draft user manual dna - soacaredirecte extractie of door reverse transcriptie van rna sequenties, te...

DIAGENODE Human Rhinovirus Real-Time PCR kit INSTRUCTIONS FOR USE

Kit Referentie: DDGS-60-L100 Versie 01 Laatste herzieningsdatum: 01.07.2015

S-DiaMGTVTM Real-Time PCR detectie van Mycoplasma genitalium

en Trichomonas vaginalis

P a g e | 2

Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3rd Floor // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]

Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) 4 364 20 50 // Mail: [email protected]

DIAGENODE S-DiaMGTVTM GEBRUIKSAANWIJZING

Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie:

Vorige versie: 16.09.2014

Herzieningsdatum Omschrijving

17.02.2015 Kleine wijzigingen in de tabel op pagina 40

P a g e | 1

1. INTRODUCTIE ...................................................................................................................................... 1

2. WOORDENLIJST................................................................................................................................... 2

3. ALGEMENE INFORMATIE .................................................................................................................... 3

3.1 BEOOGD GEBRUIK .............................................................................................................................. 3 3.2 INFORMATIE OVER DE PATHOGENEN ..................................................................................................... 3 3.3 PRINCIPE .......................................................................................................................................... 4 3.4 TARGET SEQUENTIES .......................................................................................................................... 4 3.5 INHOUD VAN DE KIT ............................................................................................................................ 4

4. KWALITEITSCONTROLE ....................................................................................................................... 5

5. REAGENS OPSLAG, HANTERING EN STABILITEIT .............................................................................. 6

6. WAARSCHUWINGEN EN VOORZORGSMAATREGELEN ....................................................................... 7

7. PROTOCOL ........................................................................................................................................... 8

7.1. ALGEMEEN OVERZICHT ...................................................................................................................... 8 7.2 ROCHE® MAGNA PURE 96 SYSTEEM EN ROCHE® LIGHTCYCLER® 480 REAL-TIME PCR SYSTEEM ............ 9 I. BENODIGDHEDEN (NIET MEEGELEVERD) ......................................................................................... 10 II. MATERIAAL AFNAME, OPSLAG EN TRANSPORT................................................................................ 11 III. EXTRACTIE PROCEDURE ............................................................................................................... 11 IV. MIX BEREIDING EN DOSERING ....................................................................................................... 12 V. REAL-TIME PCR SYSTEEM INSTELLEN .......................................................................................... 15 VI. INTERPRETATIE VAN RESULTATEN ................................................................................................. 16 7.3 ABBOTT® M2000 APPARAAT .............................................................................................................. 18 I. BENODIGDHEDEN (NIET MEEGELEVERD) ......................................................................................... 19 II. MATERIAAL AFNAME, OPSLAG EN TRANSPORT................................................................................ 20 III. EXTRACTIE PROCEDURE ............................................................................................................... 20 IV. MIX BEREIDING EN DOSERING ....................................................................................................... 21 V. REAL-TIME PCR SYSTEEM INSTELLEN .......................................................................................... 24 VI. INTERPRETATIE VAN RESULTATEN ................................................................................................. 25 7.4 ROCHE® COBAS® 4800 SYSTEEM ...................................................................................................... 27 I. BENODIGDHEDEN (NIET MEEGELEVERD) ......................................................................................... 28 II. MATERIAAL AFNAME, OPSLAG EN TRANSPORT................................................................................ 29 III. EXTRACTIE PROCEDURE ............................................................................................................... 29 IV. MIX BEREIDING EN DOSERING ....................................................................................................... 30 V. REAL-TIME PCR SYSTEEM INSTELLEN .......................................................................................... 33 VI. INTERPRETATIE VAN RESULTATEN ................................................................................................. 34

8. HANDLEIDING PROBLEMEN OPLOSSEN ........................................................................................... 35

9. EVALUATIE VAN DE KIT ...................................................................................................................... 36

9.1 ANALYTISCHE GEVOELIGHEID ............................................................................................................ 36 9.2 NAUWKEURIGHEID ........................................................................................................................... 37 9.3 ANALYTISCHE SPECIFICITEIT ............................................................................................................. 38 9.4 INTERFERENTIE................................................................................................................................ 39 9.5 KLINISCHE WERKING ........................................................................................................................ 40 9.6. PREVALENTIE ................................................................................................................................. 45


10. TEST BEPERKINGEN ........................................................................................................................ 45

11. KWALITEIT CERTIFICERING ............................................................................................................. 46

12. REFERENTIES ................................................................................................................................... 46

13. VERKLARING VAN SYMBOLEN ......................................................................................................... 47

14. MEDEDELING AAN KOPER ............................................................................................................... 48

P a g e | 1

1. Introductie

De real-time polymerase chain reaction (polymerase ketting reactie), ook kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qPCR) genoemd, is een op nucleïnezuur gebaseerde technologie die gebruikt wordt om specifieke DNA sequenties, die verkregen zijn door directe extractie of door reverse transcriptie van RNA sequenties, te detecteren en te kwantificeren. Deze kwantificatie kan in een absoluut of relatief aantal kopieën gemeten worden. Real-time PCR technologie resulteert in snelle, specifieke en kwantitatieve bepalingen van de aanwezigheid van genen die betrokken zijn bij infectieziekten, kanker en genetische afwijkingen. Deze krachtige technologie wordt gebruikt in de kits van Diagenode om nauwkeurig het aantal ziekte pathogenen te bepalen. Een van de belangrijkste kenmerken van qPCR technologie is de “real-time” kwantificatie gedurende alle PCR amplificatie cycli van geamplificeerd DNA terwijl het zich vormt in de reactie, hetgeen dus nauwkeurigere metingen oplevert vergeleken met traditionele eindpunt PCR. Deze real-time metingen zijn mogelijk door het kwantificeren van signalen van fluorescente kleurstoffen die intercaleren met het dubbelstrengs DNA geproduceerd in elke amplificatie cyclus. Als alternatief gebruikt men gelabelde DNA oligonucleotide probes met een fluorofoor (bijv. een TaqMan® probe) die hybridiseren met het complementaire DNA om real-time metingen te realiseren tijdens qPCR. De gevormde fluorescente signalen kunnen nauwkeurig worden gemeten en gekwantificeerd door gebruikt te maken van een apparaat zoals een thermocycler die is aangepast voor qPCR.

Figuur 1: Technologie die dubbel-gelabelde hydrolyse probes gebruikt

Figuur 2: Specifieke hybridisatie van primers en probes aan het target gen

gene.

Figuur 3: Elongatie en afsplitsing van fluorofoor door Taq polymerase.

P a g i n a | 2


2. Woordenlijst

C+ Positieve controle C- Negatieve controle CI Betrouwbaarheidsinterval (Confidence Interval) Cp Snijpunt (Crossing Point) Ct Drempelwaarde van cyclus (Cycle Threshold) DNA Deoxyribonucleïnezuur DR Dragonfly orange (kleurstof) EIC Extractie en Inhibitie Controle Ex. Excitatie Em. Emissie IVD In-vitro Diagnostisch LC LightCycler LoD Detectielimiet (Limit of Detection) MG Mycoplasma genitalium MGP Magnetische glas deeltjes (Magnetic Glass Particles) MGTV Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis MM Master Mix PBS Fosfaat gebufferde zoutoplossing (Phosphate Buffered Saline) PCR Polymerase Ketting Reactie (Polymerase Chain Reaction) PP Probe en Primers PPc Probe en Primers voor controle PPp Probe en Primers voor pathogeen qPCR Kwantitatieve Polymerase Ketting Reactie (quantitative PCR) RD Rode Kleurstof (Red Dye) RNA Ribonucleïnezuur STM Materiaal Transport Medium (Specimen Transport Medium) TM Transport Medium TR Texas Red (kleurstof) TV Trichomonas vaginalis UIC Universele Inhibitie Controle YD Gele Kleurstof (Yellow Dye)

P a g i n a | 3


3. Algemene Informatie

3.1 Beoogd Gebruik

De S-DiaMGTVTM kit is een in vitro diagnostische assay waarmee met PCR de kwalitatieve detectie van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis in klinisch materiaal (mannelijke en vrouwelijke urine, urogenitale uitstrijken in Abbott®, Cobas® en Amplicor transport medium) van patiënten, die mogelijk geïnfecteerd zijn met deze pathogenen, mogelijk is.

Deze IVD assay is bedoeld als een hulpmiddel bij de diagnose van seksueel overdraagbare aandoeningen en mag alleen in diagnostieklaboratoria worden gebruikt door gekwalificeerde technici.

3.2 Informatie over de Pathogenen

Mycoplasma genitalium is een kleine parasitaire bacterie die leeft op de trilhaar-epitheelcellen van zowel het voortplantings- als het ademhalingssysteem van primaten. Besmetting met Mycoplasma genitalium komt relatief veel voor, kan worden overgedragen tussen partners tijdens onbeschermde geslachtsgemeenschap en kan worden behandeld met antibiotica. Mycoplasma genitalium wordt in verband gebracht met urethritis bij zowel mannen als vrouwen en met cervicitis bij vrouwen. Bij Mycoplasma genitalium geïnfecteerde mannen komt symptomatische urethritis meer voor dan asymptomatische urethritis. Ten gevolge van langzame celdeling en strikte groeicondities is het gebruik van een kweek in klinische praktijken niet mogelijk. Polymerase ketting reactie (PCR) is momenteel de voorkeursmethode voor detectie. Trichomonas vaginalis is een anaerobe, protozoa met flagellen, een soort micro-organisme dat de veroorzaker is van trichomoniasis. Trichomoniasis is de meest voorkomende pathogene protozoa infectie bij mensen in geïndustrialiseerde landen (1). Bij benadering doen zich ieder jaar 7,4 miljoen nieuwe gevallen voor bij vrouwen en mannen (2). Het aantal besmettingen bij mannen en vrouwen is gelijk, maar alleen vrouwen vertonen symptomen (vaginitis, urethritis, en cervicitis) terwijl besmettingen bij mannen meestal asymptomatisch zijn. Overdracht vindt direct plaats omdat de trofozoïeten zich niet ontwikkelen naar het cyste stadium.

