-
Penentuan Kondisi Optimum Xilanase dari Aspergillus
niger yang Diamobilkan pada Matriks Bentonit Teraktivasi
SKRIPSI
Oleh:
INDIANA ZULFA
165090200111017
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2019
-
i
Penentuan Kondisi Optimum Xilanase dari Aspergillus
niger yang Diamobilkan pada Matriks Bentonit Teraktivasi
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
dalam bidang Kimia
Oleh:
INDIANA ZULFA
165090200111017
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2019
-
ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI
Penentuan Kondisi Optimum Xilanase dari Aspergillus niger
yang Diamobilkan pada Matriks Bentonit Teraktivasi
Oleh:
INDIANA ZULFA
165090200111017
Setelah diseminarkan di depan Majelis Penguji
pada tanggal……………………….
dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains dalam bidang Kimia
Pembimbing I
Drs. Sutrisno, M.Si.
NIP. 196203181990021001
Pembimbing II
Dr. Sasangka Prasetyawan, MS.
NIP. 196304041987011001
Mengetahui,
Ketua Jurusan Kimia
Fakultas MIPA Universitas Brawijaya
Masruri, S.Si., M.Si., Ph.D.
NIP. 197310202002121001
-
iii
LEMBAR PERNYATAAN
Saya yang bertanda di bawah ini :
Nama : Indiana Zulfa
NIM : 165090200111017
Jurusan : Kimia
Penulis skripsi berjudul :
Penentuan Kondisi Optimum Xilanase dari Aspergillus niger
yang Diamobilkan pada Matriks Bentonit Teraktivasi
Dengan ini menyatakan bahwa:
1. Isi dan skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya sendiri dan tidak menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang
termaktub di isi dan tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.
2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala
resiko yang akan saya terima.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.
Malang, 23 Desember 2019
Yang menyatakan,
(Indiana Zulfa)
165090200111017
-
iv
Penentuan Kondisi Optimum Xilanase dari Aspergillus niger
yang Diamobilkan pada Matriks Bentonit Teraktivasi
ABSTRAK
Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis
xilan menjadi xilosa. Pada penelitian ini, xilanase yang digunakan
diisolasi dari biakan Aspergillus niger. Xilanase dapat dalam bentuk
bebas dan amobil yang memiliki kondisi lingkungan yang berbeda.
Amobilisasi enzim xilanase dilakukan untuk meningkatkan stabilitas
enzim xilanase dengan proses pengikatan enzim pada matriks. Pada
penelitian ini digunakan bentonit teraktivasi asam sebagai matriks.
Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui nilai aktivitas optimum
enzim xilanase bebas dan amobil dalam matriks bentonit pada variasi
pH, suhu dan waktu inkubasi. Variasi pH yang digunakan yaitu pH 5,
6, 7, 8, dan 9. Variasi suhu yang dilakukan yaitu (40, 45, 50, 55, dan
60)°C dan variasi waktu inkubasi yang dilakukan yaitu (40, 45, 50, 55,
dan 60) menit. Kondisi optimum xilanase ditentukan secara
spektrofotometri dengan mengukur aktivitas xilanase bebas dan
amobil menggunakan reagen DNS sedangkan kadar protein awal dan
jumlah enzim xilanase yang teradsorpsi menggunakan reagen biuret.
Pada penelitian ini didapatkan kondisi optimum xilanase bebas adalah
pada pH 6 sebesar 3,029 µg/mg.menit, pada suhu 50°C sebesar 3,811
µg/mg.menit dan pada waktu inkubasi 45 menit sebesar 4,743
µg/mg.menit. Sedangkan kondisi optimum xilanase amobil adalah
pada pH 8 sebesar 0,821 µg/mg.menit, pada suhu 50°C sebesar 0,311
µg/mg.menit dan pada waktu inkubasi 55 menit sebesar 0,315
µg/mg.menit.
Kata Kunci: Xilanase, Aspergillus niger, Amobilisasi, Bentonit,
Optimum
-
v
Determination of Xylanase Optimum Condition from Aspergillus
niger Immobilized on Activated Bentonite Matrix
ABSTRACT
Xylanase is an extracellular enzyme that can hydrolyze xylan to
xylose. In this study, the xylanase used was isolated from the culture
of Aspergillus niger. Xylanase can be in a free and immobile form
which has different environmental conditions. Immobilization of
xylanase enzymes is done to increase the stability of xylanase enzymes
by binding the enzyme to the matrix. In this research, acid activated
bentonite is used as a matrix. The purpose of this study was to
determine the optimum activity value of free and immobilized
xylanase enzymes in the bentonite matrix on variations in pH,
temperature and incubation time. The pH variations used were pH 5,
6, 7, 8, and 9. The temperature variations carried out were (40, 45, 50,
55, and 60)°C and the incubation time variations made were (40, 45,
50, 55 and 60) minutes. The optimum condition of xylanase was
determined spectrophotometry by measuring the activity of free and
immobilized xylanases using DNS reagents while the initial protein
content and the amount of xylanase enzymes adsorbed using biuret
reagents. In this study, the optimum condition of free xylanase was
obtained at pH 6 of 3,029 µg/mg.minute, at 50°C at 3,811
µg/mg.minute and at 45 minutes incubation time of 4,743
µg/mg.minute. While the optimum condition of immobilized xylanase
is at pH 8 of 0,821 µg/mg.minute, at 50°C at 0,311 µg/mg.minute and
at 55 minutes incubation time of 0,315 µg/mg.minute.
Keywords: Xylanase, Aspergillus niger, Immobilization, Bentonite,
Optimum
-
vi
KATA PENGANTAR
Puji syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah
SWT atas limpahan nikmat, rahmat serta hidayah-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penentuan
Kondisi Optimum Xilanase dari Aspergillus niger yang
Diamobilkan pada Matriks Bentonit Teraktivasi” sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains dalam bidang Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam di Universitas
Brawijaya. Sholawat serta salam tetap tercurahkan kepada junjungan
Nabi Muhammad SAW beserta keluarga dan sahabatnya.
Penulis menyadari bahwa selama pelaksanaan skripsi ini telah
banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,
penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Drs. Sutrisno, M.Si. selaku dosen pembimbing I atas kesabaran, arahan, dan bimbingan selama penyusunan
proposal penelitian, pelaksanaan penelitian hingga
penyelesaian skripsi.
2. Dr. Sasangka Prasetyawan, MS. selaku dosen pembimbing II atas arahan, saran, motivasi dan bimbingan selama
penyusunan proposal penelitian, pelaksanaan penelitian
hingga penyelesaian skripsi.
3. Dr. Dra. Tutik Setianingsih, M.Si. selaku pembimbing akademik atas arahan dan bimbingan selama masa studi dan
penyelesaian skripsi ini.
4. Masruri, S.Si., M.Si., Ph.D. selaku Ketua Jurusan Kimia Universitas Brawijaya yang memberikan dukungan dalam
proses penyelesaian skripsi ini.
5. Riswoyo dan Sunarmi Ami selaku orang tua penulis yang selalu mendoakan, memberi dukungan dan motivasi untuk
penulis demi kelancaran skripsi.
6. Bapak Maryono selaku PLP Biokimia dan Nuril Fadilla selaku rekan satu tim penelitian atas dukungan semangat dan
berbagi ilmu terkait penelitian ini.
7. Farid Nur Huda dan seluruh sahabat Rastogi yang selalu memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis sehingga
penulisan skripsi ini dapat terselesaikan.
-
vii
8. UKM Seni Religi dan HMK UB sebagai tempat berkembang penulis selama masa studi.
9. Teman-teman Kimia 2016 atas kebersamaan dan dukungan kepada penulis selama masa studi.
10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan dukungan kepada penulis hingga
terselesaikannya skripsi ini.
Penulis menyadari banyak kekurangan dan kesalahan dalam
penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan
saran untuk memperbaiki kesalahan dalam penulisan selanjutnya.
Penulis berharap semoga naskah ini bermanfaat dan memberi
informasi bagi pembaca.
Malang, 23 Desember 2019
Penulis
-
viii
DAFTAR ISI
COVER
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PENGESAHAN ii
HALAMAN PERNYATAAN iii
ABSTRAK iv
ABSTRACT v
KATA PENGANTAR vi
DAFTAR ISI viii
DAFTAR GAMBAR xi
DAFTAR TABEL xii
DAFTAR LAMPIRAN xv
BAB I PENDAHULUAN 1
1.1 Latar Belakang 1
1.2 Rumusan Masalah 2
1.3 Batasan Masalah 3
1.4 Tujuan Penelitian 3
1.5 Manfaat Penelitian 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4
2.1 Klobot Jagung 4
2.2 Xilan 4
2.3 Aspergillus niger 5
2.4 Enzim 6
2.5 Xilanase 6
2.6 Amobilisasi Enzim 7
-
ix
2.7 Matriks Bentonit 7
2.8 Aktivitas Enzim 8
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 10
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 10
3.2 Alat dan Bahan Penelitian 10
3.2.1 Alat 10
3.2.2 Bahan 10
3.3 Tahapan Penelitian 11
3.4 Prosedur Penelitian 12
3.4.1 Pembuatan Tepung Klobot Jagung 12
3.4.2 Pembuatan Media Padat 12
3.4.3 Peremajaan Biakan Murni Aspergillus niger 12
3.4.4 Pembuatan Media Cair 13
3.4.5 Pembuataan Inokulum 13
3.4.6 Produksi Enzim 13
3.4.7 Isolasi Ekstrak Kasar Xilanase dari Biakan Aspergillus
niger 14
3.4.8 Penentuan Kadar Protein Awal 14
3.4.9 Penentuan Kurva Baku Gula Pereduksi Xilosa 15
3.4.10 Penentuan Aktivitas Xilanase Bebas 16
3.4.11 Amobilisasi Enzim Xilanase pada Matriks Bentonit
Teraktivasi 18
3.4.12 Penentuan Aktivitas Xilanase Amobil 19
3.4.13 Penentuan Kadar Protein Enzim Xilanase Sisa 20
3.4.14 Analisa Data 20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 21
4.1 Produksi dan Isolasi Xilanase dari Aspergillus niger 21
4.2 Amobilisasi Xilanase pada Matriks Bentonit Teraktivasi 23
-
x
4.3 Penentuan Kondisi Optimum Xilanase Bebas dan Amobil 24
4.3.1 Penentuan pH Optimum 24
4.3.2 Penentuan Suhu Optimum 26
4.3.3 Penentuan Waktu Inkubasi Optimum 28
BAB V PENUTUP 31
5.1 Kesimpulan 31
5.2 Saran 31
DAFTAR PUSTAKA 32
LAMPIRAN 37
-
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1: Struktur xilan 5 Gambar 2.2: Struktur Montmorillonit 8
Gambar 4.1: Mekanisme reaksi enzimatis yang terjadi pada
pembentukan xilosa 22 Gambar 4.2: Reaksi reagen DNS dengan Xilosa 23
Gambar 4.3: Kurva Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim
Xilanase Bebas dan Amobil 25
Gambar 4.4: Kurva Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim
Xilanase Bebas dan Amobil 27 Gambar 4.5: Kurva Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap
Aktivitas Enzim Xilanase Bebas dan Amobil 29
Gambar D.1: Kurva Penentuan λmaks Kasein 46
Gambar D.2: Kurva Baku Larutan Kasein 47
Gambar F.1: Kurva Penentuan λ maks Xilosa 49 Gambar F.2 Kurva Baku Larutan Xilosa 50
-
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1: Komposisi Kimia Klobot Jagung 4 Tabel D.1: Data Absorbansi Kasein pada λ = 460-600 nm 46
Tabel D.2: Data Absorbansi Kasein pada Panjang Gelombang
Maksimum (λmaks = 540 nm) 47 Tabel F.1: Data Absorbansi Larutan Xilosa 300 µg/mL pada λ 480-
600 nm 49
