Use of Ultra Filtration for the Study of
Phenol Red Binding to Serum Albumin
Bo Nordström
School of Engineering, Jönköping University
P.O. Box 1026, S 551 11 Jönköping, Sweden
Abstract
A fast ultrafiltration method is described for quantitative studying of protein-ligand
interactions at equilibrium. This protocol is aimed for student studies in the laboratory.
Bovine serum albumin is allowed to complex with phenol red dye at various
concentration ratios in a series of tests. These equilibrium mixtures are then subject to
quick ultrafiltration steps using centrifugal ultrafiltration filters. The dye concentrations in
the filtrates are determined by spectrophotometry, thus establishing the concentrations of
free dye in equilibrium with protein bound dye in each case. In combination with
knowledge of the protein concentration and the total amount of dye in each case, it is
possible to evaluate the number of bound phenol red molecules per protein molecule.
In a typical experiment a saturation curve, and a Scatchard plot were constructed using
results from 10 different equilibrium mixtures. The results typically show that a total of
13-14 phenol red molecules bind to serumalbumin by two interacting sites with different
binding constants.
Keywords
Biochemistry, Laboratory Instruction, Proteins/Peptides, Dyes/Pigments
Table of contents
Introduction …………………………………………………………...1
Experimental procedure ………………………………………………………...…2
Chemicals …………………………………………………………...2
Instruments …………………………………………………………...2
Results and discussion …………………………………………………………...4
Literature …………………………………………………………...9
Appendix:
Student laboratory protocol ………………………………………………….10
Introduction
Many courses in biochemistry include experiments using dyes for studying ligand-protein
interactions quantitatively. Saturation curves as well as Scatchard plots are used to
estimate the resulting number of ligands and their binding constants. Systems that have
been described, include the interaction between Coomassie Blue dye and ovalbumin (1).
Here the dye develops a colour change upon binding to the protein, which constitutes a
means to estimate the amounts of bound and free dye at equilibrium. Other experiments
use separation of the equilibrium mixture of protein-dye complex and free dye molecules
followed by determination of free dye by spectrophotometry. Boyer (2) describes such an
experiment using phenol red dye binding to bovine serum albumin, where the equilibrium
mixture is treated by gel chromatography for separation of free dye from protein-dye
complex. Slight improvements and corrections of Boyer´s experiment have recently been
suggested by Silverstein (3).
This paper describes a method with a setup similar to Boyer´s, but using a fast
ultrafiltration step to separate free dye from protein-dye complex at equilibrium. This is
followed by spectrophotometric determination of free dye in the filtrate using its
absorption maximum at 430 nm at pH 4.0. Parallel procedures are used for several
different protein-dye concentration combinations. The experiments and the following
calculations are readily finished in 4-5 h making the method suitable for a half-day
student lab in biochemistry.
The resulting Scatchard plot shows a curved line with two distinct slopes, suggesting two
interacting binding sites with different binding constants. The saturation curve and the
Scatchard plot show binding of a total of 13-14 phenol red molecules to the protein
molecule. This value is slightly uncertain and dependent upon how the information in the
Scatchard plot is used. For the same reason, the two binding constants are somewhat
uncertain. The multiple binding of phenol red to serum albumin, as found here, is
however well within agreement with earlier results (2).
1
Experimental procedure
Chemicals
Bovine serum albumin A7906 SIGMA Lot 30K0932
Phenol red MERCK Lot 53902741 349
Sodium acetate pA
Sodium hydroxide pA
MilliQ water
Instruments
Amicon® Centriplus® centrifugal filters, cutoff 50K, MILLIPORE
Perkin Elmer UV/VIS Spectrophotometer Lambda 16
Hettich Universal 30 RF Centrifuge
25 mg phenol red were dissolved in 20 mL of MilliQ water, slightly alkalized with
NaOH, thus producing a 3.5x10-3 M solution (PhR). The 430 nm molar absorptivity for
phenol red at pH 4 was estimated by spectrophotometry using this solution and a 0.20 M
sodium acetate buffer pH 4 (NaAc). A 20 mg/mL, corresponding to 3.0x10-4 M, solution
of bovine serum albumin (BSA) was also prepared in MilliQ water.
