Marjan Akhyany

Degree project for Master of Science 60 hec

Department of Biological and Environmental SciencesUniversity of Gothenburg 2013

Effects of individualantibiotics and their

mixtureson single bacterial species, artificial and natural

microbial communities

http://www.rightparenting.com/article/understanding-antibiotics.html

Abstract Several  pharmaceuticals  including  antibiotics  are  currently  used  to  treat  human  and  animal 

disease. Antibiotics as a subgroup of pharmaceuticals could pass through Sewage Treatment Plants 

and  reach aquatic  compartments of  the environment and are present at very  low  concentrations 

compared to the other chemicals. Presently, concern of occurrence, fate and environmental risks of 

pharmaceutical  including  antibiotics  have  been  increased.  Empirical  evidences  on  mixture  eco‐

toxicity of chemicals sometimes demonstrate higher  joint toxicity even at their individual non‐toxic 

concentrations.  

Since  bacteria  are most  sensitive  organism  to  antibiotics,  the  authors  of  this  study  aimed  to 

present  the  current  toxicity  of  antibiotics  to  bacteria  in  single  substance  and mixture  exposure 

scenarios.  Selection  of  antibiotics was  based  on  a  study  by  Andreozzi  et  al.  2002  which  seven 

antibiotics  from different  therapeutic classes were detected  in effluents of  three STPs  in Sweden, 

Italy  and  France  as  worst  cases,  namely  Ofloxacin,  Lomefloxacin,  Enoxacin,  Norfloxacin  and 

Ciprofloxacin  (Quinolones)  and  Trimethoprim  and  Sulfamethoxazole  (Sulfonamides)  with 

concentrations between 0.04 and 1.61 nmol/L, in addition to 14 non‐antibiotics.  

Single substance toxicities were evaluated using a standard bacteria assay (Pseudomonas putida), 

a  new  approach  using  artificial  community  (B.O.D.seed),  and  natural  biofilms  (Limnic  periphyton 

communities)  under  controlled  exposure  in  laboratory.  All  substances  demonstrated  toxicities  to 

bacteria where Quinolones  (most  hazardous  substances was  Ciprofloxacin)  showed more  toxicity 

compared  to  Sulfonamides.    In  term  of  single  substance  toxicity,  the  bioassays  were  sorted  in 

different order which seems to be substance dependent. Evaluating the single substance toxicity  in 

three  different  bioassays  also  demonstrated  looking  at  the whole  curve  is  essential  in  order  to 

determine the toxicity of a substance. 

Mixture toxicities were evaluated using the first two bioassays. The mixture at the concentration 

at which it is present in the selected effluents had no visible effect .Therefore, no impact of mixture 

of antibiotics at their realistic concentrations in natural environment (which is comparatively lower 

than effluents of STPs) would be considered for bacterial groups of the communities. Since bacteria 

are most  sensitive  part  of  the  natural  communities  to  antibiotics  and  no  adverse  effects  were 

observed  for  bacteria,  there  is no  concern  for non‐bacterial  parts  such  as  invertebrates  and  fish 

which are less sensitive to antibiotics. 

In addition mixture toxicities of tested antibiotics were predicted by using  two classic concepts 

namely  Concentration  Addition  (CA)  and  Independent  Action  (IA).  Both  CA  and  IA  concepts 

underestimate  the mixture  toxicities.  This  fact  is  in  contrast  to  earlier  studies  in  ecotoxicity  of 

chemicals. Higher predictive power was also illustrated for CA concept. 

2  

Furthermore, the results of mixture tests are valid only for the current mixture of the substances. 

Therefore, presence of other  chemicals  including non‐antibiotics group of pharmaceuticals, heavy 

metal and biocides should be also taken in to the account. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3  

TableofContents

Introduction .......................................................................................................................................... 5 

Pharmaceutical in the environment .......................................................................................................... 5 

Antibiotics  .................................................................................................................................................. 6 

Environmental Risk Assessment (ERA) of antibiotics  ........................................................................ 8 

Exposure scenario and the compounds  .................................................................................................. 8 

Mixture toxicity concepts  ....................................................................................................................... 12 

Study organism and communities  ......................................................................................................... 14 

Aims of the thesis  .................................................................................................................................... 17 

Materials and methods  .............................................................................................................. 18 

Preparation of the test solutions  ........................................................................................................... 18 

Endpoint .................................................................................................................................................... 18 

Toxicity tests  ............................................................................................................................................ 19 

Pseudomonas putida test  ........................................................................................................................ 19 

Artificial communities’ tests  .................................................................................................................. 19 

Experimental design- method development  ........................................................................................ 20 

Limnic periphyton community test (Swift)  .......................................................................................... 23 

Data treatment  .......................................................................................................................................... 25 

Results  .................................................................................................................................................. 27 

Control experiment  ................................................................................................................................. 27 

Single substance tests in Pseudomonas putida  .................................................................................... 28 

Mixture toxicity tests of antibiotics in Pseudomonas putida  ............................................................ 30 

Impact of non-antibiotic pharmaceuticals present in the effluents  ................................................... 31 

Single substance tests in B.O.D.seed artificial community  ............................................................... 33 

Mixture toxicity tests of antibiotics in B.O.D.seed artificial community  ........................................ 36 

Single substance tests in Limnic periphyton bacterial community  ................................................... 37 

Compared toxicities of four antibiotics to three different bioassays  ................................................ 40 

Predictability of the mixture toxicity by CA and IA concepts  .......................................................... 43 

Discussion & Conclusion  ...................................................................................................... 49 

4  

Acknowledgments ......................................................................................................................... 52 

References  ......................................................................................................................................... 53 

Appendix I .......................................................................................................................................... 55 

Details of the media  ............................................................................................................................... 55 

Appendix II ........................................................................................................................................ 57 

Toxicity of tested antibiotics to Pseudomonas putida in single substance exposure  ..................... 57 

Toxicity of tested antibiotics to B.O.D.seed in single substance exposure  ..................................... 60 

The parameters of Weibull fit model  .................................................................................................... 63 

5  

Introduction

Pharmaceuticals in the environment

In  general,  pharmaceuticals  are  used  to  cure  or  prevent  human  and  animal  disease  with 

different  way  of  application,  followed  by  digestion,  absorption,  metabolism  and  excretion  in 

human or animal bodies.  

Although releasing of the pharmaceuticals occurs for decades, the first report of presence of the 

pharmaceuticals  was  at  the  beginning  of  80’s  (Andreozzi  et  al.,  2002).  Anyway,  different 

compartments  of  the  environments  are  contaminated  by  pharmaceuticals.  There  are  several 

routes to enter the environment for pharmaceuticals  in production, consumption and disposal as 

shown  in  Figure  1.  The  human medicines  could mainly  end  up  in  the  environment  via  Sewage 

treatment  plants  (STPs)  streams.  In  contrast  veterinary medicines, mainly  antibacterial  agents 

might  directly  enter  the  environment.  For  instance,  they  are  used  directly  to  the  water  in 

aquaculture  (Boxall B.A., 2004). There are several other entering ways  for  the other sorts of  the 

pharmaceuticals such as runoff from applied sewage sludge and agricultural fields.  

 

Figure 1: Indication of how pharmaceuticals enter the terrestrial and aquatic environment

(Boxall B.A., 2004)

The major  reasons  for  the  concern  are  that pharmaceuticals  are designed  to have  a  specific 

action in their biological targets or affect a physiological process in organisms as well as their low 

6  

biodegradability  within  the  human  or  animal  bodies.  This  means,  they  could  have  inherent 

properties  that  could  also  remain  stable  outside  the  human  or  animal  bodies.  Though, 

Pharmaceutical might  have  also  some  unanticipated  effects  on  non‐target  organisms with  the 

same receptors with target organisms. From an environmental perspective, such persistence might 

lead  to persist  in degradation  in Sewage Treatment Plants as well and may cause environmental 

impacts (EEA Technical report, 2010, P8). Pharmaceuticals are present in the environment in lower 

than their  low effect concentration (LOEC) (EEA Technical report, 2010, p17).   Hence, continuous 

releasing  of  pharmaceuticals  to  the  environment  expose  the  organisms  to  a  low  level  of  the 

substance, but also chronic exposure would occur over a long period of time.  

Concerns  of  using,  exposure,  fate  and  environmental  impact  of  pharmaceuticals  have  been 

increased during recent decades in Europe, due to developing European pharmaceutical market.    

In Europe, the first attention to the impact of pharmaceuticals was in European Environmental 

Agency  (EEA) at the  first years of 21th century.  It has been confirmed by researches that human 

and veterinary medicines could have environmental  impacts  (EEA Technical  report, 2010, P5) via 

unwanted effects on non‐target organisms that would alter ultimately the ecosystem function. 

So  far,  the hazardous  impacts of  two compounds of pharmaceuticals have been documented 

well  including Ethinyl Estradiol  (EE2)  causing  the  feminisation of male  fish and Diclofenac which 

kills vultures in Asia (EEA Technical Report, 2010, p8). Unfortunately there are still knowledge gaps 

for other pharmaceuticals like antibiotics and endocrine disrupters.  

Antibiotics:

In general,  there  is no widely accepted definition  for antibiotics. Antibiotics are originally any 

chemical  agents with  biological  activity  against  living  organisms.  In  particular,  antibiotics  are  a 

specific  therapeutic  class  of  pharmaceuticals with  inhibitory  effect  on microorganisms'  growth 

including bacteria, fungi and protozoa (parasite). Antibiotics without toxic effect on host are used 

to prevent or treat the microbial  infection  in human, veterinary and aquaculture medicines. They 

are even applied as a growth promoter in veterinary medicine (Kummerer, 2009, part I). According 

to Wise 2002 the world wide consumption of antibiotics is estimated between 100,000 to 200,000 

tons per year (Kummerer, 2009, part I reference in there). 

They  could  be  classified  by  their  mode  of  action  or  chemical  structure  such  as  solubility, 

hydrophobicity and hydrophilicity. These properties determine their distribution pattern and their 

fate in Sewage Treatment Plants (STPs) streams. Hydrophobic substances take part in portioning in 

the sludge while hydrophilic substances could pass through the STPs. Their biological activity and 

toxicity might also change with pH value. Thus, log Kow of these substances are also pH dependent 

(Kummerer, 2009, part I). 

7  

Antibiotics  could have different  source  in  the environment. They  could be even produced by 

natural  bacteria  of  soil  and  sediments  (Kummerer  K.,  2009,  part  I).  Three main  sources  of  the 

antibiotics  in the aquatic environments are STPs, agriculture farms and manure deposit form civil 

area  (Brosche  S.  et  al,  2010).  Total  concentration  of  the  antibiotics  is  also  increased  by  direct 

discharging from aquaculture, meat processing or even from pets. Despite antibiotics are used  in 

lower  rates  in  hospitals,  they  have  been  detected  in  higher  concentration  in  hospital  effluents 

compared to the municipal waste water (Kummerer K., 2009, part I). 

Elimination  of  the  antibiotics  is  done  by  different  processes  namely  sorption,  photolysis, 

hydrolysis, thermolysis and biodegradation. To  investigate the rate of sorption of antibiotics onto 

sediment and  sludge,  their chemical and physical properties are necessarily. Antibiotics are very 

different in sorption behaviour which is affected by the content of minerals and lipids in receiving 

environment. Organic  content  has  also  effect  on  sorption  rate  (Boxall,  2004).  Photolysis  is  the 

major of abiotic elimination pathway in some of light sensitive antibiotics which is possible only in 

clear  surface water. The affectivity of  the process  could  vary with  light  intensity and  frequency, 

latitude, pH and water hardness. Hydrolysis is also an effective pathway for some antibiotics like B‐

lactams which are rapidly hydrolysed in laboratory (Kummerer K., 2009 part I), but not for most of 

the antibioticss, because they are designed persistent to hydrolysis in digesting system (Andreozzi 

R., 2002). 

Biodegradation is also a pathway to eliminate the antibiotics mainly by the bacteria which will 

be discussed later.  