P a g i n a | 4


3.3 Principe

De S-DiaMGTVTM assay wordt uitgevoerd na de extractie van nucleïnezuren uit het materiaal van een urogenitale uitstrijk of van urine. De S-DiaMGTVTM kit is een multiplex kit die primers bevat waarmee de amplificatie van een specifiek deel van het Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis genoom in één reactie mogelijk is. Elk geamplificeerd target gen wordt gedetecteerd door een specifieke hydrolyse probe die gelabeld is met een unieke fluoriserende kleurstof. De uitgestraalde fluorescentie wordt gemeten en geanalyseerd door het optische deel van de real-time PCR machine. Het wel of niet meten van het fluorescentie signaal geeft de aan- of respectievelijk de afwezigheid aan van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis in het klinisch materiaal in kwestie.

3.4 Target Sequenties

De primers zijn ontwikkeld om specifiek te hybridiseren met de meest geconserveerde sequentie van het target pathogeen.

De probe is ontwikkeld om specifiek te hybridiseren met de meest geconserveerde sequentie van het target pathogeen en bevat een reporter kleurstof op zijn 5' uiteinde waarvan de emissie wordt geremd door een tweede kleurstof op zijn 3' uiteinde.

3.5 Inhoud van de Kit

Deze kit bevat de volgende reagentia:

Reagentia box Reagentia Kleur Dopje Volume Hoeveelheid

M.genitalium/T.vaginalis (FAM/YD) Double-Dye Probe & Primers

Rood 250 µL 1 epje

M.genitalium/T.vaginalis negative control Licht blauw 250 µL 1 epje

M.genitalium/T.vaginalis positive control Groen 250 µL 1 epje

H2O (Rnase/Dnase-vrij) Donker Blauw 1000 µL 1 epje

M.genitalium/T.vaginalis PCR mix* Bruin Leeg 1 epje

* Enkel voor gebruik in combinatie met het LightCycler® 480 systeem. De hoeveelheid probes en primers is voldoende voor 100 PCR reacties met een eindvolume van 25 µL.

Pathogeen Target Sequenties (3), (4), (5) Mycoplasma genitalium mgpa en mg219 gen

Trichomonas vaginalis Repeatsequentie

Pathogenen Reporter Kleurstoffen Mycoplasma genitalium FAM (Ex./Em.: 494/520 nm)

Trichomonas vaginalis YELLOW (Ex./Em.: 530/549 nm)

1 tube

P a g i n a | 5


4. Kwaliteitscontrole

Kwaliteitscontrole procedures zijn bedoeld om de werking van reagentia en assay te monitoren. Kwaliteitscontrole voorschriften moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met lokale, provinciale en/of federale regelgeving of accreditatie eisen en standaard kwaliteitscontrole procedures van uw laboratoria. Er zijn verschillende controles: Positieve en negatieve controles Interne controle Voor elke run: De PCR procedure moet een negatieve en een positieve controle bevatten om de werking van de testen te monitoren.

Een positieve controle is essentieel voor het beoordelen van de efficiëntie van de amplificatie stap en maakt een uit te voeren controle van de kwaliteit van de gebruikte reagentia mogelijk (bijv. Integriteit van de probes en primers). De Diagenode positieve controle wordt in het bijzonder herkend door de in de S-DiaMGTVTM kit aanwezige primers en probes gelabeld met de FAM en YD reporter. Een negatieve controle is essentieel om gecontamineerde reagentia (bijv. master mix, RNase/DNase-vrij water, primers en probes) of een gecontamineerde omgeving (bijv. nucleïnezuren, target genen in amplicons) te kunnen detecteren. De Diagenode negatieve controle is RNase/DNase-vrij water en mag geen enkel amplificatie signaal geven.

Voor al het materiaal: Diagenode raadt sterk aan om een interne controle toe te voegen aan uw samples om te garanderen dat het DNA succesvol uit het materiaal is geëxtraheerd, geamplificeerd en gedetecteerd.

Een extractie en inhibitie controle (EIC) maakt het voor gebruikers van diagnostische assays mogelijk om de efficiëntie van de extractie te bepalen evenals het detecteren van aanwezige PCR inhibitoren en proces fouten. Hiervoor is de S-DiaMGTVTM kit op de Roche® LightCycler® 480 gevalideerd in combinatie met DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 of DICD-Cy-L100. Universele Inhibitie controle (UIC) maakt het voor gebruikers van diagnostische assays mogelijk om de efficiëntie van de PCR te bepalen evenals het detecteren van aanwezige PCR inhibitoren en proces fouten.

Hiervoor is de S-DiaMGTVTM kit op de Abbott® m2000 gevalideerd in combinatie met DIA-UIC(Cy5)-050 of DICU-Cy-L100.

P a g i n a | 6


5. Reagens Opslag, Hantering en Stabiliteit

Bescherm reagentia tegen licht. Hanteer alle onderdelen van de kit op ijs. Het bewaren van de kit op kamertemperatuur kan leiden tot degradatie van de in de kit

aanwezige onderdelen. Dit heeft een verminderde gevoeligheid tot gevolg en wij raden in dit geval sterk aan een nieuwe kit te gebruiken.

Voorkom meer dan 12 vries-dooi cycli van de reagentia om degradatie ervan te

voorkomen. Maak zo nodig kleinere porties. Onze kits worden bevroren verstuurd, dienen bevroren te worden ontvangen en na

ontvangst bij ≤ -20 °C te worden opgeslagen.

Conditie Opslag temperatuur Stabiliteit

Ongeopend reagens ≤ -20 °C Houdbaarheidsdatum (zie etiket)

Geopend reagens 2 - 8 °C 3 maanden

PCR mix (MM + PP + water)

2 - 8 °C 3 maanden

P a g i n a | 7


6. Waarschuwingen en Voorzorgsmaatregelen

Lees alle instructies voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Gebruik reagentia niet als de beschermende doos geopend of gescheurd is bij

ontvangst. Gebruik reagentia niet als het epje geopend of beschadigd is. Gebruik geen verlopen reagentia en/of materiaal. Verwissel reagentia uit de kit niet met die van andere batchnummers of met die van

andere fabrikanten. Dit product mag enkel worden gebruikt door wetenschappers/analisten die een

training hebben gehad over de technieken van real-time PCR. GLP moet worden nageleefd, in het bijzonder:

- Het openen, isoleren en real-time amplificeren van nucleïnezuur moeten worden uitgevoerd in gescheiden laboratorium ruimten. Het PCR laboratorium (biologisch veiligheidskabinet, DNA/RNA extractie locatie, werkblad, etc.) moet na elk PCR experiment worden schoon gemaakt en gedesinfecteerd met de juiste oplossingen.

- Voer de kwaliteitscontrole uit zoals beschreven in paragraaf 4. - Draag beschermende kleding en wegwerphandschoenen tijdens het

werken met reagentia uit de kit. Was en desinfecteer uw handen grondig na het uitvoeren van de test.

- Houd alle epjes en flacons gesloten als deze niet worden gebruikt. Voorkom onderlinge verwisselingen van dopjes van epjes evenals hergebruik van dopjes. Dit kan leiden tot contaminatie en verstoring van resultaten van de test.

- Filter tips (aerosol resistant) moeten worden gebruikt voor alle pipetteer handelingen.

Virussen die dienen ter interne controle, moeten worden gehanteerd in een biologisch veiligheidskabinet voor een handmatige extractie procedure of in een specifieke ruimte voor een automatische extractie procedure; zoals voorgesteld door de fabrikant.

De kit mag niet worden gebruikt door iemand die symptomen vertoont van de ziekte die met behulp van de kit wordt gedetecteerd.

Gooi iedere kit die mogelijk gecontamineerd is weg. Na gebruik moeten het gebruikte materiaal en de gebruikte reagentia worden

behandeld als potentieel besmet en worden weggegooid in een specifiek voor biologisch materiaal bedoelde afvalbak. Gooi ongebruikte reagentia en afval weg in overstemming met landelijke, federale, provinciale, staat en lokale regelgeving.

Hanteer materiaal en controle reagentia altijd alsof deze besmet zijn en werk ermee in overeenstemming met laboratorium veiligheidsvoorschriften zoals deze beschreven staan in de lokale regelgevingshandleiding.

Niet met de mond pipetteren. Voorkom inname van onderdelen uit de kit. Rook, drink, of eet niet in de ruimtes waar wordt gewerkt met materiaal of reagentia.

Indien u een beschadigd pakket of ontdooide kit ontvangt, gelieve

contact met ons op te nemen.