Tabel F.2: Data Absorbansi Larutan Xilosa pada Panjang Gelombang
Maksimum (λmaks = 490 nm) 50 Tabel G.1: Data Absorbansi Xilanase Bebas Variasi pH 6-9 pada
λmaks 490 nm 51
Tabel G.2: Data Konsentrasi Xilosa Xilanase Bebas pada Variasi pH
Dengan Pengenceran 25 mL 51 Tabel G.3: Data Aktivitas Xilanase Bebas Variasi pH 52 Tabel G.4: Data Absorbansi Xilanase Bebas Variasi Suhu 40, 45,
50,55 dan 60°C pada λmaks 490 nm 52 Tabel G.5: Data Konsentrasi Xilosa Xilanase Bebas pada Variasi
Suhu dengan Pengenceran 25 mL 53 Tabel G.6: Data Aktivitas Xilanase Bebas Variasi Suhu 53 Tabel G.7: Data Absorbansi Xilanase Bebas Variasi Waktu Inkubasi
40, 45, 50, 55 dan 60 menit pada λmaks 490 nm 53 Tabel G.8: Data Konsentrasi Xilosa Xilanase Bebas pada Variasi
Waktu Inkubasi Dengan Pengenceran 50 mL 54 Tabel G.9: Data Aktivitas Xilanase Bebas pada Variasi Waktu
Inkubasi 55 Tabel H.1: Data Absorbansi Protein Xilanase Sisa pada λmaks 540
nm 55
Tabel H.2: Kadar Protein Xilanase Sisa 55 Tabel I.1: Data Absorbansi Xilanase Bebas Variasi pH 6-9 pada
λmaks 490 nm 56
Tabel I.2: Data Konsentrasi Xilosa Xilanase Amobil pada Variasi pH
Dengan Pengenceran 15 mL 57 Tabel I.3: Data Aktivitas Xilanase Amobil Variasi pH 57 Tabel I.4: Data Absorbansi Xilanase Bebas Variasi Suhu 40, 45,
50,55 dan 60°C pada λmaks 490 nm 58 Tabel I.5: Data Konsentrasi Xilosa Xilanase Amobil pada Variasi
Suhu dengan Pengenceran 15 mL 58
-
xiii
Tabel I.6: Data Aktivitas Xilanase Amobil Variasi Suhu 59 Tabel I.7: Data Absorbansi Xilanase Amobil Variasi Waktu Inkubasi
40, 45, 50, 55 dan 60 menit pada λmaks 490 nm 59 Tabel I.8: Data Konsentrasi Xilosa Xilanase Amobil pada Variasi
Waktu Inkubasi Dengan Pengenceran 15 mL 60 Tabel I.9: Data Aktivitas Xilanase Amobil pada Variasi Waktu
Inkubasi 60 Tabel J.1: Data Pengaruh Variasi pH terhadap Aktivitas Xilanase
Bebas 61 Tabel J.2: Data Uji F Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase Bebas
62 Tabel J.3: Data Analisis Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase
Bebas dengan Uji BNT 5% 63 Tabel J.4: Data Pengaruh Variasi Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Bebas 63 Tabel J.5: Data Uji F Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Bebas 65 Tabel J.6: Data Analisis Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Bebas dengan Uji BNT 5% 66 Tabel J.7: Data Pengaruh Variasi Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas
Xilanase Bebas 66 Tabel J.8: Data Uji F Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas
Xilanase Bebas 68 Tabel J.9: Data Analisis Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas
Xilanase Bebas dengan Uji BNT 5% 68 Tabel J.10: Data Pengaruh Variasi pH terhadap Aktivitas Xilanase
Amobil 69 Tabel J.11: Data Uji F Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase
Amobil 71 Tabel J.12: Data Analisis Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase
Amobil dengan Uji BNT 5% 71 Tabel J.13: Data Pengaruh Variasi Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Amobil 72 Tabel J.14: Data Uji F Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Amobil 73
-
xiv
Tabel J.15: Data Analisis Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Amobil dengan Uji BNT 5% 74 Tabel J.16: Data Pengaruh Variasi Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas
Xilanase Amobil 74 Tabel J.17: Data Uji F Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas
Xilanase Amobil 76 Tabel J.18: Data Analisis Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap
Aktivitas Xilanase Amobil dengan Uji BNT 5% 77
-
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran A. Diagram Alir 37 Lampiran B. Preparasi Larutan 39 Lampiran C. Perhitungan 43 Lampiran D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan Kurva
Baku Kasein 46 Lampiran E. Uji Kadar Protein Awal dan Perhitungan Kadar
Xilanase Bebas (Kadar Protein Awal) 48 Lampiran F. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan Kurva
Baku Gula Pereduksi Xilosa 49 Lampiran G. Penentuan Aktivitas Xilanase Bebas 50 Lampiran H. Perhitungan Kadar Protein Xilanase Sisa 55 Lampiran I. Penentuan Aktivitas Xilanase Amobil pada Matriks
Bentonit 56 Lampiran J. Analisis Data Statistika 61
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Klobot jagung merupakan kulit terluar sebagai penutup biji
pada tanaman jagung. Klobot jagung sebagai limbah pertanian
mengandung hemisesulosa yang cukup tinggi. Tingginya
hemiselulosa dalam klobot jagung dapat digunakan sebagai induser
pertumbuhan jamur dalam produksi xilanase.
Xilanase adalah enzim ekstraseluler yang menghidrolisis
hemiselulosa atau xilan menjadi xilosa [1]. Xilanase dapat dihasilkan
dari beberapa mikroorganisme melalui proses fermentasi antara lain
jamur, ragi dan bakteri. Salah satu jamur yang dapat memproduksi
xilanase yaitu Aspergillus niger. Jamur ini memiliki kemampuan
dalam produksi beberapa jenis enzim, salah satunya enzim xilanase.
Selain itu, jamur ini memiliki morfologi yang sangat kompleks [2].
Enzim yang dihasilkan dari bakteri umumnya mempunyai ketahanan
pada suhu tinggi dibanding jamur, namun enzim yang dihasilkan dari
jamur mempunyai aktivitas xilanase lebih tinggi dibanding dari
bakteri. Selain itu, hasil produksi lebih banyak dan mudah dalam
kultivasi sehingga jamur banyak digunakan dalam produksi enzim [3].
Secara umum, xilanase dimanfaatkan dalam bentuk enzim
bebas. Padahal dalam penggunaan enzim bebas membutuhkan biaya
mahal, bersifat tidak stabil terhadap lingkungan dan hanya dapat
digunakan satu kali dalam reaksi. Karena enzim xilanase bebas tidak
stabil terhadap lingkungan, maka dilakukan amobilisasi enzim untuk
meningkatkan stabilitas enzim xilanase dan mencegah kerusakan
ketika pada pH dan suhu tertentu [4]. Amobilisasi enzim adalah upaya
untuk meningkatkan stabilitas operasional enzim dengan proses
pengikatan enzim pada suatu media pendukung serta memberikan
kemampuan pada enzim untuk dapat digunakan kembali secara
berulang-ulang. Enzim amobil secara fisik terjebak dalam ruang
tertentu dengan retensi dari aktivitas katalitiknya sehingga dapat
digunakan secara berulang-ulang.
Metode adsorpsi adalah salah satu metode amobilisasi
sederhana yaitu enzim dijerat berdasarkan interaksi ikatan ionik,
-
2
ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik antara enzim dan bahan pendukung
[5]. Dilakukan metode adsorpsi pada amobilisasi enzim dikarenakan
mudah, memiliki efek perubahan konformasi enzim yang kecil dan
mudah meregenerasi enzim yang tidak aktif [6]. Salah satu matriks
yang dapat digunakan dalam metode amobilisasi enzim yaitu bentonit.
Bentonit merupakan lempung yang bersifat plastis dan koloidal tinggi
dengan kandungan utama mineral montmorillonit yaitu dengan kadar
85-95%. Montmorillonit memiliki luas permukaan spesifik yang
besar, yaitu 700-800m2/gram. Oleh karena luas permukaannya besar,
bentonit merupakan adsorben yang baik [7].
Xilanase mempunyai kondisi optimum untuk bekerja secara
maksimal. Kondisi optimum xilanase dipengaruhi oleh beberapa
faktor diantaranya konsentrasi, pH lingkungan, suhu lingkungan serta
waktu selama enzim bekerja. Kondisi kerja optimum xilanase bebas
telah dilakukan pada penelitian Sujarwo dengan hasil kondisi
optimum xilanase bebas pada pH 8, suhu 55°C dan waktu inkubasi 55
menit. Karena kondisi lingkungan enzim bebas dan enzim amobil
berbeda, maka perlu dilakukan penentuan aktivitas xilanase bebas dan
amobil untuk mengetahui kondisi kerja optimum xilanase amobil yang
kemungkinan terjadi pergeseran dari enzim bebasnya. Oleh karena itu,
berdasarkan latar belakang tersebut, maka dilakukan penelitian
tentang penentuan kondisi optimum xilanase dari Aspergillus niger
yang diamobilkan pada matriks bentonit berdasarkan pengaruh suhu,
pH dan waktu inkubasi.
1.2 Rumusan Masalah Rumusan masalah dalam penelitian ini antara lain:
1. Bagaimana pengaruh pH terhadap kondisi optimum aktivitas xilanase yang diamobilkan pada matriks bentonit?
2. Bagaimana pengaruh suhu terhadap kondisi optimum aktivitas xilanase yang diamobilkan pada matriks bentonit?
3. Bagaimana pengaruh waktu inkubasi terhadap kondisi optimum aktivitas xilanase yang diamobilkan pada matriks
bentonit?
-
3
1.3 Batasan Masalah Batasan masalah dalam penelitian ini antara lain :
1. Induser produksi enzim xilanase dari Aspergillus niger menggunakan klobot jagung.
2. Enzim xilanase yang digunakan berupa ekstrak kasar hasil isolasi dari Aspergillus niger.
3. Amobilisasi enzim xilanase dilakukan pada pH 8 dengan menggunakan matriks bentonit teraktivasi.
4. Parameter yang dianalisis antara lain variasi pH (5, 6, 7, 8, 9), variasi suhu (40, 45, 50, 55, 60)°C dan variasi waktu inkubasi
(40, 45, 50, 55, 60) menit terhadap aktivitas enzim xilanase
bebas dan amobil.
1.4 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini antara lain:
1. Melakukan variasi pH untuk menentukan pengaruhnya terhadap kondisi optimum aktivitas xilanase yang
diamobilkan pada matriks bentonit.
2. Melakukan variasi suhu untuk menentukan pengaruhnya terhadap kondisi optimum aktivitas xilanase yang
diamobilkan pada matriks bentonit.
3. Melakukan variasi waktu inkubasi untuk menentukan pengaruhnya terhadap kondisi optimum aktivitas xilanase
yang diamobilkan pada matriks bentonit.
1.5 Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah dapat memberikan informasi
tentang pengaruh pH, suhu dan waktu inkubasi terhadap kondisi
optimum aktivitas enzim xilanase yang diamobilkan pada matriks
bentonit teraktivasi.
-
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Klobot Jagung
Tanaman jagung adalah salah satu makanan pokok yang
banyak dikonsumsi di Indonesia sehingga menghasilkan jumlah cukup
banyak limbah alami. Salah satu limbah alami tanaman jagung yaitu
klobot jagung. Limbah klobot jagung dapat dimanfaatkan menjadi
produk yang dapat menambah nilai dari limbah alami tanaman jagung
[8]. Komponen utama serat kasar klobot jagung yaitu hemiselulosa
sehingga disebut salah satu sumber xilan. Kandungan hemiselulosa
dalam klobot jagung sekitar 32%. Klobot jagung berperan menjadi
induser dalam media pertumbuhan untuk menginduksi biosintesis
enzim dari mikroorganisme. Komponen yang terdapat dalam klobot
jagung antara lain [9] :
Tabel 2.1: Komposisi Kimia Klobot Jagung
Komponen Kandungan (%)
Serat kasar 38
Selulosa 6.41
Hemiselulosa 32
Lignin 6.3
Abu 4.47
Protein kasar 6.41
2.2 Xilan
Ekstrak xilan adalah senyawa polisakarida yang tersusun atas
rantai karbon kompleks sehingga dapat menjadi sumber karbon.