Ten different assays (1-10) were set up, each with 150 µL BSA solution, 300 µL NaAc
but with varying amounts of PhR, ranging from 3µL to 300 µL. MilliQ water was added
to a final volume of 1000 µL in each tube. The tubes were then softly shaken to avoid
foaming during incubation for 30 minutes at room temperature.
For comparison, ten other tubes (11-20) were also prepared with PhR solution and NaAc
solution volumes as above, but with no protein added. These were also diluted to final
volumes of 1000 µL in each case.
2
Meanwhile ten Centriplus® tubes were prepared by rinsing with MilliQ water followed by
washing the filters by centrifugating MilliQ water at 4000xg for 5 minutes. All water was
then carefully removed both from the filter units and the collecting tubes. Each tube was
then filled with one of the respective equilibrium solutions. These tubes were centrifuged
at 4000xg for 10 minutes, whereupon the filtrates were collected in the removable bottom
tubes.
The 430 nm absorbancies of the filtrates were then read in the spectrophotometer as well
as corresponding absorbancies for the solutions in the comparison tubes.
In each case, the equilibrium concentration of free phenol red (symbolized by [L]) could
now be calculated, using the absorbancy of the filtrate and the molar absorptivity at 430
nm for phenol red. Using the absorbancies of the comparison tube and the equilibrium
tube, the amount of protein bound phenol red at equilibrium could be calculated, as well
as the number of bound phenol red molecules per molecule of bovine serum albumin
(symbolized by ν) in each separate case.
The experimental values of [L] and ν were then used to construct a saturation curve of ν
versus [L], as well as a Scatchard plot of ν / [L] versus ν.
3
Results and discussion
The resulting 430 nm apparent absorbancies of filtrates from tubes 1-10 are displayed in
Table 1. below, whereas Table 2 shows the corresponding values from comparison tubes
11-20. When needed, the solutions were diluted directly in the cuvette with 0,3X NaAc in
order to read the absorbancy. The read absorbancy values were then multiplied by the
corresponding dilution factors in order to give "apparent absorbancies"
Table 1. Equilibrium mixtures 1-10 and 430 nm absorbancies of their filtrates
Tube nr Volume
BSA / µL
Volume
NaAc /µL
Volume
PhR / µL
Volume
H2O / µL
Apparent
A430-value
1 150 300 300 250 6.48
2 150 300 200 350 2.71
3 150 300 100 450 0.914
4 150 300 75 475 0.674
5 150 300 50 500 0.314
6 150 300 25 525 0.102
7 150 300 15 535 0.063
8 150 300 10 540 0.033
9 150 300 5 545 0.015
10 150 300 3 547 0.010
4
Table 2. Comparison mixtures 11-20 and their 430 nm absorbancies
Tube nr Volume1XNaAc
/ µL
Volume PhR
/ µL
Volume H2O
/ µL
Apparent
A430-values
11 300 300 400 20.82
12 300 200 500 13.88
13 300 100 600 7.25
14 300 75 625 5.30
15 300 50 650 3.58
16 300 25 675 1.79
17 300 15 685 1.10
18 300 10 690 0.695
19 300 5 695 0.364
20 300 3 697 0.224
The number of bound ligands to each protein molecule, ν, the corresponding equilibrium
concentration of free ligand, [L], and ν/[L] were then calculated. These values are
displayed in Table 3 below. The experimentally determined value (ε430 = 1.97x104
M-1cm-1) for the molar absorptivity of phenol red was used for the calculations. This ε430-
value is somewhat higher than was reported by Silverstein (3).