[email protected] / +32 4 364 20 52

P a g i n a | 8


7. Protocol

7.1. Algemeen Overzicht

MagNA pure 96 & LightCycler® 480 Abbott® m2000 Cobas® 4800

Hoofdstuk Laboratorium

ruimte Vereisten

Materiaal Zie punt I

Materiaal Afname Zie punt II

Materialen

Transport medium

Extractie Zie punt III

Extractie ruimte Biologisch

veiligheidskabinet

Materialen DNA isolatie kit Interne controle (virus)

Mix Bereiding & Dosering

Zie punt IV Reagens bereidingsruimte Laminaire flowkast

Geëxtraheerd materiaal S-DiaMGTVTM kit Master Mix Interne controle (pp)

Real-Time PCR Systeem Instellen

Zie punt V Amplificatie ruimte PCR mix met geëxtraheerd materiaal

Resultaat Analyse & Interpretatie

Zie punt VI Amplificatie ruimte Geamplificeerde samples

P a g i n a | 9


7.2

Roche® MagNA Pure 96 Systeem

en

Roche® LightCycler® 480

Real-Time PCR Systeem

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 10


I. Benodigdheden (niet meegeleverd)

Disposables Steriele pipet tips met filters (DNase/RNase-vrij) RNase/DNase-vrije microcentrifuge epjes (1,5 en/of 2 mL) MagNA Pure 96 disposables (Output Plate, Filter Tips, Processing

Cartridges, Intern Controle Epje, afdekfolie) 96-well plate en afplakstrip voor LightCycler® 480

Laboratorium apparatuur Biologisch veiligheidskabinet, laminaire flowkast Koelblok/ijs Pipetten (nauwkeurig tussen 1-1000 µL) Vortex Microcentrifuge Stopwatch of klokje Roche® MagNA Pure 96 Systeem met software versie 2.02 Roche® LightCycler® 480 real-time PCR Systeem met software versie

1.0.5.039

Reagentia Voor extractie: MagNA Pure 96 DNA en Viral NA Small Volume Kit, Roche® (ref:

06543588001) Voor amplificatie: Interne controle

Bijv. Diagenode DNA Extractie & Inhibitie Controle (Nieuwe ref: DICD-xx*-L100 / Oude ref: Dia-EIC/DNA-050) *De letters ‘xx’ verwijzen naar kleurstoffen beschikbaar voor de S-DiaMGTVTM kit: Texas Red (TR), Cy5 (CY) en Red Dye (RD).

Optima DU Master Mix 5x DNA (ref: DMML-D5-D100)

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 11


II. Materiaal Afname, Opslag en Transport

De op PCR-gebaseerde diagnose van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis is afhankelijk van de afname van geschikt materiaal, het snelle transport hiervan in aangepaste containers naar het laboratorium en de juiste opslag voorafgaand aan de analyse.

Type Afname* Opslag - Transport**

Uitstrijk

Urogenitale uitstrijk afgenomen en getransporteerd in 1 - 3 mL Amplicor Transport Medium (Roche®). Gebruik geen hard staafje of houten staafje

- Gekoeld bij 2 - 8 °C voor ≤ 72 uur - Bevroren bij -70 °C voor een langere

periode voorafgaand aan de verwerking

Urine Eerst 10 mL tot 50 mL urine, bij voorkeur 2 tot 6 uur na de laatste mictie verkregen in een steriel buisje met schroefdop zonder conserveermiddel

- Gekoeld bij 2-8 °C voor ≤ 24 uur - Bevroren bij -20 °C of -70 °C voor › 24

uur

* Standaard afname procedures zijn geschikt om urogenitaal materiaal te verkrijgen. ** Zorg ervoor dat het transport van menselijke materialen voldoet aan alle lokale en nationale regelgeving met betrekking tot transport van etiologisch materiaal.

III. Extractie Procedure

Nucleïnezuur extractie is het proces dat gebruikt wordt voor het isoleren van DNA en/of RNA uit materiaal (gelyseerde cellen) en het extraheren van nucleïnezuur van eiwitten, vetten,… Voer de gegevens volgens de instructies van de fabrikant in in de MagNa Pure Systeem software.

Extractie Apparaat MagNA pure 96 Software Versie 2.02 Extractie Protocol V.2.0 Pathogen Universal 200 Extractie Kit MagNA Pure 96 DNA en Viral NA Small Volume Materiaal Volume 200 µL urogenitale uitstrijk in Amplicor transport medium

200 µL urine Extractie Volume 200 µL Intern Controle Volume 10 µl EIC viruskweek + 10 µl PBS Elutie Volume 50 µL

Wij raden aan om alle samples die mogelijk besmet zijn in een biologisch veiligheidskabinet te hanteren.

1. Ontdooi EIC virus op ijs. 2. Plaats alle reagentia behalve Magnetic Glass Particles (MGP) en benodigde

verbruiksmaterialen inclusief tips en output plate in de machine volgens de instructies van de software (workplace).

3. Pipetteer 200 µL transport medium of urine in een Processing Cartridge, kolom per kolom.

4. Plaats de Processing Cartridge met al het materiaal in het betreffende rek. 5. Voer, in veelvouden van 8, het aantal samples voor extractie in in de software om het

totale EIC volume te bepalen. 6. Pipetteer de helft van het door de software berekende EIC volume in een intern controle

epje.

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

http://www.google.be/url?sa=i&rct=j&q=symbol+hand&source=images&cd=&docid=xFT8E8hPjPN9-M&tbnid=vjlv9eJxHeEvXM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.designofsignage.com/application/symbol/hands/largesymbols/up-arrow-2.html&ei=OLMcUZGwI8mu0QXp84GYDQ&psig=AFQjCNGMvnM4Q0eX2KGMCPel5R3XszqLhA&ust=1360921756003801

P a g i n a | 12


7. Voeg een gelijke hoeveelheid PBS toe aan het interne controle epje met de EIC. 8. Vortex het epje kort. 9. Plaats het interne controle epje in de houder. 10. Vortex elk MGP flesje 1 minuut. 11. Plaats deze flesjes in de houder. 12. Na de extractie stap, verwijder de output plate die de materiaal extracten bevat. 13. Sluit de plaat af met MagNA Pure 96 afdekfolie en bewaar op ijs.

Voer nooit nucleïnezuur isolatie uit op de positieve controle Voer de PCR uit op dezelfde dag en bewaar de geëxtraheerde nucleïnezuren op ijs. Het voor een langere periode op kamertemperatuur bewaren van materiaal extracten kan leiden tot degradatie van nucleïnezuren met een verlaagde PCR gevoeligheid als gevolg.

IV. Mix Bereiding en Dosering

Werkwijze

Aanbeveling voorafgaand aan het starten van de mix bereiding

Werkplek Materiaal bereidingsruimte

Reagens bereidingsruimte

Hanteer mogelijk besmet materiaal in een biologisch veiligheidskabinet. Hanteer reagentia in een laminaire flowkast die ver weg of op zijn minst gescheiden is van de amplificatieruimte.

Opslag tijdens het experiment Materiaal extract (+ EIC) C+ (plasmide) MM PP H20 (Rnase/Dnase-vrij) C-

ijs ijs ijs ijs kamertemperatuur kamertemperatuur

Voordat de mix wordt bereidt dienen alle oplossingen na het ontdooien kort te worden afgedraaid. Pipetteer ze vervolgens op en neer om ze te homogeniseren.

Dosering Dosering

2 3

Negatieve controle

Materiaal extract

Positieve controle

Bereiding

1

PCR mix

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80


P a g i n a | 13


IV.a PCR mix bereiding PCR mix bedoeld voor direct gebruik

1. Tel het totale aantal samples en controles (negatieve en positieve) die in één run worden getest.

2. Vermenigvuldig het volume van elke component (MM, PP, H2O) met het totale aantal samples en controles (positieve C+ en negatieve C-), plus 1 of 2 extra (zie voorbeeld figuur 1).

3. Kort voor het runnen van de assay, bereid de hier onderstaande PCR mix berekend op een eindvolume van 25 µL:

Figuur 1: Tabel met berekeningen voor bepaalde aantallen samples.

MM Diagenode Optima DU Master Mix 5x DNA

PPpathogeen MGTV dubbele-kleurstof probe en primers

PPcontrole Dubbele-kleurstof probe en primers (DNA EIC)

Water H2O (RNase/DNase-vrij)

5x geconcentreerd MM Voor één 25 µL PCR reactie

5 µL

2,5 µL

2,5 µL

10 µL

Eindvolume zonder sample: 20 µL

Het totale aantal samples en controles

Extra Master Mix 5X DNA (µL)

PPp (µL)

PPc (µL)

H2O (Rnase/Dnase-vrij)

(µL)

Totaal volume PCR mix (µL)

3 1 20 10 10 40 80 4 1 25 12,5 12,5 50 100 5 1 30 15,0 15,0 60 120 6 1 35 17,5 17,5 70 140 7 1 40 20 20 80 160 8 1 45 22,5 22,5 90 180 9 1 50 25 25 100 200

10 1 55 27,5 27,5 110 220 11 2 65 32,5 32,5 130 260 12 2 70 35 35 140 280 13 2 75 37,5 37,5 150 300 14 2 80 40 40 160 320 15 2 85 42,5 42,5 170 340 16 2 90 45 45 180 360 17 2 95 47,5 47,5 190 380 18 2 100 50 50 200 400 19 2 105 52,5 52,5 210 420 20 2 110 55 55 220 440

1

X (n samples + 1 C+ + 1C-)

MM PPp PPc

W

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 14


PCR mix bedoeld voor langdurig gebruik

IV.b PCR mix dosering

1. Pipetteer 20 µL van de bereidde PCR mix in ieder cupje van de 96-well plate. 2. Pipetteer de mix voor de negatieve en positieve controle zo ver mogelijk van de test

samples om contaminatie te voorkomen.

IV.c Pipetteren van de samples en controles 1. Neem de output plate met het geëxtraheerde materiaal. 2. Neem 5 µL extract. 3. Voeg deze 5 µL toe aan de 20 µL PCR mix die eerder is gepipetteerd in de 96-well plate.

Dit resulteert in een eindvolume van 25 µL (uitgezonderd de controle cupjes). 4. Voeg 5 µL van positieve of negatieve controle toe aan de PCR mix aan het bestemde cupje

van de 96-well plate. Dit resulteert in een eindvolume van 25 µL. 5. Dek de reactie plaat af met een doorzichtige afplakstrip. 6. Centrifugeer de 96-well plate kort (5 tot 10 seconden). 7. Plaats de 96-well plate in het amplificatie systeem.

Voor één 25 µL PCR reactie

PCR mix………………20 µL

Materiaal, C+, C-…..…5 µL

2

3

Positieve controle

Negatieve controle

Test sample

C+ C-

PCR MIX voor negatieve controle

PCR MIX voor positieve controle

PCR MIX voor samples

Diagenode voegt een bruin epje toe aan deze kit voor het maken van een reserve voorraad PCR mix. Deze voorraad dient te worden bewaard bij 2-8 °C voor maximaal 3 maanden.