Ekstrak xilan dapat berfungsi sebagai induser dalam produksi enzim
xilanolitik [10]. Xilan adalah komponen utama penyusun
hemiselulosa pada dinding sel tanaman. Selain itu, xilan merupakan
polisakarida kedua paling berlimpah di alam setelah selulosa, yaitu
menyusun 20-30% komposisi dinding sel tanaman [11]. Polimer xilan
terdiri dari rantai utama residu D-xilosa dengan ikatan β-1,4 dan
memiliki berbagai cabang, antara lain L-arabinosa, D-glukosa, D-
-
5
galaktosa, D-manosa, asam D-glukoronik, dan residu asam 4-O-metil
glukoronik [12].
Gambar 2.1: Struktur xilan [13]
2.3 Aspergillus niger
Aspergillus niger adalah jamur berfilamen memiliki hifa
berseptat yang banyak ditemukan di alam. Jenis jamur ini mudah
diisolasi dari tanah, air, udara, kapas, buah-buahan, beras, kopi, teh,
tebu serta jagung. Aspergillus niger merupakan mikroba jenis jamur
yang dapat tumbuh dengan cepat dan tidak berbahaya, hal ini
dikarenakan jamur tersebut tidak menghasilkan mikotoksin. Selain itu,
Aspergillus niger dapat bertumbuh dengan cepat sehingga banyak
digunakan secara komersial [14]. Aspergillus niger dapat
mendekomposisi polisakarida di dalam kayu, bersifat aerob,
bertumbuh pada suhu 30-37°C dan pH 4-6. Klasifikasi Aspergillus
niger yaitu [15] :
Kingdom : Fungi
Divisi : Fungi imperfecti
Kelas : Deuteromycetes
Sub Kelas : Hyphomyces
Ordo : Monoliales
Famili : Monoleaceae
Genus : Aspergillus
Spesies : Aspergillus niger
-
6
2.4 Enzim
Enzim merupakan benda tak hidup yang diproduksi oleh sel
hidup. Enzim berfungsi sebagai biokatalisator dengan mempercepat
laju reaksi kimia tanpa terlibat dalam reaksi tersebut. Enzim memiliki
ciri khas, yaitu bersifat tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya,
tidak mengubah kedudukan normal dari keseimbangan kimia
meskipun dapat mempercepat reaksi [16]. Jumlah enzim dinyatakan
dalam unit aktivitas enzim. Persetujuan internasional menyebutkan
1.0 unit aktivitas enzim adalah jumlah yang menyebabkan
pengubahan 1.0 mikromol (µmol = 10-6) substrat per menit pada
kondisi optimum. Jumlah unit enzim per miligram protein disebut
aktivitas spesifik yang merupakan ukuran kemurnian suatu enzim.
Selama pemurnian nilainya akan meningkat, menjadi maksimum dan
konstan saat enzim sudah dalam keadaan murni [17].
2.5 Xilanase
Xilanase adalah kelompok enzim yang mampu
menghidrolisis hemiselulosa dalam hal ini ialah xilan atau polimer
dari xilosa dan xilo-oligosakarida. Xilanase merupakan protein kecil
yang memiliki berat molekul antara 15.000-30.000 Dalton, aktif pada
suhu 55°C dan pada pH 9. Xilanase dapat dihasilkan dari jenis
mikroorganisme seperti jamur dan bakteri. Xilan merupakan sumber
karbon dalam produksi enzim xilanase. Xilosa dapat terbentuk dari
reaksi hidrolisis antara xilan dan aktivitas xilanase yang dihasilkan
oleh mikroorganisme. Enzim xilanase memiliki banyak kegunaan
antara lain untuk proses pemutihan kertas, pembuatan gula xilosa,
sebagai campuran pakan ternak, memperbaiki mutu produk makanan
dan minuman [18].
Xilan merupakan sumber karbon dalam produksi enzim
xilanase. Aktivitas xilanase yang dihasilkan oleh mikroorganisme
menjadikan xilan akan terhidrolisis menjadi xilosa [15] :
(C5H8O4)n + H2O C5H10O5
Xilan Xilosa
-
7
2.6 Amobilisasi Enzim
Enzim merupakan molekul bebas terlarut air sehingga sangat
sulit dipisahkan dari substrat dan produknya. Amobilisasi enzim
adalah salah satu upaya untuk menjadikan enzim pada kondisi tidak
bergerak dan tidak larut. Amobilisasi enzim dapat dilakukan dengan
[16] :
1. Pengikatan enzim secara kovalen pada permukaan bahan yang tidak larut air
2. Pengikatan silang dengan bahan yang cocok untuk menghasilkan partikel baru
3. Penjebakan di dalam suatu matrik atau gel yang permeabel terhadap enzim, substrat dan produk
4. Enkapsulasi 5. Absorbsi pada zat pendukung
Amobilisasi adalah metode menguntungkan yang dapat
meningkatkan efisiensi penggunaan enzim agar dapat digunakan
berulang-ulang serta memisahkan katalis dari media reaksi dengan
mudah. Amobilisasi enzim merupakan proses penahanan pergerakan
molekul enzim dalam reaksi kimia pada tempat tertentu yang
dikatalisnya. Amobilisasi enzim menjadikan enzim lebih stabil
terhadap suhu, pH dan lebih mudah dipisahkan dari campuran pada
akhir reaksi [19]. Spesifisitas substrat enzim dapat ditingkatkan
dengan amobilisasi sehingga dapat meningkatkan sifat enzim dan
dapat mengurangi efek inhibitor [20]. Keuntungan lain amobilisasi
enzim antara lain enzim yang sudah digunakan dapat digunakan
kembali, ideal untuk proses berkelanjutan, dapat mengontrol
keakuratan proses katalis, meningkatkan stabilitas enzim dan
memungkinkan pengambangan sistem reaksi multienzim [16].
2.7 Matriks Bentonit
Matriks atau bahan pendukung dapat meningkatkan kinerja
operasi sistem amobilisasi dan enzim yang diamobilisasi memiliki
sifat keduanya matriks dan enzim. Beberapa karakteristik penting dari
matriks untuk amobilisasi enzim antara lain stabilitas mekanisnya,
afinitas yang kuat, aksesibilitas situs aktif enzim untuk perubahan
kimia dengan mudah, hidrofilisitas dan lain-lain [21]. Salah satu
matriks yang dapat digunakan dalam produksi xilanase yaitu bentonit.
-
8
Bentonit merupakan bijih tanah liat yang melimpah. Bentonit
dapat digunakan sebagai matriks karena memiliki ukuran partikel
halus, luas permukaan tinggi dan kapasitas pertukaran kation,
keasaman permukaan. Bentonit yang diaktivasi dengan asam akan
menghasilkan bentonit dengan situs aktif yang lebih besar sehingga
daya adsorpsinya semakin tinggi dibandingkan bentonit yang belum
diaktivasi [22].
Kandungan utama bentonit yaitu mineral montmorillonit
sebesar 80% dengan rumus kimia MX(Al4.xMgx)Si8O20(OH)4.NH2O.
Selain itu, kandungan lain dalam bentonit yaitu kwarsa, ilit, kalsit,
mika dan klorit. Montmorillonit memiliki struktur terdiri 3 layer yaitu
1 lapisan alumina (AlO6) berbentuk oktahedral pada bagian tengah
diapit oleh 2 lapisan silika (SiO4) yang berbentuk tetrahedral.
Dibagian antara lapisan oktahedral dan tetrahedral terdapat kation
monovalent maupun bivalent, diantaranya Na+, Ca2+ dan Mg2+ [23].
Silika sering digunakan sebagai matriks inert dan stabil untuk
amobilisasi enzim. Hal ini dikarenakan silika mempunyai luas
permukaan spesifik yang tinggi dan diameter pori yang dapat
dikontrol sesuai dimensi enzim. Sebagian besar enzim berdiameter 3
- 6 nm, sehingga silika yang digunakan berbentuk mesopori yaitu
berukuran 2 – 50 nm [20].
Gambar 2.2: Struktur Montmorillonit [24]
2.8 Aktivitas Enzim
Enzim adalah protein yang mempunyai sifat khas seperti berat
molekul, kondisi reaksi pada aktivitas optimum dan stabilitas enzim.
Aktivitas dan stabilitas enzim dipengaruhi oleh perubahan kondisi
fisik dan kimia yang menyebabkan struktur sekunder, tersier dan
-
9
kuartener dari molekul enzim berubah [25]. Faktor-faktor yang
mempengaruhi aktivitas enzim xilanase antara lain suhu, pH,
konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pengaruh inhibitor dan
aktivator [26]:
1. Suhu Enzim mempunyai suhu optimum masing-masing. Suhu
optimum adalah suhu ketika enzim bekerja dengan sangat baik. Suhu
yang terlalu rendah akan mengakibatkan aktivitas enzim kecil,
sedangkan suhu yang terlalu tinggi akan mengakibatkan enzim
terdenaturasi sehingga merusak kemampuannya sebagai katalisator
[27].
2. pH Enzim mempunyai profil yang berbeda terkait dengan pH
lingkungannya. Sebagian besar enzim aktif pada kisaran pH antara
4,5-8. Perubahan pH dapat menyebabkan pecahnya ikatan sehingga
mengubah konformasi enzim dan juga aktivitasnya. Pada pH ekstrim,
enzim akan terdenaturasi karena enzim merupakan suatu protein dan
akan terjadi perubahan muatan pada residu asam amino yang penting
untuk proses katalisis. [28].
3. Konsentrasi substrat dan enzim Peningkatan konsentrasi substrat atau enzim akan
meningkatkan kecepatan reaksi enzim. Kecepatan reaksi enzim akan
meningkat dengan meningkatnya substrat pada konsentrasi tertentu,
namun pada suatu titik penambahan konsentrasi substrat tidak
meningkatkan kecepatan reaksi enzim karena enzim mengalami
kejenuhan [28].
4. Inhibitor dan Aktivator Inhibitor merupakan senyawa yang dapat menurunkan kecepatan
reaksi enzimatik akibat menurunnya kemampuan enzim mengikat
substrat. Sedangkan aktivator merupakan suatu senyawa, unsur atau
ion yang mampu meningkatkan aktivitas kerja enzim. Aktivator dapat
berupa ion-ion anorganik terutama ion logam atau kation [29].
Faktor-faktor tersebut dapat menganggu stabilitas enzim.
Stabilitas enzim adalah kestabilan aktivitas enzim selama
penyimpanan, penggunaan, dan kestabilan terhadap senyawa tertentu
(asam, basa) serta pengaruh suhu dan pH yang tinggi [16].
-
10
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini bertempat di Laboratorium Biokimia, Jurusan
Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Brawijaya Malang. Penelitian dilakukan dari bulan Agustus sampai
dengan Desember 2019.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
3.2.1 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain
gelas kimia (100 mL dan 250 mL), erlenmeyer (50 mL,100 mL, 250
mL, dan 300 mL), labu ukur (10 mL, 25 mL, 50 mL dan 100 mL),
tabung reaksi, pipet ukur 10 mL, bola hisap, pipet tetes, gelas arloji,
pengaduk gelas, botol semprot, corong gelas, botol sampel, rak tabung
reaksi, blender dan grinder, inkubator, tanur, sentrifuse dingin, shaker,
autoklaf, jarum ose, magnetic stirrer, spectronic genesys 20, kuvet,
kertas pH, aluminium foil, kertas saring, kapas steril, oven, pemanas
listrik, ayakan 120, neraca analitik, cutter, kertas cokelat, karet gelang,
bunsen, dan laminar air flow.
