Differential effects of Human Differential effects of Human Papillomavirus DNA Types on p53 Papillomavirus DNA Types on p53
Tumor-Supressor Gene Apopitosis in Tumor-Supressor Gene Apopitosis in spermsperm
Lee, CA,Huang, CTF, King A, Chan PJ.
Gynecologic Oncology 85, 511–516 (2002)
Equipe: Cybelle Cristina
Maria Angélica
Papilomavirus Papilomavirus Estrutura:
DNA dupla fita circular
8 ORFs (E e L), 1 região de controle (LCR)
Capsídeo icosaédrico
Patogênese:
Infectam células basais do epitélio
Causam lesões hiperplásicas benignas
que podem evoluir para o câncer
HPVs de alto e baixo risco
Infecções latentes no epitélio e outros
tecidos
Presença do HPV no sêmen:
Alterações na motilidade do
espermatozóide (astenospermia)
Diminuição da capacidade reprodutiva
Fragmentação do DNA e apoptose em espermatozóides
p53:
Proteína nuclear que se liga ao DNA e regula
a expressão de pts envolvidas no controle do
ciclo celular
Possui três domínios: ligante ao DNA,
oligomerização e ativação da transcrição
Gene localiza-se no cromossomo 17
Encontra-se freqüentemente mutado durante infecção por HPV
HPV E6 + Ubiquitina-ligase + p53 p53
Objetivo
Determinar a integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 de espermatozóide durante a exposição a diferentes tipos de HPV.
Materiais e Métodos
Preparação da amostra
•Amostras de espermatozóide foram coletadas de doadores HPV negativos e lavadas;
•Fragmentos de DNA de HPV dos tipos 6b/11 (157 pb), 16 (98 pb), 18 (83 pb), 31 (162 pb) e 33 (103 pb) e um fragmento controle HLA-DQA1 (242 pb) foram colocados em tubos e incubados juntos com as amostras por 24h.
Um tubo sem fragmentos de DNA também foi incubado (controle não tratado)
•Os fragmentos de DNA do HPV contém os genes E6 e E7
A integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 foi avalida através dos ensaios DNA disc chip
Ensaio DNA Disc Chip
Descongelamento
Ressuspenção
Aquecimento p/
Desnaturação do DNA
Amplificação do DNA
Exons 5 e 8 p53
HPV e DQA
Primers antisense
Amostra não tratada
Primers sense
Marcação do DNA com corantes fluorescente
DNA fitas simples derivado amostras expostas ao DNA de HPV e DQACorante Syr Gold
DNA fitas simples derivado amostras não tratadasBisbemizide
Ensaio DNA Disc Chip
Discos de membrana confeccionados
DNA fita simples controle
DNA fita simples HPV
DNA fita simples DQA
Discos alinhados em um vidroFormação do Chip
Os discos foram analisados em um microscópio de epifluorescênciaImagens capturadas por uma câmera e gravadas em um computador
Imagens coladas para o programa Paint, convertidas em escala de cinza e analisadas
RESULTADOS
*A análise do gene P53 em esperma mostrou significante fragmentação apopitótica no exon 5 exposto ao DNA do
HPV tipo 18 acarretando uma queda na fluorescência exibida pelo exon;
*Em contraste, a exposição do DNA ao HPV tipo 16 resulta em fragmentação do DNA do exon 8 mas não do exón 5;
*O HPV dos tipos 31 e 33 não exibem fragmentação significante;
*O DNA intacto DQA1 exibe máxima fluorescência em contraste com o DNA danificado que devido a pouca hibridação exibe pouca fluorescência;
*A motilidade do espermatozóide foi reduzida na presença de fragmentos de DNA das regiões E6 e
E7em todos os tipos de HPV testados;
*A motilidade também foi reduzida na presença de fragmentos do controle positivo;
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle HPV 16 HPV 18 HPV6b/11
HPV 31 HPV 33 DQA1
motilidade %
deslocamento lateral dacabeça
DISCUSSÃO
* Neste estudo, fragmentos de DNA preferencialmente das regiões E6 e E7 dos genes de oncoproteínas de transformação foram utilizados para avaliar o efeito
direto na instabilidade da P53em esperma;
*A nível genômico, o efeito direto da integração do HPV no genoma do hospedeiro causando instabilidade no
gene P53 não foi claramente demonstrado, embora seja sugerida uma relação de causa e efeito;
*Embora em muitos casos o gene P53 tenha sido danificado, os dados sugerem que os danos dependem
do tipo de vírus pois estes tem alvo específico representado por importantes exons;
CONCLUSÃO
*Em suma, o presente estudo demonstrou que fragmentos das regiões E6 e E7 do DNA de HPV tipos 16 e 18 alteram a expressão dos exóns 5 e 8 do gene
da P53;
*Os HPVs tipos 31 e 33 não afetam significativamente os exóns da P53;
*A motilidade e progressão foram reduzidas em espermas expostos a fragmentos do DNA de HPV
sugerindo a diminuição da capacidade de fertilização e possibilidade de transmissão de genes modificados
pelos vírus durante a fertilização.