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Doctoral Thesis

Total Synthesis and SAR Investigations of Natural ProductsInhibiting Bacterial RNA PolymeraseRipostatin B and Tiacumicin B

Author(s): Glaus, Florian D.

Publication Date: 2015

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-010422569

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DISS. ETH NO. 22501

Total Synthesis and SAR Investigations of Natural Products Inhibiting

Bacterial RNA Polymerase:

Ripostatin B and Tiacumicin B

A thesis submitted to attain the degree of

DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH

(Dr. sc. ETH Zurich)

Presented by

Florian David Glaus

MSc ETH Zurich

Born on January 3rd, 1985

Bitizen of Benken SG, Switzerland

Accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Karl-Heinz Altmann, examiner

Prof. Dr. Erick M. Carreira, co-examiner

2015

Abstract page v

Abstract

Bacterial RNA polymerase (RNAP) is an attractive target for broad-spectrum

antibacterial drug discovery because it is an essential enzyme which is highly

conserved among bacteria, but, at the same time, differs significantly from RNA

polymerases of eukaryotic origin. The relevance of bacterial RNAP for antibacterial

therapy was established in the 1960s by the market introduction of the rifamycin

antibiotics. These have proven to be particularly important for the treatment of

tuberculosis, a disease which an estimated nine million people developed in 2013

alone. However, the number of rifamycin-resistant bacterial strains has increased

during the last ten years, thus threatening the clinical utility of this class of antibiotics

and creating an urgent need for the search and development of new inhibitors of

RNAP that do not exhibit cross-resistance with rifamycin antibiotics. In 2011, at the

outset of this PhD project, the rifamycins were still the only approved class of RNAP

inhibitors.

Ripostatins A (I) and B (II) (Figure A1) are 14-membered macrolides that were

first isolated in 1995 from the myxobacterium Sorangium cellulosum. Ripostatins

inhibit bacterial RNA polymerase by a different mode of action than rifamycin-type

inhibitors. As a result, the degree of cross-resistance between these two classes of

antitiotics is very limited. At the outset of this PhD project, no total synthesis of either

ripostatin had been reported in the literature. Furthermore, no inhibitory data against

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) was available and no detailed structure-activity

relationship (SAR) studies had been carried out. Hence, with the goal to provide a

basis for SAR studies with a focus on Mtb, we embarked on the total synthesis of

ripostatin B (II), the chemically more stable variant among the two natural products.

Figure A1: Structures of ripostatins A(I) and B (II).

The advanced stages of the total synthesis of ripostatin B (II) are outlined in

Scheme A1. A Paterson aldol reaction between aldehyde III, which was synthesized

Abstract page vi

in eleven steps from D-aspartic acid, and ketone IV, available in three steps from

phenylacetaldehyde, gave β-hydroxy ketone V (62% yield, >10:1 dr). The C15

stereocenter was then set in high yield (93%) and selectivity (>20:1 dr) by an Evans-

Tishchenko reduction. After protection and reduction, the resulting alcohol VI was

esterified with acid VII employing a low-temperature Yamaguchi protocol. This

reaction failed to produce synthetically useful yields under a variety of other

conditions. Macrocyclization was effected by treatment of VIII with Grubbs-I

catalyst, affording IX in 78% yield as a single isomer. The elaboration of the RCM

product into II involved selective removal of the primary TBS group, one-pot

oxidation of the ensuing hydroxyl group to the corresponding acid functionality and

global deprotection. Ripostatin B (II) was synthesized in 21 steps for the longest

linear sequence from D-aspartic acid.

Scheme A1: Fragment assembly toward ripostatin B (II).

Using the same overall strategy, a total of seven ripostatin B analogs were

synthesized (Figure A2). Unfortunately, neither the natural product itself nor any of

these analogs exhibited significant activity against Mtb (MIC ≥ 50 μg/mL in all cases).

The activity of II against Mtb was not improved in presence of efflux inhibitors;

furthermore, a permeability impaired strain of Mtb (H37RvΔphoP) was also not

Abstract page vii

susceptible toward II. Similar to Mtb, a range of other investigated bacteria were not

sensitive to II, with the exception of the efflux-impaired E. coli ΔtolC strain JW5503-1.

SAR studies in this latter strain revealed that modifications of the C3 side chain, i.e.

reduction of the carboxyl group to the alcohol stage (X), one-carbon homologation

(XI) as well as the introduction of a terminal methyl carbamate moiety (XII) are

tolerated well. Likewise, the C2–C3 double bond is not required for activity ((3R)-

XIII and (3S)-XIII). The phenyl ring, on the other hand, was found to be crucial for

activity, as truncation of the C15 side chain (analogs XIVa and XIVb) led to

considerably higher MIC values. The most active analog was X, which was about

eight-fold more potent than the parent natural product.