3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain
hasil biakan murni Aspergillus niger dari Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang. Bahan-bahan dengan
kemurnian pro analisis (p.a) antara lain KH2PO4, CaCl2, (NH4)2SO4,
Na2EDTA, ZnSO4.7H2O, MgSO4.7H2O, NaMoO4, MnSO4.H2O,
FeSO4.7H2O, padatan NaOH, HCl, dekstrosa, DNS (asam
dinitrosalisilat), Na2SO3, natrium asetat, asam asetat glasial, asam
sulfat pekat, CuSO4.5H2O, NaKC4O6H4, kristal fenol, akuades dan
bentonit. Bahan-bahan yang memiliki kualitas for microbiology antara
lain klobot jagung, kentang, pepton, urea, tepung agar, tween-80,
kasein, xilosa dan xilan.
-
11
3.3 Tahapan Penelitian
Tahapan penelitian yang akan dilakukan yaitu :
1. Pembuatan tepung klobot jagung 2. Pembuatan media padat 3. Peremajaan biakan murni Aspergillus niger 4. Pembuatan media cair 5. Pembuatan inokulum 6. Produksi enzim 7. Isolasi ekstrak kasar xilanase dari biakan Aspergillus niger 8. Penentuan kadar protein awal
a) Penentuan panjang gelombang maksimum larutan kasein b) Pembuatan kurva baku larutan kasein c) Uji kadar protein awal
9. Penentuan kurva baku gula pereduksi xilosa a) Penentuan panjang gelombang maksimum gula pereduksi
xilosa
b) Pembuatan kurva baku gula pereduksi xilosa 10. Penentuan aktivitas xilanase bebas
a) Penentuan pH optimum xilanase bebas b) Penentuan suhu optimum xilanase bebas c) Penentuan waktu inkubasi optimum xilanase bebas d) Pengukuran aktivitas xilanase bebas
11. Amobiliasi enzim xilanase pada matriks bentonit teraktivasi a) Aktivasi matriks bentonit b) Amobilisasi xilanase pada matriks bentonit teraktivasi
12. Penentuan aktivitas enzim xilanase amobil a) Penentuan pengaruh pH terhadap aktivitas xilanase amobil b) Penentuan pengaruh suhu terhadap aktivitas xilanase
amobil
c) Penentuan pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas xilanase amobil
13. Penentuan kadar protein enzim xilanase sisa 14. Analisa data
-
12
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pembuatan Tepung Klobot Jagung
Klobot jagung dipisahkan dari tongkol jagung. Kemudian
dicuci dengan akuades dan dikeringkan di dalam oven pada suhu
100°C. Setelah kering, klobot jagung dipotong menjadi ukuran kecil-
kecil. Lalu dihaluskan menggunakan blender dan grinder. Setelah
klobot jagung halus, diayak menggunakan ayakan berukuran 120
mesh. Serbuk halus hasil ayakan digunakan sebagai induser.
3.4.2 Pembuatan Media Padat
Media padat yang digunakan yaitu Potatoes Dextrose Agar
(PDA). PDA dibuat dari kentang yang telah dikupas, lalu ditimbang
di neraca analitik sebanyak 20 g. Setelah itu, kentang dicuci dengan
akuades dan dipotong menjadi kecil-kecil. Kemudian dimasukkan ke
dalam gelas kimia 250 mL, ditambahkan akuades hingga volumenya
menjadi 100 mL lalu dipanaskan di atas pemanas listrik hingga
mendidih selama 1 jam serta dijaga volume tetap 100 mL. Selanjutnya
disaring menggunakan kertas saring sehingga didapatkan sari kentang.
Pada sari kentang, ditambahkan dekstrosa sebanyak 2 g, buffer asetat
0,2 M pH 5 sebanyak 1 mL dan dipanaskan kembali hingga mendidih
sambil ditambahkan tepung agar sebanyak 1,5 g. Kemudian diambil
larutan PDA sebanyak 4 mL, dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu
ditutup dengan kapas dan dilapisi dengan kertas cokelat lalu diikat
dengan karet gelang. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama 15
menit. Setelah disterilkan, didinginkan pada suhu ruang dengan posisi
miring dan dibiarkan selama 24 jam. Media PDA yang sudah padat
disimpan di dalam refrigerator.
3.4.3 Peremajaan Biakan Murni Aspergillus niger
Peremajaan biakan murni Aspergillus niger dilakukan di
dalam laminar air flow. Disiapkan jarum ose, kemudian disterilkan
mulut tabung biakan murni Aspergillus niger dan mulut tabung media
dengan cara dipanaskan pada nyala api Bunsen. Selanjutnya, diambil
spora Aspergillus niger sebanyak satu mata ose, dipindahkan ke dalam
media padat steril secara aseptis dan segera ditutup kembali tabung
dengan kapas steril yang dilapisi dengan kertas cokelat serta diikat
-
13
dengan karet gelang. Kemudian tabung disimpan dan diinkubasi
selama 6 hari (144 jam) dalam inkubator pada suhu 30°C.
3.4.4 Pembuatan Media Cair
Ditimbang pepton sebanyak 0,09 g; urea sebanyak 0,054 g;
KH2PO4 sebanyak 0,054 g; CaCl2 sebanyak 0,054 g; tween-80
sebanyak 0,036 g; (NH4)2SO4 sebanyak 0,252 g; MgSO4.7H2O
sebanyak 0,054 g; unsur renik sebanyak 0,18 mL dan tepung klobot
jagung sebanyak 0,9 g. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam gelas kimia
250 mL lalu dibuat larutan sebanyak 180 mL. Kemudian ditambahkan
buffer asetat pH 5 sebanyak 1 mL, diaduk campuran dan dipanaskan
hingga mendidih. Setelah itu, dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu
ditutup dengan kapas steril dan dilapisi kertas cokelat serta diikat
dengan karet gelang. Selanjutnya, disterilkan dalam autoklaf selama
15 menit pada suhu 121°C pada tekanan 15 Psi.
3.4.5 Pembuataan Inokulum
Pembuatan inokulum dilakukan di dalam laminar air flow.
Spora hasil pembiakan murni Aspergillus niger yang telah berumur 6
hari dipindahkan sebanyak satu mata ose secara aseptis ke dalam
erlenmeyer 100 mL yang telah berisi 25 mL media cair steril.
Kemudian dikocok dengan shaker pada kecepatan 100 rpm hingga
mencapai pertengahan fase logaritma (49 jam). Selanjutnya, diambil
larutan inokulum sebanyak 5 mL secara aseptis dan dimasukkan ke
dalam 4 erlenmeyer yang berisi media cair steril sebanyak 50 mL.
Setelah itu, dikocok kembali dengan shaker pada kecepatan 100 rpm
pada suhu ruang hingga mencapai fase logaritma (49 jam).
3.4.6 Produksi Enzim
Diambil larutan inokulum sebanyak 8 mL. Selanjutnya
dimasukkan secara aseptis ke dalam 8 erlenmeyer yang berisi media
cair steril sebanyak 180 mL di dalam laminar air flow. Setelah itu,
larutan dikocok menggunakan shaker pada kecepatan 100 rpm selama
60 jam.
-
14
3.4.7 Isolasi Ekstrak Kasar Xilanase dari Biakan Aspergillus niger
Enzim xilanase diisolasi dengan metode ekstraksi yaitu
dengan dilakukan penambahan buffer tris-HCl pH 8 sebanyak 15 mL.
Kemudian disentrifuse pada suhu 4°C dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar
enzim xilanase.
3.4.8 Penentuan Kadar Protein Awal
3.4.8.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Larutan
Kasein
Diambil larutan kasein dengan konsentrasi 5000 µg/mL
sebanyak 2 mL lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian
ditambahkan reagen biuret sebanyak 8 mL dan ditambahkan akuades
sebanyak 2 mL serta dikocok hingga homogen. Selanjutnya diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 50°C. Setelah itu, diukur absorbansi
menggunakan spectronic genesys 20 pada rentang panjang gelombang
460-600 nm.
3.4.8.2 Pembuatan Kurva Baku Larutan Kasein
Kasein ditimbang sebanyak 1 g lalu dimasukkan ke dalam
gelas kimia 250 mL serta dilarutkan dengan akuades. Kemudian
diaduk menggunakan pengaduk magnetik dan ditambahkan beberapa
tetes larutan NaOH 0,1 N hingga kasein larut sempurna. Setelah kasein
larut, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan
akuades sampai tanda batas serta dikocok hingga homogen. Sehingga
diperoleh larutan stok kasein 10000 µg/mL. Setelah itu, dipipet larutan
stok dengan volume 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 dan 9 mL dan masing-masing
dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Selanjutnya ditambahkan
akuades sampai tanda batas dan dikocok hingga homogen. Sehingga
diperoleh larutan kasein 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000,
8000 dan 9000 µg/mL. Kemudian dipipet masing-masing konsentrasi
larutan kasein sebanyak 2 mL dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi. Setelah itu, ditambahkan ke masing-masing tabung reaksi
sebanyak 2 mL akuades dan reagen biuret sebanyak 8 mL. Larutan
dikocok hingga homogen dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu
-
15
50°C. Selanjutnya diukur absorbansi larutan menggunakan spectronic
genesys 20 pada panjang gelombang maksimum kasein, yaitu 540 nm.
Dibuat kurva baku hubungan antara konsentrasi (µg/mL) pada sumbu
x dengan absorbansi pada sumbu y.
3.4.8.3 Uji Kadar Protein Awal
Dipipet ekstrak xilanase sebanyak 2 mL ke dalam tabung
reaksi lalu ditambahkan reagen biuret sebanyak 8 mL dan larutan
kasein 5000 µg/mL sebanyak 2 mL serta dikocok larutan hingga
homogen. Selanjutnya diinkubasi selama 30 menit pada suhu 50°C.
Diukur absorbansi menggunakan spectronic genesys 20 pada panjang
gelombang maksimum kasein, yaitu 540 nm. Kadar protein awal
diketahui dengan cara memplotkan nilai absorbansi pada persamaan
kurva baku kasein.
3.4.9 Penentuan Kurva Baku Gula Pereduksi Xilosa
3.4.9.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Gula
Pereduksi Xilosa
Dipipet larutan stok xilosa 300 µg/mL sebanyak 1 mL lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya ditambahkan
akuades sebanyak 1 mL dan reagen DNS sebanyak 2 mL. Kemudian
dipanaskan campuran larutan dalam penangas air mendidih selama 15
menit. Setelah itu, didinginkan dengan air mengalir. Setelah dingin,
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan ditambahkan akuades
sampai tanda batas serta dikocok hingga homogen. Diukur nilai
absorbansi pada kisaran panjang gelombang 480-530 nm.
3.4.9.2 Pembuatan Kurva Baku Gula Pereduksi Xilosa
Xilosa ditimbang sebanyak 0,15 g lalu dimasukkan ke dalam
gelas kimia 100 mL serta ditambahkan akuades secukupnya.
Kemudian dipindahkan larutan ke dalam labu ukur 10 mL dan
ditambahkan akuades sampai tanda baras serta dikocok hingga
homogen, sehingga diperoleh larutan stok gula 1500 µg/mL.
Selanjutnya dipipet larutan stok gula 1500 µg/mL sebanyak 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL yang berbeda.
Setelah itu, ditambahkan akuades sampai tanda batas dan dikocok
-
16
hingga homogen, sehingga diperoleh larutan stok 300, 450, 600, 750,
900, 1050 dan 1200 µg/mL. Kemudian diambil setiap konsentrasi
larutan stok sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berbeda. Setelah itu, ditambahkan akuades sebanyak 1 mL dan
reagen DNS sebanyak 2 mL pada masing-masing tabung reaksi lalu
dipanaskan semua campuran larutan dalam penangas air mendidih
selama 15 menit. Selanjutnya didinginkan dengan air mengalir.
Setelah dingin, dimasukkan masing-masing larutan ke dalam labu
ukur 25 mL yang berbeda dan ditambahkan akuades sampai tanda
batas serta dikocok hingga homogen. Diukur absorbansi
menggunakan spectronic genesys 20 pada panjang gelombang
maksimum xilosa yaitu 490 nm.