5
Table 3. The numbers of ligands per protein molecule, ν, the concentrations of free
ligand, [L], and corresponding ν / [L] quota at different equilibria
No ν / (mol / mol) [L] / (mol / L) ν/[L] / (L / mol)
1 8.01 3.29 . 10-4 24300
2 6.24 1.38 . 10-4 45200
3 3.54 4.64 . 10-5 76300
4 2.74 3.42 . 10-5 80100
5 1.82 1.59 . 10-5 115000
6 0.94 5.19 . 10-6 181000
7 0.58 3.21 . 10-6 181000
8 0.37 1.69 . 10-6 218900
9 0.19 7.46 . 10-7 255000
10 0.12 5.18 . 10-7 232000
A Scatchard plot (Fig.1) as well as a saturation curve (Fig.2) were constructed using the
values from Table 3.
6
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
v (mol/mol)
v/[L] (1/M)
Fig. 1. Scatchard plot, ν/[L] as function of ν
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,00E+00 5,00E-05 1,00E-04 1,50E-04 2,00E-04 2,50E-04 3,00E-04 3,50E-04
[L] / M
v / mol/mol)
Fig. 2. Saturation curve, ν as function of [L]
7
As can be seen from the saturation curve, the maximum number of phenol red ligands to a
serum albumin molecule is well above 8. The non-linear result of the Scatchard plot
shown in Figure 1 clearly indicates non-similar, interacting binding sites for phenol red
on the protein molecule.
Two straight lines were fitted to the data above, assuming two types of binding sites. One
of the lines1, using points 1-4 in Table 3, corresponds to a binding site for approximately
ten phenol red molecules with a binding constant of Kf =1x104. The other line2, using
points 4-10, shows binding of approximately 4 phenol red molecules with Kf = 6x104.
These results showing multiple binding, are well in agreement with other experiments (2)
on the binding of dyes to bovine serum albumin.
In my biochemisty courses I have used methods from both protocols (1, 2) suggested by
Boyer as foundations for lab protocols to study protein-ligand interactions. However, I
have experienced drawbacks with both protocols. I feel that the Coomassie Blue dye
binding lab has been theoretically too advanced for my beginners in biochemistry, thus
making it less suitable. In the other, more theoretically straight-forward case, where the
equilibrium mix is separated by gel filtration, I have had trouble with the gel filtration
step due to partial binding of dye to the gel material. I, therefore, tried to membrane
filtrate the equilibrium mixtures instead of using gel filtration to separate free dye from
complexed dye. This turned out to be both a simple and quick method for the separation
with the aid of Centriplus® tubes from AMICON. A few minutes centrifugation of the
equilibria mixtures readily separates enough of free dye solution for analysis in the
spectrophotometer. The recommendations of the manufacturer (4) include centrifuging
the Centriplus® tubes upside down to collect the concentrated protein solution above the
membrane. If this handling of the tubes is avoided, the centrifuge tubes may be reused for
the described experiments a great number of times, if only care is taken not to damage the
membrane on rinsing, filling or evacuating the tubes. I, therefore, highly recommend the
procedure described above for studying ligand-protein interactions. The experimental
1 ν /[L] = -10870 ν - 112300 ( R2 = 0.994 ) 2 ν /[L] = -62880 ν - 241000 ( R2 = 0.937 ) 8
procedure is cheap, straight-forward, simple, reliable and fast, and the following
treatment of data to achieve the results is also straight-forward and simple making the
protocol ideal for a student experiment.