Figure A2: Structures of synthesized ripostatin B derivatives and of ripostatin B (II) as well as

MIC values against E. coli ΔtolC (strain JW5503-1).

In light of the unsatisfactory biological results obtained with ripostatin B-type

structures, we turned our attention toward another inhibitor of bacterial RNA

polymerase, namely tiacumicin B (XV) (Figure A3). This natural product, first

isolated in 1975 from Actinoplanes deccanensis, is highly potent against a range of

Gram-positive bacteria and also against Mtb, without being susceptible to cross-

resistance with rifamycin antibiotics. However, XV is only minimally absorbed from

the gastrointestinal tract, which strongly limits its utility for the treatment of

tuberculosis and of other systemic infections. Thus, to provide a basis for SAR

studies with tiacumicin B-type structures, we embarked on the synthesis of the

tiacumicin B aglycone (XVI).

At the outset of this PhD project, no total synthesis of XV or its aglycone XVI had

been reported in the literature. Furthermore, the isolation of XVI from fermentation

broths or a protocol enabling the semisynthesis of XVI from the parent natural

product had not been described.

Abstract page viii

Figure A3: Structures of tiacumicin B and of the aglycone thereof.

The synthesis of XVI is outlined in Scheme A2. The sequence started from known

allylic alcohol XVII, which was elaborated into aldehyde XIX. The latter was then

transformed into enal XXI by a newly developed variant of the Corey-Peterson

olefination reaction, which employed thiophenol rather than the commonly used

trifluoroacetic acid for the (Z) to (E) isomerization of the mixture of aldimines

obtained upon addition of XX to XIX. Notably, these conditions allowed the one-pot

conversion of XIX into XXI in 81% yield. After installation of the C7 stereocenter

using Leighton’s strained silacycle XXII and protection of the ensuing hydroxyl

group, olefin XXIII was coupled with diene XXIV by means of a cross metathesis

reaction. After saponification of the methyl ester in the metathesis product, the

ensuing carboxylic acid XXV was esterified with alcohol XXVI employing a

Yamaguchi protocol. The macrocycle was closed by means of a TlOEt-promoted

Suzuki reaction, which was usually complete in less than 30 minutes and afforded

the product in 73% yield. Depending on the exact reaction conditions, final

deprotection with NEt3·3HF as the reagent afforded then either fully deprotected

aglycone XVI or partially protected versions thereof, which allow the synthesis of

tiacumicin analogs. Aglycone XVI was obtained in 13 linear steps from alcohol XVII.

Interestingly, XVI was (almost) inactive against RNAP from different sources,

indicating that the sugar moieties are crucial for activity.

Abstract page ix

Scheme A2: Total Synthesis of the tiacumicin B aglycone (XVI).

Zusammenfassung page x

Zusammenfassung

Die bakterielle RNA-Polymerase (RNAP) ist ein attraktives Zielprotein für die

Entwicklung neuer Breitbandantibiotika, da sie einerseits bei Bakterien

hochkonserviert ist, sich jedoch andererseits deutlich von eukaryotischen Varianten

unterscheidet. Die Relevanz der bakteriellen RNAP für die antibakterielle Therapie

wurde in den 1960er-Jahren mit der Markteinführung der Rifamycin-Antibiotika

demonstriert. Es zeigte sich, dass die Rifamycine besonders zur Bekämpfung der

Tuberkulose geeignet sind, an welcher allein im Jahr 2013 ungefähr neun Millionen

Menschen erkrankten. Da die Zahl der Rifamycin-resistenten Bakterienstämme in

den letzten zehn Jahren jedoch stark zugenommen hat, ist die klinische Relevanz

dieser Antibiotikaklasse stark gefährdet. Dies macht die Erforschung und

Entwicklung neuer RNAP-Hemmer, welche keine Kreuzresistenzen mit den

Rifamycinen aufweisen, dringend nötig. Zum Zeitpunkt des Beginns dieser

Doktorarbeit im Jahr 2011 stellten die Rifamycine noch immer die einzige für

klinische Anwendungen zugelassene Klasse von RNAP-Hemmern dar.