3.4.10 Penentuan Aktivitas Xilanase Bebas
3.4.10.1 Penentuan pH Optimum Xilanase Bebas
Dimasukkan substrat xilan 1% (w/v) sebanyak 1 mL ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15
menit ada suhu 60°C. Selanjutnya ditambahkan xilanase, variasi pH
5-9 yaitu buffer asetat pH 5 dan 6 serta buffer tris-HCl 0,2 M pH 7,8
dan 9 dan air bebas reduktor masing-masing sebanyak 1 mL dan
dipanaskan campuran larutan selama 55 menit pada suhu 55°C.
Kemudian ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL ke dalam tabung
reaksi dan dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit.
Setelah itu, didinginkan dengan air mengalir. Setelah dingin,
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan ditambahkan akuades
sampai tanda batas serta dihomogenkan. Diukur absorbansi
menggunakan spectronic genesys 20 pada panjang gelombang
maksimum xilosa, yaitu 490 nm.
3.4.10.2 Penentuan Suhu Optimum Xilanase Bebas
Dimasukkan substrat xilan 1% (w/v) sebanyak 1 mL ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15
menit ada suhu 60°C. Selanjutnya ditambahkan xilanase, larutan
buffer pH kondisi optimum pada tahap 3.4.10.1 dan air bebas reduktor
masing-masing sebanyak 1 mL dan dipanaskan campuran larutan
-
17
selama 55 menit pada variasi suhu 40°C, 45°C, 50°C, 55°C dan 60°C.
Kemudian ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL ke dalam tabung
reaksi dan dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit.
Setelah itu, didinginkan dengan air mengalir. Setelah dingin,
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan ditambahkan akuades
sampai tanda batas serta dihomogenkan. Diukur absorbansi
menggunakan spectronic genesys 20 pada panjang gelombang
maksimum xilosa, yaitu 490 nm.
3.4.10.3 Penentuan Waktu Inkubasi Xilanase Bebas
Dimasukkan substrat xilan 1% (w/v) sebanyak 1 mL ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15
menit ada suhu 60°C. Selanjutnya ditambahkan xilanase, larutan
buffer pH kondisi optimum pada tahap 3.4.10.1 dan air bebas reduktor
masing-masing sebanyak 1 mL dan dipanaskan campuran larutan
dengan variasi waktu inkubasi selama 40,45, 50, 55 dan 60 menit pada
suhu optimum tahap 3.4.10.2. Kemudian ditambahkan reagen DNS
sebanyak 2 mL ke dalam tabung reaksi dan dimasukkan dalam
penangas air mendidih selama 15 menit. Setelah itu, didinginkan
dengan air mengalir. Setelah dingin, dimasukkan ke dalam labu ukur
25 mL dan ditambahkan akuades sampai tanda batas serta
dihomogenkan. Diukur absorbansi menggunakan spectronic genesys
20 pada panjang gelombang maksimum xilosa, yaitu 490 nm.
3.4.10.4 Pengukuran Aktivitas Xilanase Bebas
Aktivitas xilanase dinyatakan dalam satuan µg/mg menit.
Satuan unit aktivitas enzim bebas dinyatakan sebagai 1 µg xilosa yang
dihasilkan per menit per mg enzim. Nilai aktivitas xilanase bebas
dapat diperoleh dengan cara memplotkan nilai absorbansi yang
diperoleh pada persamaan kurva baku gula pereduksi xilosa, sehingga
diperoleh konsentrasi gula pereduksi dari hidrolisis xilan oleh
xilanase. Berikut adalah persamaan untuk mengetahui satu unit
aktivitas enzim:
𝐴𝐸 = 𝑋 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓𝑝
𝑝 𝑥 𝑞 (3.1)
-
18
Keterangan :
AE = aktivitas enzim (µg.mg-1.menit-1)
X = konsentrasi gula pereduksi (µg.mL-1)
V = volume total sampel (mL)
fp = faktor pengenceran
p = konsentrasi protein xilanase bebas (mg/mL)
q = waktu reaksi (menit)
3.4.11 Amobilisasi Enzim Xilanase pada Matriks Bentonit
Teraktivasi
3.4.11.1 Aktivasi Matriks Bentonit
Bentonit hasil preparasi ditimbang sebanyak 10 g dan
dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 mL. Selanjutnya ditambahkan
larutan HCl 0,4 M sebanyak 200 mL. Kemudian dikocok larutan
campuran dengan shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 4 jam.
Setelah itu, disaring menggunakan kertas saring dan dicuci dengan
akuades hingga pH air pencuci sama dengan pH akuades. Selanjutnya
dikeringkan endapan bentonit yang tidak tersaring ke dalam oven pada
suhu 105°C hingga berat konstan. Kemudian dikalsinasi bentonit hasil
aktivasi selama 4 jam pada suhu 500°C.
3.4.11.2 Amobilisasi Enzim Xilanase pada Matriks Bentonit
Teraktivasi
Amobilisasi enzim xilanase dilakukan dengan cara ekstrak
kasar xilanase dipipet sebanyak 2 mL lalu dimasukkan ke dalam labu
ukur 5 mL. Setelah itu, ditambahkan buffer tris-HCl 0,2 M pH 8
hingga tanda batas dan dihomogenkan. Campuran larutan dimasukkan
ke dalam erlenmeyer yang berisi 0,1 g bentonit yang telah diaktivasi.
Selanjutnya dishaker selama 3 jam dengan kecepatan 100 rpm.
Kemudian disaring dengan kertas saring. Endapan yang diperoleh
merupakan xilanase amobil, sedangkan filtratnya merupakan xilanase
sisa yang tidak teradsorpsi pada matriks bentonit.
-
19
3.4.12 Penentuan Aktivitas Xilanase Amobil
3.4.12.1 Penentuan pH Optimum Xilanase Amobil
Dimasukkan substrat xilan 1 % (w/v) sebanyak 1 mL ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15
menit pada suhu 60°C. Selanjutnya, ditambahkan 0,1 g xilanase
amobil, 1 mL variasi pH 5-9 yaitu buffer asetat pH 5 dan 6 serta buffer
tris-HCl 0,2 M pH 7,8 dan 9, dan 1 mL air bebas reduktor di tabung
reaksi yang berbeda. Kemudian dipanaskan campuran larutan selama
55 menit pada suhu 55°C. Setelah itu, didinginkan larutan dan disaring
enzim xilanase. Filtrat dalam tabung reaksi ditambah reagen DNS
sebanyak 2 mL dan dimasukkan dalam penangas air mendidih selama
15 menit. Selanjutnya didinginkan dengan air mengalir. Setelah
dingin, diencerkan dengan akuades sampai volumenya 15 mL lalu
dihomogenkan. Diukur absorbansi menggunakan spectronic genesys
20 pada panjang gelombang maksimum xilosa, yaitu 490 nm.
3.4.12.2 Penentuan Suhu Optimum Xilanase Amobil
Dimasukkan substrat xilan 1 % (w/v) sebanyak 1 mL ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15
menit pada suhu 60°C. Selanjutnya, ditambahkan 0,1 g xilanase
amobil, 1 mL larutan buffer pH kondisi optimum pada tahap 3.4.12.1
dan 1 mL air bebas reduktor. Selanjutnya masing-masing larutan
campuran diinkubasi pada variasi suhu 40, 45, 50, 55 dan 60°C selama
55 menit. Setelah itu, didinginkan larutan dan disaring enzim xilanase.
Filtrat dalam tabung reaksi ditambah reagen DNS sebanyak 2 mL dan
dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit.
Selanjutnya didinginkan dengan air mengalir. Setelah dingin,
diencerkan dengan akuades sampai volumenya 15 mL lalu
dihomogenkan. Diukur absorbansi menggunakan spectronic genesys
20 pada panjang gelombang maksimum xilosa, yaitu 490 nm.
3.4.12.3 Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Xilanase Amobil
Dimasukkan substrat xilan 1 % (w/v) sebanyak 1 mL ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15
menit pada suhu 60°C. Selanjutnya, ditambahkan 0,1 g xilanase
-
20
amobil, 1 mL larutan buffer pH kondisi optimum pada tahap 3.4.12.1
dan 1 mL air bebas reduktor di tabung reaksi yang berbeda. Kemudian
dipanaskan campuran larutan dengan variasi waktu inkubasi 40, 45,
55, dan 60 menit pada suhu optimum pada tahap 3.4.12.2. Setelah itu,
didinginkan larutan dan disaring enzim xilanase. Filtrat dalam tabung
reaksi ditambah reagen DNS sebanyak 2 mL dan dimasukkan dalam
penangas air mendidih selama 15 menit. Selanjutnya didinginkan
dengan air mengalir. Setelah dingin, diencerkan dengan akuades
sampai volumenya 15 mL lalu dihomogenkan. Diukur absorbansi
menggunakan spectronic genesys 20 pada panjang gelombang
maksimum xilosa, yaitu 490 nm.
3.4.13 Penentuan Kadar Protein Enzim Xilanase Sisa
Ditentukan kadar protein yang tidak terjebak dengan cara
filtrat dari enzim yang tidak teramobilkan sebanyak 2 mL
ditambahkan larutan kasein 5000 µg/mL sebanyak 2 mL dan reagen
biuret sebanyak 8 mL. Kemudian diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 50°C. Diukur absorbansi menggunakan spectronic genesys 20
pada panjang gelombang maksimum kasein yaitu 540 nm sehingga
diketahui kadar protein xilanase sisa dengan memplotkan nilai
absorbansi pada persamaan regresi kurva standar kasein.
3.4.14 Analisa Data
Data aktivitas xilanase bebas dan amobil pada matriks
bentonit teraktivasi yang dipengaruhi oleh pH, suhu dan waktu
inkubasi dianalisis dengan uji F dan diulang tiga kali setiap perlakuan.
Selanjutnya jika F hitung lebih besar dari F tabel maka dilakukan uji
Beda Nyata Terkecil (BNT).
-
21
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Produksi dan Isolasi Xilanase dari Aspergillus niger
Xilanase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis xilan
menjadi xilosa. Xilosa dapat terbentuk dari reaksi hidrolisis antara
xilan dan aktivitas xilanase yang dihasilkan dari jenis mikroorganisme
seperti jamur atau bakteri [18]. Pada penelitian ini digunakan klobot
jagung sebagai induser dalam media pertumbuhan untuk menginduksi
biosintesis enzim xilanase dari mikroorganisme Aspergillus niger.
Digunakan klobot jagung karena memiliki kandungan hemiselulosa
yang tinggi [9]. Tingginya kandungan hemiselulosa dalam klobot
jagung digunakan sebagai sumber xilan dalam produksi enzim
xilanase.
Xilanase dihasilkan dari jenis kapang Aspergillus niger yang
telah diremajakan pada media padat PDA. Aspergillus niger yang
ditumbuhkan pada media cair mengalami beberapa fase untuk
beradaptasi dengan lingkungannya karena adanya keterbatasan nutrisi.
Fase pertumbuhan yang dialami antara lain fase adaptasi, fase
logaritma, fase stasioner dan fase kematian [30]. Produksi xilanase
ketika memasuki fase pertengahan hingga akhir fase logaritma
sehingga diperlukan biakan aktif berupa inokulum agar diperoleh hasil
yang maksimal. Isolasi xilanase dilakukan dengan cara sentrifugasi
dingin untuk memisahkan antara supernatan berupa ekstrak kasar
xilanase dengan endapan yang merupakan komponen sisa yang
memiliki berat molekul tinggi. Dilakukan menggunakan sentrifuse
dingin untuk mencegah terjadinya denaturasi akibat panas.