Literature
1. Boyer, R.F. Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed.; Benjamin/Cummings
Publishing Company, Inc. : Redwood City, CA, 1993; p 285
2. Boyer R.F. Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed. ; Benjamin/Cummings; San
Francisco, CA, 2000; p 243
3. Silverstein, T. J. Chem. Ed. 81 (2004) 645
4. CENTRIPLUS® Concentrators Operating Manual, Publication I-430B; AMICON Inc.,
Beverly, MA, 1996
9
1(10)
Appendix: Student lab protocol
Bindning av färgämnet fenolrött till proteinet serum albumin - en studie av protein-ligand bindning Bakgrund Proteinet serum albumin är ett transportprotein som finns i blod hos däggdjur. Proteinet har flera bindningsställen på sig för mindre molekyler och man vet att det är transportör i blodet av ämnen som inte har så god vattenlöslighet, exempelvis fettsyror. Man vet också att många läkemedel binder till serumalbumin och på så sätt fördelas i kroppen via blodbanan. Man har också funnit att färgämnen kan binda till serumalbumin. Interaktionen mellan albumin och färgämnen har utnyttjats som modell för interaktioner mellan makromolekyler och mindre molekyler - så även i denna laboration. Kvantitativ behandling av ligandbindning I biokemisk terminologi kallas en liten molekyl som binder till en makromolekyl för ligand till den stora molekylen. Bindningsstyrkan mellan de två molekylerna uttrycks ofta som en jämviktskonstant, bildningskonstanten , Kf.
Om liganden betecknas med L och makromolekylen med M, kan komplexbildningen beskrivas med
L + M LM Komplexkonstanten, Kf, är då helt enkelt lika med jämviktskonstanten för denna jämvikt:
[ ][ ] [ ]ML
LMK f
⋅=
Ju högre Kf värde desto starkare är bindningen mellan ligand och makromolekyl.
För att kunna bestämma Kf måste man då i princip kunna mäta koncentrationerna vid
jämvikt av L, M och LM. Då dessa är svåra att mäta direkt måste man skriva om jämviktsekvationen i sådana termer som är lättare mätbara.
10
2 För att kunna härleda ett sådant samband definierar vi följande: [L] = jämviktskoncentrationen av fri (obunden) ligand [M] = jämviktskoncentrationen av makromolekyl utan bunden L, eller koncentrationen av ickeockuperade bindningsställen [LM] = jämviktskoncentrationen av ligand-makromolekylkomplex, eller koncentrationen av upptagna bindningsställen [M]o = totalkoncentrationen av makromolekyl, eller totalkoncentrationen av tillgängliga
bindningsställen [L]o = ursprungskoncentrationen av ligand, eller sammanlagda koncentrationen av bunden och obunden ligand ν = bråkdelen av makromolekylerna som bundit ligand = bråkdelen upptagna ligandbindningsställen
dvs [ ][ ]0M
LM=ν
Eftersom [ ] [ ] [ ]MLMM +=0 , kan man skriva om detta uttryck till
[ ]
[ ] [ ]MLM
LM
+=ν
Men [ ] [ ] [ ]MLKLM f ⋅⋅= ⇒
[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]MMLK
MLK
f
f
+⋅⋅
⋅⋅=ν
Förenkling ger
[ ]
[ ] 1+⋅
⋅=
LK
LK
f
fν
En graf av ν mot [L] ger därför en hyperbolisk mättnadskurva som närmar sig ett gränsvärde eller mättnadsvärde, där alla bindningsställen är upptagna. Eftersom det är svårt att avläsa ett exakt värde för mättnad används sällan denna typ av icke-linjär kurva för att bestämma Kf. Linjära samband är mer önskvärda så uttrycket konverteras därför till en ekvation för en rät linje.
