia de BrettanomycesDekkera

En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la

turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las

muestras de altas concentraciones

La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de

ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar

Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se

demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos

dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el

tiempo de deteccioacuten fue menor

Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten

miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil

fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente

activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve

reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy

bajas

55

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los

dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura

BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha

levadura

En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera

el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues

en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas

83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE

(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE

DALMACIA CROACIA

El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y

15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg

estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II

Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los

resultados se muestran en la tabla

Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera

durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos

CFUml

Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15

Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03

Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03

SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67

SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183

Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03

Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03

Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03

Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03

56

Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 0

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extracto

seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetato

(grl)

1473

525

083

09928

473

332

164

799

305

117

1471

522

084

09927

479

329

162

786

299

116

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o

Antibrettreg Diacutea 15

Alcohol

()

Acidez Total

(gr Aci

Tartaacuterico L)

Acidez volaacutetil

(Aci

AceacuteticoL)

Densidad

(grml)

Azuacutecar residual

(grl)

Extrac

to seco

(grl)

Acido

Laacutectico

(grl)

Glicerol

(grl)

Taninos

(grl)

Acetatos

(grl)

Control

1414

565

107

09935

436

364

177

827

259

136

Control

1415

556

108

09936

420

365

170

824

256

137

SO2

1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125

SO2

1457

542 108 09933 472 370 170 804 271 124

Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125

Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124

Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia

57

Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para

evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por

duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura

deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para

su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta

consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que

representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino

Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito

fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta

poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml

respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo

debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten

58

Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en

concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas

El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de

BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma

significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual

de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la

poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la

poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml

siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten

Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y

de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis

adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de

levaduras

59

Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de

Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo

de 15 diacuteas

El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su

mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia

porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de

60

SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de

agregarse el producto

El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de

la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta

poblacioacuten debe ser lt103 UFCml

El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten

de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas

nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten

Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)

hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico

aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como

fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales

presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y

otras pentosas residuales)

138

14

142

144

146

148

Alcohol

Day 0 Day 15

61

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin

compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas

iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se

presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se

ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su

contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten

compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia

en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol

Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una

reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de

BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su

reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007

En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un

porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en

comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de

la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este

compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se

produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica

62

Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no

significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las

muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos

compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la

calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes

controlados en la produccioacuten de vinos

la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura

BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el

oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el

desarrollo de la levadura

002040608

112

Acidez Volatil

Day 0 Day 15

63

Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin

adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control

Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido

de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de

aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico

Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del

vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura

BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este

compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de

BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico

en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en

este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no

permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran

cantidad

A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto

muy comuacuten y poco agradable para el consumidor

105110115120125130135140

Acido Acetico

Day 0 Day 15

64

Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007

desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en

comparacioacuten con el vino de control

BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono

para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo

y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de

BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en

el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes

de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha

bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la

cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto

Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462

38

4

42

44

46

48

5

Azucares Reductores

Day 0 Day 15

65

84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE

CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON

EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID

PHASE

Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1437

Propanol 3759

Diacetil 4202

Etil-acetato 4523

i-butanol 6232

Acido Aceacutetico 7840

i-amil alcohol 11740

n-amil 13489

lactato de etiacutelico 15741

acetato amil metiacutelico 17796

1-hexanol 19101

etil-hexanol 24456

Linalol 30370

2-feniletanol 32768

p-cresol 33522

octanoato de etilo 34226

4-etilfenol 37100

2-feniletil acetato 32769

4-etilguayacol 39704

4 vinilfenol 40529

decanoato de etilo 42117

Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar

para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a

este

66

Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas

MODEL 0

(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)

Compuesto Pureza Cantidad

(g)

Concentracioacuten (gl)

Acetaldehiacutedo 099 1623 160677

Propanol 0995 13849 137718

Diacetil 098 01071 104958

Etil-acetato 0995 30172 3002114

i-butanol 099 15016 1486584

Acido Acetico 0995 0 0

i-amil alcohol 099 20116 1991484

n-amil 098 15442 1513316

lactato de etilio 098 00507 049686

acetato amil metilico 098 01028 100744

1-hexanol 098 00367 035966

etil-hexanol 098 00308 029876

Linalol 097 00288 027936

Nerol 097 00311 030478

Citronelol 098 0031 03038

Geraniol 098 15803 1548694

2-feniletanol 098 00402 039396

4-etilfenol 098 00812 078764

octanoato de etilo 097 00597 059103

2-feniletil acetato 099 00315 031185

4-etilguayacol 098 00803 079674

Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea

de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009

Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de

estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor

Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta

67

la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e

investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo

Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml

Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el

meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del

meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados

se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo

68

Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en

vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado

Compuesto Tiempos de

retencioacuten (min)