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 15


V. Real-Time PCR Systeem Instellen

Voer deze procedure uit in een ruimte met het geschikte biosafety level. Volg de fabrikant zijn instructies voorafgaand aan het gebruik van het real-time PCR systeem. 1. Selecteer het kanaal in de LightCycler 480 software: 465/510 voor MG en 533/580 voor TV.

De interne controle zal worden gedetecteerd in het kanaal dat correspondeert met de kleurstof van uw keuze (TR, Cy5, of RD).

Diagenode soortnaam

M.G T.V

Ex. (nm) Em. (nm)

494 520

530 549

554 576

583 603

646 662

644 669

NB: Compensatie file (ccc) moet klaar zijn voor elke gebruikte master mix. 2. Run de PCR gebruik makend van het volgende temperatuur protocol:

*Detectie

PCR stappen

Activatie van Enzym Amplificatie

1 Denaturatie

2* Annealing en Elongatie

Temperatuur 50 °C 95 °C 95 °C 60 °C Tijd 2 min 10 min 15 sec 60 sec

Cyclus 1 x 1X 45 X

FAM YD TR Cy5 RD DR

533580 533

533610

465510

53

618660

618660

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 16


Interne controle

Negatieve controle

VI. Interpretatie van Resultaten

Resultaten van Controles Om er zeker van te zijn dat de run goed is, dienen de controle resultaten als volgt geïnterpreteerd te worden: In het analysis menu, kies de “Fit point” manier. Pas de drempelwaarde handmatig aan voorafgaand aan het interpreteren van de resultaten. Plaats de lijn net boven de achtergrond.

*Het waargenomen signaal hangt af van de kleurstof die u gekozen heeft voor de interne controle (TR, Cy5 of RD).

FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde

Geen FAM en Yellow signaal boven de drempelwaarde

Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen

Oplossen

Test is geldig Controleer de C+ en interne controle

1. Signaal* met een Ct/Cp waarde ≤ 36 Test is geldig

Zie pagina 17 “Resultaten van test samples”.

2. Geen signaal boven de drempelwaarde en een lage Ct waarde van pathogeen Test is geldig

Het EIC signaal kan verdwijnen in positieve samples waar het pathogeen DNA in hoge concentraties aanwezig is (competitie voor reagentia)

Zie pagina 17 “Resultaten van test samples”.

3. Geen signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig

Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen

4. Signaal* met een Ct/Cp waarde 36 Test is ongeldig


Positieve controle

FAM en Yellow signaal met een Ct waarde ±3,3 ten opzichte van het analyse certificaat

Geen FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde

Test is geldig Controleer de interne controle


Oplossen

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 17


Resultaten van test samples Zodra u zeker bent dat de run geldig is, interpreteer de resultaten van de samples. In het analysis menu, kies de “Fit point” manier. Pas de drempelwaarde handmatig aan voorafgaand aan het interpreteren van de resultaten. Plaats de lijn net boven de achtergrond. FAM signaal voor de detectie van Mycoplasma genitalium: YELLOW signaal voor de detectie van Trichomonas vaginalis:

Geen Ct/Cp waarde

Ct/Cp waarde Sample is POSITIEF

Sample is NEGATIEF

Geen Ct/Cp waarde


Sample is NEGATIEF

M

agN

A P

ure

96 &

Lig

htC

ycle

r® 4

80

P a g i n a | 18


7.3

Abbott® m2000

apparaat

Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 19



Disposables Steriele pipet tips met filters (DNase/RNase-vrij) RNase/DNase-vrije microcentrifuge epjes (1,5 en/of 2 mL) Abbott® m2000 sp disposables (96 Deep Well Plates, Tips, reactie vaatjes) Abbott® m2000 rt disposables (doorzichtige afplakstrip, 96-Well Optical

Reaction Plate)

Laboratorium apparatuur Biologisch veiligheidskabinet, laminaire flowkast Koelblok/ijs Pipetten (nauwkeurig tussen 1-1000 µL) Vortex Microcentrifuge Stopwatch of klokje Extractie: Abbott® m2000 sp met software versie 6 Real-time PCR systeem: Abbott® m2000 rt met software versie 6 Abbott® m2000 Systeem Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae

applicatie Cd-Rom

Reagentia Voor materiaal afname: Abbott® multi-Collect Specimen Collection kit (ref: 9K12-03) Voor extractie: mSample Preparation Systems DNA (ref: 04J70-24) Voor amplificatie: Abbott® RealTime CT/NG (ref: 8L07-91) Interne controle

Bijv. Diagenode Universele Inhibitie Controle (UIC) (Nieuwe ref: DICU-xx*-L100 / Oude ref: Dia-UIC-050) *De letters ‘xx’ verwijzen naar de kleurstoffen beschikbaar voor de S-DiaMGTVTM kit: Texas Red (TR), Cy5 (CY) en Red Dye (RD).

Optima DU Master Mix 5x DNA (ref: DMML-D5-D100)

Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 20





Uitstrijk

Urogenitale uitstrijk afgenomen en getransporteerd in de Abbott transport buis die 1,2 mL Spicemen Transport Buffer bevat. Gebruik geen hard staafje of houten staafje



Urine Urine afgenomen en getransporteerd in de Abbott transport buis die 1,2 mL Spicemen Transport Buffer bevat.


uur



Nucleïnezuur extractie is het proces dat gebruikt wordt voor het isoleren van DNA en/of RNA uit materiaal (gelyseerde cellen) en het extraheren van nucleïnezuur van eiwitten, vetten,… De extractie procedure voor de detectie van MG/TV is dezelfde als die voor de detectie van CT/NG. Het eluaat kan zowel voor de Abbott® RealTime CT/NG kit als voor de S-DiaMGTVTM kit worden gebruikt.

Voer de gegevens volgens de instructies van de fabrikant in in de Abbott® m2000 sp software.

Extractie Apparaat Extractie module van het Abbott m2000 apparaat Extractie Protocol Abbott® CT/NG protocol Extractie Kit mSample Preparation Systems DNA Input Volume -1,2 mL urogenitale uitstrijk verdund in Specimen Transport

Buffer -3,5 mL urine verdund in Specimen Transport Buffer

Extractie Volume 400 µL Intern Controle Volume Geen*

Elutie Volume 60 µL - 25 µL gebruikt voor het Abbott® CT/NG assay - 35 µL achterhouden voor het S-DiaMGTVTM assay

* Een Interne Controle is toegevoegd aan de CT/NG extractie en deze wordt gedetecteerd door de CT/NG amplificatie. Zie de Abbott® CT/NG test instructies voor verdere informatie over de interne controle.

Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 21



1. Extraheer het materiaal zoals beschreven in de Abbott® m2000sp handleiding. 2. Pipetteer 60 µL eluaat uit de deep-well plate:

- 25 µL wordt gebruikt voor de CT/NG test met behulp van de Abbott® kit. - 5 µL, of meer indien duplo’s worden ingezet, wordt gebruikt voor de MG/TV test. - Het restant van het eluaat wordt overgebracht naar een epje en bewaard bij ≤ -70 °C.

Voer nooit nucleïnezuur isolatie uit op de positieve controle Voer de PCR voor MG/TV detectie uit vooraf of na afloop van de CT/NG test, op dezelfde dag, en bewaar geëxtraheerde nucleïnezuren op ijs. Het voor een langere periode op kamertemperatuur bewaren van materiaal extracten kan leiden tot degradatie van nucleïnezuren met een verlaagde PCR gevoeligheid als gevolg.


Werkwijze

Dosering Dosering

2 3

Negatieve controle

Materiaal extract

Positieve controle

Bereiding

1

PCR mix

Ab

bott

® m

200

0


P a g i n a | 22


IV.a PCR mix bereiding Wanneer enkel het MG/TV assay wordt uitgevoerd raadt Diagenode sterk aan om een interne controle (UIC) toe te voegen aan de PCR mix om zo de efficiëntie van de PCR te verifiëren.

1. Tel het totale aantal samples en controles (negatieve en positieve) die in één run worden getest.

2. Vermenigvuldig het volume van elke component (MM, PP, H2O) met het totale aantal samples en controles (positieve C+ en negatieve C-), plus 1 of 2 extra (zie voorbeeld figuur 1).






Opslag tijdens het experiment Materiaal extract C+ (plasmide) MM PP H20 (Rnase/Dnase-vrij) C-



MM Diagenode Optima DU Master Mix 5x DNA


PPcontrole Dubbele-kleurstof probe en primers (UIC) (niet meegeleverd met de S-DiaMGTVTM kit)

Water H2O (Rnase/Dnase-vrij)


5,0 µL

2,5 µL

2,5 µL

7,5 µL

Eindvolume zonder sample en UIC plasmide: 17,5 µL

1

Ab

bott

® m

200

0

PPp

PPc

W


MM


P a g i n a | 23




1. Pipetteer 17,5 µL van de bereidde PCR mix in ieder cupje van de 96-Well Optical Reaction

Plate. 2. Pipetteer de mix voor de negatieve en positieve controle zo ver mogelijk van de test




PPp (µL)

PPc (µL)

H2O (Rnase/Dnase-vrij)

(µL)


3 1 20 10 10 30 70 4 1 25 12,5 12,5 37,5 87,5 5 1 30 15,0 15,0 45 105 6 1 35 17,5 17,5 52,5 122,5 7 1 40 20 20 60 160 8 1 45 22,5 22,5 67,5 157,5 9 1 50 25 25 75 175

10 1 55 27,5 27,5 82,5 192,5 11 2 65 32,5 32,5 97,5 227,5 12 2 70 35 35 105 245 13 2 75 37,5 37,5 112,5 262,5 14 2 80 40 40 120 280 15 2 85 42,5 42,5 127,5 297,5 16 2 90 45 45 135 315 17 2 95 47,5 47,5 142,5 332,5 18 2 100 50 50 150 350 19 2 105 52,5 52,5 157,5 367,5 20 2 110 55 55 165 385

2




Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 24


IV.c Pipetteren van de samples en controles 1. Voeg 5 µL extract toe aan de 20 µL PCR mix reeds gepipetteerd in de 96-Well Optical

Reaction Plate. 2. Voeg nu 2,5 µL van de UIC plasmide aan de reeds in de 96-Well Optical Reaction Plate

gepipetteerde PCR mix. De UIC plasmide mag niet worden toegevoegd aan de positieve en negatieve controle cupjes. Voeg aan deze cupjes in plaats van 2,5 µL UIC plasmide 2,5 µL H2O toe.

