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BACTERIA - General characteristics I Bacteria are microrganisms classified as prokaryotes, i.e. their nuclear material is not separated from the cytoplasm by a nuclear membrane and there is no mitotic apparatus. Most of the genetic information in a bacterial cell is carried on a single chromosome with double-stranded DNA in a closed circular form. In addition, some bacterial cells contain extrachromosomal DNA as plasmids. These are circles of DNA which replicate independently of the chromosomes and are important for several reasons. Genetic material relating to pathogenicity, tumour formation and resistance to chemicals such as antibiotics may be located on the plasmids; plasmids can pass from one bacterial cell to another with ease.
BACTERIA - General characteristics II Bacterial cells have either no organelles or poorly developed organelles, unlike eukaryotic cells of plants and animals. Almost all bacteria are unicellular and one of three shapes; round (coccus, spherical or ovoid); rods (cylinders) or spirals (helices). All plant pathogenic bacteria are rod-shaped, 0.5-3.5 μm in length and 0.3-1.0 μm in diameter. About 200 out of the total 1600 known bacterial species are recognized as plant pathogens. Most of the remaining species are beneficial to man as saprophytic decomposers although some important bacteria are pathogenic to man and other animals.
What about bacteria in Plant Pathology ?
Most of the plant pathogenic bacteria are either Gram-positive, in the Phylum
Actinobacteria, or Gram-negative, in the Phylum Proteobacteria.
Gram-positive and Gram-negative cells appear purple or red, respectively, with
specific stains. The different colors largely reflect differences in stain retention
by the respective cell walls of the bacteria during the staining process.
BACTERIA
Epiphytes vs endophytes
I batteri, anche fitopatogeni, che colonizzano le superfici esterne di una pianta
sono definiti epifiti, ma la loro presenza non necessariamente implica che si
svilupperà la malattia, poiché questo evento dipende da una serie di fattori tra
cui la combinazione ospite-patogeno, le condizioni climatico-ambientali, le
condizioni fisiologiche del potenziale ospite, la entità della popolazione del
patogeno e la contemporanea presenza di microflora con le sue specifiche
attività, quali produzione di siderofori, il rilascio di antibiotici e la competizione
per i nutrienti.
Agli epifiti si contrappongono i cosiddetti endofiti, ovvero i batteri che vivono
dentro la pianta, come residenti o in maniera transiente. Anche in questo caso la
condizione di endofitismo non coincide con lo sviluppo della malattia anche se
è ovvio che, rispetto agli epifiti, gli endofiti non hanno bisogno di penetrare
l’ospite.
What about bacteria in Plant Pathology ?
Agrobacterium
Arthrobacter
Erwinia
Clavibacter
Pseudomonas
Curtobacterium
Ralstonia
Rhodococcus
Xanthomonas
Streptomyces
Xylella
What about bacteria in Plant Pathology ?
….. with some exceptions….
Some exceptions? those living into vascular tissues, such as Xylella fastidiosa or Phytoplasmas in general
Schaad et al. (2002)
Real-time polymerase chain reaction for
one-hour on-site diagnosis of Pierce’s
disease of grape in early season
asymptomatic vines
Phytopathology 92: 721-728
Let’s begin with some characteristic and informative examples
Agrobacterium
Arthrobacter
Erwinia
Clavibacter
Pseudomonas
Curtobacterium
Ralstonia
Rhodococcus
Xanthomonas
Streptomyces
Xylella
Genere Agrobacterium
Agrobacterium agile, Agrobacterium albertimagni,
Agrobacterium aurantiacum, Agrobacterium
larrymoorei, Agrobacterium radiobacter,
Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi,
Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium
vitis....
Agrobacterium tumefaciens
Gram-negativo
non sporulante
mobile per 1-6 flagelli peritrichi
morfologia “a bastoncello”
strettamente correlato al genere Rhizobium 3 biovar....2 + A. vitis
Agrobacterium tumefaciens
Batterio iperplastico
agente del “tumore del colletto”
o
“crown gall disease”
POMODORO CAROTA
ROSA
VITE
ALCUNI DEGLI OSPITI DI Agrobacterium tumefaciens……..