 Antibiotics are metabolised within the human or animal bodies (often  in  liver), they might be 

more  water  soluble  which  can  lead  to  more  toxic  substances  than  parent  compounds.  The 

metabolic rates of the antibiotics within the human body are 30% in average which indicates 70% 

of used antibiotics might emit to the waste water unchanged while they are still active (Kummerer 

K.,  2009,  part  I  references  in  there).  Despite  they  are metabolised  or  not,  these  two  fractions  after 

passing  through  STPs  could  reach  to  the water  compartments  of  the  environment  like  surface 

water, sediments or ground water. Moreover, physical and chemicals processes have an important 

role  in transferring of the antibiotic through different compartments which means they could be 

bio  transformed  from one  trophic  level  to another. Thus, all  the  relevant  forms of  the antibiotic 

should be taken to the account such as degradation products, metabolites in addition to the parent 

compounds (Backhaus T. et al, 2008, book chap, p263).  

Several  antibiotic  therapeutic  classes  are  detected  in  the water  compartments.  Although  β‐

lactam  class  (β‐lactamase  inhibitor)  are  the most  common used  therapeutic  class,  they  are not 

detected  in  aquatic  environment.  (Kummerer,  2009,  part  I  references  in  there).    In  particular  the 

antibiotics from tetracyclines, sulphonamides and macrolides classes are present in the sediments. 

(Kummerer, 2009, part I references in there).   

8  

Environmental Risk Assessment (ERA) of antibiotics

At  1980,  the  first  requirement  for  providing  the  environmental  risk  assessments  of 

pharmaceuticals was demonstrated by Food and Drug Administration  (FDA)  in the USA,  followed 

by The EU at 1997. The risk assessments should be performed in terms of their effect on organisms 

in aquatic and terrestrial ecosystems (Boxall B.A., 2004).   

To date, there is a lack of data available on the risk assessment of the antibiotics. In most of the 

cases  Environmental  risk  assessment  (ERA)  were  provided  for  the  other  class  of  the 

pharmaceuticals.  In  addition,  in  a  few  ERAs  with  focus  on  antibiotics,  the  procedures  were 

undertaken  in  single  substance  exposure.  Thus,  the  Predicted  No‐Effect  Concentration  was 

provided for single antibiotic.  

Exposure scenario and the compounds

Selection of test chemicals in single substance exposure was based on Andreozzi R. et al. 2002. 

According to this paper, seven different antibiotics have been detected  in the effluents from STPs 

in four European countries; Sweden, Greece, Italy and France. They appear in concentration range 

between 0.01 and 0.58 µg/L (Tab 1).  

The  toxicity  tests  in  single  substances  exposure  are  frequently  done  in  eco‐toxicological 

attempts. The real exposure scenario is mixture of different compound in various concentrations in 

contaminated environment. Since single substance exposure is not environmentally relevant and it 

is also possible to underestimate the hazard of exposure of the toxicants, investigating the toxicity 

of  the  chemicals  should  be  performed  in mixture  scenario.  In  addition,  in most  of  the  cases, 

mixture of several compounds might have higher effects compared to the individuals even at their 

concentrations  with  no  significant  effects  (NOEC)  (Backhaus  T.  et  al,  2008,  book  chap,  p264). 

Selection  of  mixture  scenarios  was  also  based  on  Andreozzi  2002,  in  three  STPs  in  Europe. 

Additionally  to  the  Swedish  mixture,  the  two  highest  toxic  scenarios  were  selected  to  be 

investigated, which were Italian and French (Backhaus T. et al, 2013). 

In  order  to  determine  the  pure  additivity,  synergistic  or  antagonistic  effects  of  the mixture 

exposure, all the seven compounds were used in mixture toxicity tests in their real concentrations 

in  the  effluents  of  three  STPs  in  Europe  (in  dilution  factor  of  ten  between  0.01  and  1000), 

regardless their toxicity in individual exposure.  

 

 

9  

Table 1: Antibiotics present in the effluents from STPs and their concentration (in µg/l) in

three selected STPs (Andreozzi R. et al., 2002) and their mode of actions

The compound and 

 the molecular 

 structure 

CAS  

num 

Swede

 (µg/L) 

Italy

(µg/L) 

France

(µg/L) 

Mode of action  Referenc

Trimethoprim 

 

738‐70‐ 

5 

0.05  0.04  0.02  Inhibits bacterial 

DNA synthesis, 

consequently inhibits bacterial growth 

Web  

page:  

PubChem 

Sulfamethoxazole 

 

723‐46‐ 

6 

0.02  0.01  0.07  Inhibits folic acid synthesis in susceptible bacteria, 

consequently inhibits bacterial growth 

Web  

page:  

PubChem 

Ofloxacin 

 

82419‐ 

36‐1 

0.12  0.58  0.51  Prevents DNA replication 

transcription, repair, and 

recombination, inhibits 

bacterial cell division 

via inhibits DNA gyrase and 

topoisomerase IV 

Sato K., 

Et al,  

1986 

Lomefloxacin 

 

98079‐ 

51‐7 

0.13  0.32  0.19  Inhibits DNA replication and 

transcription (via inhibits  

DNA gyrase and 

topoisomerase IV) 

Web  

page: 

drug  

bank 

Enoxacin 

 

74011‐ 

58‐8 

0.01  0.03  0.01  Prevents DNA replication, 

inhibits bacterial cell division 

via inhibits DNA gyrase 

Web  

page: 

drug  

bank 

Norfloxacin 

 

70458‐ 

96‐7 

0.03  0.07  0.08  Inhibits DNA replication 

transcription, repair, and 

recombination 

via inhibits DNA gyrase 

Web  

page: 

druglib 

Ciprofloxacin 

 

85721‐ 

33‐1 

0.03  0.07  0.06  Inhibits DNA replication 

transcription, repair, and 

recombination 

via inhibits DNA gyrase 

and topoisomerase IV 

Web  

page: 

toxnet 

 

Antibiotics are mostly classified by their mode of action. They inhibit synthesis of the cell wall, 

proteins or nucleic acids, also inhibit the membrane function or metabolism of the cell (Fig 2).  

10  

 

Figure 2: mechanism of action of the antibiotics from different therapeutic classes.

http://www.orthobullets.com/basic‐science/9059/antibiotic‐classification‐and‐mechanism 

Trimethoprim  and  Sulfamethoxazole  belong  to  Sulfonamides  while  Ofloxacin,  Lomefloxacin, 

Enoxacin, Norfloxacin and Ciprofloxacin are classified in Quinolones therapeutic class. 

Trimethoprim is used to treat urinary tract infection. This antibiotic is also used to treat animals 

in  veterinary  medicine  and  has  synergistic  effect  in  combination  with  Sulphametoxazole  and 

inhibits  the  synthesis  of DNA  in  bacteria  by  binding  to  an  enzyme  that  interferes  in  thymidine 

synthesis (Web page: PubChem). 

Sulphametoxazole  is used  to  treat human bacterial  infection and binds  to an enzyme with  is 

crucial  in purine  synthesise. This compound has  the  same  target with Trimethoprim  (Web page: 

PubChem).  

Ofloxacin  is  used  to  treat  infections  in  respiratory  tract  and  skin, which  high  rate  of  parent 

compound  is observed unchanged  in urine. This  substance prevents  replication of  the DNA and 

consequently cell division via acting on DNA gyrase and topoisomerase IV (Sato K., et al, 1986).   

Lomefloxacin  is mostly  used  in  bacterial  infections  in  respiratory  and  urinary  tracts with  the 

common target site with Ofloxacin which were DNA gyrase and topoisomerase IV. (Web page: drug 

bank) 

Enoxacin  is  also  used  as  antibiotics  in  the  same  infections mentioned  above with  the  same 

target; DNA gyrase. 40% of the compound is reported unchanged in urine. Enoxacin also might be 

active against resistant bacteria with different mechanism of action (Web page: drug bank). 

11  

Norfloxacin and Ciprofloxacin are antibiotic against bacterial infection in mostly urine tract. The 

target sites are two enzymes; DNA gyrase and topoisomerase  IV  (Web page: druglib)  (Web page: 

toxnet).  

Several other non‐antibiotic group of the pharmaceuticals were also present in the effluents of 

the STPs in Europe (Andreozzi R. et al., 2002) (Tab 2).  

Table 2: Non‐antibiotic pharmaceuticals present in the effluents of three STPs and their

concentration (in µg/l) in Europe (Andreozzi R. et al., 2002)

The compound  CAS num  Sweden 

 (µg/L) 

Italy  

(µg/L) 

France 

 (µg/L) 

Therapeutic class 

Gemfibrozil  25812‐30‐0  2.07  0.81  0.06  Lipid regulator 

Fenofibrate  49562‐28‐9  n.d.  0.16  0.02 

Bezafibrate  41859‐67‐0  n.d.  n.d.  1.07 

Clofibric acid  882‐09‐7  0.46  0.68  n.d. 

Ibuprofen  15687‐27‐1  7.11  0.18  0.02  Antiphlogistics 

 Fenoprofen  34597‐40‐5  n.d.  n.d.  0.19 

Naproxen  22204‐53‐1  2.15  0.29  0.51 

Ketoprofen  22071‐15‐4  n.d.  n.d.  1.62 

Diclofenac  15307‐86‐5  n.d.  0.47  0.25 

Acebutolol  37517‐30‐9  <0.01  0.04  0.08  β ‐blocker 

Metoprolol  37350‐58‐6  0.39  0.01  0.08 

Oxprenolol  6452‐71‐7  n.d.  0.01  0.02 

Propranolol  525‐66‐6  0.01  0.01  0.04 

Carbamazepine  298‐46‐4  0.87  0.3  1.2  Antiepileptic 

   n.d.: not detected 

 

 

12  

Mixture toxicity concepts:

Regarding  to  continuous  releasing  of  the  different  pharmaceuticals  to  the  environment, 

chemical mixture pattern are not constant in concentrations and combination. Thus the number of 

realistic mixture scenario would be huge and performing such a huge number of tests is practically 

non‐executable (Porsbring, 2009). In addition, results of the mixture tests are only meaningful for 

the current tested mixture. 

Because  of  mentioned  items  above  and  highly  variation  in  qualitative  and  quantitative 

combination  in  realistic exposure  in  the natural environment, using  the predictive approaches  is 

suggested.  

Two  component based approaches were used  in  this  study; Concentration Addition  (CA) and 

Independent Action (IA). These two concepts are able to predict the mixture toxicity of chemicals 

where mechanisms of toxic action of the compounds are assumed similar  in CA and dissimilar  in 

IA.   Both mathematical concepts are based on individual toxicities of the compounds presented in 

the mixture and their concentration in a mixture. It should be pointed out that both models could 

be  used  for  both  retrospective  and  prospective  assessments  (Backhaus  T.,  2008,  book  chapter, 

p267).  

CA concept: 

CA  concept  assumes  every  single  substance  can  contribute  to  the whole  toxicity, where  any 

substance can be exchanged or replaced by another while the overall toxicity will not change as far 

as  toxic  unit  (TU)  of  the  compound  does  not  change.  TU  is  fraction  of  concentration  of  the 

component  in  the mixture  and  the  concentration  of  that  compound  which  provoke  a  certain 

percentage  of  effect.  The  assumptions  for  this  model  are  similar  mode  of  action  for  all  the 

components.  Particularly  for  pharmaceuticals,  they  should  have  the  same  receptor  sites.  The 

selected endpoint  should be also on common  for all  the present components  in  the mixture.  In 

these  conditions,  the TU of  the mixture  is  sum of every  single TU of  the  component with  their 

concentrations in the mixture. CA can be calculated for a mixture of n compounds as;  

ECx mix ∑ ‐1 

(eq 1) 

Where  Pi  stand  for  relative  fraction  of  a  compound  in  the  mixture.  ECxi  denotes  the 

concentration of  the  compound which provoke x% effect  in  single exposure. For  instance,  if we 

want to predict the EC50mix, all the EC50 values of the component are required. These ECxi values 

13  

were calculated from the concentration‐response curves. ECx(mix)  is the concentration of the total 

mixture that provoke x% effect.  

IA concept:

In  contrast  IA  concept  assumes  every  single  component  affect  the  organisms  independently, 

which  means  the  toxicity  of  each  component  is  not  affected  by  the  presence  of  the  other 

chemicals in the mixture due to their dissimilar mechanisms of action. The same receptor sites and 

common endpoint for all the present compounds in the mixture are assumptions of this model. 

IA concept is formulated as; 

Emix 1 ∏ 1

(eq 2) 

Eci denotes the effect of the compound i at concentration ci in single exposure. These Eci values 

are calculated from single exposure tests at the real concentration.  