Dilakukan uji aktivitas enzim dengan mereaksikan ekstrak
kasar xilanase dan substrat xilan agar terbentuk reaksi enzimatis yang
menghasilkan xilosa. Xilosa dapat diukur dengan penambahan DNS
yang mengalami reaksi redoks atau reduksi oksidasi, xilosa akan
teroksidasi menjadi asam xilonat dan DNS akan tereduksi menjadi
asam-3-amino-5 nitrosalisilat. Reaksi yang terjadi memberikan warna
merah kecokelatan. Semakin pekat warna yang dihasilkan maka
absorbansi yang terukur semakin besar pula. Nilai absorbansi yang
dihasilkan dikonversi pada persamaan kurva baku xilosa dan dihitung
aktivitas xilanase menggunakan persamaan aktivitas enzim (AE).
-
22
Selain itu, dilakukan uji kadar protein awal dengan mereaksikan
ekstrak kasar xilanase dengan reagen biuret. Penambahan reagen
biuret untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida dari protein yang
terkandung dalam ekstrak kasar xilanase. Kadar protein awal xilanase
bebas sebesar 0,94 mg/mL.
Gambar 4.1: Mekanisme reaksi enzimatis yang terjadi pada
pembentukan xilosa
-
23
Gambar 4.2: Reaksi reagen DNS dengan Xilosa
4.2 Amobilisasi Xilanase pada Matriks Bentonit Teraktivasi
Amobilisasi xilanase dilakukan menggunakan bentonit
sebagai matriks. Bentonit diaktivasi terlebih dahulu menggunakan
HCl untuk memperbesar ukuran pori bentonit sehingga dapat
meningkatkan adsorpsi, selain itu menghilangkan pengotor yang
terdapat pada bentonit sehingga luas permukaan menjadi lebih besar
menyebabkan dapat mengadsorpsi xilanase lebih maksimal.
Amobilisasi xilanase pada matriks bentonit melalui metode
adsorpsi fisik yaitu xilanase akan teradsorp atau menempel pada
permukaan matriks. Hasil ekstrak kasar xilanase dicampurkan dengan
bentonit teraktivasi kemudian dishaker pada suhu ruang selama 3 jam
dengan kecepatan 100 rpm. Interaksi hidrogen terjadi ketika enzim
xilanase teradsorp dalam matriks bentonit akibat adanya kontak antara
atom H dari gugus amino pada rantai samping asam amino penyusun
xilanase (-NH2) maupun atom H pada gugus karboksil (-COOH) dari
residu asam amino dengan atom oksigen pada bentonit (Si-O-Al).
Dilakukan uji kadar protein sisa dengan mereaksikan filtrat xilanase
yang tidak teramobilkan dengan reagen biuret. Kadar protein xilanase
sisa sebesar 0,22 mg/mL dan massa enzim yang teradsorp pada
matriks bentonit ketika amobil sebesar 1,44 mg.
-
24
4.3 Penentuan Kondisi Optimum Xilanase Bebas dan Amobil
4.3.1 Penentuan pH Optimum
Enzim bebas dan amobil memiliki kondisi pH lingkungan
yang berbeda untuk mencapai aktivitas enzim tertinggi. Aktivitas
maksimum enzim terjadi pada pH optimum ketika kondisi tingkat
keasaman sesuai untuk bereaksi dengan substrat. Pada penelitian ini,
variasi pH yang digunakan untuk menentukan aktivitas enzim bebas
dan amobil adalah 5, 6, 7, 8, dan 9. Berdasarkan data yang diperoleh,
diketahui pH optimum xilanase bebas yaitu pada pH 6 dengan
aktivitas enzim sebesar 3,029 µg/mg.menit, sedangkan pH optimum
xilanase amobil pada pH 8 dengan aktivitas enzim sebesar 0,821
µg/mg.menit.
Pada xilanase bebas dengan pH 5 aktivitas enzim yang
dihasilkan sebesar 2,718 µg/mg.menit, kemudian mengalami
kenaikan pada pH 6 dengan aktivitas enzim sebesar 3,029
µg/mg.menit, pada pH 7 dan pH 8 mengalami penurunan dengan
aktivitas enzim masing-masing sebesar 2,284 µg/mg.menit dan 1,808
µg/mg.menit. Pada pH 9 aktivitas xilanase bebas sebesar 2,074
µg/mg.menit, mengalami kenaikan dari aktivitas enzim sebelumnya.
Sedangkan pada xilanase amobil dengan variasi pH 5, 6, 7,
dan 8 mengalami kenaikan aktivitas xilanase amobil sampai pH
optimum yaitu 8, aktivitas xilanase amobil berturut-turut 0,221
µg/mg.menit, 0,220 µg/mg.menit, 0,301 µg/mg.menit dan 0,821
µg/mg.menit. Pada pH 9 aktivitas xilanase amobil mengalami
penurunan, aktivitas xilanase amobil pada pH 9 yaitu 0,209
µg/mg.menit. Data yang diperoleh dapat dilihat pada Gambar 4.1.
-
25
0,000
1,000
2,000
3,000
5 6 7 8 9
Aktivitas
Enzi
m (
µg/m
g.m
enit)
pH
Amobil
Bebas
Gambar 4.3: Kurva Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim
Xilanase Bebas dan Amobil
Berdasarkan kurva tersebut, diketahui bahwa terjadi
pergeseran aktivitas enzim xilanase bebas dan amobil yaitu dari
aktivitas enzim tertinggi pada pH 6 (xilanase bebas) ke pH 8 (xilanase
amobil). Hal ini dapat disebabkan karena adanya perbedaan jumlah
ion H+ pada lingkungan dan jumlah anion pada matriks. Perubahan pH
berpengaruh terhadap ionisasi gugus fungsi yang menyebabkan
terjadinya perubahan bentuk atau konformasi enzim xilanase dan sifat
katalitiknya. Kenaikan aktivitas enzim xilanase sampai pada pH
optimum disebabkan adanya perubahan gugus aktif (-COOH) dari
asam amino glutamat yang telah bermuatan negatif menjadi ion
karboksilat (-COO-). Semakin tinggi pH maka ion karboksilat semakin
banyak sehingga mudah terjadinya protonasi oksigen glikosidik
menyebabkan aktivitas enzim xilanase semakin meningkat dengan
dihasilkannya gula pereduksi yang banyak.
Berdasarkan analisis data statistik, Fhitung xilanase bebas
sebesar 485,516 sedangkan Ftabel sebesar 3,480 sehingga Fhitng > Ftabel,
maka dapat diartikan bahwa perlakuan masing-masing pH
berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim xilanase bebas. Pada
xilanase amobil, Fhitung yang diperoleh sebesar 3254,659 sedangkan
Ftabel sebesar 3,480 sehingga Fhitng > Ftabel, maka dapat diartikan bahwa
perlakuan masing-masing pH berpengaruh nyata terhadap aktivitas
-
26
enzim xilanase amobil. Uji BNT 5% dilakukan untuk mengetahui
variasi pH mana saja yang menunjukkan perbedaan yang sangat nyata.
Berdasarkan hasil uji BNT 5%, xilanase bebas pada pH 5, 6, 7, 8, dan
9 terdapat perbedaan yang sangat nyata. Sedangkan xilanase amobil
pada pH 5 dan 9 serta pH 5 dan 6 tidak berbeda nyata.
4.3.2 Penentuan Suhu Optimum
Enzim bebas dan amobil memiliki suhu optimum masing-
masing yang merupakan suhu ketika enzim bekerja dan memiliki laju
reaksi yang sangat baik. Semakin jauh dari suhu optimum, maka
aktivitas enzim semakin rendah [27]. Pada penelitian ini, variasi suhu
yang digunakan untuk menentukan aktivitas enzim bebas dan amobil
adalah 40°C, 45°C, 50°C, 55°C dan 60°C. Berdasarkan data yang
diperoleh, diketahui suhu optimum xilanase bebas dan xilanase amobil
yaitu pada suhu 50°C dengan aktivitas xilanase bebas sebesar 3,811
µg/mg.menit, sedangkan aktivitas xilanase amobil sebesar 0,311
µg/mg.menit.
Aktivitas xilanase bebas pada variasi suhu 40°C, 45°C dan
50°C mengalami kenaikan, antara lain 0,966 µg/mg.menit, 2,528
µg/mg.menit dan 3,811 µg/mg.menit. Namun pada suhu 55°C dan
60°C mengalami penurunan dari sebelumnya yaitu 3,027 µg/mg.menit
dan 1,862 µg/mg.menit.
Sedangkan pada xilanase amobil, aktivitas enzim mengalami
kenaikan dari suhu 40°C, 45°C dan 50°C antara lain 0,224
µg/mg.menit, 0,238 µg/mg.menit dan 0,311 µg/mg.menit. Namun
pada suhu 55°C dan 60°C mengalami penurunan yaitu 0,216
µg/mg.menit dan 0,176 µg/mg.menit. Data yang diperoleh dapat
dilihat pada Gambar 4.2.
-
27
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
40 45 50 55 60
Aktivitas
Enzi
m (
µg/m
g.m
enit)
Suhu (°C)
Amobil
Bebas
Gambar 4.4: Kurva Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim
Xilanase Bebas dan Amobil
Berdasarkan kurva tersebut, diketahui bahwa tidak terjadi
pergeseran aktivitas enzim xilanase bebas dan amobil yaitu suhu
optimum terjadi pada suhu 50°C. Namun xilanase bebas dan amobil
pada suhu optimum yang sama menghasilkan aktivitas enzim yang
berbeda, aktivitas xilanase bebas lebih besar yaitu 15,880
µg/mg.menit dibandingkan aktivitas amobil sebesar 1,553
µg/mg.menit. Pada suhu optimum, enzim xilanase dan substrat
bertumbukan efektif sehingga menghasilkan kompleks enzim-substrat
dengan mudah dan produk yang terbentuk lebih banyak. Hal ini
menyebabkan aktivitas enzim xilanase meningkat pada suhu
optimum. Setelah mencapai suhu optimum, aktivitas enzim xilanase
menurun dan mengalami denaturasi pada suhu tinggi sehingga
didapatkan aktivitas enzim yang jauh lebih kecil akibat perubahan
konformasi dan struktur sekunder dan tersier enzim xilanase.
Berdasarkan Analisis data statistik, Fhitung xilanase bebas
sebesar 1320,331 sedangkan Ftabel sebesar 3,480 sehingga Fhitng > Ftabel,
maka dapat diartikan bahwa perlakuan masing-masing suhu
berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim xilanase bebas. Pada
xilanase amobil, Fhitung yang diperoleh sebesar 899,363 sedangkan
Ftabel sebesar 3,480 sehingga Fhitng > Ftabel, maka dapat diartikan bahwa
perlakuan masing-masing suhu berpengaruh nyata terhadap aktivitas
enzim xilanase amobil. Uji BNT 5% dilakukan untuk mengetahui
-
28
variasi suhu mana saja yang menunjukkan perbedaan yang sangat
nyata. Berdasarkan hasil uji BNT 5%, xilanase bebas dan xilanase
amobil pada suhu 40°C, 45°C, 50°C, 55°C dan 60°C terdapat
perbedaan yang sangat nyata.
4.3.3 Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Waktu inkubasi optimum ditentukan untuk mengetahui waktu
yang dibutuhkan enzim untuk berikatan dengan substrat sehingga
dapat bekerja maksimal menghasilkan produk tinggi. Pada penelitian
ini, variasi waktu inkubasi yang digunakan untuk menentukan
aktivitas enzim bebas dan amobil adalah 40 menit, 45 menit, 50 menit,
55 menit dan 60 menit. Berdasarkan data yang diperoleh, diketahui
waktu inkubasi optimum xilanase bebas selama 45 menit dengan
aktivitas xilanase bebas sebesar 4,743 µg/mg.menit, sedangkan waktu
inkubasi optimum xilanase amobil selama 55 menit dengan aktivitas
enzim sebesar 0,315 µg/mg.menit.
Pada xilanase bebas, aktivitas enzim mengalami kenaikan dari
waktu inkubasi 40 menit ke 45 menit antara lain 1,917 µg/mg.menit
dan 4,743 µg/mg.menit. Namun pada waktu inkubasi 50 menit, 55
menit dan 60 menit mengalami penurunan aktivitas enzim yaitu dari
4,414 µg/mg.menit ke 4,110 µg/mg.menit dan 4,107 µg/mg.menit.
