-
1Sveuilite u SplituPrirodoslovno-matematiki fakultet
Odjel za kemiju
prof. dr. sc. Maja Pavela-Vrani
Preparativne i analitike metode Metode koje se temelje na razliitoj topljivosti Kromatografske metode Elektroforeza Ultracentrifugiranje
Spektrometrija masa
2
Spektrometrija masa MALDI-MS (Mass Assisted Laser Desorption/Ionisation) ESI-MS (Electrospray Ionisation)
Metode za odreivanje trodimenzionalne strukture proteina Rendgenska strukturna analiza NMR (Nuklearna Magnetska Rezonancija)
-
2Izvor proteina:tkivo ili stanine kulture (Escherichia coli, kvasac)
3
sterilna klupa (laminar)
Rad sa staninim kulturama u sterilnim uvjetima
Uzgoj staninih kulturau hranjivom tekuem mediju
Termostatirana tresilica Fermentor ili bioreaktor
4pri stalnoj temperaturi
,u kontroliranim uvjetima:
temperatura, pH, protok kisika
-
3Taloenje centrifugiranjemOdvajanje organela od tekueg medija pri poveanojgravitacijskoj sili
poslije
supernatanttalog
rotor
prije
5
rotacija
Centrifugiranje u gradijentu gustoegradijentsaharoze uzorak
utracentri-fuguranje
6
Razdvajanje sedimentacijom kroz gradijent guste tvari razdvajanjena osnovu plutanja uzrokovanog uzgonom (neovisno o veliini iobliku), do postizanja ravnotee gustoe estica i gustoe otopine
-
4Priprava staninog ekstraktaRazbijanje stanica i centrifugiranje
Enzimska razgradnjarazgradnja lizozimom (G+) permeabilizacija vanjske membrane (G-)
Mehaniko razbijanjetrenjem u tarioniku ili mljevenjem u
homogenizatoru
lt k ( ik t )
7
ultrazvukom (sonikator)suspenzija stanica se uz hlaenjeviekratno izlae zvunim valovimavisoke frekvencije
naglom promjenom tlakaprea po French-u
IsoljavanjeOdvajanje proteina na temelju razlike u topljivosti
Dodatkom zasiene otopineamonijeva sulfata slabe vodikoveveze izmeu proteina i vode:proteini se taloe
Proteini se mogu odvojiti od Topl
jivos
t pro
tein
a
isoljavanjeotapanje
8
Proteini se mogu odvojiti odsupernatanta centrifugiranjem
T
Koncentracija soli
Nakon taloenja amonijevim sulfatom trebaukloniti viak iona
-
5Odvajanje proteina od malih molekula (manje od 15 000 Da) i ionaDijaliza
crijevo za dijalizu(polupropusna membrana)
koncentriranaotopina
9
p
pufer
poetak dijalize ravnoteakraj dijalize
Gel-filtracijaRazdvajanje na osnovu veliine estica
porozna polimernazrnca (matriks)
male molekulezadravaju se
u porama zrnaca
uzorakproteina
Primjena proiavanje proteina odreivanje molekulske
mase odsoljavanje
10
velike molekuleprolaze izmeu
zrnaca
smjer protoka
proteina
polimernigel
-
6Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC)Ureaj za kromatografsko razdvajanje i proiavanje proteina
11
Kromatografija na ionskom izmjenjivauRazdvajanje proteina na osnovu razliitog naboja
pufer niskeionske jakosti
pufer visokeionske jakosti
niska visokakonc. konc.soli soli
ncen
trac
ija p
rote
ina
smjesaproteina
12
frakcije
broj frakcije, ilivolumen otapala
Kon
-
7Nepokretna (stacionarna) faza ionskog izmjenjivaa(matriks)
Karboksimetil (CM) skupina
Kationski izmjenjiva:negativno nabijena polimerna zrnca
A i ki i j ji
celulozaili
agaroza
pozitivno nabijeni proteiniveu se za negativno
nabijena polimerna zrnca
Kationski izmjenjiva
13 Dietilaminoetil (DEAE) skupina
celulozaili
agaroza
Anionski izmjenjiva:pozitivno nabijena polimerna zrnca
Vezani protein ispire se (eluira)rastuom koncentracijom soli
negativno nabijeniproteini prolaze
Afinitetna kromatografijaRazdvajanje proteina na osnovu afiniteta prema specifinimkemijskim skupinama (ligandima)
ciljni protein
ligandligand vezanna matriks
smjesaproteina Interakcije
enzim-inhibitorhormon-receptorantitijelo-antigenprotein-ugljikohidratenzim-koenzimmetaloprotein-ion metala
14
krutinosa
Protein se ispire s koloneistiskivanjem s visokomkoncentracijom liganda
ciljni proteinvee se na
ligand
-
8Odreivanje koncentracije proteina po Bradfordu
badarni pravac
t iApso
rban
cija
(595
nm
)na
15 Rastua koncentracija proteinaspektrofotometrijsko odreivanje koncentracije proteinamjerenje apsorbancije kod 595 nmbadarni pravac: albumin goveeg seruma (BSA)
mg proteinaA
Aktivnost enzima