Abies, Acer, Aesculus, Alnus, Anthirrhinum, Araucaria, Arbutus,
Asparagus, Aster, Begonia, Beta, Brassica, Calendula, Calycanthus,
Cannabis, Carnegiea, Carya, Castanea, Cedrus, Celtis, Chrysanthemum,
Cichorium, Citrullus, Citrus, Clematis, Cornus, Corylus, Crataegus, Cucumis,
Cupressus, Cydonia, Dahlia, Daphne, Datura, Daucus, Dianthus, Diospyros,
Eucalyptus, Ficus, Forsythia, Fraxinus, Fuchsia, Gardenia, Geranium,
Glaeditschia, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hibiscus, Humulus,
Hydrangea, Kalanchoe, Impatiens, Juglans, Juniperus, Larix, Lathyrus,
Ligustrum, Lonicera, Lycopersicum, Maclura, Malus, Malva, Matthiola,
Medicago, Morus, Nerium, Nicotiana, Olea, Opuntia, Oxalis,
Parthenocissus, Passiflora, Pastinaca, Pelargonium, Persea, Petunia,
Phaseolus, Philodendron, Pinus, Pisum, Populus, Primula, Prunus,
Pseudotsuga, Pyrus, Raphanus, Reseda, Rheum, Ricinus, Rosa, Rubus,
Rumex, Saintpaulia, Salix, Salvia, Sequoia, Solanum, Sorbus, Syringa,
Taraxacum, Taxus, Thuja, Trifolium, Tropaeolum, Ulmus, Vaccinium,
Verbena, Viburnum, Vinca, Vitis, Wistaria.
Agrobacterium tumefaciens
Batterio iperplastico
agente del “tumore del colletto”
o
“crown gall disease”
Agrobacterium tumefaciens:
From Plant Pathology to Biotechnology
Edited by Eugene Nester, Milton P. Gordon, and Allen Kerr
APS Press October 2004
A. tumefaciens ceppo C58
Organizzazione del genoma cromosomi 2,0 Mb, lineare 2,8 Mb circolare plasmide 206,479 kbp
PLASMIDE Ti............”Tumor inducing”......
I geni responsabili della formazione del tumore sono per lo più localizzati sul plasmide Ti.
N.B. Se in vitro A. tumefaciens è incubato alla temperatura di 30°C, il plasmide viene perduto, con la capacità del batterio di causare sintomi.
PLASMIDE Ti
T-DNA = “transferred DNA”
Noc = geni per il catabolismo della nopalina
Ori = origine di replicazione del plasmide
Con = regione per il trasferimento coniugativo del plasmide ad altri ceppi
Acc = geni per il catabolismo delle agrocinopine
tzs = geni per la sintesi della transzeatina
Vir = geni associati alla virulenza
PLASMIDE Ti ll plasmide Ti è coniugativo, ovvero può essere trasferito da cellula a cellula sotto
il controllo della regione Con.
In laboratorio, il trasferimento coniugativo è fortemente promosso dalla presenza di nopalina....segreto svelato nella lezione su Quorum Sensing....
Hp: in natura la nopalina prodotta a livello del sito di infezione promuoverebbe il trasferimento del plasmide dai ceppi patogeni a quelli non patogeni presenti nella rizosfera, che in genere sono circa il 90% dei ceppi presenti......e non solo.....vedere ancora QS......
Agrobacterium tumefaciens L’”attacco” è a livello delle ferite fresche......attrazione chemiotattica.....
es. acetosiringone (concentrazioni 10-7 M)
A concentrazioni 10-5 - 10-4 M, l’acetosiringone provoca l’attivazione dei geni vir
Arabidopsis thaliana VirE2 Interacting Protein 1 (AtVIP1) si associa al complesso T tramite VirE2 facendo da tramite con gli istoni della cromatina dell’ospite AtVIP1 interagisce con istoni in vivo e in planta.
