elektroforesis
TRANSCRIPT
-
5/22/2018 elektroforesis
1/11
MODUL BIOLOGI MOLEKULER
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI III
ELEKTROFORESIS
Kelompok 2
Puspa Negara FAA 113 013
Nurul Hidayanti Maharani FAA 113 014
Efraim Said Sudarto FAA 113 015
Dian Triyeni Asi FAA 113 016
Sheren Vinera Lins FAA 113 017
Feromiya Oksa FAA 113 018
Sofia Eugenia Manginte FAA 113 019
Mira Aprilia FAA 113 020
Ismi Sholihah FAA 113 021
Widi Cahya Utami FAA 113 022
Pipin Septiana FAA 113 023
FASILITATOR/TUTOR:
Fatmaria,S.FARM.,APT
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS PALANGKA RAYA
2014
-
5/22/2018 elektroforesis
2/11
I. Pendahuluan1.1 Latar Belakang
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk
hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk
dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis
gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar
tekni kini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik. Dalam hal ini, molekul molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik didalam matriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel
biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
teknik preparatifuntuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-
metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau
immune -blotting yang merupakan metodemetode karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis merupakan prosesbergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung
pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat
digunakan untuk separasi makro molekul( seperti protein dan asam nukleat).
Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atauautoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Molekul DNA atau suatu fragmen DNA yang telah di amplifikasikan dapat
dipisahkan berdasarkan ukuran atau besarnya pasangan basany6a melalui Gel
elektroforesis. Deteksi fragmen DNA tersebut dapat dilakukan dengan cara
mewarnai gel dengan suatu zat yang dapat meng-interkalasi rantai ganda DNA
yaitu, misalnya ethidiumbromida. Metoda pemisahan atau reparasi DNA secara
luar digunakan untuk tujuan analisis molekul DNA atau tujuan preparative.
1.2 Tujuan Praktikum- Melakukan elektroforesis DNA hasil isolasi dari darah vena dan hasil
amplifikasi dengan gel agarosa.
- Melakukan analisis hasil elektroforesis total DNA genom manusia
dan hasil amplifikasi fragmen gen dengan metode PCR.
-
5/22/2018 elektroforesis
3/11
II. Dasar TeoriElektroforesisi DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran9berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan
untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga
20.000 pasang basa(bp) Elektroforesis gel agarosa besarnya digunakan untuk
analisis ukuran dan konpormasi sampel DNA, kualifikasi DNA, pemisahan dan
ekstrasi fragmen DNA.
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga didalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel melalui kutub positif(anoda). Makin besar ukuran
molekulnya makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar(DNA marker) yang telah diketahui
ukurannya.vasualisasi selanjutnya DNA dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah lebih dahulu gel dalam pembuatnya ditambahkan larutan
etidiumbromida atau dengan paparan di atas sinar ultraviolet.
III.Metodologi Praktikum3.1 Waktu Dan Tempat
Praktikum Gel Elektroforesis DNA ini berlangsung pada hari senin,
tanggal 2 Mei 2014 pukul 11.30 - 14.00 WIB diruang praktikum Fakultas
Kedokteran Universitas Palangka Raya.
3.2 Alat Dan Bahan
1. Alat
Satu set alat elektroforesis DNA berikut power supply, terdiri dari :
- Chamber elecktroforesis
- Tray elecktroforesis
- Sisir
- Power supply
2. Bahan
- Larutan hasi; isolasi DNA darah vena
- Larutan hasil PCR (produk PCR )
- Larutan TAE 1X ( tris-base, glacical acetic acid dan EDTA)
- Marker DNA + loading dye
- Ethidiumbromida
-
5/22/2018 elektroforesis
4/11
3.3 Cara Kerja
a. Timbang bubuk agarosa untuk membuat 1,5% gel agarosa dalam larutan
TBE ( catatan :1,5% untuk DNA yang panjangnya 300-10000bp).
b. Masak larutan agarosa tersebut sampai mendidih dan larut semua.
c. Biarkan larutan tersebut dingin sampai kira-kira 70o
C kemudian masukan
5ul 0,1% ethidiumbromida.
d. Tuang larutan agarosa ke dalam tray elektroforesis yang telah disiapkan
terlebih dahulu dan dipasangi sisir.
e. Biarkan agarosa dingin dan mengeras.
f. Sementara menunggu sampai mengeras siapkan larutan untuk maker DNA
dengan larutan loading dye dengan komposisi, 2ul loading dye + 3ul larutan
marker DNA + 3ul ddH2O
g. Setelah gel agarosa mengeras, pasang tray berikut beserta isinya kedalam
chamber. Elektroforesis, ambil atau cabut sisir pada gel, kemudian tuang
larutan TAE sampai melebihi permukaan gel.
h. Masukan larutan DNA hasil PCR kedalam struktur yang terbentuk dari
sisir yang telah terangkat, secara hati-hati dan perlahan-lahan.
i. Hubungkan alat elektroforesis tersebut dengan power suplly yang telah
diatur dengan voltage 90 volt selama 1 jam.
j. Amati pita-pita (bands) yang terbentuk dengan menggunakan UV
transluminator, dan apabila diperlukan dapat difoto dengan kamera .