To clarify these two concepts, it is needed to mention that CA and IA are different in principles 

which CA needs effect concentration (ECx) values which come from concentration‐response curves, 

while IA based on single substance effect (Eci). CA model also predicts the effect concentration of 

the  mixture  that  provoke  x%  effect.  In  contrast,  IA  model  predicts  the  mixture  effect  of  n 

compounds with certain concentrations in the mixture. Thus in addition to the data on qualitative 

and quantitative mixture composition, required input data for both models could be derived from 

concentration‐response curves (more details in material and method). 

It  is still debated  that which predictive concepts might predict  the  toxicity more efficiently.  In 

EEA worksheet 2010  report num 4, Backhaus T,  it was mentioned  that  these  two models  could 

predict  the  joint  toxicity  rather well.  In  addition  CA  concept often predicts  higher  joint  toxicity 

compared to IA. (Same ref) 

More over according  to  the predictions of  these  two models, which model  could predict  the 

mixture toxicity better, similar or non‐similar mode of actions of the components could be derived 

(Backhaus T., 2008, book chapter, p272). 

 

 

 

 

14  

Study organism and communities:

Bacteria  are  likely  the most  sensitive  groups  of microorganisms  to  the  antibiotics.  They  are 

present  in different compartment of the natural environment which have essential role in sustain 

the  ecological  balance  and  furthermore  ecosystem  function.  Since  the  selected  toxicant 

(antibiotics)  mostly  affect  the  bacterial  groups  of  the  communities  in  aquatic  compartments, 

toxicity tests were decided to be performed on bacterial bioassays.  

Selecting an appropriate end point is also crucial in toxicological experiments. In some cases in 

environmentally relevant concentration, the adverse effects were detected  in one endpoint while 

no effect was observed in another endpoint (Kummerer K., 2009 part I). Growth inhibition rates of 

bacteria were considered as an endpoint to present the results of the tests. This endpoint could be 

measured by comparing the growth rate of exposed samples with non‐exposed controls.  

From another perspective, the real exposed organisms are also  in diverse community forms  in 

the natural environment; contain mixture of different spices of different trophic levels. In addition, 

adverse  effect  on  one  trophic  level  might  have  severe  effect  on  another  trophic  level,  and 

ultimately influence the ecosystem function. Thus, in order to investigate the effect of the toxicant 

on  community  level which  is more  environmentally  relevant,  this  attempt was performed  from 

single species tests following by gradually increasing the complexity to community levels.  

Single species assay

Since  a  response of  an  ecosystem  against  entering  chemicals  is  specific  from  one  species  to 

another, there is no representative species in toxicology studies. Pseudomonas putida is one of the 

most used species in toxicological tests among bacteria with a complex metabolism. This species is 

selected due to the biological characteristics of the bacteria such as their ability to degrade organic 

pollutants. Market availability, standard lab protocol and low level complexity to culture were the 

commercial and practical reasons to select this species.  

Pseudomonas  putida  belongs  to  Gamma  proteobacteria  class.  This  species  is  a  rod‐shaped, 

gram‐negative bacteria which lives in most soil and water environment compartment with aerobic 

condition (Espinosa‐Urgel, M.,et al, 2000). 

15  

 

Figure 3: Picture of Pseudomonas putida (Dennis Kunkle Microscopy, Inc)

Underestimating the toxicity of a substance should be also considered due to delayed toxicity in 

acute  tests.  The  single  species  tests  are  performed  with  in  exponential  bacterial  growing 

population over a time period of 16 hours. This test might be considered as an acute test.  In my 

point  of  view  that  was  chronic  due  to  the  test  duration,  which  covers  life  cycles  of  several 

generations. All  the  tests were  performed  under  controlled  condition  such  as  temperature  and 

light (in the darkness).   

Artificial community assay:

The  most  dominant  process  to  eliminate  the  organic  compounds  in  the  environment  is 

biodegradation  which  is  performed  by  microbial  communities  (Paixao  S.M.,  et  al,  2005).  In 

detecting  the  presence  of  the  pollutants  and  monitoring  the  effect  of  the  toxicant  in  the 

environment, more  complex  biological  assays  in  community  level  should  be  used.  Several  test 

methods,  including  the  standard  test methods  in  International Organization  for  Standardization 

(ISO, Geneva, Switzerland), are provided to  indicate health of the aquatic environment, mostly  in 

Activated Sludge (AS) bacterial communities. The results are obtained by measuring the effect of 

the  pollutants  on  bacterial  survival  or  growth,  in  addition  to  their  ability  to  biodegradation  or 

bioremediation (Paixao S.M., et al, 2002).  

The potential of artificial communities  in ecotoxicological tests have been evaluated  in several 

scientific papers. For instance, in Paixao S. M. 2002 & 2005, the potential of artificial communities 

was investigated by different parameter such as catabolic (carbon utilization) profile, reproduction 

and respiration rate. The results indicated activated sludge (AS) test could be replaced by artificial 

communities.  It has been  also well documented  that  two  common  commercial  inocula namely, 

16  

Polyseed  and  B.O.D.seed  are  appropriate  alternative  to  AS,  due  to  no  significant  differences 

between  them  and  natural  samples  in  the  investigated  parameter  such  as  substrate  utilization 

profile (Paixao S.M., et al, 2005 & Khan E. A. et al, 2005, references in there) 

Polyseed and B.O.D.seed are non‐pathogenic bacterial community  in dehydrated capsule  form 

for microbial standard assay contained 100 mg of specialized bacterial culture. They are often used 

as  seed  in  biological  (biochemical)  oxygen  demand  (BOD)  and  biodegradable  dissolved  organic 

carbon  (BDOC)  tests  in  degradation  of  industrial  and municipal waste  (Khan  E.  A.  et  al,  2005). 

Polyseed and B.O.D.seed are used as a  standard  seeding material  in BOD  tests due  to  low  cost, 

consistently good results and their availability in the market. 

In this study, these two artificial communities were applied in a new way. The further interest of 

this step was evaluating the result of such a test with a community which contains only bacterial 

species compared to the natural community with all the other non‐bacterial organisms.   

Limnic periphyton community assay:

Fresh water  is  a water  compartment  of  the  natural  environment worldwide;  contain  highly 

biodivers communities including macroscopic fauna such as invertebrates, fishes and flora such as 

algae and higher plants, as well as microorganisms. Bacteria, virus, fungi, protozoa and micro algae 

are  the present microorganisms'  communities  in  fresh water which  are  also  important  from  an 

environmental perspective, due to their activities. Freshwater microorganisms have important role 

in inorganic nutrients concentration and could affect the surrounding environment via transition of 

the nutrients trough food webs (Sigee, 2005). In addition to their role in nutrient cycling, they also 

contribute  to  primary  production  as well  as  removing  the  pollutant  from water  compartments. 

Thus  the  function  of microorganisms  such  as  bacterial  communities  is  important  in  ecosystem 

health and  function.  Investigating the adverse effects of chemicals  is critical which might  lead to 

deterioration of the freshwater environment (Sigee , 2005).  

Periphyton  communities  are  developed  autotrophic  and  heterotrophic  microbial,  algal 

communities on submerged surfaces in aquatic environment (Fig 4). This community also contains 

the wide  range  of  other  organisms  such  as  fungi  and  protozoa, which  is  too  dynamic  in  their 

number  of  species  and  species'  abundance  (Porsbring,  2009).  Periphyton  provides  food  for  the 

other trophic levels. 

17  

 

Figure 4: Picture of periphyton community, photo by Mats Kuylenstierna.

http://www.thomasbackhaus.eu/research/pharmaceuticals/ 

Ecological  succession  in  these  communities  occurs  as  a  consequence  of  their  interaction 

between consisting species, trophic levels, additionally to the surrounding environment (Porsbring, 

2009).  

Since all  the  species present  in natural bacterial  communities have different  sensitivities,  the 

results from such a test provide more realistic interpretation.  

 

Aims of the thesis:

The aims of this study were:  

Identifying the most hazardous substance  in single exposure and sort those substances 

in  terms  of  toxicity  from  higher  to  lower  in  Pseudomonas  putida,  B.O.D.seed  artificial 

communitiy and limnic periphyton communities. 

Investigating  the  joint  toxicity  of  seven  antibiotics  to  Pseudomonas  putida  and 

B.O.D.seed artificial community. 

Analysing whether the mixture of antibiotics identified in the STPs effluents are toxic to 

bacteria. 

Evaluating the performance of CA and IA concepts, particularly in community level which 

is more complex and include ecological succession.  

To develop an ecotoxicological assay using artificial communities. 

 

 

18  

Materials & Methods

Preparation of the test solutions:

All seven selected substances were purchased from Sigma‐Aldrich (Tab 1) 

Stock solutions of the compounds were prepared in methanol and stored in ‐20°C. For preparing 

the test solution, specific amount of toxicant dissolved in methanol were added to 300 ml or 1 litre 

bottles. After  evaporating,  the medium  depending  on  the  protocol  of  the  test was  added  to  re‐

dissolve the toxicant, followed by shaking on the shaker in the darkness overnight. 

Prior to each test, dilution series were prepared by using the highest concentration test solution 

diluted with the medium.  

Endpoints:

For  two bioassays;  single  species  and  artificial  communities,  bacterial  growth  rate  is  routinely 

determined by recording the turbidity of the bacterial suspension. Hence the growth inhibition will 

be evaluated by comparing measured Optical Density (OD) of the samples with unexposed controls 

(ISO 10712). The Optical Density was measured by spectrometer at λ=700 nM wave  length. This 

value  is  directly  related  to  biomass which means  higher OD  value  indicated  higher  biomass  and 

consequently growth inhibition rate will be inversely related to OD which could be derived as a final 

endpoint (ISO 10712). 

For  limnic  periphyton  communities’  tests,  ability  of  bacterial  communities  in  utilization  of 

different  carbon  source was  considered  as  an endpoint. These  changes might occur due  to both 

physiological  and  structural  changes  in  the  bacterial  community  and  evaluated  by  investigating 

colour  development  of  the  exposed  bacterial  communities  in  Biolog©Ecoplates.  The  Ecoplates 

contain  31  different  carbon  sources  in  96 wells while  each well  contains  redox  dye  tetrazolium 

violet. This material turns to purple due to electron transfer  in substrate utilization of the bacteria 

(Paixao S. M. 2007). The colour developments were measured by spectrometer at λ=700 and 595 

nM wave  length, due  to absorbance of  the plate which  should be corrected with  subtracting  the 

absorbance at 700nM from the absorbance at 595nM wave length. 

 

 

 

 

19  

Toxicity tests

Pseudomonas putida test:

To prepare the stock culture, dried capsule of the bacteria was rehydrated with a specific solution 

in  the  sterile  conditions  according  to  the  instruction  from  the  manufacturer  (DSMZ;  Deutscha 

Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). After half an hour,  the whole bacterial 

suspension was added to 200 ml of the stirring nutrient solution in 250 ml E‐flask.  

According to ISO 10712 two different solutions were used in this assay; namely nutrient solution 

and test solution. These two solutions were prepared by using Milli‐Q water followed by autoclaving 

and stored in the refrigerator (see details in appendix I).  

To run the assay, the OD of the bacterial suspension should reach the value between 0.2 and 0.6. 

It would occur  in 1 week after  the  first  inoculation of  the dried capsule. This value was often  less 

than 0.2 (between 0.17 and 0.2) during these tests depending on the season. 

To have fresh exponentially multiplying population, 200 µl of the previous bacterial stock should 

be  re‐inoculated daily with  the  freshly prepared nutrient  solution  stirring on  stir bar at  the  room 

temperature (approximately 23°C). This bacterial culture is usable for almost 4 weeks. In this study, 

fresh re‐inoculated bacterial culture was used in all the tests. 

The dilution series of the toxicant solutions also were prepared by using the test solution in 3.6 

ml  in  scintillation  vials.  For  all  the  single  species  tests  triplicates  for  each  concentration  and  six 

untreated controls were considered.   

In order to have comparable results, all the conditions were kept similar for all the tests including 

temperature and even the initial OD of the bacterial culture. Since the bacterial culture growth rates 

vary from one day to another, all the tests were performed using bacterial culture with OD values of 

0.18 to 0.2 after 24 Hours incubation.  