SUMMARY
•Amino acids, organic acids and sugars released from
wounded plant cells act as chemoattractants to A.t
• Autophosphorylation of the transmembrane receptor
VirA
• Activated VirA transfers its phospate to the cytoplamic
VirG
• VirG binds to the box enhancer elements in the
promoters of the virA, virB, virC, virD, virE and virG
operons, upregulating their transcription
• VirD1 and VirD2 proteins permit the synthesis of a single
strand DNA corresponding to the T-DNA
• VirD2 remains covalently linked to the T-DNA (in „5),
coated by VirE2 protein
• T-DNA + Vir proteins exported by type IV secretion
system encoded by the virB operon and by virD4
Assembly of T-pili in A. tumefaciens. (a) A model for T-pilus assembly in A. tumefaciens
showing the proposed VirB4–VirB8–VirB5–VirB2 interaction sequence leading to the
formation of VirB2–VirB5 complexes followed by T-pilus assembly [39]. (b)
Transmission electron microscopic image showing T-pili and flagella on A. tumefaciens
Genetic organization of the vir gene cluster
on the symbiosis island of Mesorhizobium loti strain R7A
(The locations of various vir gene mutants are indicated by arrows)
Molecular Microbiology (2004) 54, 561-574
Comparison of C-terminal amino acids of putative effector proteins Msi059
and Msi061 and of three translocated effector proteins of A. tumefaciens
strain 15955. Amino acids conserved between the two putative M. loti effector
proteins are shown in bold as are matching residues in the A. tumefaciens
proteins. Accession numbers for VirE2, VirE3 and VirF are CAC15175,
CAC15176 and CAC15183 respectively.
Molecular Microbiology 54 (2), 561-574
Agrobacterium tumefaciens:
From Plant Pathology to Biotechnology
Edited by Eugene Nester, Milton P. Gordon, and Allen Kerr
APS Press October 2004
Genome: Unlocking Biology's Storehouse
5 October 2001 Volume 294 Number 5540
Special Issue:
Genomics
The Genome of the Natural Genetic Engineer Agrobacterium tumefaciens C58
Wood et al., (2001) Science 294: 2317-2323
The C58 genome project, initiated in August of 1999, includes:
•The University of Washington Genome Center
•The Bioinformatics laboratory at the University of Campinas (Brazil)
•The Institute for Genomic Research
•SRI International
•The E.I. du Pont de Nemours company
•Pioneer Hi-Bred International
•The University of Washington's Crown Gall group
Agrobacterium tumefaciens C58 Cereon
Cereon Genomics/University of Richmond
Goodner et al., (2001), Science 294: 2323-2328
Cereon Microbial Sequence Database
Cereon Genomics was created in November 1997
as a wholly-owned subsidiary of Monsanto
Organismi geneticamente modificati (OGM)
PIANTE
es. per resistenza a erbicidi
es. per resistenza a stress abiotici
es. per resistenza a virus, batteri, funghi
Some commercial releases of transgenic plants (from Birch, 1997)
Crop and release date
Name Company Novel properties
Tomato (1994) Flavr Savr Calgene Vine-ripened flavour, shelf life
Tomato (1995) Zeneca Consistency of tomato paste
Cotton Potato
Maize (1996-97)
Bollgard NewLeaf
YieldGuard
Monsanto
Bacillus thuringiensis toxin
for insect resistance
Soybean Canola (rape) Cotton (1995-
96)
Roundup Ready Monsanto Glyphosate herbicide
resistance
Il primo biotecnologo!!!!
A. tumefaciens può trasferire qualunque DNA, anche estraneo inserito tra
i due “border repeats” (25 pb ciascuno), che fiancheggiano il T-DNA....