3
[ ]1
111+⋅=
LK fν
Vi ska nu göra om slutekvationen ovan till en mer allmängiltig form där man tillåter flera olika bindningsställen på en och samma makromolekyl. Vi skall använda symbolen ν för att representera det genomsnittliga antalet bundna ligander per M-molekyl och n får betyda det möjliga totala antalet bindningsställen per M-molekyl. Då blir ν /n bråkdelen upptagna ligandbindningsställen i detta fall. Om dessa är ekvivalenta så kan vi skriva om ekvationen till
Denna ekvation innehåller en term som ofta är svårbestämd, [L] - koncentrationen av fri ligand vid jämvikt, så man gör ofta om uttrycket till ett mer lättbestämt sådant. Om ν är medelvärdet av antalet bundna ligander per M-molekyl, så är n - ν medelvärdet av antalet ickeockuperade bindningsställen per M-molekyl
[ ]
[ ] 1+⋅
⋅⋅−=−
LK
LKnnn
f
fν
Om man förenklar detta får man
) [ ] ) [ ]( ) [ ](( LKnLKnLKn fff ⋅⋅−+⋅⋅=+⋅⋅− 11ν
och
[ ] 1+⋅=−
LK
nn
f
ν
För att förenkla ytterligare kan man låta termen ν
ν
−n få betyda kvoten mellan
ockuperade och ickeockuperade bindningsställen på M och då får man
[ ]
[ ]
[ ]
+⋅⋅
+⋅
⋅⋅=
− n
LK
LK
LKn
nf
f
f 1
1ν
ν
eller
][
][ 1+⋅
⋅⋅=
LK
LKn
f
fν
4
[ ]LKn f ⋅=
−ν
ν
En mer önskvärd form för grafisk behandling är "Scatchard"-sambandet
[ ]( )ν
ν−⋅= nK
L f = ν⋅−⋅⋅ff KnK = nKK ff ⋅+⋅− ν
En s.k. Scatchard plot fås därför om man i ett diagram avsätter ν / [L] mot ν . Om man då finner en rät linje enligt figuren nedan, så tyder detta på att alla bindningsställena är identiska och oberoende. Kf och n avläses som visas i figuren.
Figur1. Scatchardplotter. Övre linjen representerar ligandbindningen till en makromolekyl med icke interagerande bindningsställen. Linjen har extrapolerats så att skärningarna med axlarna kan avläsas. Den undre, streckade kurvan visar ligandbindning till bindningsställen som interagerar. Den streckade upplöses till två räta linjer med olika lutningar som vardera kan evalueras för n och Kf,. I härledningen av "Scatchardsambandet" antar man att Kf är identisk för alla bindningsställen, dvs att bindning av en ligandmolekyl inte påverkar bindningen av de andra ligandmolekylerna då de binder till M. Emellertid är det mycket vanligt vid ligand-makromolekyl interaktioner med sådan påverkan. Bindningen av en L molekyl kan därför ofta antingen förenkla eller försvåra bindningen av nästa ligandmolekyl till M.
5 I figuren ovan illustreras ett sådant fall - att bindningen är kooperativ. Man får då ett ickelinjärt samband såsom visas av den streckade linjen i figuren nedan. Ur den streckade linjens förlopp kan man utläsa antalet typer av bindningsställen. I detta fall när den streckade linjen kan lösas upp i två räta linjer indikerar detta att två typer av bindningsställen finns på M-molekylen. Antalet bindningsställen av vardera sorten (respektive n-värde) och de tillhörande bindningskonstanterna (respektive Kf värde) kan uppskattas ur Scatchardplotten genom att extrapolera de två räta linjerna till axlarna, så som framgår av figuren. Översikt av experimentet I experimentet används serum albumin från nötkreatur och färgämnet fenolrött.
Figur 2. Fenolrött
Figur 3. Humant serumalbumin, som är av ungefär samma storlek som det bovina albuminet (pdb-fil 1AO6)
6 Albumin och fenolrött får bilda komplex vid ett antal olika molförhållanden. Då jämvikt uppnåtts i varje delförsök separeras snabbt komplexet bort från fritt färgämne genom en kort filtrering genom ett ultrafilter. Detta tillåter vatten, buffertsubstanser och fritt färgämne passera genom filtret men inte makromolekylen eller makromolekylen med bundet färgämne. Koncentrationen av fritt färgämne i filtratet kan sedan lätt bestämmas med spektrofotometern. Med kännedom om ursprungsmängderna av färgämne och protein kan man därför lätt räkna fram andelen bunden färg i de olika delförsöken - och därmed antalet färgämnesmolekyler per proteinmolekyl. Härur kan sedan n och Kf bestämmas som beskrivs ovan.
Experiment Kemikalier Fenolrött, vattenlösning 25 mg/20 ml, 3,5 . 10-3 M (FR) Bovint serumalbumin Acetatbuffert, O,60 M, pH = 4,0 Utrustning Amicon Centriplus rör, cutoff 50 K Spektrofotometer Halvmikro- och mikrokyvetter Centrifug Utförande A. Att bereda och koncentrationsbestämma en serumalbuminlösning, 40 mg/ml.