The inoculom of the bacteria with the OD of 0.0054 was prepared by diluting the bacterial culture 

by nutrient solution. 400 µl of the bacterial suspension with this certain OD were added to each vial 

which contained 3.6 ml of  the  test solution  in different concentrations. The  tests were run  for 16 

hours on the shaker at 350 rpm at room temperature (approximately 23°C). All the procedures were 

performed in semi‐sterile conditions. 

Artificial communities’ tests:

B.O.D.seed  is  developed  and marketed  by  Fitzmaurice  &  Gray  (1989)  and M/s  International 

Biochemical Ltd., Berkshire, U.K, while Polyseed is developed in the USA and approved by the United 

States Environmental Protection Agency (USEPA) (Web page: Polyseed). 

20  

Tryptic Soy Broth was used  to prepare a medium  for this  test which  is also known as Soybean‐

Casein  Digest  Medium.  This  medium  is  recommended  to  use  for  the  tests  for  bacterial 

contamination in cosmetics and blood culture in clinical application (See details in appendix I). OD of 

pure TSB medium was measured as 0.049. 

 

Experimental design- method development

Since  these 2 artificial communities were used  in a new  setting  in  this study,  five  independent 

tests were done under controlled conditions such as temperature and  light (darkness) which were 

recommended  by  the  manufacturer.  In  order  to  have  an  idea  on  growth  rate  of  the  artificial 

communities over a long period of time, the test durations were rather long in initial steps (up to 60 

hours). The  first  three attempts were  conducted with  collaborating with one of  the other master 

student. 

First experiment: An attempt to establish growth rate curve for Artificial bacterial Communities: 

Polyseed and B.O.D.seed 

Due  to  time  limitations  in OD measurements, several  tests were performed  in order  to have a 

fitted  growth  curve  four  bacterial  communities.  The  first  test was  planned  to  be  performed  as 

follow;  Two  capsules  one  each  for  Polyseed  and  B.O.D.seed were  taken  and  the  contents were 

rehydrated in 100 ml of TSB in E‐ flasks with shaking at 150 rpm and incubated for 24 hours at room 

temperature  in  two  different  experimental  set  up,  one with  decanting  the  supernatant  and  one 

without  decanting.  After  24  hours  of  incubation,  the  bacterial  culture  was  re  inoculated  by 

transferring 1ml of the culture to 100 ml of fresh medium for each.  

Further  steps  of  this  experiment  was  the  rehydration  the  contents  of  one  capsule  each  for 

Polyseed and B.O.D.seed with 300ml of TSB medium, along with stirring for 60 minutes (Paixao et al. 

2003, Paixao et al. 2007) followed by the same procedures as mentioned above with one exception; 

adding filtration step to the sample without bran.  

No difference  in growth rate for filtered and unfiltered samples was observed for both Polyseed 

and B.O.D.seed. Therefore, only the decanting step was recommended for the further experiments. 

In addition, the presence of the bran could inhibit the growth in Polyseed and stimulate the growth 

in B.O.D.seed, but only  in exponential phase, which means both could reach  the same ODs  in the 

stationary  phase.  This  could  be  correlated  that  with  difference  in  particle  size  of  the  bran;  as 

Polyseed  contained  larger  bran  particles  than  B.O.D.seed.  Both  could  reach  the  stationary  phase 

after  approximately  55  hours  after  inoculation.  This  test  also  indicated  higher  growth  rate  for 

B.O.D.seed compared to Polyseed. 

21  

 

Second experiment:  an  assay  to  investigate  the  growth  rate of Polyseed with Ciprofloxacin  in 

three different proportions of the culture and the growth medium 

The contents of one capsule of Polyseed were rehydrated with 300ml of TSB medium, along with 

stirring for 60 minutes. The solution was allowed to stand for 15 minutes to let the bran settle down. 

The suspension was then re‐inoculated in three different proportions namely, 1:99, 5:95 and 10:90 

using fresh TSB medium (1, 5 and 10 parts of culture of Polyseed, respectively in 99, 95 and 90 parts 

of medium)  for  the controls. These  three proportions were exposed  to different concentration of 

Ciprofloxacin; 1, 10, 100 and 1000nmol/L. All the three parts of the bacterial suspensions were kept 

at 150 rpm at the room temperature (23°C) throughout the assay. For all the three proportions, the 

measurement  of  three  endpoints  namely,  Optical  densities,  Cell  count  by  Flow  cytometer  and 

Bacterial Respiration by Optodes were done.  

According to the growth rate curves of these tests, 1:99 proportion was considered as a proper 

proportion  for  the  further  tests.  The  delayed  growth was  observed  in  1000nM  samples,  due  to 

succession in bacterial communities. 

Unfortunately, results from the respiration rate measurements were not reasonable.  

The cell counts and observation of cell size were done by Flow cytometer at 1 hour only for the 

controls belonging to different proportions, and at 16, 21, 40 and 44 hours after re‐inoculation. The 

last measurement was done only  for 1000nmol/L  treatment as  it was  the only growing sample at 

that time. The cell sizes were different from the initial stage (bigger cells, R3 cluster) to the last stage 

at 40 and 44 hours  (smaller cells, R4 cluster) only  in  the controls. This should be mentioned here 

that in 1000 nmol/L treatments with the delayed growth the present cells belong to the R3 cluster. 

So Ciprofloxacin could affect the smaller bacteria. 

Third experiment:  an  attempt  to  indicate  the  effect  of  Ciprofloxacin  on  Polyseed in  1:99 proportion  

The experimental set up was the same as the second experiment except the proportion that 1:99 

was selected to further tests and the bacterial community were exposed to Ciprofloxacin in 10, 100 

and 1000 nmol/L. To fill the gap  in growth rate of the bacteria, the OD values of the controls were 

measured at different  time compared  to  the previous experiment. The growth curves were  fitted 

fine with  the  new  data  from  this  test.  The  variations  between  the OD  values were  too  high  in 

controls and the treatments in the later stages at 50 to 55 hours after inoculation.  

The respiration rates also were measured  in  later stages of  the experiment. The  reason was to 

confirm the growth and metabolic activity in the exposed community to higher concentration of the 

22  

toxicant were delayed. The outcomes were similar to the previous test such no good results were 

observed from respiration measurements. 

To have a  look on the cell size distribution of  the community  in  initial stage, surprisingly,  there 

was only one cluster (R4, bigger cells) in all the controls. Both R3 and R4clusters were also observed 

in all the controls and the lowest treatments (10 nmol/L) at the middle stages of the experiment (33 

hours); while  the  R3  cluster  disappeared  from  all  the  samples  at  53  hours.  These  finding were 

concordant  to  the  previous  experiment.  But  an  important  point  to mention  is  that  these  two 

different types of clusters at one hour after  inoculation could not be  identified  in this experiment. 

The result of the cell count also demonstrated that the growth was delayed in higher concentration 

compared to the lower concentrations and the controls.  

Forth experiment: an assay to obtain growth behaviour of Polyseed in 1:99 proportions in three 

replicates 

To investigate the behaviour of the capsules from one brand the next experiment was performed 

at  the  same  set  up  with  previous  test  in  triplicates  of  Polyseed  in  23°C  at  150  rpm.  The 

measurements  were  from  20  hours  after  inoculation  followed  by  hourly measurement  until  30 

hours.  

The data from OD measurements and respiration rates did not provide any reliable data. The cell 

counts which were done at 33 hours after  inoculation also presented high variation between  the 

three  capsules.  Since  all  the  conditions were  the  same  for  all  the  replicates,  the  cause  of  this 

variation was unknown. 

Fifth experiment: impact of volume of the samples in scintillation vials on growth rate 

Since scintillation vial is more convenient to manage and due to several practical limitations such 

as  limited  number  of  replicates  in  bigger  container  on  the  shakers,  the  test  was  performed  in 

scintillation vials. Since it was required to decide about the volume of the bacterial suspension and 

investigate whether the volume had effect on the growth rate, the  test was run  in  three different 

volumes of bacterial suspension, namely 5, 10 and 15 ml in proportion of 1:99 at 350 rpm under the 

incubator at 21°C. B.O.D.seed capsules were selected for the upcoming tests. The longer exponential 

phase  (up  to 60 hours) was observed  for  this assay  that might be due  to  the  lower  temperature 

compared to the earlier tests. Lower growth was observed in 15 ml samples compared to 10 and 5 

ml, due to smaller surface in the higher volume to transfer the air through the liquid. Due to limited 

volume of bacterial suspension for sampling in 5 ml samples, volume of 10 ml was selected for the 

upcoming tests.  

Since  the bacteria  should be  in exponential phase  to be exposed,  it was  required  to know  the 

growth  curve  of  the  bacterial  community  prior  to  perform  another  assay.  To  determine  the  test 

23  

duration, two further experiments were performed on B.O.D.seed with the same set up mentioned 

above on the shaker under the incubator at 21°C.  

According to the data from these two assays the bacteria started to grow approximately at 24 to 

26 hours after inoculation and were growing up to 42 to 44 hours after inoculation. Then 36 and 44 

hours  after  inoculation  were  selected  as  the  test  durations  of  the  toxicity  tests  in  artificial 

communities’ bioassays.  

Conclusion of method development tests:  

B.O.D.seed has higher  reproducibility  (Manoharan A. Et al, 2000). This  fact was confirmed with 

results of the developing tests as well.   Thus, B.O.D.seed  in the TSB medium  in scintillation vials  in 

volume of 10 ml and in 1:99 proportion at 350 rpm at 21°C was selected to perform further tests.  

One hour after  inoculation (the procedures described above) exposure was done  in 3 replicates 

for each treatment and 6 untreated controls.  

The  first  OD  measurement  was  36  hours  after  exposure  time  followed  by  the  second 

measurement at 44 hours after exposure time. 

The  final  outcomes  were  concentration‐response  curves  for  each  antibiotic  and  3  mixture 

scenarios at 36 hours after inoculation. The reason of this decision was decreasing the effects during 

longer periods of time (44hours) in community level due to succession. 

 

Limnic periphyton community test (Swift):

The  Swift  test  is  a  bioassay  to  assess  the  effects  of  toxicants  on  succession  in  periphyton 

community.   From physiological to structural changes could be studied as a response of periphyton 

communities to the toxicant (Porsbring T. Et al, 2007).  

Four  independent Swift  tests were conducted  in a small stream at  the university research area 

(Landvetter) during summer 2012.  

Small round glass discs (1.5 cm2) on polyethylene sampling racks were used to have biofilms of 

periphyton communities. After 7 to 9 days of submerging of racks contained 170 discs each  in the 

river at  the depth of 30  cm,  the visible biofilms were established. Those glasses were washed  in 

nitric acid and  rinsed with distilled water prior  to use. Before putting  in  the  river,  the  racks were 

immersed in 70% ethanol for 5 minutes.  

Two test media were used in these tests, test medium and Z8 medium (See Details in appendix I). 

The test medium was used to expose Priphyton to the toxicants with using filtered river water. Z8 

24  

medium was used  to expose only  the bacterial part of periphyton with using milli‐Q water. Both 

media were enriched with nutrients,  in order to have higher net production rate and phototrophic 

succession in microbial communities (Porsbring T., 2009).  

The river water were collected, filtered and stored in the dark chamber room at 4°C from one day 

before each test. The filtration step was due to remove the other macro organisms or particles such 

as phytoplankton which could use microorganisms as a food supply. Two different filters were used; 

GF/D (pore size 2.7µm) and GF/F (pore size 0.7µm).  

Preparations of the test media and dilution series were done daily and 24 hours prior to use. The 

dilution  series were prepared using  test medium  in 300ml bottles  stored  in  the  thermo‐constant 

room, with 2 replicates for each treatment and four untreated controls. 

The  biofilms  were  transported  to  the  lab  in  a  black  plastic  container  filled with  river  water 

protected from light. The biofilms with damaged parts or with additional organisms were discarded. 

Those with the same and healthy appearance were sorted. Eight discs per treatment were taken and 

distributed into quadrangular glass containers (10×10×5 cm) with 200 ml of the test medium.   

 The  incubation time of the experiment was 4 days while the test medium was replaced by the 

fresh medium daily.  The  glass  containers were  located on  a  shaker  (72  spm)  in  thermo‐constant 

room with the ambient temperature (14‐18°C). 