3. Voeg 5 µL positieve of negatieve controle toe aan de 17,5 µL PCR mix in het bestemde cupje van de 96-Well Optical Reaction Plate.

4. Dek de reactie plaat af met een doorzichtige afplakstrip. 5. Centrifugeer de 96-Well Optical Reaction Plate kort (5 tot 10 seconden). 6. Plaats de 96-Well Optical Reaction Plate in het amplificatie systeem.


Voer deze procedure uit in een ruimte met het geschikte biosafety level. Volg de fabrikant zijn instructies voorafgaand aan het gebruik van het real-time PCR systeem.

1. Selecteer het kanaal in de Abbott® m2000 rt software: FAM voor MG en VIC voor TV. De interne controle zal worden gedetecteerd in het kanaal dat correspondeert met de kleurstof van uw keuze (TR, Cy5, of RD).

Diagenode soortnaam

M.G T.V

Ex. (nm) Em. (nm)

494 520

530 549

554 576

583 603

646 662

644 669

Diagenode Optima DU Master Mix 5x DNA bevat geen ROX.


PCR mix…………………..17,5 µL UIC plasmide…………….2,5 µL Materiaal, C+, C-…………5,0 µL

3

Positieve controle

Negatieve controle

Test sample

C+ C-

FAM YD TR Cy5 RD DR

VIC ROX FAM CY5 CY5

Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 25


Negatieve controle

2. Run de PCR gebruik makend van het volgende temperatuur protocol:

*Detectie


Resultaten van Controles Om er zeker van te zijn dat de run goed is, dienen de controle resultaten als volgt geïnterpreteerd te worden:

Om de positieve controle te analyseren dient de drempelwaarde handmatig boven de achtergrond te worden geplaatst.

PCR stappen


1 Denaturatie


Temperatuur 50°C 95°C 95°C 60°C Tijd 2 min 10 min 15 sec 60 sec

Cyclus 1 x 1X 45 X



Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen

Test is geldig Controleer de C+ en interne controle

Positieve controle

FAM en Yellow signaal met een Ct waarde ± 3,3 ten opzichte van het analyse certificaat

(op aanvraag)


Test is geldig Controleer de interne controle


Oplossen

Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 26


Interne controle

*Het waargenomen signaal hangt af van de kleurstof die u gekozen heeft voor de interne controle (TR, Cy5 of RD).

Resultaten van test samples Zodra u zeker bent dat de run geldig is, interpreteer de resultaten van de samples. FAM signaal voor de detectie van Mycoplasma genitalium: YELLOW signaal voor de detectie van Trichomonas vaginalis:

1. Signaal* met een Ct/Cp waarde van 27,0 ± 3,3 Test is geldig

Zie pagina 26 “Resultaten van test samples”

2. Geen signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig


Geen Ct/Cp waarde


Sample is NEGATIEF

Geen Ct/Cp waarde


Sample is NEGATIEF

Ab

bott

® m

200

0

P a g i n a | 27


7.4

Roche® Cobas® 4800 Systeem

Co

ba

s®

4800

P a g i n a | 28



Disposables Steriele pipet tips met filters (DNase/RNase-vrij) RNase/DNase-vrije microcentrifuge epjes (1,5 en/of 2 mL) Cobas® x480 disposables (DWP Deepwell Plate, MWP Microwell Plate,

reagens reservoir, Tips High Volume 1 mL met filter) Cobas® PCR Media buis of 13 mL buis met een ronde bodem van 16,5 mm

bij 101 mm van Sarstedt 96-Well Reaction Plate en afplakstrip voor Cobas® z480

Laboratorium apparatuur Biologisch veiligheidskabinet, laminaire flowkast Koelblok/ijs Pipetten (nauwkeurig tussen 1-1000 µL) Vortex Microcentrifuge Roche® Cobas® 4800 Systeem:

- Cobas® x480 apparaat - Cobas® z480 analyzer

Reagentia

Voor materiaal afname: Cobas® PCR Urine Sample Kit, Roche® (ref: 05170486190) Cobas® PCR Female Swab Sample Kit Roche® (ref: 05170516190)

Voor extractie: Cobas® 4800 System Sample Preparation Kit (HPV, CT/NG, 240 tests],

Roche® (ref: 05235782190) Cobas® 4800 System Wash Buffer Kit [HPV, CT/NG, 240 tests], Roche®

(ref: 05235863190) Cobas® 4800 System Control Diluent Kit [CT/NG], Roche®

(ref: 05235847190) Cobas® 4800 CT/NG Controls Kit 10 Sets, Roche® (ref: 0523592819)

Voor amplificatie: Cobas® 4800 CT/NG Amplification/Detection Kit (240 testen), Roche®

(ref: 05235952190) LightCycler® 480 Probes Master, Roche® (ref: 04707494001)

Co

ba

s®

4800

P a g i n a | 29





Uitstrijk Urogenitale uitstrijk afgenomen en getransporteerd in de Cobas® PCR Media buis die 4,3 mL Cobas® PCR media bevat. Gebruik geen hard staafje of houten staafje



Urine Urine (4,3 mL) afgenomen en getransporteerd in de Cobas PCR Media buis die 4,3 mL Cobas® PCR media bevat.


uur



Nucleïnezuur extractie is het proces dat gebruikt wordt voor het isoleren van DNA en/of RNA uit materiaal (gelyseerde cellen) en het extraheren van nucleïnezuur van eiwitten, vetten,… De extractie procedure voor de detectie van MG/TV is dezelfde als die voor de detectie van CT/NG. Het eluaat kan zowel voor de Cobas® 4800 CT/NG Amplificatie/Detectie Kit als voor de S-DiaMGTVTM kit worden gebruikt.

Voer de gegevens volgens de instructies van de fabrikant in in de Cobas® x480 software.

Extractie Apparaat Cobas® x480 Extractie Protocol CT/NG Werkwijze:

UUT voor urine samples / UT voor uitstrijk samples Extractie Kit Benodigde reagentia voor het Cobas 4800 CT/NG assay Input Volume 1 mL urogenitale uitstrijk verdund in Cobas® PCR media

1,5 mL urine verdund in Cobas® PCR media Extractie Volume Urogenitale uitstrijk: 400 µL

Urine: 850 µL Intern Controle Volume Geen* Elutie Volume

100 µL: - 25 µL gebruikt voor het Roche® CT/NG assay - 75 µL achterhouden voor het S-DiaMGTV assay

* Een Interne Controle is toegevoegd aan de Roche CT/NG extractie en deze wordt gedetecteerd door de CT/NG amplificatie. Zie de Cobas® CT/NG test instructies voor verder informatie over de interne controle.

Co

ba

s®

4800

P a g i n a | 30



1. Pipetteer 1 mL urogenitaal materiaal of 1,5 mL urine in de 13 mL Sarstedt buis. 2. Laad het sample rek met de geopende sample buizen. 3. Schuif het sample rek in het automatische laad rek van het apparaat.

Volg de werkwijze zoals voorgeschreven in de gebruiksaanwijzing van de Cobas® CT/NG test (onderhoud, laden van sample, laden van verbruiksartikelen, en laden van reagentia). Na afloop van de test is het belangrijk om de DWP Deepwell Plate niet weg te gooien: pipetteer de overgebleven 75 µL eluaat uit de Deepwell Plate gebruik makend van een magnetische plaat (meegeleverd met het Cobas® 4800 Systeem).

Voer nooit nucleïnezuur isolatie uit op de positieve controle Voer de PCR voor MG/TV detectie uit na afloop van de CT/NG test, op dezelfde dag, en bewaar geëxtraheerde nucleïnezuren op ijs. Het voor een langere periode op kamertemperatuur bewaren van materiaal extracten kan leiden tot degradatie van nucleïnezuren met een verlaagde PCR gevoeligheid als gevolg.


Werkwijze

Dosering Dosering

2 3

Negatieve controle

Materiaal extract

Positieve controle

Bereiding

1

PCR mix

Co

ba

s®

4800


P a g i n a | 31


IV.a PCR mix bereiding PCR mix bedoeld voor direct gebruik

1. Tel het totale aantal samples en controles (negatieve en positieve) die in één run worden

getest. 2. Vermenigvuldig het volume van elke component (MM, PP, H2O) met het totale aantal

samples en controles (positieve C+ en negatieve C-), plus 1 of 2 extra (zie voorbeeld figuur 1).