• T-DNA “ingegnerizzato”:
• rimossi i geni per la sintesi di fitormoni
• inserito un marker di selezione (es. gene per resistenza a kanamicina)
La trasformazione della pianta richiede:
Agrobacterium quale veicolo del plasmide trasformante
un plasmide Ti in cui siano funzionanti i geni vir, per il riconoscimento dei
segnali provenienti dalla pianta e per l’excisione del T-DNA
T-DNA ingegnerizzato”
NB il T-DNA non necessita does di essere sullo stesso plasmide dei geni
vir plasmide Ti "disarmato” e vettori binari
Agrobacterium tumefaciens:
From Plant Pathology to Biotechnology
Edited by Eugene Nester, Milton P. Gordon, and Allen Kerr
APS Press October 2004
AGROBACTERIUM RADIOBACTER CEPPO K84
INOCULO PER PIANTE FRUTTIFERE E ORNAMENTALI ANTAGONISTA DI
AGROBATTERI TUMORIGENI
Saggio di inibizione da A. radiobacter ceppo K84, inoculato al centro della
piastra e cresciuto per 24 h prima di essere ucciso con vapori di cloroformio.
Sulla coltura e’ stato versato successivamente uno strato di “soft agar”
contenente A. tumefaciens (“overlay plate technique”).
NOTARE: la crescita di A. tumefaciens è inibita all’intorno della colonia di A. radiobacter ceppo K84.
Specificità dell’agente di biocontrollo A. radiobacter ceppo K84
Piante di Pomodoro dopo 3 settimane dall’inoculazione con: A) A. tumefaciens B) A. tumefaciens in miscela 1:1 con A. radiobacter ceppo K84
A.t. 529 e T57: plasmide Ti per produzione nopalina A.t. 8150 e 502: plasmide Ti per produzione altre opine
A
B
Meccanismo di azione dell’agrocina 84
Ceppi patogeni di A. tumefaciens con plasmidi Ti codificanti per la sintesi di nopalina sono in grado di indurre la pianta a produrre anche agrocinopine, che possono entrare nella cellula batterica tramite un’ ”agrocinopina-permeasi” sempre codificata a livello plasmidico e inserita nella mebrana batterica. L’agrocina 84 di A. radiobacter è riconosciuta da questa permeasi, entra nella cellula e blocca la sintesi di DNA, portando la cellula a morte.
LE “STRATEGIE” DI A. radiobacter
A. radiobacter K84 contiene il plasmide pAgK84, che codifica per la
produzione di agrocina 84.
Inoltre contiene anche il plasmide pNOC, che codifica per l’ “uptake”
e il catabolismo della nopalina
Quindi in natura A. radiobacter K84 prolifera a livello del tumore
indotto da A tumefaciens, sottraendogli nutrienti (= nopalina) e
uccidendo il patogeno con l’agrocina 84.
Peraltro A. radiobacter K84 è un efficiente colonizzatore delle
radici di piante sane e delle ferite, conferendo una protezione
persistente anche dopo l’applicazione
PNAS June 6, 2006 vol. 103 no. 23
Agrocina 84: geni per biosintesi e immunità su pAgK84 (45 kb) pAgK84 può essere trasferito per coniugazione a: Agrobacterium spp. Rhizobium spp. Sinorhizobium spp. conferendo loro la capacità di produrre Agrocina 84 pAgBo542, in stretta relazione con pAgK84, identificato in un ceppo selvaggio di A.t. in Germania…. … pAgK84 trasmissibile e diffusibile…… - Geni per sintesi/immunità in 5 gruppi di complementazione su un contiguo di 15 kb - Replicazione e trasferimento: 8 kb
Agrobacterium radiobacter ceppo K1026
Pesticida microbico per la lotta al “crown gall disease”.
Approvato dall’EPA nel 2001 per l’utilizzazione in serre e vivai.
Sulla base delle informazioni disponibili, il suo uso non presenta
effetti avversi ne’ per la salute umana ne’ per l’ambiente
J Clin Microbiol. 1993 September; 31(9): 2541–2543.
Recovery of a strain of Agrobacterium radiobacter with a mucoid phenotype from an immunocompromised child with bacteremia.