Die Ripostatine A (I) und B (II) (Abbildung Z1) sind 14-gliedrige Makrolide,

welche erstmals im Jahr 1995 aus dem Myxobakterium Sorangium cellulosum isoliert

wurden. Die Ripostatine hemmen die bakterielle RNAP über einen

Wirkmechanismus, welcher sich fundamental von demjenigen der Antibiotika vom

Rifamycin-Typ unterscheidet. Es bestehen deshalb kaum Kreuzresistenzen zwischen

diesen beiden Antibiotikaklassen. Am Beginn dieser Dissertation waren weder

Totalsynthesen der Ripostatine in der Literatur beschrieben, noch waren Daten zur

Hemmung von Mycobacterium tuberulosis (Mtb) durch die Ripostatine oder

detaillierte SAR-Studien mit den Ripostatinen bekannt. Mit dem Ziel eine Grundlage

für SAR-Studien, mit einem Fokus auf Mtb, zu schaffen, haben wir deshalb die

Totalsynthese von Ripostatin B (II), welches sich gegenüber Ripostatin A (I) durch

eine höhere chemische Stabilität auszeichnet, in Angriff genommen.

Abbildung Z1: Strukturen der Ripostatine A (I) und B (II).

Zusammenfassung page xi

Die fortgeschrittenen Phasen der Totalsynthese von II sind in Schema Z1

dargelegt. Der Aldehyd III, welcher in elf Stufen ausgehend von D-Asparaginsäure

synthetisiert wurde, und Keton IV, zugänglich in drei Stufen ausgehend von

Phenylacetaldehyd, wurden mittels einer Paterson Aldolreaktion verknüpft. Die

Reaktion lieferte β-Hydroxyketon V in moderater Ausbeute (62%), aber hoher

Diastereoselektivität (>10:1 dr). Die Reduktion von V unter Evans-Tishchenko

Bedingungen ermöglichte dann den Aufbau des C15-Stereozentrums mit hoher

Ausbeute (93%) und ausgezeichneter Selektivität (>20:1 dr). Mittels eines Reduktions-

und eines Schützungsschrittes wurde dann der Alkohol VI erhalten, welcher unter

Anwendung einer Tieftemperaturvariante der Yamaguchi-Reaktion mit Säure VII

verestert wurde. Hierbei gilt es zu erwähnen, dass diverse andere

Veresterungsmethoden nicht das gewünschte Produkt lieferten.

Schema Z1: Totalsynthese von Ripostatin B (II);Verknüpfung der Fragmente.

Der Makrozyklus wurde ausgehend von VIII mittels einer Ringschlussmetathese

geschlossen (Schema Z1). Dazu wurde der Grubbs-I Katalysator verwendet,

wodurch IX als ein einziges Isomer in 78% Ausbeute erhalten wurde. Die

Überführung des RCM-Produktes IX in Ripostatin B (II) erfolgte dann über die

selektive Entfernung der primären TBS-Gruppe, die Eintopf-Oxidation der daraus

hervorgegangenen Hydroxylgruppe zur entsprechenden Carbonsäurefunktionalität

Zusammenfassung page xii

und der Entschützung der beiden verbliebenen Hydroxylgruppen. Ripostatin B (II)

konnte somit ausgehend von D-Asparaginsäure in einer längsten linearen Sequenz

von 21 Stufen synthetisiert werden.

Unter Verwendung derselben Gesamtstrategie wurden insgesamt sieben

Ripostatin B-Derivate synthetisiert (Abbildung Z2). Es stellte sich jedoch heraus, dass

weder der Naturstoff selbst noch eines der Analoga eine signifikante Aktivität gegen

Mtb aufweist (MIC >50 μg/mL für alle Verbindungen). Die Gegenwart von Efflux-

Hemmern hatte dabei keinen Einfluss auf die MIC-Werte von II gegen Mtb und auch

ein hyperpermeabler Mtb-Stamm (H37RvΔphoP) erwies sich II gegenüber als

unempfindlich. Des Weiteren konnte auch gegen eine Reihe von anderen Bakterien

keine nennenswerte Aktivität von II festgestellt werden. Eine Ausnahme bildete

hierbei der in seinem Efflux-Verhalten beeinträchtigte E. coli-Stamm ΔtolC JW5503-1.

SAR-Studien mit diesem Stamm zeigten, dass Modifikationen der C3-Seitenkette,

d.h. die Reduktion der Carbonsäurefunktionalität zur Hydroxylgruppe (X), die

Verlängerung der Seitenkette um eine Methylengruppe (XI) sowie die Einführung

einer Methylcarbamatgruppierung (XII), gut toleriert werden (Abbildung Z2).

Ebenfalls konnte demonstriert werden, dass die C2–C3 Doppelbindung für die

Aktivität nicht Relevant ist ((3R)-XIII und (3S)-XIII). Im Gegensatz dazu lieferte die

Verkürzung der C15-Seitenkette Derivate (XIVa und XIVb), welche massiv höhere

MIC-Werte aufwiesen als der Naturstoff, d.h. der Phenylring scheint von grosser

Wichtigkeit für die Aktivität der Ripostatine zu sein. Die potenteste Verbindung, X,

wies einen rund achtfach tieferen MIC-Wert auf als Ripostatin B (II).

Abbildung Z2: Strukturen der synthetisierten Ripostatin B-Derivate und von Ripostatin B (II),

sowie MIC-Werte gegen E. coli ΔtolC (strain JW5503-1).

Angesichts der unbefriedigenden biologischen Resultate, welche mit den

Ripostatinen erhalten wurden, haben wir uns in einem zweiten Teil dieser

Doktorarbeit einem anderen Hemmer der bakteriellen RNAP, nämlich Tiacumicin B

Zusammenfassung page xiii

(XV), zugewandt. Dieser Naturstoff, der erstmals im Jahr 1975 aus Actinoplanes

deccanensis isoliert wurde, ist wirksam gegen verschiedene Gram-positive Bakterien

sowie gegen Mtb, ohne dabei Kreuzresistenzen mit Rifamycin-Antibiotika

aufzuweisen. Infolge seiner geringen oralen Bioverfügbarkeit ist XV jedoch nicht zur

Behandlung der Tuberkulose und anderen systemischen Infektionen geeignet. Mit

dem Ziel eine Grundlage für nachfolgende SAR-Studien zu schaffen, haben wir

deshalb die Synthese des Tiacumicin B-Aglykons (XVI; Abbildung Z3) in Angriff

genommen.

Abbildung Z3: Strukturen von Tiacumicin B (XV) und des Tiacumicin B-Aglykons (XVI).

Bei Beginn dieser Dissertation waren weder eine Totalsynthese von XV noch des

Aglykons XVI publiziert. Zudem war keine Methode für die semisynthetische

Überführung des Naturstoffs XV in das Aglykon XVI bekannt und auch die Isolation

von XVI aus Fermentationsbrühen war nicht beschrieben.

Unsere Synthese ist in Schema Z2 dargelegt. Die Sequenz startete mit der

Herstellung des Aldehyden XIX ausgehend vom allylischen Alkohol XVII. Der

Aldehyd XIX wurde anschliessend mittels einer neuentwickelten Variante der Corey-

Peterson Olefinierung in Enal XXI überführt. Diese Variante beinhaltete die

Verwendung von Thiophenol anstatt der gemeinhin verwendeten Trifluoressigsäure

für die (Z) zu (E) Isomerisierung des durch Addition von XX an XIX und

anschliessende Eliminierung entstandenen Aldimin-Gemisches. Die Reaktion konnte

im Eintopfverfahren durchgeführt werden, was XXI in einer guten Ausbeute von

81% lieferte.

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Schema Z2: Totalsynthese des Tiacumicin B-Aglykons (XVI).

Nach der Einführung des C7-Stereozentrums mittels einer Leighton-Allylierung

und anschliessender Schützung der dabei entstandenen Hydroxylgruppe wurde

Olefin XXIII mittels einer Kreuzmetathese mit Dien XXIV verknüpft (Schema Z2).

Anschliessend wurde die Estergruppe im Metatheseprodukt verseift und die so

erhaltene Carbonsäure XXV wurde unter Anwendung eines Yamaguchi-Protokolls

mit Alkohol XXVI verestert. Der Ringschluss zum Makrozyklus wurde mittels einer

TlOEt-vermittelten Suzuki-Kreuzkupplung herbeigeführt, welche in weniger als 30

Minuten vollständig ablief und das gewünschte Produkt in 73% Ausbeute lieferte. In

Abhängigkeit von den exakten Reaktionsbedingungen lieferte die Entschützung mit

NEt3·3HF entweder das vollständig entschützte Aglykon XVI, oder teilweise

entschützte Varianten. Letztere erlauben die Synthese von Tiacumicin B-Derivaten.

Das Aglykon XVI wurde, ausgehend von XVII, in 13 linearen Schritten synthetisiert.

Das Aglykon XVI war (praktisch) inaktiv gegen die RNAP verschiedener

Bakterien. Dies beweist, dass die Zucker entscheidend für die biologische Aktivität

sind.