Sedangkan pada xilanase amobil, aktivitas xilanase amobil
mengalami kenaikan dari waktu inkubasi 40 menit, 45 menit, 50 menit
dan 55 menit antara lain 0,259 µg/mg.menit, 0,280 µg/mg.menit,
0,301 µg/mg.menit dan 0,315 µg/mg.menit. Namun pada waktu
inkubasi 60 menit mengalami penurunan aktivitas enzim menjadi
0,169 µg/mg.menit. Data yang diperoleh dapat dilihat pada Gambar
4.3.
-
29
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
40 45 50 55 60
Aktivitas
Enzi
m (
µg/m
g.m
enit)
Waktu Inkubasi (menit)
Amobil
Bebas
Gambar 4.5: Kurva Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas
Enzim Xilanase Bebas dan Amobil
Berdasarkan kurva, diketahui bahwa terjadi pergeseran
aktivitas enzim xilanase bebas dan amobil yaitu dari aktivitas enzim
tertinggi pada waktu inkubasi 45 menit (xilanase bebas) ke waktu
inkubasi 55 menit (xilanase amobil). Waktu inkubasi xilanase amobil
lebih lama dibandingkan xilanase bebas untuk mencapai aktivitas
maksimumnya. Hal ini dikarenakan terdapat efek tahanan difusi akibat
bahan pendukung pada xilanase amobil sehingga membutuhkan waktu
yang lama agar substrat dan enzim bertemu. Substrat akan berdifusi
masuk terlebih dahulu ke dalam partikel xilanase amobil untuk
membentuk produk.
Sebelum mencapai waktu inkubasi optimum, aktivitas enzim
xilanase belum maksimal karena enzim dan substrat belum
berinteraksi optimal. Pada saat mencapai waktu inkubasi optimum,
enzim dan substrat bereaksi maksimal karena sisi aktif enzim
mengikat lebih banyak substrat. Setelah tercapai waktu inkubasi
optimum, aktivitas xilanase menurun dikarenakan sisi aktif enzim
untuk mengikat substrat sudah jenuh.
Berdasarkan Analisis data statistik, Fhitung xilanase bebas
sebesar 1779,672 sedangkan Ftabel sebesar 3,480 sehingga Fhitng > Ftabel,
maka dapat diartikan bahwa perlakuan masing-masing waktu inkubasi
berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim xilanase bebas. Pada
-
30
xilanase amobil, Fhitung yang diperoleh sebesar 62,245 sedangkan Ftabel
sebesar 3,480 sehingga Fhitng > Ftabel, maka dapat diartikan bahwa
perlakuan masing-masing waktu inkubasi berpengaruh nyata terhadap
aktivitas enzim xilanase amobil. Uji BNT 5% dilakukan untuk
mengetahui variasi waktu inkubasi mana saja yang menunjukkan
perbedaan yang sangat nyata. Berdasarkan hasil uji BNT 5%, xilanase
bebas pada waktu inkubasi 55 menit dan 60 menit tidak berbeda nyata.
Sedangkan xilanase amobil pada waktu inkubasi 40°C dan 45°C, 45°C
dan 50°C serta 50°C dan 55°C tidak ada beda nyata.
-
31
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat
disimpulkan bahwa:
1. pH, suhu dan waktu inkubasi berpengaruh terhadap aktivitas enzim xilanase bebas dan amobil.
2. pH optimum xilanase bebas yaitu pada pH 6 dengan aktivitas enzim sebesar 3,029 µg/mg.menit sedangkan xilanase amobil
pada pH 8 dengan aktivitas enzim sebesar 0,821
µg/mg.menit.
3. Suhu optimum xilanase bebas dan xilanase amobil pada suhu 50°C dengan aktivitas enzim masing-masing sebesar 3,811
µg/mg.menit dan 0,311 µg/mg.menit.
4. Waktu inkubasi optimum xilanase bebas selama 45 menit dengan aktivitas enzim sebesar 4,743 µg/mg.menit,
sedangkan pada xilanase amobil selama 55 menit dengan
aktivitas enzim sebesar 0,315 µg/mg.menit.
5.2 Saran
Enzim amobil dapat digunakan kembali secara berulang-
ulang sehingga perlu ditentukan efisiensi penggunaan ulang xilanase
amobil dengan matriks bentonit teraktivasi.
-
32
DAFTAR PUSTAKA
1. Microbial Xylanases And Their Industrial Applications As Well
As Future Perspectives: A Review. (2017). Global Journal of
Biology, Agriculture & Health Sciences, 6(3), 5–12.
https://doi.org/10.24105/gjbahs.6.3.1702
2. Wucherpfennig, T., Hestler, T., & Krull, R. (2011).
Morphology engineering - Osmolality and its effect on
Aspergillus niger morphology and productivity. Microbial
Cell Factories, 10(1), 58. https://doi.org/10.1186/1475-2859-
10-58
3. Pangesti, N. W. I., Pangastuti, A., & N, E. R. (2012). Pengaruh
penambahan molase pada produksi enzim xilanase oleh
fungi Aspergillus niger dengan substrat jerami padi.
Bioteknologi Biotechnological Studies, 9(2), 41–48.
https://doi.org/10.13057/biotek/c090202
4. Sari, I. P., Sutrisno, S., & Prasetyawan, S. (2014). Optimasi
Amobilisasi Xilanase Dari Trichoderma Viride Dengan
Matriks Zeolit. Jurnal Ilmu Kimia Universitas Brawijaya, 2(1),
pp.421-427-427.
5. Guisan, J. M. (2016). Immobilization of Enzymes and Cells.
Humana Press.
6. Mulyasuryani, A. (2018). Elektroanalitik: Dasar dan
Aplikasi. Deepublish.
-
33
7. Buchari, H., Muji. (1996). Karakterisasi Bentonit Pacitan.
JKTI, 6, 1–2.
8. Ginting, A. (2016). Pemanfaatan Limbah Kulit Jagung untuk
Produk Modular dengan Teknik Pilin. Dinamika Kerajinan
dan Batik: Majalah Ilmiah, 32(1), 51–62.
https://doi.org/10.22322/dkb.v32i1.1180
9. Mayangsari, D. (2009). Pengaruh Sumber Karbon terhadap
Produksi Enzim Xilanase dari Trichoderma viride. Jurnal
Ilmu Kimia Universitas Brawijaya.
10. Jatmiko, Efendi. (2016). Pemanfaatan Xilan Asal Tongkol
Jagung Sebagai Sumber Karbon Dan Induser Untuk
Produksi Enzim Xilanolitik Dari Escherichia Coli
Rekombinan Campuran [Gbtxyl43b] Dan [Abfa51]
(Skripsi). Universitas Airlangga. Retrieved from
http://lib.unair.ac.id
11. Siv, S., & Prema, P. (2002). Biotechnology of Microbial
Xylanases: Enzymology, Molecular Biology, and
Application. Critical reviews in biotechnology, 22, 33–64.
https://doi.org/10.1080/07388550290789450
12. Agung Istri Ratnadewi, A., Handayani, W., & Nur Avida, S.
(2016). Optimasi Konsentrasi Substrat Xilan Ampas Tahu
Terhadap Endo-Β-1,4-D-Xylanase Untuk Memproduksi
Xilooligosakarida. Jurnal Kimia Riset, 1, 73.
https://doi.org/10.20473/jkr.v1i2.3084
-
34
13. Lachke, A. (2002). Biofuel fromD-xylose — The second most
abundant sugar. Resonance, 7(5), 50–58.
https://doi.org/10.1007/BF02836736
14. Natawijaya, D., Saepudin, A., & Pangesti, D. (2015). Uji
Kecepatan Pertumbuhan Jamur Rhizopus Stolonifer Dan
Aspergillus Niger Yang Diinokulasikan Pada Beberapa Jenis
Buah Lokal. Jurnal Siliwangi Seri Sains dan Teknologi, 1(1).
Retrieved from
http://jurnal.unsil.ac.id/index.php/jssainstek/article/view/24
15. Budiman, A., & Setyawan, S. (n.d.). Pengaruh Konsentrasi
Substrat, Lama Inkubasi Dan pH Dalam Proses Isolasi
Enzim Xylanase Dengan Menggunakan Media Jerami Padi,
11.
16. Susanti, R., & Fibriana, F. (2017). Teknologi Enzim. Penerbit
Andi.
17. Agustina, I. (2011). Studi Awal Produksi Enzim Selulase Oleh
Trichoderma Sp. Strain T004 Dan T051 Menggunakan
Substrat Pelepah Sawit = Preliminary Study Of Cellulase
Enzyme Production By Trichoderma Sp. Strains T004 And
T051 Using Palm Frond As Substrates. Universitas Indonesia,
1.
18. Richana, N. (2002). Produksi dan Prospek Enzim Xilanase
dalam Pengembangan Bioindustri di Indonesia, 5(1), 8.
-
35
19. Vilma, M., Winkelhausen, E., & Slobodanka, K. (2005). Lipase
Immobilized By Different Techniques On Various Support
Materials Applied In Oil Hydrolysis. Journal of the Serbian
Chemical Society, 70. https://doi.org/10.2298/JSC0504609M
20. Betancor, L., & Luckarift, H. R. (2008). Bioinspired Enzyme
Encapsulation For Biocatalysis. Trends in Biotechnology,
26(10), 566–572. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2008.06.009
21. Millicent Mabel, M., Parthasarathy, N., Rajkumar, J., Gururaj,
P. N., & Thulasi Priyadharshini, M. (2016). A Study On The
Immobilization Of Acid Xylanase On Chitosan From Chitin
Of Shrimp Shells. Journal of Chemical and Pharmaceutical
Sciences, 9, 268–271.
22. Komadel, P. (2003). Chemically Modified Smectites. Clay
Minerals, 38(1), 127–138.
https://doi.org/10.1180/0009855033810083
23. Hamzah, S., Rachmad, W., Suwardi, J., & Rohman, S. (2009).
Modifikasi Bentonit (Clay) menjadi Organoclay dengan
Penambahan Surfaktan. Jurnal Nanosains & Nanoteknologi.
24. Volzone, C., Rinaldi, J. O., & Ortiga, J. (2002). N2 and CO2
Adsorption by TMA- and HDP-Montmorillonites. Materials
Research, 5(4), 475–479. https://doi.org/10.1590/S1516-
14392002000400013
25. Muawanah, A. (2006). Produksi Enzim Xilanase Termostabil
Dari Thermomyces Lanuginosus Ifo 150 Pada Substrat
-
36
Bagasse Tebu. Retrieved from
http://repository.ipb.ac.id/xmlui/handle/123456789/8484
26. Sukmana, E., Sutrisno, S., & Roosdiana, A. (2014). Pengaruh
Suhu Dan Lama Penyimpanan Terhadap Kestabilan Enzim
Xilanase Dari Trichoderma Viride. Jurnal Ilmu Kimia
Universitas Brawijaya, 2(1), pp.340-344-344.
27. Sumardjo, D. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan
Kuliah Mahasiswa Kedokteran. EGC.
28. Sutrisno, A. (2017). Teknologi Enzim. Universitas Brawijaya
Press.