Väg in 80 mg av serumalbuminet på vaxpapper med analysvågen. Överför pulvret till ett provrör och till sätt 2,0 ml MilliQ-vatten. Låt albuminet lösa sig. Skaka inte lösningen utan vagga den i provröret i stället - om du skakar skummar lösningen kraftigt. Koncentrationsbestäm sedan lösningen i spektrofotometern vid 280 nm i halvmikrokyvett (kvarts) mot 0,06 M acetatbuffert som referens: Pipettera ned 1000 µl 0,06 M acetatbuffert i kyvetten och sedan 50 µl av proteinlösningen. Vänd lösningen ett par gånger i kyvetten och avläs vid 280 nm. Serumalbumin har ε280 = 4,0
. 104 M-1cm-1 . Beräkna koncentrationen av serumalbuminlösningen i mol/dm3 utgående från detta värde och sedan i mg/ml ur detta värde och med kännedom om molmassan 66 000 g/mol för serumalbuminet. Detta bör ge svaret cirka 40 mg/ml. B. Bestämning av ε430 för fenolröttlösning
Mät absorbansen för fenolröttlösningen på samma sätt med 0,06 M acetatbuffert som referens men nu vid 430 nm: Pipettera 1000 µl 0,06 M acetatbuffert ned i kyvetten och
7 därefter 15 µl fenolröttlösning. Vänd så det blandas ordentligt och avläs sedan A430. Beräkna sedan ε430 för fenolrött med kännedom om att lösningen innehåller 25 mg/20 ml och att molmassan för fenolrött är 354 g/mol. Du bör få värdet cirka 20 000 M-1cm-1. C. Jämviktsförsök
Gör nu i ordning en serie jämviktsförsök i 10 st provrör, 1 - 10: Börja med att till varje rör sätta 150 µl av serumalbuminlösningen samt 300 µl av 0,20 M acetatbuffert pH=4,0. Sätt därefter till fenolröttlösning till respektive rör enligt: 1: 300 µl 2: 200 µl 3: 100 µl 4: 75 µl 5: 50 µl 6: 25 µl 7: 15 µl 8: 10 µl 9: 5 µl 10: 3 µl Komplettera i varje rör med MilliQ-vatten till volymen 1000 µl. Blanda varje rör försiktigt utan att låta det skumma. Låt inkuberas medan du fortsätter med försöken nedan. För jämförelse prepareras 10 st andra rör, 11 - 20, enligt: Till varje rör pipetteras 300 µl 0,20 M acetatbuffert pH= 4,0. Pipettera sedan ned fenolröttlösning i rören enligt samma schema som för jämviktsrören ovan. Tillsätt sedan MilliQ-vatten i varje rör så att totalvolymerna blir 1000 µl. Blanda lösningarna. D. Ultrafiltrering av jämviktsblandningarna
Skölj 10 stycken Centriplus-rör noggrant med MilliQ-vatten. Fyll därefter vatten ovan filtret och skölj filtren genom att centrifugera vatten under 5 minuter vid 5000 rpm. Töm därefter rören helt och torka dem torra. Torka membranfiltren genom att försiktigt pressa en Kleenex-sudd mot membranets ovansida och mot undersidan. Fyll därefter rören med varsin jämviktslösning och centrifugera vid 5000 rpm 5 minuter. Filtraten som skall analyseras samlas i Centriplus-rörens underdel. E. Mätning av absorbans vid 430 nm i rör 11 - 20 och i filtrat från rör 1 - 10
Flera av dessa lösningar har för hög absorbans för att man ska kunna mäta den direkt - de behöver spädas i 0,06 M acetatbuffert direkt i kyvetten. Vissa lösningar har tillräcklig volym för semimikrokyvett medan vissa kräver mikrokyvett. Förslag till kyvettstorlek och spädningar syns i nedan: Filtraten från rör 1-10: Spädda filtrat mäts i halvmikro-, ospädda filtrat i mikrokyvett.