Opslag tijdens het experiment Specimen extract C+ (plasmide) MM PP H20 (Rnase/Dnase-vrij) C-



MM LightCycler® 480 Probes Master


Water H2O (Rnase/Dnase-vrij)


12,5 µL

2,5 µL

5 µL

Eindvolume zonder sample: 20 µL

1


Co

ba

s®

4800

PPp

W

MM


P a g i n a | 32




1. Pipetteer 20 µL van de bereidde PCR mix in ieder cupje van de 96-Well Reaction Plate. 2. Pipetteer de mix voor de negatieve en positieve controle zo ver mogelijk van de test




PPp (µL)

H2O (Rnase/Dnase-vrij) (µL)


3 1 50 10 20 80 4 1 62,5 12,5 25 100 5 1 75 15,0 30 120 6 1 87,5 17,5 35 140 7 1 100 20 40 160 8 1 112,5 22,5 45 180 9 1 125 25 50 200

10 1 127,5 27,5 55 220 11 2 156 32,5 65 260 12 2 175 35 70 280 13 2 187,5 37,5 75 300 14 2 200 40 80 320 15 2 212,5 42,5 85 340 16 2 225 45 90 360 17 2 237,5 47,5 95 380 18 2 250 50 100 400 19 2 262,5 52,5 105 420 20 2 275 55 110 440

2




Co

ba

s®

4800

P a g i n a | 33


IV.c Pipetteren van de samples en controles 1. Voeg 5 µL extract toe aan de 20 µL PCR mix reeds gepipetteerd in de 96-Well Reaction

Plate (uitgezonderd de controle cupjes). 2. Voeg 5 µL positieve of negatieve controle toe aan de 20 µL PCR mix in het bestemde cupje

van de 96-Well Reaction Plate.

3. Dek de reactie plaat af met een doorzichtige afplakstrip. 4. Centrifugeer de 96-Well Reaction Plate kort (5 tot 10 seconden). 5. Plaats de 96-Well Reaction Plate in het amplificatie systeem.


Voer deze procedure uit in een ruimte met het geschikte biosafety level. Volg de fabrikant zijn instructies voorafgaand aan het gebruik van het real-time PCR systeem.

1. Selecteer het kanaal in de Cobas® z480 software: 465/510 voor MG en 540/580 voor TV.

Diagenode soortnaam

M.G T.V

Ex. (nm) Em. (nm)

494 520

530 549

554 576

583 603

646 662

644 669

2. Run de PCR gebruik makend van het volgende temperatuur protocol:

*Detectie


PCR mix……………………..20 µL Materiaal, C+, C-……………5 µL

PCR stappen


1 Denaturatie


Temperatuur 50°C 95°C 95°C 60°C Tijd 2 min 10 min 15 sec 60 sec

Cyclus 1 x 1X 45 X

Positieve controle

Negatieve controle

Test sample

C+ C-

FAM YD TR Cy5 RD DR

540 580

465 510

3

Co

ba

s®

4800

P a g i n a | 34


Negatieve controle


Resultaten van Controles Om er zeker van te zijn dat de run goed is, dienen de controle resultaten als volgt geïnterpreteerd te worden:

Resultaten van test samples Zodra u zeker bent dat de run geldig is, interpreteer de resultaten van de samples. FAM signaal voor de detectie van Mycoplasma genitalium: YELLOW signaal voor de detectie van Trichomonas vaginalis:




Oplossen

Test is geldig Controleer de C+

Positieve controle

FAM en Yellow signaal met een Ct waarde ± 3,3 ten opzichte van het analyse certificaat


Test is geldig


Oplossen

Geen Ct/Cp waarde


Sample is NEGATIEF

Geen Ct/Cp waarde


Sample is NEGATIEF

Co

ba

s®

4800

P a g i n a | 35


8. Handleiding Problemen Oplossen

Waarneming: lage* of geen amplificatie curvee

Globale analyse Samples &

Controle Potentiële Oorzaken Oplossingen

Alle behalve C-

(Sample, EIC/UIC en C+)

1. Incorrecte opslagomstandigheden: - Master Mix - Probe & primers van kit

Controleer de opslagcondities van de kit (zie punt 5)

2. Suboptimale PCR condities (thermische cyclus, aantal cycli)

Controleer de toegepaste PCR condities (zie punt V horend bij uw apparaat)

EIC en sample

1. Aanwezigheid van inhibitoren

Gebruik een extra portie van het originele materiaal met de gevalideerde extractie methode (zie punt III horend bij uw apparaat)

2. Afgenomen extractie efficiëntie of incorrecte extractie methode

Herhaal het extractie proces met de gevalideerde extractie methode (zie punt III horend bij uw apparaat)

Individuele analyse

Controle Potentiële Oorzaken Oplossingen

C+ 1. Incorrecte opslag condities van C+ Controleer de opslag condities van de kit (verwijs naar punt 6)

2. Foute kleurstof keuze Controleer de gekozen kleurstof (zie punt V horend bij uw apparaat)

3. Foute hantering Herhaal het PCR assay

EIC 1. Afgenomen extractie efficiëntie of incorrecte extractie methode

Herhaal het extractie proces met de gevalideerde extractie methode (zie punt III horend bij MagNA Pure 96)

2. Incorrecte opslag condities voor EIC Controleer de opslag condities van de controle kit

3. Foute kleurstof keuze Controleer de gekozen kleurstof (zie punt V horend bij LC 480)

4. Foute hantering Herhaal de test en begin met het extractie proces

UIC 1. Incorrecte opslag condities voor UIC Controleer de opslag condities van de controle kit

2. Foute kleurstof keuze Controleer de gekozen kleurstof (zie punt V horend bij Abbott® m2000 rt)

3. Foute hantering Herhaal de test en begin met het extractie proces

* Slecht fluorescentie signaal of een vertraagde Ct

Waarneming: amplificatie curvee Controle Potentiële Oorzaken Oplossingen C- Gecontamineerde reagentia en/of

gecontamineerde omgeving Goede Laboratorium Werkwijzen moeten worden nageleefd (zie punt 6) Herhaal de test met een nieuwe kit en begin met de extractie stap.

P a g i n a | 36


9. Evaluatie van de Kit

9.1 Analytische Gevoeligheid

De Analytische Gevoeligheid (LoD) van de S-DiaMGTVTM kit is bepaald met behulp van seriële verdunningen van gekwantificeerd Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis DNA in verschillende matrices. Hiervoor zijn samples gespiked en met verschillende extractie methoden geëxtraheerd. Elk geëxtraheerd sample is geamplificeerd door middel van PCR op verschillende apparaten met óf de Optima DU Master Mix 5x (Diagenode) óf de LightCycler® Probe Master (Roche). De resultaten zijn geanalyseerd door een Probit analyse met behulp van de Minitab 16 Software. De analytische gevoeligheden voor Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis, gedefinieerd als de laagste concentratie waarbij ≥ 95% van alle geteste kopieën positief zijn (LoD C95), zijn weergegeven in de onderstaande tabellen: MagNA Pure 96 / LightCycler® 480 / Optima DU Master Mix 5x :

Pathogeen Matrix LoD (kopieën/ mL)

Mycoplasma genitalium Amplicor Specimen Transport Medium 921 Mannelijke urine 428 Vrouwelijke urine 592

Trichomonas vaginalis Amplicor Specimen Transport Medium 168 Mannelijke urine 183 Vrouwelijke urine 185

Cobas® 4800 Systeem / LightCycler Probe Master :

Abbott® m2000 / Optima DU Master Mix 5x :


Mycoplasma genitalium Abbott® Multi-Collect 4769 Urine 1702

Trichomonas vaginalis Abbott® Multi-Collect 3050 Urine 695


Mycoplasma genitalium Cobas® PCR Medium 3989 Mannelijke urine 1017 Vrouwelijke urine 959

Trichomonas vaginalis Cobas® PCR Medium 1325 Mannelijke urine 1480 Vrouwelijke urine 608

P a g i n a | 37


9.2 Nauwkeurigheid

Voor de beoordeling van de herhaalbaarheid (intra-assay variatie) en de reproduceerbaarheid (inter-assay variatie) van de S-DiaMGTVTM kit, zijn de Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis DNA concentraties in verschillende matrices dicht in de buurt van hun betreffende LoD95 gekozen. Hiervoor zijn samples gespiked en met verschillende extractie methoden geëxtraheerd. Elk geëxtraheerd sample is geamplificeerd door middel van PCR op verschillende apparaten met óf de Optima DU Master Mix 5x (Diagenode) óf de LightCycler® Probe Master (Roche). De intra-run variatie is berekend uit de Ct waarden van sample kopieën uit één experiment. Op een zelfde manier is de inter-run variatie berekend uit de Ct waarden van sample kopieën uit drie tot zes onafhankelijke experimenten. Resultaten zijn weergegeven in de onderstaande tabellen: MagNA Pure 96 / LightCycler® 480 / Optima DU Master Mix 5x :

Pathogeen Matrix Concentratie K/mL (%LoD)

Gemiddelde Ct

CV intra-run (%)

CV inter-

run (%)

Mycoplasma genitalium

Amplicor STM 1333 (98%) 36,0 1,18 1,65

4000 (100%) 34,4 1,51 2,33

Mannelijke urine 500 (97%) 37,4 1,86 2,25 1000 (100%) 36,2 1,51 1,98

Vrouwelijke urine 500 (93%) 37,7 2,36 2,43

1000 (99%) 36,6 1,02 2,10

Trichomonas vaginalis

Amplicor STM 222 (98%) 36,1 2,82 1,21

667 (100%) 34,6 1,72 1,65

Mannelijke urine 250 (98%) 36,4 1,85 2,13 500 (100%) 35,3 1,42 2,02

Vrouwelijke urine 250 (97%) 36,8 2,57 3,23 500 (100%) 35,3 1,98 1,96

Cobas® 4800 Systeem / LightCycler® Probe Master :


Gemiddelde Ct

CV intra-run (%)

CV inter-

run (%)


Cobas® PCR Medium

1333 (65) 38,3 2,24 0,35 4000 (96) 36,6 1,73 1,99

Mannelijke urine 1111 (96) 37,1 1,88 2,22 3333 (100) 35,9 1,54 4,91

Vrouwelijke urine 1111 (96) 37,0 1,83 1,00 3333 (100) 34,6 1,11 0,56


Cobas® PCR Medium

667 (85) 37,3 2,56 3,37 2000 (99) 35,5 1,81 5,74

Mannelijke urine 667 (85) 36,5 1,74 3,97 2000 (97) 35,3 2,58 6,39

Vrouwelijke urine 667 (96) 36,4 2,18 1,83 2000 (100) 33,4 1,59 0,87

P a g i n a | 38


Abbott® m2000/ Optima DU Master Mix 5x :