29. Salirawati, D. (2017). Karakterisasi Beberapa Ion Logam
Terhadap Aktivitas Enzim Tripsin. Jurnal Penelitian Saintek,
21, 107. https://doi.org/10.21831/jps.v21i2.12581
30. Hamdiyati, Y. (2011). Pertumbuhan Dan Pengendalian
Mikroorganisme II. Retrieved December 15, 2019, from
https://docplayer.info/36951119-Pertumbuhan-dan
pengendalian-mikroorganisme-ii-oleh-dra-yanti-hamdiyati-m-
si.html
-
37
LAMPIRAN
Lampiran A. Diagram Alir
A. Tahapan Penelitian
Pembuatan tepung klobot
jagung
Pembuatan media padat
Peremajaan biakan murni Aspergillus niger
Pembuatan media cair
Pembuatan inokulum
Produksi enzim xilanase
Isolasi ekstrak kasar xilanase dari biakan Aspergillus niger
Penentuan kadar protein awal
Penentuan kurva baku gula pereduksi xilosa
Penentuan aktivitas xilanase bebas
pH Suhu Waktu Inkubasi
-
38
Amobilisasi enzim xilanase pada matriks bentonit
teraktivasi
Penentuan kadar protein enzim xilanase sisa
Penentuan aktivitas xilanase amobil
pH Suhu Waktu Inkubasi
Analisa Data
-
39
Lampiran B. Preparasi Larutan
B.1 Larutan Asam Asetat 0,2 M
Asam glasial 98% (BJ: 1,05 g/mL; BM: 60 g/mol; konsentrasi
17,15 M) dipipet sebanyak 1,17 mL. Selanjutnya, dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan akuades hingga tanda batas.
Kemudian dikocok hingga homogen.
B.2 Larutan Natrium Asetat 0,2 M
Natrium asetat (BM: 82 g/mol) ditimbang sebanyak 1,64 g.
Selanjutnya, dilarutkan dengan akuades dan dimasukkan ke dalam
labu ukur 100 mL. Kemudian ditambahkan dengan akuades hingga
tanda batas dan dikocok hingga homogen.
B.3 Larutan Buffer Asetat 0,2 M pH 5
Larutan asam asetat 0,2 M dipipet sebanyak 50 mL ke dalam
gelas kimia. Kemudian ditambahkan larutan natrium asetat 0,2 M
sebanyak 90,99 mL dan diaduk menggunakan magnetik stirrer hingga
homogen. Selanjutnya, diukur pH menggunakan kertas pH hingga
menunjukkan pH 5.
B.4 Larutan Buffer Asetat 0,2 M pH 6
Larutan asam asetat 0,2 M dipipet sebanyak 2 mL ke dalam
gelas kimia. Kemudian ditambahkan larutan natrium asetat 0,2 M
sebanyak 36,39 mL dan diaduk menggunakan magnetik stirrer hingga
homogen. Selanjutnya, diukur pH menggunakan kertas pH hingga
menunjukkan pH 6.
B.5 Unsur Renik
Ditimbang Na2EDTA sebanyak 3,0229 g; NaOH sebanyak
0,5171 g; MgSO4.7H2O sebanyak 0,2502 g; ZnSO4.7H2O sebanyak
0,1004 g; MnSO4.4H2O sebanyak 0,1006 g; CuSO4.5H2O sebanyak
0,0256 g; Na2SO4 sebanyak 2,5005 g; NaMoO4 sebanyak 0,0254 g dan
FeSO4.7H2O sebanyak 0,5002 g lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer
250 mL. Ditambahkan H2SO4 pekat sebanyak 0,125 mL dan
-
40
dihomogenkan. Setelah itu, ditambahkan akuades hingga volumenya
menjadi 250 mL dan dihomogenkan. Ditutup menggunakan kapas dan
dilapisi dengan kertas cokelat serta diikat dengan karet gelang.
Disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
B.6 Larutan HCl 0,2 M
Larutan HCl 37% (BJ: 1,19 g/mL; BM: 36,5 g/mol;
konsentrasi 12,06 M) dipipet sebanyak 1,66 mL lalu dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 mL. Setelah itu, ditambahkan akuades hingga
tanda batas dan dihomogenkan.
B.7 Larutan Buffer Tris-HCl 0,2 M pH 8
Padatan Tris (BM: 121,1 g/mol) ditimbang sebanyak 6,055 g
lalu dimasukkan ke dalam gelas kimia dan dilarutkan dengan akuades
secukupnya. Ditambahkan larutan HCl 0,2 M sedikit demi sedikit
hingga pHnya menjadi 8. Setelah itu, masukkan ke dalam labu ukur
250 mL dan ditambahkan akuades hingga tanda batas serta
dihomogenkan.
B.8 Larutan Buffer Tris-HCl 0,2 M pH 7
Padatan Tris (BM: 121,1 g/mol) ditimbang sebanyak 0,2422
g lalu dimasukkan ke dalam gelas kimia dan dilarutkan dengan
akuades secukupnya. Ditambahkan larutan HCl 0,2 M sedikit demi
sedikit hingga pHnya menjadi 7. Setelah itu, masukkan ke dalam labu
ukur 10 mL dan ditambahkan akuades hingga tanda batas serta
dihomogenkan.
B.9 Larutan Buffer Tris-HCl 0,2 M pH 9
Padatan Tris (BM: 121,1 g/mol) ditimbang sebanyak 0,6055
g lalu dimasukkan ke dalam gelas kimia dan dilarutkan dengan
akuades secukupnya. Ditambahkan larutan HCl 0,2 M sedikit demi
sedikit hingga pHnya menjadi 9. Setelah itu, masukkan ke dalam labu
ukur 25 mL dan ditambahkan akuades hingga tanda batas serta
dihomogenkan.
-
41
B.10 Larutan NaOH 10%
NaOH ditimbang sebanyak 10 g dan dilarutkan menggunakan
akuades secukupnya serta diaduk hingga homogen. Setelah itu,
dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan akuades
hingga tanda batas serta dihomogenkan.
B.11 Larutan NaOH 0,1N
NaOH ditimbang 0,4 g dan dilarutkan menggunakan
akuades secukupnya serta diaduk hingga homogen. Setelah itu,
dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan dengan
akuades hingga tanda batas serta dihomogenkan.
B.12 Reagen Biuret
Ditimbang CuSO4.5H2O sebanyak 0,3754 g dan NaKC4O6H4
sebanyak 1,5 g. Setelah itu, dilarutkan dengan akuades secukupnya
dan diaduk hingga homogen. Ditambahkan larutan NaOH 10%
sebanyak 75 mL sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer.
Larutan yang sudah tercampur, dimasukkan ke dalam labu ukur 250
mL dan ditambahkan akuades hingga tanda batas serta dihomogenkan.
B.13 Xilan 1%
Xilan ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas
kimia. Setelah itu, dilarutkan dengan buffer asetat pH 5 secukupnya.
Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL lalu ditambahkan
buffer asetat pH 5 hingga tanda batas dan dihomogenkan.
B.14 Reagen DNS
Ditimbang NaOH 1 g; NaKC4O6H4 18,2 g; Na2SO3 0,5 g;
kristal fenol 0,2 g lalu dimasukkan ke dalam gelas kimia dan
dilarutkan dengan akuades secukupnya. Ditambahkan asam
dinitrosalisilat sedikit demi sedikit sebanyak 1 g lalu diaduk hingga
larut menggunakan magnetik stirrer. Setelah itu, dimasukkan ke dalam
-
42
labu ukur 100 mL dan ditambahkan akuades hingga tanda batas serta
dihomogenkan.
B.15 Larutan HCl 0,4 M
Larutan HCl 37% (BJ: 1,19 g/mL; BM: 36,5 g/mol;
konsentrasi 12,06 M) dipipet sebanyak 3,3 mL lalu dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 mL. Setelah itu, ditambahkan akuades hingga
tanda batas dan dihomogenkan.
B.16 Air Bebas Reduktor
Akuades sebanyak 250 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer
lalu ditambahkan larutan KMnO4 hingga berubah warna menjadi
ungu. Selanjutnya dilakukan destilasi sehingga didapatkan air bebas
reduktor yang tidak berwarna.
-
43
Lampiran C. Perhitungan
C.1 Larutan Asam Asetat 0,2 M
Larutan asam asetat 0,2 M dibuat dari larutan asam asetat glasial 98%
(BJ: 1,05 g/mL; BM: 60 g/mol):
[𝐴𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 𝑔𝑙𝑎𝑠𝑖𝑎𝑙] =𝑝 𝑥 𝜌 𝑥 10
𝑀𝑟=
98% 𝑥 1,05𝑔/𝑚𝐿 𝑥 10
60 𝑔/𝑚𝑜𝑙
[𝐴𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 𝑔𝑙𝑎𝑠𝑖𝑎𝑙] = 17,15 𝑀
Jadi, untuk membuat asam asetat glasial konsentrasi 0,2 M dilakukan
pengenceran dengan rumus:
𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2 𝑉1 𝑥 17,15 𝑀 = 100 𝑚𝐿 𝑥 0,2 𝑀
𝑉1 = 100 𝑚𝐿 𝑥 0,2 𝑀
17,15 𝑀= 1,17 𝑚𝐿
C.2 Larutan Natrium Asetat 0,2 M
Larutan natrium asetat 0,2 M dibuat sebanyak 100 mL dengan cara
(BM: 82 g/mol):
mol natrium asetat = [natrium asetat] x V
= 0,2 mol/L x 0,1 L
= 0,02 mol
massa natrium asetat = mol natrium asetat x BM natrium asetat
= 0,02 mol x 82 g/mol
= 1,64 g
C.3 Pembuatan Buffer Asetat 0,2 M pH 5
Ka asam asetat = 1,8 x 10-5
pKa asam asetat = 4,74
pH = pKa – log [𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡]
[𝑛𝑎𝑡𝑟𝑖𝑢𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡]
5 = 4,74 – log
-
44
5-4,74 = - log 50
𝑉
V = 90,99 mL
Jadi, perbandingan volume CH3COOH : CH3COONa = 50 mL : 90,99
mL.
C.4 Pembuatan Buffer Asetat 0,2 M pH 6
Ka asam asetat = 1,8 x 10-5
pKa asam asetat = 4,74
pH = pKa – log [𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡]
[𝑛𝑎𝑡𝑟𝑖𝑢𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡]
6 = 4,74 – log
2 𝑚𝐿 𝑥 0,2 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿
(2+𝑉)𝑚𝐿𝑉 𝑚𝐿 𝑥 0,2 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿
(2+𝑉)𝑚𝐿
6-4,74 = - log 2
𝑉
V = 36,39 mL
Jadi, perbandingan volume CH3COOH : CH3COONa = 2 mL : 36,39
mL.
C.5 Pembuatan Buffer Tris 0,2 M
Larutan tris 0,2 M dibuat sebanyak 250 mL dengan cara (BM: 121,1
g/mol) :
mol tris = [tris] x V
= 0,2 mol/L x 0,25 L
= 0,05 mol
massa tris = mol tris x BM tris
= 0,05 mol x 121,1 g/mol
= 6,055 g
C.6 Pembuatan Larutan HCl 0,2 M
Larutan HCl 0,2 M dibuat dari larutan HCl 37% dengan cara (BJ: 1,19
g/mL; BM: 36,5 g/mol):
-
45
[𝐴𝑠𝑎𝑚 𝐾𝑙𝑜𝑟𝑖𝑑𝑎] =𝑝 𝑥 𝜌 𝑥 10
𝑀𝑟=
37% 𝑥 1,19𝑔/𝑚𝐿 𝑥 10
36,5 𝑔/𝑚𝑜𝑙
[𝐴𝑠𝑎𝑚 𝐾𝑙𝑜𝑟𝑖𝑑𝑎] = 12,06 𝑀
Jadi, untuk membuat asam klorida konsentrasi 0,2 M dilakukan
pengenceran dengan rumus:
𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2 𝑉1 𝑥 12,06 𝑀 = 100 𝑚𝐿 𝑥 0,2 𝑀
𝑉1 = 100 𝑚𝐿 𝑥 0,2 𝑀
12,06 𝑀= 1,66 𝑚𝐿
C.7 Pembuatan Larutan HCl 0,4 M
Larutan HCl 0,4 M dibuat dari larutan HCl 37% dengan cara (BJ: 1,19
g/mL; BM: 36,5 g/mol):
[𝐴𝑠𝑎𝑚 𝐾𝑙𝑜𝑟𝑖𝑑𝑎] =𝑝 𝑥 𝜌 𝑥 10
𝑀𝑟=
37% 𝑥 1,19𝑔/𝑚𝐿 𝑥 10