At the fourth day of incubation, 3 discs for each treatment were sampled in dilution series of the 

toxicants  in  20  ml  of  Z8  medium  in  scintillation  vials.  The  pH  value  of  Z8  medium  was  set 

corresponding  to  the pH of  the  river water  (approximately 7).  In order  to  take  the entire biofilms 

from the surface of the discs, the samples were sonificated using a sonification bath and then were 

filtered  by  paper  tissue  and  distributed  by  multi‐channel  pipette  in  Biolog©Ecoplates  for  each 

treatment.  

The measurements were  done  from  24  hours  followed  by  42,  48,  66,  72  and  96  hours  after 

preparation of the Ecoplates.  

Due to presence of the toxicant, different wells in Ecoplate develop purple colour with different 

intensities.  These  variations  might  be  consequences  of  physiological  changes  (ability  of  the 

community to utilize different carbon sources) or structural changes (different species composition).  

After correcting the values from 700 and 595 nM wave length (AbsDye=Abs595 –Abs700) for each well, 

average  of  the wells which  contain  only water were  calculated  namely AbsDye  C1.  This  value was 

needed to correct the absorbance of each well (Abscorr = AbsDye‐AbsDye C1). Then, average well colour 

developments of each Ecoplate were calculated by summarizing all the ABscorr   and dividing by 96.  

The  concentration  response  curves were prepared based on average well  colour development of 

each Ecoplate compared to the untreated controls.  

25  

Data treatment:

Calculation of the growth inhibition rate:

In single species and artificial community tests,  inhibition rates of the exposed treatments were 

calculated by using the OD values of the samples in following equation: 

I 100

(eq 3) 

Where I is inhibition rate in percentage, BC is average of the ODs of the controls at the end of the 

test, Bn is average of the ODs of each treatments and B0 is the initial OD of the controls at time 0. 

After calculating  the  inhibition  rates  these values were used  to plot  the  inhibition  rates versus 

tested concentrations for each test. 

Calculation of ECx values:

To determine the toxicity of a substance several parameter might be considered such as EC1 and 

EC50  values.  Since  the  concentration‐response  curves  are  not  symmetric  in  ECx  values 

(concentration of the substances which provoke x% of effect), it is needed to have a fitted curve. To 

achieve this purpose there are different models to fit the curve, such as Probit, Weibull and Logistic. 

The Weibull model  is  the most  common used model, based on  their advantage  compared  to  the 

classic Probit model (Backhaus T., 2008, book chapter, p271) which is formulated as: 

E conc 1‐exp exp 10  

(eq 4) 

E(conc) denotes the effect from a certain concentration.  

With applying the raw data (concentrations and inhibition rates) to a software named Nonlinear 

Regression and curve fitting (available to download from webpage: http://www.nlreg.com/), a and b 

parameters of the curve were calculated. Then with using these two parameters, the fitted curves 

were plotted in excel sheets. The exact ECx values could be derived from these fitted curves.  

These  ECx  values  in  addition  to  the  fraction  of  each  substance were  used  in  CA model  (see 

Equation 1). Then ECxmix were calculated which provided  required data  to plot  the CA predictive 

curve.  

26  

To prepare IA predictive curve, molar amount of each compound in the mixture were calculated 

using the predicted concentrations in CA and the fraction of each substance. Then, single substance 

effect which are needed for IA model, were calculated for each substance with using a and b values. 

According to the IA formula, estimated mixture effects were then calculated. Thus, the IA predictive 

curve was plotted with using the estimated mixture effects versus mixture effect concentration. 

At  last  three different  curves were prepared; CA  and  IA predictive  curves  and  the  curve  from 

experimental  observations. A  comparison  between  these  three  curves was  done  to  evaluate  the 

predictability of these two predictive concepts. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

27  

Results: In  three  tested  biological  levels,  the  complexity  was  increased  from  single  species  assay  to 

artificial  community which  contains  only  the  bacteria  to  natural  communities which  contain  the 

other groups of organisms such as fungi and algae.  

Overall,  the  toxicants  had  inhibition  effect  on  growth  of  the  exposed  bacteria.  In  some  cases 

increasing  in bacterial activities observed, which  is  indicated  in  these  tests as a stimulating effect. 

Despite this fact, the shapes of the curves were fine. 

 

Control experiment:

Since high variation between growth rates of the controls and stimulating effect of some of the 

toxicant were observed in Pseudomonas putida bioassay in initial steps, one test with all the controls 

was done. This experiment was performed in order to investigate whether the bacteria could growth 

with the same rate and whether the stimulation  in growth  is a side effect of experimental set up. 

The test was run in 24 samples which were distributed in 2 shakers. Higher turbidity were observed 

on the samples  located on one shaker which the reason might be higher temperature or different 

speed of shaking  that could  lead  to higher growth. Thus,  for all  further experiments,  the samples 

were located on one shaker. The results are shown in figure 5.  

 

Figure 5: Optical density of the samples in the control experiment.

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

Op

tica

l Den

sity

The controls in 24 Scintilation vials

Ods of the controls

28  

Single substance tests in Pseudomonas putida:

For  Trimethoprim,  Sulfamethoxazole  and  Ofloxacin,  the  tests  were  performed  with  bacterial 

suspension which the controls grew at different rates with 10 to 20 percent variation during March 

to May 2012.    For  the  rest of  the  substances, most of  the  tests were performed  in October and 

November 2012. In these recent tests the variation of growth of the controls were relatively higher 

compared  to  the  earlier  experiments.  In  addition  the  growth  rates  of  the  controls  in  these 

experiments were also lower. Since all the conditions were similar, the only possibility might be the 

temperature which was not constant  in  the  lab  from May  to Oct. This variation  in growth  rate of 

bacterial suspension had effect on toxicity which led to higher or lower toxicity of a substance. 

Since Ciprofloxacin was the most toxic substance to Pseudomonas putida, the result of toxic test 

of this substance is presented as a representative concentration‐response curve of tested antibiotics 

in Figure 6. 

 

Figure 6: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Ciprofloxacin.

The concentration‐response curves of 6 other tested antibiotics are presented in appendix II.  

Since  Pseudomonas  putida  seems  to  be  comparatively  tolerant  to  Trimethoprim  and 

Sulfamethoxazole compared to the other tested antibiotics, the comparative results of these 2 tests 

are shown in figure 7.  

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.1 1 10 100

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Ciprofloxacin

Observations

Controls

29  

 

Figure 7: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Trimethoprim and

Sulfamethoxazole.

In order to compare the toxicity in single substance exposure, the concentration‐response curves 

are indicated in one figure (Fig 8). 

 

Figure 8: Growth inhibition of Pseudomonas putida caused by seven tested antibiotics.

Comparative data on EC1 and EC50  values  from Weibull  fit model  for each  substance and  the 

effluent concentrations are presented  in Table 3. This  table  indicates  that all  the components are 

present in lower than EC1 (considered for single species bioassay) in the effluents of three STPs. 

 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06 1.E+07

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Sulfamethoxazole

Trimethoprim

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000 10000 100000 1000000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Ciprofloxacin

Norfloxacin

Ofloxacin

Enoxacin

Lomefloxacin

Sulfamethoxazole

Trimethoprim

30  

Table 3: Toxicity of the tested antibiotics to Pseudomonas putida (EC1 and EC50), compared to

effluent concentrations

Substance Effluent conc (Sweden,

nmol/L) 

Effluent conc (Italy,

nmol/L)

Effluent conc (France,nmol/L)

EC1 (nmol/L)

EC50(nmol/L)

Ciprofloxacin 0.09  0.21 0.18 7  35Norfloxacin 0.09  0.22 0.25 52  205Ofloxacin 0.33  1.61 1.41 89  340Enoxacin 0.03  0.09 0.03 70  390Lomefloxacin 0.37  0.91 0.54 120  495Sulfamethoxazole 0.08  0.04 0.28 <10000  49 500Trimethoprim 0.17  0.14 0.07 <10000  260 000

 Given are  the EC1 and EC50 values according  to  the Weibull  fit  (for parameter estimates see 

table 1, appendix II). Effluent concentrations from Andreozzi et al. (2002) 

Mixture toxicity tests of antibiotics in Pseudomonas putida:

In  this  step  at  least  2  independent  experiments  were  conducted  for  each mixture  scenario.  

Comparative data are shown in Figure 9.  

 

Figure 9: Growth inhibition of Pseudomonas putida caused by 3 mixture scenarios.

Higher toxicities were observed for Italian and French mixtures which the effect started at lower 

dilution  factor  compared  to  the  Swedish  mixture  of  antibiotics.  Italian  and  French  Scenarios 

followed almost similar pattern with almost similar EC50s, while distinction between  the  first two 

curves and Swedish mixture curve gradually decreased in higher dilution factors. Unexpectedly, 99% 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Dilution factor

Swedish mixture

italian mixture

French mixture

31  

effect was at lower dilution factor in Swedish scenario while 1% effect observed at relatively higher 

dilution factor compared to the other mixture scenarios. This might be due to different ratio of the 

substances  in three mixture scenarios. For instance, the concentration of Trimethoprim was higher 

in  Swedish mixture  while  Lomefloxacin  was  present  in  the mixture  of  the  antibiotics  at  higher 

concentration in Italian mixture. Depending on the ratio (fraction) of the substances in the mixture, 

this variation might be observed. 

All the three mixture scenarios of the antibiotics provoked stimulating effect in the lower ranges. 

The reason might be different time of the year and different growth rates, due to temperature which 

the stimulating effect occurred in the samples with higher growth rates. 

A comparative data for the different mixture scenarios are shown in Table 4.   

Table 4: Toxicity of three mixtures of antibiotics to Pseudomonas putida (EC1, EC50 and E99)

Mixture scenario EC1 EC50 EC99

Italian 7  91  290 French 4  91  374 Swedish 56  160  253 

Concentration given as the dilution factor in relation to the effluent concentration from Andreozzi 

et al. (2002). Given are the EC1, EC50 and EC99 values according to the Weibull fit (for parameter 

estimates see table 2, appendix II). 

 

Impact of non-antibiotic pharmaceuticals present in the effluents:

According  to Andreozzi  et  al., 2002,  14 non  antibiotic pharmaceuticals were  detected  in  the 

effluents in the effluent of STPs in Europe (Tab 2). Though, one further experiment was conducted 

due to investigating whether presence of those pharmaceuticals has effect on toxicity of mixtures 

of the antibiotics. The experimental set up were the same as previous experiments in mixture test. 

The  results  have  been  shown  in  3  oncoming  figures  for  Swedish,  Italian  and  French mixtures 

scenarios (Fig 10, 11 and 12).  

32  

 

Figure 10: Growth inhibition of Pseudomonas putida caused by Swedish mixture of antibiotics

including non‐antibiotic pharmaceuticals present in the effluents. Concentration given as the 

dilution factor in relation to the effluent concentration (i.e. 1= effluent concentration) 

In Swedish mixture (Fig. 10) a curve with lower slope was derived from the experiment with all 

the pharmaceuticals compared to the curve from the test contained only antibiotic. Therefore, the 

effect started very earlier  in  the  test with all the pharmaceuticals which  followed by  lower EC50 

value (from 160 to 110 in dilution factor of effluents concentration).  

Lower  steepness was also observed which  indicated higher  toxicity  for  the mixture of all  the 

pharmaceuticals in in Swedish mixture scenario.  

 

Figure 11: Growth inhibition of Pseudomonas putida caused by Italian mixture of antibiotics

including non‐antibiotic pharmaceuticals present in the effluents. Concentration given as the 

dilution factor in relation to the effluent concentration (i.e. 1= effluent concentration)

‐40%

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in Sweden

only antibiotc mixture

Observations (onlyantibiotics)with the other pharmas

Observations with the otherpharmas

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in Italy

only antibiotics mixture

Observations (onlyantibiotics mixture)with the other pharmas

Observations with the otherpharmas

33  

In Italian mixture (Fig. 11) the curve was too steep which the data between dilution factors of 10 

and 100  were less identical (the effect is approximately 1% in dilution factor of ten and 91% in the 

next). The EC50 values did not change in this experiment, but this data is not reasonable due to the 

lack of data mentioned above. Overall, no systematic differences were observed  in the toxicity of 

Italian mixture scenario with presence of non‐antibiotics pharmaceuticals.   