spektrofotometrijskim mjerenjem promjene absorbancije UV ili vidljive svjetlosti u jedinici vremena
fluorimetrijskim mjerenjem promjene fluorescencije u jedinici vremena
UV/VIS spektrometar Fluorimetar
16
-
9Elektroforetske tehnikeRazdvajanje temeljem razliite pokretljivosti nabijenih estica u elektrinom polju
Vrste nosaa za elektroforezu papir celuloza acetat
k b i l
papir
pufer
17
krobni gel agarozni gel poliakrilamidni gel
mjestonanoenja
uzorka
pozitivniioni
negativniioni
SDS-PAGESodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Koristi se najee u analitike svrheDikontinuirana denaturirajua elektroforeza
18
-
10
Polimerizacija akrilamida
akrilamid metilen-bisakrilamidpersulfat
sulfatni radikal
akrilamid monomerje kancerogen
19
(zapoinje polimerizaciju)
poliakrilamidniporozni gel
Vinilna polimerizacijamonomera akrilamida
Unakrsno povezivanjedodatkom metilen-bisakrilamida
Priprema uzorka proteina za SDS- PAGE
merkaptoetanoldenaturira protein
SDS SDS ( t ij d d il lf t)
20
SDS
SDS se vee naprotein u omjeru1 SDS na 1,4aminokiseline
svi proteini imaju isti omjernaboja i mase
aminokiselina:SDS = 2:1
SDS (natrijev dodecilsulfat) detergent
[CH3(CH2)10CH2OSO3-]Na+
-
11
Razdvajanje proteina u poliakrilamidnom gelu(SDS - PAGE)
smjer
smjesamakro-molekula
elektroforeza
uzorak
gel
katodajaice pufer
21
jelektroforeze
porozni gelanoda
pufer
Razdvajanje proteina na temelju molekulske mase
Proteinske vrpce postaju vidljive bojanjem
Bojanje bojomCoomassie brilliant blue
Bojanje srebrom(vea osjetljivost)
22
-
12
Odreivanje molekulske mase proteina s SDS-PAGEOdreivanje molekulske mase proteinapomuu SDS-PAGE
apoferitin
katalaza (tetramer)amilaza
katalaza (dimer)
lb i olek
ulsk
a m
asa
1,000,000
100,000
Mr66,200
29,000
23Marker
poznate MrUzorak
nepoznate Mr
albumin goveeg seruma
Retencijsko vrijeme (min)
Mo
10,00023 25 27 29 31
14,300
Praenje izolacije i proiavanja proteinapomou gel elektroforeze
1. stanini ekstrakt2. isoljavanje3 kromatografija na ionskom
24
3. kromatografija na ionskomizmjenjivau
4. gel filtracija5. afinitetna kromatografija
-
13
Dvodimenzionalna elektroforezaRazdvajanje proteina slinih svojstava
smjer protoka otapala A
razdvajanje uprisutnosti otapala B
ishodite
smjer
25
razdvajanjeuzastopnomprimjenom
otapala A i B
protokaotapala
B
razdvajanje uprisutnosti otapala A
Izoelektrino fokusiranjeRazdvajanje proteina u gradijentu pH
niski pH visoki pH
26Protein se kree u gradijentu pH do toke
u kojoj pH odgovara izoelektrinom pH proteina
niski pH visoki pH
-
14
Western blotPrijenos razdvojenih vrpci proteina s gela na membranu i detekcija
preslik nanitrocelulozi
vezanjeprimarnogprotutijela
vezanjeenzimski-vezanog
sekundarnogprotutijela
imunoblot
27
gel koji sadriprotein Enzimski kataliziranompretvorbom supstrata u
obojeni produkt proteinskavrpca postaje vidljiva
SDS-PAGE Western blot
28
-
15
Aminokiselinski sastav proteina
Elucijski profil proteinskog hidrolizata
29
Elucijski profil standardnih aminokiselina
Elucijski volumen
Edmanova odgradnjaOdreivanje slijeda aminokiselina u polipeptidnom lancu
fenil-izotiocijanat
obiljeavanje N-terminalneaminokiseline
30
odgradnja
PTH-alanin
peptid skraen za jednuaminokiselinu
-
16
HPLC (High pressure liquid chromatography)Razdvajanje aminokiselina, peptida i malih molekula pod visokim pritiskom
31
MALDI- MS(Mass Assisted Laser Desorption/Ionisation)
ionizacijaproteinskog
uzorka elektrinopoljeubrzava
ione
32
Kristalizacija proteina s matricom kojaima maksimum apsorpcije na valnoj
duljini laseramatriksproteinuzorak
detektorcijev proleta
laserska zraka
-
17
Nuklearna magnetska rezonancija (NMR)
Kemijski pomak (ppm)
nerg
ija
ener
gija
Prijelaz izmeuspinskih stanja
daje liniju uNMR spektru
Razlika uenergiji
33 Kemijski pomak (ppm)
Jakost magnetskog polja
zraenje
en
Difrakcija rendgenskih zraka na kristalu proteina
IzvorX-zraka
X-zraka
34
Kristal
Difrakcijska slika
-
18
Od difrakcijske slike do kristalne strukture
35
Difrakcijska slika Elektronska gustoa 3D struktura
3D-struktura aktivnog mjesta
36