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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 1
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Práticas
• Microscopia de transmissão• Microscopia de fluorescência wide-field• Microscopia confocal
BibliografiaLakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition. 1999. Kluver
Academic/Plenum Publishers, New York.Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12):910-
919, 2005.Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12):920-931/
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Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
Ondas mecânicas em um meio elástico
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Meio:Massa (inércia)Elasticidade
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Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
Carregam energias elétrica e magnética
Propriedades do meio de propagação:•Armazenar energia elétrica (capacitância)•Armazenar enérgia magnética•(indutância)
VácuoPermitividade F/mPermeabilidade H/m 1-
0
ms1
c 8
0
1003 με
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Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
s
km
s
mc
c
000.300459.792.299
Velocidade da onda
Frequência (ciclos por s, Hz)
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Espectro da radiação eletromagnética
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Onda: Refração
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Fóton
JhE
Hzc
m
sJh
azulazulfóton
azulazul
azul
19,
14
9
34
1007,4*
10*143,6
10488
1062606896,6
photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force.
νEfóton
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• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Interação radiação EM-matéria: reflexão
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Interação radiação EM-matéria: refração
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Interação radiação EM-matéria: difração
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Luminescência – Fluorescência e fosforescência
0térmicaemis1
1exc0
SEνS
SνS
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Luminescência – Fluorescência e fosforescência
Diagrama de Jablonski
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Fluoróforos de interesse em Biologia
Fluoresceína
Rodamina
Quinina
Acridina
exc
250nm
350nm
em =450nm
exc=530nm
em=556nm
exc=490nm
em=514nm
exc=495nm
em=526nm
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Fontes de “luz”: Laser x HBO
Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de
onda definido (monocromático)
Espectro do He-Ne laser
Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp)
Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)
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• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Dimensões na Biologia
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Microscopia - Objetivas
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Abertura numérica e aumento
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Resolução
1,51n
sinnΝΑ
1
θ
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Difração limita a resolução – Airy disks
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Resolução e refração do meio
1,51n
sinnΝΑ
1
θ
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Resolução51,11
)sin(*
n
nAN
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Aumento e Resolução
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Microscopia de luz refletida
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Microscopia de luz transmitida
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Iluminaçao – Sistema Köhler
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Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC
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Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC
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Imagem de Fluorescência em Microscopia “Wide Field”
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Fluorescência
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Microscopia de fluorescência “wide field”
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Imagem de Fluorescência em “Wide Field”“Filter Cube”
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Imagem de Fluorescência
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Microscópio de epifluorescência “Wide Field”
UV Filter Cube set #487902 (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP
420). This cube is used to visualize UV-excitable fluors like DAPI.
Blue Filter Cube set #487910 (Exciter Filter: BP 450-490, Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP 515-565). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set.
Green Filter Cube set #487915 (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580,
Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using
this filter set.
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Espectro da HBO
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Zeiss Axiovert 100 M
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Microscópio Confocal
Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme
Microscópico de varredura
Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência
Resolução no eixo Z
Resolução temporal reduzida.
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Microscópio Confocal: aplicaçoes
As que demandam resoluçao espacial XYZ
Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes
Análise da interação entre moléculas (FRET)
Análise da migraçao de moléculas (FRAP)
etc
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Microscopia confocal
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Princípio da Microscopia confocal
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Imagem multiespectral
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 48
Resoluções lateral e axial
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Resolução e “Airy pattern”
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 50
Compromissos
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 52
Aplicações do microscópio confocal
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 53
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 54
Espectros das FP
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 56
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 57
Inclusões
• Análise espectral – META (lambda stack - AOTF)• Proteínas fluorescentes
(http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/index.htm)