 

Figure 12: Growth inhibition of Pseudomonas putida caused by French mixture of antibiotics

including non‐antibiotic pharmaceuticals present in the effluents. Concentration given as the 

dilution factor in relation to the effluent concentration (i.e. 1= effluent concentration)

In French mixture  (Fig. 12), presence of  the non‐antibiotics  increased  the  toxicity which EC50 

value shifted from 91 to 53 in dilution factor of effluents concentration.  

Although non‐antibiotics specifically could not have any impact on bacteria; the reason of these 

shifts are still unknown. These observed changes  in Swedish and French mixture scenarios might 

be  related  (dependent)  to  the  fraction  of  each  substance  in  the  mixture.  Presence  of  the 

pharmaceutical from other therapeutic classes also might cause some changes in water chemistry, 

or might lead to some changes in bioavailability of the substances.  

 

Single substance tests in B.O.D.seed artificial community:

At  least  two  independent experiments were done  for each  substance. Overall,  comparatively 

higher variations were observed in the community level tests compared to single species tests.  As 

mentioned earlier, in some cases increasing in bacterial activities might be observed, due to their 

ability to intensify nitrification which is regarded as a stimulating effect in these tests. 

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in France

only the antibiotics

Observations (only theantibiotics)

with the other pharmas

Observations with the otherpharmas

34  

Ciprofloxacin  was  also  the most  toxic  substance  to  B.O.D.seed.  The  concentration‐response 

curve of this substance is presented in figure 13. 

 

Figure 13: Growth inhibition of B.O.D.seed caused by Ciprofloxacin.

The concentration‐response curves of 6 other tested antibiotics are presented in appendix II.  

As already  lower  toxicities  for Trimethoprim and Sulfamethoxazole observed  in  single  species 

tests,  bacteria  in  B.O.D.seed  artificial  community  were  also  relatively  resistant  to  these  two 

toxicants compared to the other tested antibiotics. The results are shown in Figure14. 

 

Figure 14: Growth inhibition of B.O.D.seed caused by Trimethoprim and Sulfamethoxazole.

Comparative data on toxicity of tested antibiotics to B.O.D.seed are presented in Figure 15. 

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.01 0.1 1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Ciprofloxacin

Observations

Controls

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1.E+04 1.E+05 1.E+06

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Sulfamethoxazole

Trimethoprim

35  

 

Figure 15: Growth inhibition of B.O.D.seed caused by seven tested antibiotics.

Comparative data are presented  in Table 5. This  table also  indicates  that all  the  toxicants are 

present in lower than their EC1 (considered for B.O.D.seed artificial community) in the effluents of 

STPs. 

Table 5: Toxicity of the tested antibiotics to B.O.D.seed artificial community (EC1 and EC50),

compared to effluent concentrations 

Substance Effluent conc. (Sweden, nmol/L) 

Effluent conc.(Italy,

nmol/L)

Effluent conc.(France, nmol/L)

EC1 (nmol/L)

EC50(nmol/L)

Ciprofloxacin 0.09  0.21 0.18 45  57

Ofloxacin 0.33  1.61 1.41 38  123

Lomefloxacin 0.37  0.91 0.54 97  250

Enoxacin 0.03  0.09 0.03 230  410

Norfloxacin 0.09  0.22 0.25 185  425

Sulfamethoxazole 0.08  0.04 0.28 93 000  152 000

Trimethoprim 0.17  0.14 0.07 63 000  366 000

   Given are  the EC50 and EC1 values according  to  the Weibull  fit  (for parameter estimates  see 

table 1, appendix II). Effluent concentrations from Andreozzi et al. (2002) 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

10 100 1000 10000 100000 1000000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Ciprofloxacin

Ofloxacin

Lomefloxacin

Enoxacin

Norfloxacin

Sulfamethoxazole

Trimethoprim

36  

Mixture toxicity tests of antibiotics in B.O.D.seed artificial community:

The mixture  toxicity  tests were  also  conducted  in  three mixture  scenarios  in  this  study.  The 

comparative results of mixture  toxicity tests  for B.O.D.seed artificial community are presented  in 

Figure 16. 

 

Figure 16: Growth inhibition of B.O.D.seed caused by three mixtures Scenarios.

Higher  toxicities  were  observed  for  Italian  and  French  mixtures  with  relatively  lower  EC1s 

compared  to  the  Swedish mixture  of  antibiotics.  Italian  and  French mixture  scenarios  followed 

different  pattern  such  distinction  between  the  two  curves  gradually  increased.  An  obvious 

interspace was also observed between Swedish mixture curve and the first two mixture scenarios’ 

curves.  

According  to  the  data  in  Figure  16,  toxicity  of  the  selected mixtures  in  B.O.D.seed  artificial 

community could be sorted as: 

Italy > France > Sweden  

A comparative data (Tab 6) is presented to illustrate the toxicity of the mixture of antibiotics in 

B.O.D.seed which indicates that effects start at 9 to 60 dilution factor of effluent concentrations.  

 

 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Dilution factor

Swedish mixture

Italian mixture

French mixture

37  

Table 6: Toxicity of three mixtures of antibiotics to B.O.D.seed (EC1, EC50 and EC99)

Mixture scenario EC1 EC50 EC99

Italian 15  42  57 

French 9  60  105 

Swedish 60  160  210 

Concentration  given  as  the  dilution  factor  in  relation  to  the  effluent  concentration  from 

Andreozzi et al. (2002). Given are the EC1, EC50 and EC99 values according to the Weibull fit (for 

parameter estimates see table 2, appendix II). 

B.O.D.seed  artificial  community  followed  different  mixture  toxicity  patterns  compared  to 

Pseudomonas putida bioassay. In order to compare the toxicities of three mixtures of antibiotics in 

two bioassays, comparative data are presented in Table 7.  

Table 7: Compared toxicity of three mixtures of antibiotics to Pseudomonas  putida and

B.O.D.seed artificial community (EC50)

Mixture scenarios Pseudomonas putida B.O.D.seed artificial community

Italian 91  42 

French 91  60 

Swedish 160  160 

  Concentration  given  as  the  dilution  factor  in  relation  to  the  effluent  concentration  from 

Andreozzi et al. (2002).  

 

Single substance tests in Limnic periphyton bacterial communities:

As mentioned  earlier  in materials  and methods,  in  order  to  investigating  the  effect  of  the 

selected antibiotics, Average Well Colour (AWC) development of each plate was considered as an 

endpoint which were measured in Ecoplates by spectrometer at 24, 42, 48, 66, 72, 90 and 96 hours 

after  preparation  of    the  Ecoplates.  Since  it  was  needed  to  consider  test  duration  for  these 

experiments,  a  comparative  data  from  different  periods  of  time  for  one  selected  compound; 

Ciprofloxacin are indicated in Figure 17. 

38  

 

Figure 17: Comparative AWC inhibitions caused by Ciprofloxacin in Limnic periphyton 

community in Ecoplates during 96 hours incubation.

In fact, presented curves indicated the variation between the treatments and the controls. The 

maximum variation obviously decreases during 48 to 90 hours measurements. The reason might 

be earlier start and stop colour development in controls compared to the treatments with delayed 

colour development due to presence of the toxicant. Thus, the variation between the curves of the 

control and the treatments were gradually decreasing in longer periods of time. 

Therefore,  42  hours was  regarded  as  test  duration  to  indicating  the  concentration‐response 

curves for the other compounds. Comparative results are shown in Figure 18. 

 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0.01 0.1 1 10 100 1000

AW

C In

hib

itio

n

Concentration (nmol/L)

42hrs

48 hrs

66 hrs

72 hrs

90 hrs

96 hrs

39  

 

Figure 18: AWC inhibition caused by 4 tested antibiotics in Limnic periphyton community at 42

hours incubation in Ecoplates.

Since the lowest tested concentrations were 0.1 for Ciprofloxacin and 10 nmol/L for three tested 

antibiotics  and  the  observed  effects  at  those  concentrations were  higher  than  1%,  EC1s  of  the 

substances could not be derived from these tests. Comparative data are shown in Table 8. 

Table 8: Toxicity of the tested antibiotics to Limnic periphyton communities (EC1 and EC50),

compared to effluent concentrations

Substance Effluent conc.

(Sweden,

nmol/L)

Effluent conc.

(Italy,

nmol/L)

Effluent conc.

(France,

nmol/L)

EC1

(nmol/L)

EC50

(nmol/L)

Ciprofloxacin 0.09  0.21 0.18 <0.1  33

Norfloxacin 0.09  0.22 0.25 <10  185

Enoxacin 0.03  0.09 0.03 <10  350

Lomefloxacin 0.37  0.91 0.54 <10  1 070

Given are  the EC50 and EC1 values according  to  the Weibull  fit  (for parameter estimates see  table 1, 

appendix II). Effluent concentrations from Andreozzi et al. (2002) 

Two mixture scenarios namely  Italian and French were selected to be performed  in Swift test. 

Unfortunately no reasonable data were derived from those Swift tests.  

 

 

 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

AW

C

Concentration (nmol/L)

Ciprofloxacin

Norfloxacin

Enoxacin

Lomefloxacin

40  

 Compared toxicities of four antibiotics to three different bioassays:

In order  to have a  comparison of  the  toxicity of  tested antibiotics on different bioassay,  four 

oncoming figures are provided (Figure 19, 20, 21 and 22). Overall, Limnoc periphyton community 

was more sensitive. 

 

Figure 19: Comparative data on toxicity of Ciprofloxacin to different bioassays. 

According to the data  in Figure 19, although  low variations were observed for Ciprofloxacin  in 

EC50 values  in three different bioassays, there are relatively high variations in EC1 values. Almost 

similar EC99 were observed in Pseudomonas putida and B.O.D.seed bioassays. Regarding the whole 

curve, highest toxicity for Ciprofloxacin was observed in Limnic periphyton community followed by 

Pseudomonas putida and B.O.D.seed artificial community. 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0.01 0.1 1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration of Ciprofloxacin (nmol/L)

Pseudomonas

Bioseed

Periphyton

41  

 

Figure 20: Comparative data on toxicity of Norfloxacin to different bioassays. 

For Norfloxacin  (Fig  20), highest  toxicity was  also observed  in  Limnic periphyton  community. 

EC50 values were almost similar for Pseudomonas putida and Limnic periphyton community while 

this value was twice  in B.O.D.seed bioassay. High variations were also observed  in EC1 and EC99 

values in three bioassays.  

 

Figure 21: Comparative data on toxicity of Enoxacin to different bioassays.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Concentration of Norfloxacin (nmol/L)

Pseudomonas

Bioseed

Periphyton

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Concentration of Enoxacin (nmol/L)

Pseudomonas

Bioseed

Periphyton

42  

In Enoxacin tests (Fig21), most sensitive bioassay was Limnic periphyton. Lowest variations were 

observed in EC50 values compared to three other substances. Highest steepness was observed in 

B.O.D.seed  which might  be  due  to  the  same  species  sensitivities  to  Enoxacin  in  this  bacterial 

community.  

 

Figure 22: Comparative data on toxicity of Lomefloxacin to different bioassays.

For Lomefloxacin (Fig 22), B.O.D.seed was the most sensitive bioassay followed by Pseudomonas 

putida and Limnic periphyton community. Highest variation in EC values were observed compared 

to three other substances.  

Table 9 indicates the variations in EC1 and EC50 for four individual substances.  

Table 9: Comparative effect concentration of the substances in different bioassays

The bioassay

Substance   Pseudomonas 

putida

B.O.D.seed artificial 

community

Limnic periphyton 

community

Ciprofloxacin EC1  7 45 <0,1

EC50  35 57 33

Norfloxacin EC1  52 185 <10

EC50  205 425 185

Enoxacin EC1  80 230 <10

EC50  450 410 350

Lomefloxacin EC1  120 97 <10

EC50  495 250 1 070

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Concentration of Lomefloxacin (nmol/L)

Pseudomonas

Bioseed

Periphyton

43  

 Given are  the EC1 and EC50 values according  to the Weibull  fit  (for parameter estimates see  table 1, 

appendix II).  Concentrations are in nmol/L. 

 

Predictability of mixture toxicity by CA and IA concepts:

Since  one  of  the Aims  of  this  study was  evaluating  the  predictability  of  CA  and  IA  concept, 

comparative curves have been shown in upcoming figures. The shapes of predicted concentration‐

response curves were reasonable. 

In  all  the  three mixture  tests,  both  CA  and  IA  underestimated  the mixture  toxicity  of  the 

antibiotics.  In addition, these results  illustrated higher predictive power of CA concept compared 

to IA concept.  