Acetaldehiacutedo 1542

Propanol 4046

Diacetil 4733

Etil-acetato 4807

i-butanol 6659

Acido Acetico 8343

i-amil alcohol 12123

n-amil 13866

lactato de etilio 16072

acetato amil metilico 18336

1-hexanol 19447

etil-hexanol 24835

Linalol 31831

2-feniletanol 33305

p-cresol 33703

octanoato de etilo 34571

4-etilfenol 37724

Citronelol 38326

Nerol 38576

2-feniletil acetato 39012

Geraniol 39944

4-etilguayacol 40271

4 vilifenol 41168

decanoato de etilo 42657

69

DIA 0

Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar

cantidades de los compuestos aromaacuteticos

Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con

BrettanomycesDekkera

Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007

Compuesto Tiempo de retencioacuten

min

Cantidad

mgl

Acetaldehiacutedo 1542 0

Propanol 4046 0

Diacetil 4733 37215204

Etil-acetato 4807 0

i-butanol 6659 0

Acido Aceacutetico 8343 2817465

i-amil alcohol 12123 16799019

n-amil 13866 26

lactato de etiacutelico 16072 10983961

acetato amil metiacutelico 18336 0185196

1-hexanol 19447 264655

etil-hexanol 24835 0158751

Linalol 31831 0

2-feniletanol 33305 4235560

p-cresol 33703 1

octanoato de etilo 34571 0152412

4-etilfenol 37724 00581345

Citronelol 38326 00439729

Nerol 38576 00344799

2-feniletil acetato 39012 00407983

Geraniol 39944 0

4-etilguayacol 40271 0

4 vilifenol 41168 0

Decanoato de etilo 42657 00190144

70

Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a

analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-

Vinylfenol

Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura

BrettanomycesDekkera

El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como

perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de

230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de

58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol

841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS

DE ALMACENAMIENTO

0

02

4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol

Vino 00581345 0 0

C (

mg

L)

Vino Babic 2007 Dia 0

71

Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado

MUESTRAS INCUBADA A 20C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156

4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499

4-etilguayacol 0 0 0 0

4-etilguayacol 0 0 0 0

4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323

4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225

72

Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-

fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156

C (

mg

L)

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499

C (

mg

L)

4 etilfenol

73

caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la

produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue

ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y

en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo

cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un

crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto

genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la

estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento

Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar prueba por duplicado

002040608

1

Vino Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

4 etilguayacol

002040608

1

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0 0 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

74

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento

probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al

desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-

fenol

Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha

levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 110709781349685317460323

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Series1 0 11071 12974 62132 69322

C (

mg

l)

4 Vinylfenol

75

durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura

BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de

vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar

que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras

productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de

almacenamiento dadas para estas pruebas

Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el

ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas

MUESTRA 2 INCUBADA A 28C

Compuesto Day 1

Amount

(mgL)

Day 2

Amount

(mgL)

Day 3

Amount

(mgL)

Day 4

Amount

(mgL)

4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932

4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554

4-etilguayacol 0 014304 0223836 0

4-etilguayacol 0 002287 00529832 0

4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847

4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0

76

Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente

estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas

de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la

industria viniacutecola

0

005

01

015

02

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813019932018661019611019932

4 etilfenol

0

005

01

015

02

025

03

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024

4 etilfenol

77

Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar

Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que

podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la

deteccioacuten del compuesto

0001002003004005006

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

0005

01015

02025

Vino

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4

4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0

C (

mg

l)

4 etilguayacol

78

Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la

levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin

contaminar Prueba por duplicado

El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco

confiable

0

2

4

6

8

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 397847665182787068397847

4 vinylfenol

0

2

4

6

8

10

12

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0

4 vinylfenol

79

Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a

temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria

de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas

dudas sobre los resultados de este ensayo

0

05

1

15

2

25

3

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

4 etil fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

80

Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o

disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento

regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera

descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de

4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos

seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)

0

005

01

015

02

025

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3

C (

mg

L)

4 etil guayacol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 20C

81

Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes

condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar

La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi

nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este

compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de

acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl

fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de

lecturas

0

2

4

6

8

10

12

14

Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

C (

mg

L)4 Vinyl fenol

Muestra 1 a 28C

Muestra 2 a 28C

Muestra 1 a 20C

Muestra 2 a 28C

82

9 CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO

Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar

selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en

incubacioacuten a 28C

El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes

raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al

de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar

resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la

selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera

La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en

condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)

Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento

en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde

entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro

83

superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos

necesarios

El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico

y uacutetil

El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura

BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para

mayor selectividad

Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad

92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO

Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera

accesible y faacutecil de elaborar

Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de

BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el

medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura

BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)

Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es

menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por

medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no

detectarlo

84

Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no

son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos

son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden

los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett

El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten

de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino

tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil

93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg

EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA

CROACIA

Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados

en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones

normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en

los vinos tintos

En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran

nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de

su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten

para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a

este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en

comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control

85

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del

vino tinto

Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la

levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente

con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra

BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)

Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera

para evitar el uso de productos alergenicos como SO2

94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA

DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN

EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO

MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE

Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME

queda como resultados

Es necesario repetir la prueba

No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos

de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos

resultados de cantidades de compuestos

86

Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un

control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se

haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros

microorganismos que no se deseen en el medio)

Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el

umbral de deteccioacuten en este vino

Control de crecimiento por medio solido Selectivo para

BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado

y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas

La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de

cromatografiacutea de gas (GC)

87

ANEXOS

11

89

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Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea

93

11

GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que

hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip

A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada

momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza

A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteres