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Doctoral Thesis

Exopolysaccharides of Weissella and propionibacterium SP. -screening, characterization, production and bread applicationstudies

Author(s): Malang, Saskia

Publication Date: 2013

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-010139562

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ETH Library

DISS. ETH NO. 21795

EXOPOLYSACCHARIDES OF WEISSELLA AND PROPIONIBACTERIUM SP. - SCREENING, CHARACTERIZATION, PRODUCTION AND BREAD

APPLICATION STUDIES

A thesis to attain the degree of

DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH

(Dr. sc. ETH Zurich)

presented by

SASKIA Katharina MALANG

Dipl. -Ing., BOKU Vienna

born July 7, 1982

citizen of Austria

accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Ing. Christophe Lacroix, examiner

Prof. Dr. Ing. Selçuk Yildirim, co-examiner

Dr. Ing. Franck Grattepanche, co-examiner

2014

IV

Summary

Shelf-life of bakery products is limited by physical changes and/or microbial deteriorations.

Exopolysaccharides (EPS) of lactic acid bacteria (LAB), e. g. dextrans can act beneficially on

bread quality and shelf-life. Propionic acid bacteria (PAB) produce different types of EPS with

unknown functionality in bread, and additionally antimicrobial active acetate and

propionate. Synergistic functionality upon combination of different polymer types from

plant and algae is reported and LAB-PAB co-cultivation can be used for simultaneous

production of their functional metabolites. Based on this knowledge the aim of this study

was to evaluate LAB and PAB EPS functionality in bread and to study their interactions.

First a comprehensive screening for EPS producing Weissella and Propionibacterium sp. and

characterization of selected strains and polymers were performed. Screening of 123

Weissella sp. strains previously isolated from African cassava and dairy fermentations

revealed prevalence of three distinct EPS phenotypes within W. cibaria and W. confusa.

These three groups correspond to strains producing (1) dextran, (2) fructan next to the

dextran or (3) cell associated, ropy capsular polysaccharide (CPS) in addition to dextran. Nine

strains, three per group, were further characterized. EPS molecular weight was determined

by high-performance gel permeation chromatography (HP-GPC), EPS monomer composition

by high-performance liquid chromatography (HPLC) after acid hydrolysis, and structural

characterization by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). All dextrans exhibited

high molecular weight above 2*107 g/mol, with low ca. 3% α-(1,3)-branching in the α-(1,6)-

glycosidic linked backbone. Levan and inulin type fructans were identified, and the CPS of W.

confusa was shown to consist of glucose, two unidentified components and O-acetyl groups.

Strains ability for gluco- and fructooligosaccharide formation in presence of acceptor

Summary

V

molecules was investigated by high-performance anion exchange chromatography with

pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Activity staining of glycansucrases revealed

constitutive expression of mainly 180 kDa dextransucrases, 110 kDa levansucrases and a 130

kDa inulosucrase. Partial sequencing of the encoding genes evidenced high genetic

conservation of Weissella glycansucrases with high homologies were found with

dextransucrases of French sourdough W. confusa and W. cibaria and fructansucrases from

Malaysian soy and coconut beverage W. confusa isolates.

EPS forming P. freudenreichii strains previously isolated from raw milk and cheese were

screened for mucoid and ropy appearance on agar plates. β-glucan type CPS producers were

identified by immunoprecipitation of cells with S. pneumonia type 37 antiserum. P.

freudenreichii JS15 was selected for its high ropy and mucoid appearance and negative β-

glucan test as presumptive heteropolysaccharide (HePS) producing strains. EPS isolation and

characterization confirmed formation of a HePS composed of glucose, mannose and

glucuronic acid likely equivalent with earlier reported structures for P. freudenreichii and P.

thoenii HePS.

Selected W. confusa and P. freudenreichii single cultures, 1:1 mixtures thereof and cultures

derived from Weissella-Propionibacterium co-fermentations were investigated for

functionality as shelf-life extending bread ingredients. Functionality of EPS was evaluated in

wheat bread by measuring impacts on dough and bread quality parameters including dough

water absorption and volume expansion during proofing, loaf volume and crumb moisture,

elasticity and firmness of fresh bread and after storage under controlled conditions of 20°C

and 55% relative humidity. Three strains of W. confusa (A3/2-1 (dextran), F3/2-2 (dextran

and levan), 11GU-1 (dextran and ropy CPS)) and two strains of P. freudenreichii (DF30 (β-

glucan) and JS15 (HePS)) were selected for this study for high EPS yields and to represent

Summary

VI

EPS diversity. EPS ingredients derived from controlled single strain fermentation of W.

confusa and P. freudenreichii strains in semi-defined cereal based medium were used for a

functionality evaluation of individual polymer types while 1:1 mixed culture ingredients were

tested for preliminary identification of interactions resulting from combination of Weissella

and PAB polymer types. Ropy CPS and dextran of W. confusa 11GU-1 exhibited high

functionality already at the low addition level of 1 g/kg dough. This mixture showed

significantly higher effects to prevent staling (32% reduction of the firming rate compared to

the control) than dextran and dextran and levan containing culture ingredients. Both P.

freudenreichii single culture ingredients did not change bread characteristics compared to

the control, but resulted in negative or positive interactions when combined with

ingredients from Weissella. The best effects were attained by the 1:1 mixed culture

ingredient of W. confusa 11GU-1 and P. freudenreichii JS15. Crumb firmness after 72 h

storage was significantly lower than for other culture combinations and for the control. This

data suggests synergistic interactions between ropy CPS and dextran of W. confusa 11GU-1

and the HePS of P. freudenreichii JS15.

A co-cultivation process using the carbon trophic chain of W. confusa and P. freudenreichii

was developed and optimized for EPS and antimicrobial active acetate and propionate

production. The co-fermentation of W. confusa 11GU-1 and P. freudenreichii JS15 performed

in semi-defined malt based medium supplemented with 60 g/l sucrose for dextran formation

was highly reproducible and led to the production of 17.6 ± 0.7 g/l EPS with 6.1 ± 0.2 g/l

acetate and 11.7 ± 0.3 g/l propionate. Addition levels of this co-culture ingredient (7.5, 15

and 30% flour base) were tested in bread and compared to bread supplemented with the

same amount of chemical acetate and propionate and an unsupplemented control. Negative

impacts of chemical acetate and propionate on dough and bread quality were observed but

Summary

VII

were counteracted by EPS and CPS present in co-culture added bread. Breads at all co-

culture supplementation levels showed significantly softer crumbs as compared to the non

supplemented control bread, with a reduction of 12, 23 and 25% of the staling rate for the

7.5, 15 and 30% addition levels, respectively. Compared to the corresponding chemical acid

supplemented breads the decreases in firming rates were higher with 7.5, 26 and 53% for

the three supplementation levels, respectively. Supplementation of 15% co-culture

ingredient corresponding to 0.5 g acetate, 1 g propionate and 1.5 g EPS per kg dough was

shown to be optimal for antimicrobial active organic acid concentrations and bread quality

and anti-staling effects.

In a final study partially purified, organic acid free co-culture ingredient of W. confusa 11GU-

1 and P. freudenreichii EPS was tested in bread. High functionality was achieved at low

addition levels of 0.25% co-culture EPS (based on flour weight), with 30% softer crumbs after

72 h compare to the additive free control. In comparison the Weissella single culture EPS

ingredient added at the same level yielded a reduced effect corresponding to 21% softer

crumbs as the control after 72 h. Our data suggest that presence of small amounts of the P.

freudenreichii JS15 HePS in addition to dextran and CPS of W. confusa 11GU-1 enhanced

staling retardation.

Our study identified new EPS and CPS phenotypes of W. confusa with high potential for

applications. The anti-staling properties attained with culture ingredients of W. confusa

11GU-1 are enhanced compared to the functionality of dextran from Weissella, possibly due

to additionally produced ropy CPS by W. confusa 11GU-1. The functional bioingredient

produced by W. confusa 11GU-1-P. freudenreichii JS15 co-fermentation with synergistic

acting EPS properties, may be applied in two ways: (1) as crude ferment for simultaneous

physical and microbial bread shelf-life extension due to anti-staling activity of EPS and

Summary

VIII

antimicrobial activity of organic acid (acetate and propionate) concentrations; (2) as organic

acid free EPS supplement produced by ultrafiltration and targeting retardation of the bread

staling, for high functionality in absence of acetate and propionate.

IX

Zusammenfassung

Die Haltbarkeit von Brot ist durch das rasche Eintreten physikalischer Veränderungen

und/oder mikrobiellem Verderb stark begrenzt. Gewisse Milchsäurebakterien (LAB)

produzieren Exopolysaccharide (EPS), z.b. Dextrane die für ihre Haltbarkeitsverlängernde

Wirkung in Brot bekannt sind. Auch Propionsäurebakterien (PAB) produzieren verschiedene

EPS Arten, ihre Funktionalität in Brot ist bislang allerdings unerforscht. PAB produzieren

zusätzlich antimikrobiell wirkende Essig -und Propionsäure. Aus der Verwendung von

Pflanzen und Algen Hydrokolloiden ist die Entstehung synergistischer Effekte durch Mischen

verschiedener Polymer Arten bekannt. Weiters stellt die co-Kultivierung von LAB und PAB

eine Möglichkeit dar, deren funktionelle Metaboliten gleichzeitig in einem

Fermentationsprozess zu erzeugen. Davon ausgehend war das Ziel dieser Studie, die

Wirkung von LAB-und PAB-EPS in Brot und im speziellen deren Interaktionen zu beobachten.

Zuerst wurde ein Screening zur Identifizierung EPS produzierender Weissella und

Propionibacterium Stämmen durchgeführt und ausgewählte Organismen und die

produzierten Polymere charakterisiert. Drei verschiedene EPS Phänotypen wurden innerhalb

der 123 gescreenten, aus Cassava und Sauermilch Fermentationen isolierten W. cibaria und

W. confusa Stämmen, beobachtet: (1) Stämme die nur Dextran produzieren,(2) solche die

gleichzeitig Fruktan und Dextran produzieren und (3) Stämme die neben Dextran ein

klebriges, faden ziehendes zell-gebundenes Kapsel-Polysaccharid (CPS) produzieren. Neun

Stämme, jeweils drei Vertreter pro Gruppe, wurden genauer charakterisiert. Das EPS

Molekulargewicht wurde mittels Gelpermeationschromatographie (HP-GPC) bestimmt, die

EPS Monomerzusammensetzung wurde nach Säurehydrolyse mit Flüssigchromatographie

(HPLC) bestimmt und die Molekülstruktur mittels Kernmagnetische Resonanzspektroskopie

Zusammenfassung

X

(NMR). Alle neun Dextrane hatten ein hohes Molekulargewicht von über 2*107 g/mol und

mit ca. 3% einen geringer Anteil an α-(1,3)-Verzweigungen im linearen α-(1,6)-glycosidisch

verknüpften Gerüst. Weiters wurden Fructane vom Levan und Inulin-typ identifiziert, und

Glukose, zwei nicht identifizierte monomere und O-Acetyl-Gruppen als Bausteine der W.

confusa CPS bestimmt. Die Produktion von Gluko- und Fruktooligosacchariden in

Anwesenheit geeigneter Akzeptor-Moleküle wurde mittels

Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD)

untersucht. Der Nachweis aktiver Glycansucrasen bestätigte die konstitutive Expression von

meist 180 kDa grossen Dextransucrasen, 110 kDa grossen Levansucrasen und einer 130 kDa

grossen Inulosucrase. Die grosse Ähnlichkeit der entsprechenden, partiell sequenzierten,

Dextransucrase-Genen mit jenen von W. confusa und W. cibaria Isolaten aus französischen

Sauerteig und Fruktansucrase-Genen von W. confusa Isolaten aus malayischen Soja- und

Kokosnussgetränken deutet auf hohe genetische Konservierung und Homologie von

Weissella Glycansucrasen.

EPS produzierende P. freudenreichii wurden auf Grund ihrer schleimig, klebrigen Erscheinung

auf Agar-Platten selektiert und Stämme die CPS vom β-Glucan-Typ produzieren mittels

Immunopräzipitation bestimmt. Von den verbleibenden, wurde P. freudenreichii JS15 als

vermutlicher HePS Produzent ausgewählt, EPS isoliert und mittels Monomeranalyse die

Produktion eines HePS bestehend aus Glucose, Mannose und Glucuronsäure nachgewiesen.

Die Struktur dieses HePS entspricht wahrscheinlich der PAB HePS Struktur die bereits früher

in P. thoenii und P. freudenreichii beobachteten wurde.

W. confusa und P. freudenreichii Kulturen, 1:1 gemischte W. confusa und P. freudenreichii

Kulturen sowie Kulturen aus co-Kultivierung wurden auf ihre haltbarkeitsverlängernde

Wirkung in Brot getestet. Einflüsse von EPS auf Teig und Brotqualität, wie gesteigerte

Zusammenfassung

XI

Wasseraufnahme, Volumen und die Beschaffenheit der Krume nach dem Backen und deren

Veränderung während der Lagerung wurden untersucht. Fünf Stämme wurden ausgewählt

um die identifizierte EPS Vielfalt abzudecken, nämlich drei W. confusa (A3/2-1 (Dextran),

F3/2-2 (Dextran und Levan), und 11GU -1 (Dextran und CPS)) und zwei P. freudenreichii

(DF30 (β-Glucan) und JS15 (HePS). Um die Funktion der verschiedenen EPS typen zu

beobachten wurden Kulturen der fünf Stämme unter kontrollierten Bedingungen in einem

Medium auf Getreidebasis hergestellt. Die Kulturen wurden einzeln eingesetzt um deren

individuelle Funktion zu bewerten und als 1:1 gemischte LAB und PAB Kulturen um eventuell

auftretende Interaktionen zwischen bestimmten EPS typen zu beobachten. CPS und Dextran

von W. confusa 11GU-1 zeigte bereits bei geringer Dosierung von 1 g/kg Teig hohe

Funktionalität. CPS und Dextran zeigten signifikant stärkere haltbarkeitsverlängernde

Wirkung (um 32% reduzierte Geschwindigkeit der Krumenhärtung während 72 h Lagerung

im Vergleich zur Kontrolle) als Dextran und Dextran und Levan haltige Kultur Zutaten. Beide

P. freudenreichii Zutaten veränderten einzeln eingesetzt die Broteigenschaften nicht, als 1:1

Mischkultur mit den drei Weissella Zutaten eingesetzt wurden allerdings starke, sowohl

positive als auch negative, Wechselwirkungen beobachtet. Die beste Wirkung zeigte die 1:1-

Mischkultur von W. confusa 11GU-1 und P. freudenreichii JS15 erreicht. Die Krumenfestigkeit

nach 72 h Lagerung war signifikant niedriger als bei anderen Kultur-Kombinationen und der

Kontrolle. Diese Beobachtungen deuten auf eine synergistische Wirkung von Dextran und

dem fadenziehenden CPS von W. confusa 11GU-1 und dem HePS von P. freudenreichii JS15.

Ein co-Kultivierungsprozess um gleichzeitig die funktionellen W. confusa und P.

freudenreichii EPS und antimikrobiell wirkende Essig -und Propionsäure herzustellen wurde

entwickelt und optimiert. Für die co-Kultivierung von W. confusa 11GU-1 und P.

freudenreichii JS15 wurde ein auf Malz basierendes Medium, mit zusätzlich 60 g Saccharose

Zusammenfassung

XII

pro Liter als Substrat für die Dextran Produktion verwendet. Der Fermentationsprozess war

sehr reproduzierbar und produziert ein Endprodukt mit 17.6 ± 0.7 g /l EPS, 6.1 ± 0.2 g/l

Essigsäure und 11.7 ± 0.3 g/l Propionsäure. Drei Zugabemengen dieser Co-Kultur (7.5, 15 und

30 % vom Mehlgewicht) wurden in Brot getestet. Zum Vergleich wurden Produkte mit

equivalenten Mengen an chemischer Essig- und Propionsäure supplementiert und eine

Kontrolle ohne jegliche Zusätze hergestellt. Durch die Zugabe von Essig- und Propionsäure

wurde die Teig- und Brot Qualität stark negativ beeinflusst. Mit der Verwendung der co-

Kultur konnten negative Effekt durch die gleichzeitige Zugabe von EPS und CPS verhindert

werden. Textur, Qualität und Haltbarkeit der co-Kultur ergänzten Produkte was sehr gut. Die

Geschwindigkeiten der Krumen Härtung bei Zugabe von 7.5, 15 und 30% lagen signifikant

unter der Kontrolle mit einer Reduktion um 12, 23 und 25 %. Verglichen mit den Produkten

die mit chemischer Essig- und Propionsäure versetzt wurden war die Reduktion mit 7.5, 26

und 53 % noch höher. Die Zugabe von 15% Co-Kultur entspricht 0.5 g Essigsäure, 1 g

Propionsäure und 1.5 g EPS pro kg Teig und erscheint optimal um antimikrobiell wirksame

Konzentrationen an Essig- und Propionsäure zuzusetzen und dabei sehr gute Brotqualität

und lange Haltbarkeit zu erreichen.

In einer letzten Studie wurden aufgereinigte, säurefreie co-Kultur EPS auf ihre Wirkung in

Brot getestet. Hohe Funktionalität wurde bereit bei geringer Zugabe von 0.25% co-Kultur-

EPS bezogen auf Mehlgewicht erreicht. Die Brotkrume war nach 72 h Lagerung um 30%

weicher als im Kontroll Produkt ohne EPS. Im Vergleich dazu war die Krume nach Zugabe der

Selben Menge EPS aus einer W. confusa 11GU-1 Einzelkultur nur um 21% weicher. Eine sehr

geringe Menge des HePS von P. freudenreichii JS15 scheint daher die Wirkung von Dextran

und CPS von W. confusa 11GU-1 signifikant erhöhen zu können.

Zusammenfassung

XIII

Diese Studie beschreibt neue W. confusa EPS- und CPS Arten mit grossem Potenzial für

Anwendungen im Lebensmittelbereich. Im Vergleich zu Dextran und Dextran und Levan

hältigen Kulturen wurde mit W. confusa 11GU-1 eine deutlich ausgeprägtere

Haltbarkeitsverlängerung erreicht die wahrscheinlich auf das zusätzlich produzierte CPS

zurückzuführen ist. Die co-Kultur von W. confusa 11GU-1 und P. freudenreichii JS15 bietet

weiters zwei verschiedene Anwendungsmöglichkeiten: (1) als Roh-Ferment um gleichzeitig

durch die Wirkung der EPS das altbackenwerden zu verlangsamen und den mikrobiellen

Verderb durch die vorhandene Essig und Propionsäure zu verhindern oder (2) als

aufgereinigtes, säurefreies Produkt um die volle synergistische, haltbarkeitsverlängernde

Wirkung der Weissella und Propionibacterium Polymere zu nutzen.