Gemiddelde Ct

CV intra-run (%)

CV inter-

run (%)


Abbott® Multi-Collect

5000 (96) 37,01 1,07 0,53 2000 (85) 40,54 1,92 2,96

Urine 4000 (100) 38,95 1,57 2,40 2000 (98) 39,91 1,46 0,87


Abbott® Multi-Collect

4000 (96) 36,50 0,86 5,75 2000 (93) 38,85 1,14 3,70

Urine 750 (96) 38,97 3,66 2,34 500 (92) 39,48 3,05 1,62

9.3 Analytische Specificiteit

De specificiteit van de S-DiaMGTVTM kit was bovenal gegarandeerd door de selectie van de primers en probes, evenals door de selectie van strikte reactieomstandigheden. De primers en probes zijn gecontroleerd op mogelijke homologieën met behulp van sequentie-alignering in databases van DNA sequenties. Om de experimentele specificiteit van de S-DiaMGTVTM kit te bepalen zijn de in onderstaande tabel genoemde pathogenen getest op kruisreactiviteit bij een eindconcentratie van 106

kopieën/µL. Het onderzoek naar de specificiteit liet een geringe reactie zien van de S-DiaMGTVTM kit met Mycobacterium smegmatis (< 0,0001%; > 24 400 K/PCR*), Streptococcus salivarius (< 0,0001%; > 61 200 K/PCR*) en Vibrio parahaemolyticus (< 0,0001%; > 91 800 K/PCR*). Er zijn geen reacties waargenomen met de overige geteste pathogenen.

* Aantal kopieën/PCR van de kruisreactanten dat gevoelig is voor het geven van een Ct van 45 in het target kanaal.

Geteste Pathogenen Bacteriën

Achromobacter xerosis Mycoplasma pneumoniae Acinetobacter baumannii Mycoplasma salivarium Acinetobacter sp Mycoplasma hominis Aerococcus viridans Mycoplasma genitalium Aeromonas hydrophila Mycoplasma orale Alcaligenes faecalis Neisseria flava Bacillus subtilis Neisseria gonorrhoeae Bacteroides ureolyticus Neisseria meningitidis Bifidobacterium breve Neisseria meningitidis FAM 18 Bordetella pertussis Neisseria meningitidis M1883 Brevibacterium linens Neisseria meningitidis serogroep B Campylobacter jejuni Neisseria perflava Chlamydia trachomatis, stam D (UW-3/Cx) Peptostreptococcus anaerobius Chlamydophila pneumoniae Plesiomonas shigelloides Clostridium difficile Proteus mirabilis Clostridium perfringens Proteus vulgaris Deinococcus radiodurans Providencia stuartii

P a g i n a | 39


9.4 Interferentie

Endo/exo substanties Met de S-DiaMGTVTM kit, in combinatie met het Roche® MagNa Pure 96 extractie systeem en het Roche® LightCycler® 480 real-time PCR systeem, is onderzocht of de contaminatie van het E-Swab transport medium met 10% bloed en de contaminatie van urine met 1% bloed of 1mg/mL albumine, de detectiegevoeligheid beïnvloed. Het DNA van de target organismen (Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis) is met een LoD95 vergelijkbare concentratie geplaatst in negatieve mannelijke urine en in E-Swab transport medium. De mogelijk interfererende stof is vervolgens toegevoegd aan de individuele samples. De S-DiaMGTVTM assay is uitgevoerd bij 30 kopieën van elke sample. Het 10% bloed werd beschouwd als interfererend indien de ΔCt tussen de test conditie en de referentie groter was dan twee standaard deviaties van de intra-run variatie of indien het de analytische gevoeligheid aanzienlijk verlaagde (percentage positieve uitslagen). De resultaten van de interferentie test zijn weergegeven in de onderstaande tabel:

Matrix Interfererende

stof Target (K/mL)

Effect op gemiddelde ΔCt*

Effect op % positieve uitslagen*

Mannelijke urine

Bloed 1% MG (500) + 1,7 NS TV (250) + 2,1 NS

Albumine 1mg/mL

MG (500) + 2,7 NS TV (250) + 3,2 NS

Bacteriën Derxia gummosa Pseudomonas aeruginosa Enterobacter aerogenes Pseudomonas fluorescens Enterobacter cloacae Pseudomonas putida Enterococcus faecalis Rahnella aquatilis Escherichia coli Rhodospirillum rubrum Fusobacterium nucleatum Salmonella enterica serovar Choleraesuis Gardnerella vaginalis Salmonella enterica serovar Typhimurium Haemophilus ducreyi Serratia marcescens Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Haemophilus parainfluenzae Staphylococcus epidermidis Klebsiella oxytoca Staphylococcus saprophyticus Klebsiella pneumoniae Streptococcus agalactiae Lactobacillus acidophilus Streptococcus mitis Lactobacillus brevis Streptococcus pneumoniae Lactobacillus jensenii Streptococcus pyogenes Legionella pneumophila Streptococcus salivarius Leuconostoc mesenteroides Streptococcus sanguinis Listeria monocytogenes Streptomyces griseinus Micrococcus luteus Trichomonas vaginalis Morganella morganii Vibrio parahaemolyticus Mycobacterium smegmatis Yersinia enterocolitica

Virussen Cytomegalovirus (CMV) Herpes Simplex Virus (HSV2) Herpes Simplex Virus (HSV1)

Gisten Candida albicans Candida parapsilosis Candida glabrata Candida tropicalis

P a g i n a | 40


E-Swab Bloed 10% MG (2000) NS NS TV (200) NS NS

* NS indien niet significant De gemiddelde Ct waarden van MG en TV namen aanzienlijk toe in urine met 1% bloed of 1 mg/mL albumine. Echter, de analytische gevoeligheid toonde geen noemenswaardige verandering. De detectie van MG en TV in E-Swab veranderde niet door de aanwezigheid van 10% bloed. Competitieve interferentie Competitieve interferentie is onderzocht door het maken van kunstmatige samples die DNA van een target organisme (Mycoplasma genitalium of Trichomonas vaginalis) bevatten met een LoD95 vergelijkbare concentratie en DNA van het andere target met een hogere concentratie. De extractie van deze samples is uitgevoerd op het Roche® MagNa Pure 96 systeem. De S-DiaMGTVTM assay is uitgevoerd bij 30 kopieën van elk sample gebruik makend van het Roche® LightCycler® 480 real-time PCR systeem. Een pathogeen werd beschouwd als interfererend met de detectie van het andere target indien de ΔCt tussen de test conditie en de referentie groter was dan twee standaard deviaties van de intra-run variatie of indien het de analytische gevoeligheid aanzienlijk verlaagde (percentage positieve uitslagen). De resultaten van de competitieve interferentie test zijn weergegeven in de onderstaande tabel:

Matrix Interfererend

pathogeen (K/mL) Target pathogeen

(K/mL) Effect op

Gemiddelde ΔCt*

Effect op % positieve

uitslagen*

Urine TV (2,5 105) MG (500) + 1,8 NS MG (2,5 105) TV (250) + 2,1 NS

E-Swab TV (2,5 105) MG (2 000) NS NS MG (2,5 105) TV (200) - 2,5 NS

* NS indien niet significant De gemiddelde Ct waarden van MG en TV namen aanzienlijk toe in urine in de aanwezigheid van 2,5 105 kopieën/mL van het andere pathogeen. Echter, de analytische gevoeligheid toonde geen noemenswaardige verandering. De gemiddelde Ct waarde van TV nam aanzienlijk af in E-Swab in aanwezigheid van 2,5 105 kopieën/mL van MG, echter de analytische gevoeligheid toonde geen noemenswaardige verandering. De detectie van MG in E-Swab veranderde niet door de aanwezigheid van 2,5 105 kopieën/mL van TV.

9.5 Klinische Werking

De klinische werking van de S-DiaMGTVTM kit is bepaald in een retrospectief of prospectief onderzoek uitgevoerd door verschillende laboratoria als vergelijk voor de gevalideerde in-huis gemaakte PCR methodes voor MG (6, 7) en TV (8, 9) respectievelijk. Materiaal type, aantal geteste samples, extractie en PCR methoden van S-DiaMGTVTM zijn samengevat in de volgende tabel.

Matrix MG TV Extractie methode PCR methode

Vrouwelijke en mannelijke urine 72 72 MagNA Pure 96 LightCycler® 480

443 37 Abbott® m2000 rt Abbott® m2000 sp 67 26 Cobas® 480x Cobas® 480z

Urogenitale uitstrijk in Amplicor TM 56 83 MagNA Pure 96 LightCycler® 480 Urogenitale uitstrijk in Abbott® TM 397 39 Abbott® m2000 rt Abbott® m2000 sp Urogenitale uitstrijk in Cobas® TM 66 43 Cobas® 480x Cobas® 480z

P a g i n a | 41


Diagnostische gevoeligheid, diagnostische specificiteit en nauwkeurigheid (algemene overeenkomst) zijn berekend voor MG en TV detectie respectievelijk. De resultaten zijn weergegeven in de volgende tabellen.