W M Dunne, Jr, J Tillman, and J C Murray
Agrobacterium radiobacter ceppo K1026
è stato il PRIMO microrganismo geneticamente modificato rilasciato nell’ambiente e per uso diffuso
(Allan Kerr, in Australia, dal 1973 è commercializzato con vari nomi es. "Galltrol")
Deriva da A. radiobacter ceppo K84, ubiquitario nei suoli e nella rizosfera. I due ceppi sono identici salvo per…… In A radiobacter ceppo K1026 è stata operata la rimozione di un frammento di DNA che previene il trasferimento a A. tumefaciens del plasmide codificante per l’agrocinopina 84.
Agrobacterium radiobacter ceppo K1026
Applicato su: semi (mandorlo, albicocco, ciliegio, susino, noce, etc)
radici e fusti (mandorlo, albicocco, sambuco, ciliegio,
pesco, susino, noce, e anche ornamentali
quali evonimo e rose)
barbatelle/”cuttings” (mandorlo, albicocco, sambuco,
ciliegio, pesco, susino, noce, e
anche ornamentali quali evonimo
e rose)
Agrobacterium radiobacter ceppo K1026
Fitopatogeni “bersaglio”: A. tumefaciens e A. rhizogenes.
Trattamento: il prodotto è miscelato con acqua a dare una
soluzione, nella quale sono immersi semi, radici, fusti, o che
puo’ essere utilizzata per trattamenti diretti su pianta
Agrobacterium radiobacter strain K1026
Registration Number Product Name
062388-00001 NOGALL
Agrobacterium radiobacter strain K1026 (006474) Technical Document
http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/ingredients/tech_docs/tech_006474.htm
Company number Company Name Address
062388 BIO-CARE
TECHNOLOGY PTY.
LTD.
RMB 1084
PACIFIC
HIGHWAY
SOMERSBY, NSW
2250, AUSTRALIA
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 1999, p. 1936–1940
Il ceppo K84 è stato dimostrato un ottimo colonizzatore dei sistemi radicali degli
ospiti Popolazioni di un mutante di K84 Rif-R e Stp-Rr mantenute nella rizosfera di piante di ciliegio
fino a 2 anni
Colonizzazione e persistenza essenziali nel biocontrollo da K84
Il ceppo K84 produce altre due sostanze antibiotiche * agrocina 434 * antibiotico ALS84
- Geni per agrocina 434 su plasmide pAgK434 - Agrocina 434 efficace solo su A.t. biovar 2 - Geni per ALS84 su cromosoma batterico - ALS84 efficace su tutte le biovar di A.t - Attività inibitoria di ALS84: per produzione di siderofori
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 1999, p. 1936–1940
L’introduzione di formulati commerciali a base di microrganismi
antagonisti ha sicuramente fornito uno strumento utile per molte
problematiche legate alla difesa delle colture orticole e floricole
in agricoltura biologica.
vantaggi di natura ambientale
sicurezza per l’operatore e il consumatore
aspetti negativi intrinseci ai pesticidi (es. riduzione di
efficacia, fenomeni di resistenza e ridotta selettività, etc)
L’eventuale impiego di formulati commerciali contenenti tali
microrganismi in strategie di lotta integrata con mezzi chimici,
non può prescindere dalla conoscenza della loro sensibilità ai
prodotti di sintesi di possibile utilizzazione sulle colture alle quali
sono destinati.
……….
Tabelle di compatibilità
A. rhizogenes
induzione formazione di radici avventizie (“hairy root”)
Trasferimento di un frammento di DNA (T-DNA) dal plasmide Ri
Il T-DNA di A. rhizogenes, di cui si conosce la sequenza nucleotidica, è
composto di 18 “open reading frames” (= ORFs), cioè presumibilmente di 18
differenti funzioni geniche.
Il fenotipo “hairy root” può essere indotto trasferendo nella pianta solo tre
dei 18 geni presenti nel T-DNA, in particolare le ORF 10,11,12,
rispettivamente indicate come geni rol A.B,C (rol= “root locus”)