8 1: 100 µl → 1100 µl 2: 300 µl → 1000 µl 3 - 10: osp Rörserie 11 - 20: Samtliga mätningar i halvmikrokyvett med följande spädningari 0,05 M acetatbuffert.
11: 50 µl → 1050 µl 12: 100 µl → 1100 µl 13: 100 µl → 1100 µl 14: 200 µl → 1200 µl 15: 200 µl → 1200 µl 16: 500 µl → 1000 µl 17: osp 18: osp 19: osp 20: osp
9
Analys av mätdata A. Beräkningar av [ ]L , ν och [ ]L
ν
För varje jämviktsdelförsök görs nu med hjälp av dina data beräkningar av proteinmängd (mol) i röret, bråkdelen av färgämnet som bundit till protein, jämviktskoncentrationen av fritt färgämne [L] (mol/dm3) samt antalet färgämnesmolekyler som bundit per proteinmolekyl, ν .
Dessutom skall för varje delförsök kvoten Lν beräknas.
Här följer ett exempel på hur beräkningarna kan se ut i rör 1: Antag att du fått följande värden på A430 i rör 1 respektive rör 11: 0,5895 respektive 0,9916. Antag dessutom att du har fått serumalbuminkoncentrationen till 6,06 . 10-4 M och att du erhållit ε430 = 19700 M
-1cm-1 för fenolrött.
Skenbar absorbans3 från total mängd färgämne i röret: 82,209916,050
1050=⋅
Skenbar absorbans från fritt färgämne vid jämvikt: 48,65895,0100
1100=⋅
Andel bundet färgämne: 689,082,20
48,682,20=
−
Vid jämvikt är koncentrationen fritt färgämne: [ ] 41029,319700
48,6 −⋅==L mol/dm3
Mängden albuminbundet färgämne: 73 1028,710119700
82,20689,0 −−⋅=⋅⋅
⋅mol
Mängd serumalbumin i delförsöket: 846 1009,91006,610150 −−−
⋅=⋅⋅⋅ mol
Antal bundna fenolröttmolekyler/albuminmolekyl: 01,81009,9
1028,78
7
=⋅
⋅=
−
−
ν
Man får då [ ]
243001029,3
01,84
=⋅
=−L
ν.
3 Skenbar absorbans beräknas som uppmätt absorbansvärde för utspädd lösning gånger spädfaktorn och används här som ett mått på färgämneskoncentrationen. Reell absorbans är förstås inte linjärt beroende av koncentration vid så höga värden.
10 B. Grafisk behandling: mättnadskurva och Scatchardplot
Avsätt i diagram ν som funktion av [ ]L så att en mättningskurva fås . Uppskatta ur
figuren det maximala värdet på ν vid hög ligandkoncentration.
Gör ytterligare ett diagram där [ ]Lν avsätts som funktion av ν . Analysera kurvans
förlopp i detta Scatchard diagram enligt beskrivningen bakgrunden ovan. Beräkna Kf- och n-värden.
Efterarbete med membranfilterrören Så snart alla mätningar har gjorts på filtraten kan rören rengöras. Skölj noga med MilliQ-vatten både inuti och utanpå rören. Centrifugera genom lite MilliQ-vatten för att rengöra filtren. Skölj därefter på nytt och fyll rören till sist med MilliQ-vatten innehållande 15-20 % (v/v) etanol. Sätt på locken och ställ därefter rören i kylskåp för förvaring.
Referenser Boyer, R.F. Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed.; Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. : Redwood City, CA, 1993; p 285 Boyer R.F. Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed.; Benjamin/Cummings; San Francisco, CA, 2000; p 243 Silverstein, T. J. Chem. Ed. 81 (2004) 645 CENTRIPLUS® Concentrators Operating Manual, Publication I-430B; AMICON Inc., Beverly, MA, 1996