 

In Pseudomonas putida bioassay:

Both  concepts  underestimated  the mixture  toxicity  of  tested  antibiotics.  CA  concept  could 

predict  the  toxicity with higher power compared  to  IA concept. The results are shown  in  figures 

presented below (Fig 23, 24 and 25). 

 

Figure 23: Observed and predicted mixture toxicities of Swedish mixture of antibiotics in

Pseudomonas putida.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

10 100 1000

effe

ct

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in Sweden

Treated samples

CA predictive curve

IA predictive curve

44  

In  Swedish mixture  test  (Fig  23),  three  curves  were  almost  similar  in  EC1  value  while  the 

variation  between  observed  and  predicted  EC  values  gradually  increased  in  upper  parts  of  the 

curves. 

 

Figure 24: Observed and predicted mixture toxicities of Italian mixture of antibiotics in

Pseudomonas putida.

 

Figure 25: Observed and predicted mixture toxicities of French mixture of antibiotics in

Pseudomonas putida.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

eff

ect

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in Italy

treated samples

CA predictive curve

IA predictive curve

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

eff

ect

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in France

Treated samples

CA predictive curve

IA predictive curve

45  

In Italian and French mixtures (Fig 24 and 25), higher variations were detected in observed and 

predicted  EC1  values  compared  to  Swedish mixture  test.  In  both mixture  scenarios  CA  could 

predict mixture toxicity more accurately in upper part of the curve. 

To evaluate the predictability of these two concepts, two effect‐concentrations are considered 

to record, EC1 and EC50. Comparative EC1 and EC50s are presented in Table 10. 

Table 10: comparative observed and predicted EC1 and EC50 in mixture tests in Pseudomonas 

putida

EC1 EC50

Mixture

scenario

observed  Predicted 

by CA 

Predicted 

by IA 

observed  Predicted 

by CA 

Predicted 

by IA 

Swedish 55  52  94  155  238  440 

Italian 7  53  101  90  235  478 

French 4  53  101  90  235  453 

   Concentration given as the dilution factor in relation to the effluent concentration 

High variations were observed in predicted and observed EC1 and EC50 values differ by factor of 

1 to 7.6 for the mixture tests, with some exceptions in Italian and French mixture tests (surprisingly 

too high  in EC1 values). Table 11 shows the variation  factors of predicted and observed EC1 and 

EC50 values. 

Table 11: Variation factors of predicted and observed EC1 and EC50 values in Pseudomonas 

putida (Predicted value divided by observed value).

Variation factor

Mixture scenario EC1 predicted 

 by CA 

EC1 predicted 

 by IA 

EC50 predicted 

 by CA 

EC50 predicted 

 by IA 

Swedish 1  1.7  1.5  2,8 

Italian 7.6  14.4  2.6  5.3 

French 13.2  25.2  2.6  5 

   Concentration given as the dilution factor in relation to the effluent concentration 

In B.O.D.seed artificial community bioassay:

In  this bioassay also  IA predicted mixture  toxicity with obvious  lower power compared  to CA 

model. The results are shown in following figures (Fig 26, 27 and 28).  

46  

 

Figure 26: Observed and predicted mixture toxicities of Swedish mixture of antibiotics in

B.O.D.seed.

The observed and predicted curve by CA and IA concepts had similar shapes in Swedish mixture 

test (Fig 26) while CA predicted curve resembled the observation curve very closely. 

 

Figure 27: Observed and predicted mixture toxicities of Italian mixture of antibiotics in

B.O.D.seed.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

10 100 1000

eff

ect

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in Sweden

treated samples

CA predictive curve

IA predictive curve

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

eff

ect

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in Italy

Treated samples

CA predictive curve

IA predictive curve

47  

 

Figure 28: Observed and predicted mixture toxicities of French mixture of antibiotics in

B.O.D.seed.

In  Italian and French mixture tests (Fig 27 and 28), two predictive curves were  located closely 

while predicted  EC1s were rather close and higher variation for EC50s were observed. In these two 

mixture  scenarios,  the  predictive  curves  were  shifted  to  the  right  which  indicated  higher 

underestimations of mixture toxicities by CA and IA concepts compared to Swedish mixture.  

In order  to have an overview on  the mixture  toxicities, comparative EC1 and EC50 values are 

presented in Table 12. 

Table 12: comparative observed and predicted EC1 and EC50 in mixture tests in B.O.D.seed.

EC1 EC50

Mixture

enario

observed  Predicted 

by CA 

Predicted 

by IA 

observed  Predicted 

by CA 

Predicted 

by IA 

Swedish 61  72  126  160  184  390 

Italian 15  55  77  42  150  240 

French 9  55  72  60  150  222 

   Concentration given as the dilution factor in relation to the effluent concentration  

Predicted EC1  and EC50  values were  away  from  the observed  values by  factor of 1.2  to 6.2. 

These data are shown in Table 13. 

 

 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

eff

ect

Dilution factor of antibiotics in STP effluents in France

treated samples

CA predictive curve

IA predictive curve

48  

Table 13: Variation factor of predicted and observed EC1 and EC50 values in B.O.D.seed

(Predicted value divided by observed value).

Variation factor

Mixture

scenario

EC1 predicted  

by CA 

EC1 predicted  

by IA 

EC50 predicted 

 by CA 

EC50 predicted 

 by IA 

Swedish 1.2  2  1.1  2.4 

Italian 3.6  5.1  3.6  5.7 

French 6.2  8  2.5  3.7 

   Concentration given as the dilution factor in relation to the effluent concentration 

The variation  factors  for observed and predicted EC values were between 1.1 and 6.2. These 

variation  factors  for B.O.D.seed were  relatively  lower compared  to Pseudomonas putida mixture 

tests.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

49  

Discussion & Conclusions:

Identifying the most hazardous substance in single exposure and sort those substances in terms of toxicity: According to the data in Figure 8, toxicity of the selected antibiotics in Pseudomonad putida could 

be sorted as: 

Ciprofloxacin  >  Norfloxacin  >  Ofloxacin  >  Enoxacin  >  Lomefloxacin  >  Sulfamethoxazole  > 

Trimethoprim.  

The seven substances were also divided in two groups in terms of toxicity to Pseudomonas putida 

(first  five and  the  last two substances  in Figure 8). The  first  five compounds belong  to Quinolones 

therapeutic class with similar mode of actions, while Trimethoprim and Sulfamethoxazole belong to 

Sulfonamides therapeutic class with similar mode of actions as well (Tab 1). Therefore, the toxicity of 

the individual substance might be mode of action dependent. 

In contrast, the toxicities of tested antibiotics to B.O.D.seed artificial community (Fig 15) could be 

sorted as: 

Ciprofloxacin  >  Ofloxacin  >  Lomefloxacin  >    Enoxacin  >  Norfloxacin  >  Sulfamethoxazole  > 

Trimethoprim.  

In figure 15, the concentration‐response curves of the substances were  located  in two distinct 

groups. As mentioned earlier,  the  reason  for  this pattern would be different mode of  action of 

those substances.  

As a comparison in term of sensitivity presented in Table 3 and 5, the variations in EC50s were 

between  35  to  495  in  Pseudomonas  putida  and  57  to  425  in  B.O.D.seed  for  Quinolones.  For 

Sulfonamides  relatively  similar  pattern  occurred.  These  facts  indicated  lower  toxicity  of  the 

antibiotics  to  B.O.D.seed  artificial  community.  The  main  reason  would  be  different  biological 

complexity. Biodiversity is one of the structural characteristics in the community level (B.O.D.seed) 

which could be regarded from 2 aspects; number of different species and the number of organisms 

of each species which are equally important (Kummerer K., 2009, part II). Biodiversity might lead to 

elasticity and resilience of a bacterial community and consequently lower sensitivity as a response 

to a toxicant. In community level, products of biodegradation of some bacteria could be utilized by 

other  species  in  the  community.  Furthermore  lower  sensitivity might be due  to different media 

which could cause some changes in water chemistry and finally alter bioavailability of the toxicant. 

Casein and Soybean Meal in TSB media used for B.O.D.seed tests might cause lower bioavailability 

of the toxicant.  

50  

According  to  the  data  on  Figure  18,  toxicity  of  the  selected  antibiotics  in  limnic  periphyton 

communities could be sorted as: 

Ciprofloxacin > Norfloxacin > Enoxacin > Lomefloxacin.  

The orders of  toxicities were non‐similar  to  three bioassays. The probable  reason behind  this 

finding might  be  different  species  sensitivity  in  two  communities’  bioassays. Different  order  of 

toxicity also seems to be substances dependent.   

 

Investigating the joint toxicity of seven antibiotics:

The  results of mixture  tests  shown  in Table 7  (regarding EC50s)  illustrated higher  toxicity  for 

Italian and French mixture scenarios to B.O.D.seed artificial community compared to Pseudomonas 

putida bioassay. The toxicities were almost similar in Swedish mixture scenario for both bioassays. 

Since antibiotics are not similarly toxic to different bacteria in community level, in addition to the 

factors  in  community  test  mentioned  above  (in  single  substance  exposure  discussion),  these 

variations might be dependent to the fraction (ratio) of the substances in different mixtures. 

 

Analysing whether the mixture of antibiotics identified in the STPs effluents are toxic to bacteria.

According to the data from Table 4 and 6, the effects start at 4 to 56 dilution  factor of effluent 

concentration of  antibiotics  in Pseudomonas  putida.  For B.O.D.seed  artificial  community  also  the 

effects start at 9 to 60 dilution factor of effluents concentrations of antibiotics. These observations 

indicated  the mixture at  the concentration at which  it  is present  in  the  selected effluents had no 

visible effect. Thus, mixture of antibiotics at  their  concentration  in natural environment  (which  is 

substantially  lower than their concentrations in the STPs effluents) has no  impact on bacteria. This 

should be pointed out here, no visible effect does not mean there is no effect in reality. 

In addition, bacterial parts of the community in natural environment are most sensitive parts to 

antibiotics.  No  adverse  effect  would  be  considered  for  non‐bacterial  parts  of  the  natural 

communities which  are  less  sensitive  compared  to microorganisms. Thus  there  is no  concern  for 

multi‐cellular organisms from higher classification classes including invertebrates and fish in term of 

mixture toxicity of tested antibiotics. 

 

 

51  

Evaluating the performance of CA and IA concepts:

According to the results shown in Figure 23 to 28, both CA and IA underestimated the mixture 

toxicities of the antibiotics to Pseudomonas putida and B.O.D.seed artificial community bioassays. 

In  addition,  these  results  illustrated  higher  predictive  power  of  CA  concept  compared  to  IA 

concept.  

Overall, the variation factors in predicted and observed EC values presented in Table 11 and 13, 

both  CA  and  IA  concept  could  predict  the  joint  toxicity more  accurately  in  B.O.D.seed  artificial 

community compared to Pseudomonas putida bioassay. 

 

Compared toxicities of four antibiotics to three different bioassays:

According  to  the  result  shown  in  Figure  19  to  22,  the  concentration  response  curves were 

different in steepness. Limnic periphyton community was the most sensitive bioassay with shallow 

curve  compared  to  the  other  bioassays.  The  reason  of  this  finding might  be  different  species 

sensitivities  in  limnic  periphyton  community.  The  concentration  response  curves  of  B.O.D.seed 

community were steeper compared to  limnic periphyton that  indicated  likely similar sensitivity of 

species in this artificial community which low changes in concentration could provoke high effect.   

Furthermore some variations in EC50 values were observed for each substance shown in Table 

9. Therefore conducting different bioassays with different endpoints are required to calculate EC50 

value for a particular substance. In addition, selecting a bioassay as a proper test to determine the 

toxicity of a substance is unenviable.  

Furthermore, in Enoxaicn test relatively high variations were observed in EC1 values while EC50s 

were almost similar in three different bioassays. This means calculating EC50 provides inadequate 

data  in  ecotoxicological  tests.  Hence,  looking  at  the  whole  concentration  response  curve  is 

essential in order to determine the toxicity of a substance. 

Different sensitivity  in different biological  level (single species and community) were observed 

which  B.O.D.seed  was  more  sensitive  to  Lomefloxacin,  less  sensitive  to  Norfloxacin  and 

Ciprofloxacin  and  almost  similar  in  sensitivity  to  Enoxacin  compared  to  single  species  bioassay. 