MYCOPLASMA GENITALIUM Sample: Urine

Extractie: MagNA Pure 96 Referentie test PCR: LC480

Positief Negatief TOTAAL

S-D

iaM

GTV

TM

kit

Positief 8 0 8 Gevoeligheid 100,0% (68,0 – 100,0) 95 % CI

Negatief 0 64 64 Specificiteit 100,0 % (94,0 – 100,0) 95 % CI

TOTAAL 8 64 72 Algemene overeenkomst: k = 1,0

TRICHOMONAS VAGINALIS Sample: Urine Extractie: MagNA Pure 96

Referentie test PCR: LC480


S-D

iaM

GTV

TM

kit




MYCOPLASMA GENITALIUM Sample: Amplicor Transport Medium Extractie: MagNA Pure 96 Referentie test PCR: LC480


S-D

iaM

GTV

TM

kit




P a g i n a | 42


MYCOPLASMA GENITALIUM Sample: Urine Extractie: Abbott® m2000 rt

Referentie test PCR: Abbott® m2000 sp


S-D

iaM

GTV

TM

kit




TRICHOMONAS VAGINALIS Sample: Urine Extractie: Abbott® m2000 rt



S-D

iaM

GTV

TM

kit




TRICHOMONAS VAGINALIS Sample: Amplicor Transport Medium Extractie: MagNA Pure 96

Referentie test PCR: LC480


S-D

iaM

GTV

TM

kit




P a g i n a | 43


MYCOPLASMA GENITALIUM Sample: Abbott® Transport Medium Extractie: Abbott® m2000 rt



S-D

iaM

GTV

TM

kit




TRICHOMONAS VAGINALIS Sample: Abbott® Transport Medium Extractie: Abbott® m2000 rt



S-D

iaM

GTV

TM

kit




MYCOPLASMA GENITALIUM Sample: Urine Extractie: Cobas® 480x

Referentie test PCR: Cobas® 480z


S-D

iaM

GTV

TM

kit


Negatief 0 47 47 Specificiteit 95,9% (86,0 – 99,0) 95 % CI


P a g i n a | 44


MYCOPLASMA GENITALIUM Sample: Cobas transport medium Extractie: Cobas® 480x



S-D

iaM

GTV

TM

kit




*De prevalentie van Trichomonas vaginalis kan laag zijn in bepaalde populaties of patiënten groepen (zie punt 9.6 Prevalentie) en kan de werking van de test beïnvloeden. De gevoeligheid van 80% is grotendeels ten gevolge van de lage prevalentie van Trichomonas vaginalis in de door ons bekeken populatie.

TRICHOMONAS VAGINALIS Sample: Urine Extractie: Cobas® 480x



S-D

iaM

GTV

TM

kit


Negatief 0 16 16 Specificiteit 88,9 % (67– 100,0) 95 % CI


TRICHOMONAS VAGINALIS Sample: Cobas transport medium Extractie: Cobas® 480x



S-D

iaM

GTV

TM

kit

Positief 4 1 5 Gevoeligheid 80,0%* (38,0 – 96,0) 95 % CI

Negatief 1 37 38 Specificiteit 97,4 % (99,0– 100,0) 95 % CI


P a g i n a | 45


9.6. Prevalentie

De prevalentie in Frankrijk van MG en TV positieve samples per geslacht en per type sample zijn weergegeven in de volgende tabel: MG TV Globaal 3,80% 0,72% Urogenitale uitstrijk 4,53% 1,51%

Vrouwelijk 4,44% 1,57% Mannelijk 7,14% 0,00%

Urine 4,51% 0,90% Vrouwelijk 4,35% 4,35% Mannelijk 4,52% 0,71%

10. Test Beperkingen

Alle reagentia moeten enkel worden gebruikt voor in vitro diagnostiek. Een strikte naleving van de handleiding is nodig voor een optimaal resultaat. Betrouwbare resultaten zijn afhankelijk van voldoende materiaal, transport, opslag en

verwerkingsprocedures. Deze test is gevalideerd met het Roche® MagNA Pure 96 extractie systeem op de Roche®

LightCycler®480 voor opsporing in urine en in urogenitale uitstrijken in Amplicor Specimen Transport Medium.

Deze test is gevalideerd met het Cobas® 4800 systeem voor de detectie in urine en in urogenitale uitstrijken in Cobas® PCR Medium.

Deze test is gevalideerd met het Abbott® m2000 systeem voor de detectie in urine en in urogenitale uitstrijken in Abbott® Multi-Collect.

Negatieve resultaten sluiten infectie niet uit en enkel op basis van deze resultaten mag niet worden overgegaan tot diagnose, behandeling of andere beslissingen.

Er is een kans op vals negatieve waarden door de aanwezigheid van sequentie varianten in het target organisme van de assay, procedurefouten, amplificatie inhibitoren in samples, of een onvoldoende aantal organismen voor amplificatie.

Vals negatieve resultaten kunnen ook voorkomen door verlies van nucleïnezuur. De inhibitie controle is toegevoegd aan de test om te helpen bij het identificeren van samples die inhibitoren voor de PCR amplificatie bevatten. De controle geeft niet aan of nucleïnezuur verloren is gegaan door inadequate afname, door transport of door opslag van materiaal.

Er is een kans op vals positieve waarden van contaminatie door target organismen, door hun nucleïnezuren of geamplificeerd product, of door een niet-specifiek signaal in de assay.

Er is een kans op vals positieve waarden met een hoge Ct waarde en een lage eindpunt fluorescentie ten gevolge van kruisreactie tussen Mycoplasma genitalium en Mycobacterium smegatis, Streptococcus salivarium, Vibrio paraheamolyticus.

P a g i n a | 46


11. Kwaliteit Certificering

Diagenode is ISO 9001 en ISO 13485 gecertificeerd voor het ontwerp, productie en verkoop van IVD assays die gebruik maken van nucleïnezuur-gebaseerde technologie voor infectieziekten. De S-DiaMGTVTM kit is getest volgens vooraf vastgestelde specificaties om de productkwaliteit te waarborgen.

12. Referenties

1. Soper, D (2004). "Trichomoniasis: under control or undercontrolled?". American Journal of Obstetrics and Gynecology 190 (1): 281–90.

2 Centers for Disease Control and Prevention. Trichomoniasis CDC Fact Sheet.

www.cdc.gov/std/trichomonas/STDFact-Trichomoniasis.htm. Geraadpleegd op 4 oktober 2011.

3. Victoria J. Chalker, Karen Jordan, Tahir Ali en Cathy Ison. “Real-time PCR detection of the

mg219 gene of unknown function of Mycoplasma genitalium in men with and without non-gonococcal urethritis and their female partners in England’’. Journal of Medical Microbiology (2009), 58, 895–899

4. Jørgen Skov Jensen, Eva Björnelius, Birthe Dohn en Peter Lidbrink. “Use of TaqMan 5’ Nuclease Real-Time PCR for Quantitative Detection of Mycoplasma genitalium DNA in Males with and without Urethritis Who Were Attendees at a Sexually Transmitted Disease Clinic”. J. Clin. Microbiol. 2004, 42(2):683.

5. Jurjen Schirm, Petra A.J. Bos, Irene K. Roozeboom-Roelfsema, Dirk S. Luijt, Lieke V. Möller. “Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR”. Journal of Microbiological Methods 68 (2007) 243–247.

6. Palmer HM, Gilroy CB, Claydon EJ, Taylor-Robinson D. “Detection of Mycoplasma

genitalium in the genitourinary tract of women by the polymerase chain reaction”. Int J STD AIDS. 1991 Jul-Aug;2(4):261-3.

7. Jensen J S, Bjornelius E, Dohn B, Lidbrink P. 2004. Use of Taqman 5’ nuclease real-time

PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol. 42:683-692.

8. Schirm, J et al., 2007. “Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR”. J. Microbiol. Methods 68, 243-247

9. Schirm J, Bos PA, Roozeboom-Roelfsema IK, Luijt DS, Möller LV. 2007. Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR. J. Microbiol. Methods. 68:243-247.

P a g i n a | 47


13. Verklaring van Symbolen

Catalogusnummer

Batch code

Bevat voldoende voor « n » testen

Bovengrens van temperatuur

Gebruik voor jjjj-mm

In vitro diagnostisch medisch apparaat

Raadpleeg gebruiksaanwijzing

Biologisch risico

Controle

Negatieve controle

Positieve controle

Niet blootstellen aan zonlicht

Fabrikant

P a g i n a | 48


14. Mededeling aan Koper

Dit product is ontwikkeld om gebruikt te worden in de polymerase ketting reactie (PCR) die valt onder de patenten die eigendom zijn van Roche Molecular Systems, Inc., en F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche). Vanwege deze patenten wordt geen licentie voor gebruik van het PCR proces expliciet of impliciet overgedragen aan de koper bij aankoop van dit product. Een licentie voor het gebruik van het PCR proces voor bepaalde onderzoeksactiviteiten wordt meegeleverd bij de aankoop van bepaalde reagentia bij gelicentieerde leveranciers, wanneer gebruikt in combinatie met een Authorized Thermal Cycler, of is verkrijgbaar bij Applied Biosystems. Verdere informatie voor het verkrijgen van licenties voor het gebruik van het PCR proces kunnen worden verkregen door contact op te nemen met de Director of Licensing bij Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404 of bij Roche Molecular Systems, Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501.

Optima en S-DiaMGTV zijn merken van Diagenode Diagnostics Eswab is een merk van Copan Diagnostics Abbott m2000, m2000rt, en m2000sp zijn merken van Abbott Laboratories. LightCycler, MagNA Pure, Cobas en Taqman zijn merken van Roche FAM is een merk van Applera Corporation Dragonfly orange is een merk van Eurogentec S.A Texas Red is een merk van Molecular Probes Cy5 is een merk van GE Healthcare Bio-Sciences trademark of GE Healthcare Bio-

Sciences.

MA

-G-D

iaN

ota_

14_1

1_13

P a g i n a | 49


DD

GS-

60-V

01_N

L_01

_07_

2015

P a g i n a | 50


Diagenode sa Luik Science Park

Rue du Bois Saint-Jean, 3 4102 Seraing

BELGIË

Tel. +32 4 364 20 50 [email protected] www.diagenodediagnostics.com

draft user manual dna - soacaredirecte extractie of door reverse transcriptie van rna sequenties, te...

Documents