These variations might be substance dependent.  

 

 

 

52  

Further directions:

The  current  study  focuses  on  bacterial  parts  of  the  natural  communities  in  limnic water  and 

specifically antibiotics as a sub group of pharmaceuticals at their concentration  in the effluents of 

STPs. According to the data in Figure 10, which lower EC1 and EC50 values observed in the mixture 

test  with  all  pharmaceutical  present  in  the  STPs  effluents,  presence  of  all  different  kind  of 

pharmaceuticals  should  be  taken  in  to  the  account  in  estimating  the  mixture  toxicity  of  the 

antibiotics. 

Moreover,  the  results  of  the  mixture  tests  are  valid  only  for  the  current  mixture  of  the 

substances. Therefore presence of the other chemicals in limnic water such as non‐antibiotics sub 

group of pharmaceuticals, heavy metals and biocides should be taken in to the account in further 

investigations.  In addition, the other form of pharmaceuticals should also be considered, such as 

metabolites and transformation products.   

These  three aspects should be also  taken  in  to  the account: antibiotics' development, handling 

and waste water management.  Thus,  active  ingredients  of  pharmaceuticals  should  be  designed 

optimistically for efficiency in human body as well as their degradability  in water compartments of 

the environment. In drug handling, the environmental aspects should be considered by changing in 

prescription and disposal of the pharmaceuticals.   

The environmental risk classification and environmental risk assessment of pharmaceuticals have 

been provided  in Stockholm County Council and confirms that to have such a scheme  is beneficial 

for patients and professionals’ health.  (EEA Technical  report, 2010, P5&8) The  final aims of  these 

considerations  might  be  increasing  public  awareness  and  improving  the  prescription  of  the 

pharmaceuticals. 

 

Acknowledgments: I would  like to thank my colleagues, head of the lab for kindly providing peaceful environment 

and everybody who contribute to the performance of this study.   

I  am  also  grateful  to my  supervisors,  Thomas  Backhaus  and  Åsa  Arrhenius  for  the  helpful 

comments that improved this manuscript. 

 

 

 

53  

References:

Andreozzi  R.,  Raffaele M., Nicklas  P.,  (2002),  Pharmaceuticals  in  STP  effluents  and  their  solar 

photodegradation in aquatic environment, Chemosphere, vol 50, p 1319‐1330. 

Backhaus T., Karlsson M.,  (2013), Screening  level mixture  risk assessment of pharmaceuticals  in 

STP effluents, Water Research, submitted for publication. 

Backhaus T., Sumpter J., Blank H., 2008, Pharmaceuticals in the environment (main author Klaus 

Kummerer) Chap 16: On the ecotoxicology of pharmaceuticals mixtures, p263‐282. 

Boxall Alistair  B.A.,  (2004),  The  environmental  side  effects  of Medication,  European Molecular 

biology organisation report, vol 5, num 12, p 1110‐1116.  

Brosche S., Backhaus T.,  (2010), Toxicity of  five protein synthesis  inhibiting antibiotics and  their 

mixture to limnic bacterial communities, Aquatic toxicology, vol 99, p457‐465. 

Ciprofloxacin:  http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi‐bin/sis/search/r?dbs+hsdb:@term+@rn+85721‐33‐1  (8 

March 2013) 

Enoxacin: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00467 (8 March 2013) 

Espinosa‐Urgel, M., Salido, A., Ramos, J. 2000, Genetic Analysis of Functions Involved in Adhesion 

of Pseudomonas putida to Seeds, Journal Of Bacteriology, May 2000, p. 2363–2369. 

European  Environmental  Agency  Technical  report,  Results  of  an  EEA workshop, No  1,  (2010), 

Pharmaceuticals in the environment  

Interlab instructions for use of Polyseed for BOD analysis. 

ISO 10712, (1995), Water Quality: Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseodomonas cell 

multiplication inhibition test), International Standardization Organization, Geneva, Switzerland.  

Khan E., Sy‐Savane O.,  Jittawattanarat R., (2005), Application of commercial biochemical oxygen 

demand inocula for biodegradable dissolved organic carbon determination, water research 39, p 

4824‐4834. 

Kummerer K., Alexy R., Huttig J., Schöll A., (2004), Standardized tests fail to assess the effects of 

antibiotics  on  environmental  bacteria, Water  Research,  Volume  38,  Issue  8, April  2004,  Pages 

2111‐2116 

Kummerer K., (2009), Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part I. 

54  

Kummerer K., (2009), Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part II. 

Lomefloxacin: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00978 (8 March 2013) 

Manoharan A.,Gangal V., Makhijani S. D., Sharma A., Kumar A., Kumar R., (2000), Validation of the 

use of microbial consortium as  standard seeding material  in BOD determination, Hydobiologia, 

vol:430, p77‐86. 

Norfloxacin: http://www.druglib.com/activeingredient/norfloxacin/ (8 March 2013) 

Paixao S.M.et al., (2002).Alternative  Inocula as Activated Sludge Surrogate Culture for a Toxicity 

Test. Environ Toxicol. 18: 37‐44 

Paixao  S.M.et  al.,  (2007).  Assessing Microbial  Communities  for  a Metabolic  Profile  Similar  to 

Activated Sludge. Water Environ. Res., Vol 79, No 5, p536‐546. 

Petchey O.L., Morin P.J., Hulot F.D., Loreau M., McGrady‐Steed J., Naeem S., (2002). Contributions 

of  aquatic model  systems  to  our  understanding  of  biodiversity  and  ecosystem  functioning.  In: 

Loreau, M., Naeem, S.,  Inchausti, P., Biodiversity and Ecosystem Functioning. Oxford University 

Press, Oxford, p. 127  

Polyseed Web page : http://www.polyseed.com/main/polyseed.php  (5 April 2012) 

Porsbring T., (2009), On Toxicant‐Induced Succession in periphyton Communities: Effects of Single 

Chemicals and Chemical Mixtures, PhD thesis, University of Gothenburg. 

Sato K.,  Inoue Y., Fujii T., Aoyama H.,  (1986), Antibacterial activity of ofloxacin and  its mode of 

action , Infection, Volume 14, Issue 4 Supplement, p S226‐S230 

Sigee  D.  C.,  (2005),  Freshwater  Microbiology:  Biodiversity  and  Dynamic  Interactions  of 

Microorganisms  in  the Aquatic Environment, University of Manchester, UK,  John Wiley &  Sons 

Ltd, England 

Sulfamethoxazole:  http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5329  (8 March 

2013)  

TIS  Lab  protocol;  Toxicant  Induced  Succession,  May  2011,  Ecotoxicology  from  an  Ecological 

Perspective course , Gothenburg University.  

Trimethoprim: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5578&loc=ec_rcs (8 March 

2013) 

TSB medium: http://www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7164_PI.pdf (10 March 2013) 

55  

Appendix I

Details of the media

Tryptic Soy Broth (TSB), used B.O.D.seed artificial community test. 

This medium  contains  Enzymatic  Digest  of  Casein  and  Enzymatic  Digest  of  Soybean Meal  as 

nitrogen  sources, Dextrose  as  a  carbon  source, Dipotassium Phosphate  as  a buffering  agent  and 

Sodium Chloride. 30 gr of TSB was dissolved in 1 litre of Milli‐Q water followed by autoclaving and 

stored in the refrigerator. 

30 grams of TSB contains: 

Enzymatic Digest of Casein ................................................. 17.0 g  

Enzymatic Digest of Soybean Meal ....................................... 3.0 g  

Sodium Chloride .................................................................... 5.0 g  

Dipotassium Phosphate ......................................................... 2.5 g  

Dextrose ................................................................................. 2.5 g  

Final pH: 7.3 ± 0.2 at 25°C (Web page: TSB medium) 

Test medium and Z8 medium, used in Limnic periphyton community tests.

Stock one: 

9.34 g NaNO3  

7.12 mL K2HPO4 of a 0.5 M stock solution 

In 100 mL Milli‐Q water 

 

Stock two:  

4.057 mL MgSO4 of a 0.5 M stock solution 

10 mL Ca(NO3)2 of a 0.5 M stock solution 

Resolved in 100 mL Milli‐Q water 

 

Stock three:  

0.5 M NaCO3‐solution 

 

56  

Stock four:  

Micronutrient solution 

compound 

mg/ 

100 mL Milli‐Q Water 

H3BO3  310 

MnSO4 * 4H2O  223 

Na2WO4 * 2 H2O  3.3 

(NH4)6Mo7O24 * 4 H2O  8.8 

KBr  11.9 

KJ  8.3 

ZnSO4 * 7 H2O  28.7 

Cd(NO3)2 * 4 H2O  15.4 

Co(NO3)2 * 6 H2O  14.6 

CuSO4 * 5 H2O  12.5 

NiSO4(NH4)2SO4 * 6 H2O 19.8 

Cr(NO3)3 * 9 H2O  4.1 

VOSO4 * 2 H2O  2 

Al2(SO4)3KSO4 * 24 H2O 47.4 

 

0.5 mL of Stock 1, 0.5 mL of Stock 2, 40 L of Stock 3 and 8 L of Stock 4 were added per litre of Milli‐Q water for Z8 and filtered river water for test solution in Swift test. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

57  

Appendix II

Toxicity of tested antibiotics to Pseudomonas putida in single substance exposure:

Figure 1: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Enoxacin

Figure 2: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Lomefloxacin

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Enoxacin

Controls

Observartions

‐40%

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Lomefloxacin

Controls

Observations

58  

Figure 3: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Norfloxacin

Figure 4: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Ofloxacin

‐40%

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Norfloxacin

Controls

Observations

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Ofloxacin

Controls

Observations

59  

  

Figure 5: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Sulfamethoxazole

Figure 6: Growth Inhibition of Pseudomonas putida caused by Trimethoprim

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1000 10000 100000 1000000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Sulfamethoxazole

Controls

Observations

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1000 10000 100000 1000000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Trimethoprim

Controls

Observations

60  

Toxicity of tested antibiotics to B.O.D.seed in single substance exposure:

 

Figure 7: Growth Inhibition of B.O.D.seed artificial community caused by Enoxacin

 

 

Figure 8: Growth Inhibition of B.O.D.seed artificial community caused by Lomefloxacin

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Enoxacin

Controls

Observations

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

lomefloxacin

Controls

Observations

61  

 

Figure 9: Growth Inhibition of B.O.D.seed artificial community caused by Norfloxacin

 

Figure 10: Growth Inhibition of B.O.D.seed artificial community caused by Ofloxacin

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.1 1 10 100 1000 10000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Norfloxacin

Controls

Observations

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0.1 1 10 100 1000

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Ofloxacin

Controls

Observations

62  

 

Figure 11: Growth Inhibition of B.O.D.seed artificial community caused by Trimethoprim

 

Figure 12: Growth Inhibition of B.O.D.seed artificial community caused by Sulfamethoxazole

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Trimethoprim

Controls

Observations

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06

Inh

ibit

ion

Concentration (nmol/L)

Sulfamethoxazole

Controls

Observations

63  

The parameters of Weibull fit model:

Table 1: a and b parameters in Weibull fit model in single exposure tests.

Pseudomonsas putida B.O.D.seed artificial community

Limnic Periphyon communities

Weibull parameters

a  b a b a  b

Ciprofloxacin ‐9.66  6.01 ‐73.56 41.64 ‐1,67  0,56Norfloxacin ‐16.79  7.09 ‐17.93 8.41 ‐2,69  1,03Ofloxacin ‐18.61  7.21 ‐25.09 10.32 ‐‐  ‐‐Enoxacin ‐15.07  5.67 ‐45.54 17.34 ‐3,63  1,29Lomefloxacin ‐19.11  6.96 ‐29.23 10.87 ‐4,86  1,49Sulfamethoxazole ‐12.16  2.51 ‐105.04 20.26 ‐‐  ‐‐Trimethoprim 12.87  2.31 ‐30.68 5.45 ‐‐  ‐‐

Table 2: a and b parameters in Weibull fit model in mixture tests.

Pseudomonsas putida B.O.D.seed artificial community

Weibull parameters

a b a  b

Swedish mixture ‐21.01 9.41 ‐22.35  9.96

Italian mixture ‐7.75 3.78 ‐15.31  9.20

French mixture ‐6.44 3.10 ‐9.47  5.13