Gambar skematik proses elektroforesis(sumber : buku pedoman praktikum modul biomol)
-
5/22/2018 elektroforesis
5/11
IV.HasilGambar hasil pengamatan gel agarosa
V. PembahasanPraktikum kali ini digunakan agarosa karena agarosa memiliki beberapa
kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik,
serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak
dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gelagarosa akan menunjukkan warna
biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNAberwarna
orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh bahwa laju migrasi
elektroforesis gelaga rosa menunjukkan pergerakan kearah positif. Halini sesuai
dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik elektroforesis pada dasarnya
berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negativepada pH
netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan
elektroforesis dengan memberikan daya listrik dikedua kutub maka DNA akan
bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektro foresis gel agarosa. Agarosa
merupakan gel yang memilik solusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat
memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat
dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dinginakan
membentuk gelatinyang padat .
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan
Pita DNA Setelah
Elektroforesis dan Diamati di
-
5/22/2018 elektroforesis
6/11
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.
Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium,
kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan
muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan
terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Secara
umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan
yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh
variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH
dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi
karena efek seleksi dan medium yang sesuai .Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan
elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri
dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase
gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya
gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam
kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang,
tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas,
dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang
menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul.
Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase
diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.
Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan
poliakrilamida sebagai gel media . Metoda Elektroforesis Gel Agarosa
didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks
stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel
agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan
dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat
memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid
biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).
-
5/22/2018 elektroforesis
7/11
Larutan DNA yang bermuatan negative dimasukkan kedalam sumur-
sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan dikutup negatif, apa bila
dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA
akan bergerak ke kutup positif.Laju migrasi DNA dalam medan listrik
berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh
ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecilakan
bermigrasi lebih cepat disbanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis
mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk
visualisasi maka ditambahkan larutan etidiumbromida yang akan masuk diantara
ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan
dibawah lampu UV. Panjang amplikon bias diperkirakan dengan
membandingkannya dengan pita DNA standar.Molekul DNA bermuatan negatif sehingga didalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya,makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen
DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju
migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNAmarker) yang telah
diketahui ukurannya.Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan dibawah paparan
sinarultra violet setelah terlebih dahu lugel dalam pembuatannya ditambahkan
larutan etidiumbromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel
direndam di dalam larutan etidium bromide sebelum dipaparkan diatas sinar
ultraviolet.
Elek troforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan
mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinisdan
pewarnaan laboratories dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat
sensitif dan tidak memerlukan radio isotop atau ultra sentrifugasi. Selanjutnya,
untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands - DNA pada gel
agarosa digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi
rendah, seperti intercalatingagent etidiumbromide (EtBr). Setelah elektroforesis,
gel diwarnai dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit. Hanya sedikit DNA
dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-
transilluminator.
Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :
Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam
arutan sebagai penghantar listrik
-
5/22/2018 elektroforesis
8/11
arutan sebagai penghantar listrik.
- Loading dye berfungsi sebagai pemberat agartidak keluar dari sumuran.
- Etidiumbromida sebagai pewarna DNAyang akan menyisip disela-
sela basa nukleotida.
- UV transiluminator untuk visualisasi DNA didalam gel agarosa
- Aquades sebagai pelarut- Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa
- TAE: Tribase sebagai buffer sesuai dengan ph
- Asam asetat glasial sebagai elektrolit
- EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DA
- Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran gel agarosa
- Tangki elektroforesis untuk running DNA
- Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA
dan loading dye
- Kertas parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan
loading dye
- Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak
DNA
Hubungan antara berat molekul DNA dengan kerapatan agarosa terhadap
laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk kerangka-kerangka atau
lubang
lubang yang kompleks untuk dilewati molekul DNA menuju elektroda
positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju migrasinya, sebaliknya
makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya. Komposisi
gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat dipisahkan. Jika
sumuran gel agarosa menyentuh dasar tempat pembuatan gel agarosa maka
DNAtidak dapat melakukan migrasi.
DNA gel elektroforesis adalah teknik biologi eksperimental penting dan
sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari
pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu.
Fragmen ini tersebar dimedia poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan
listrik diterapkan. Masing - masing fragmen memiliki muatan listrik yang
berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harusbermigrasi pada tingkat
yang berbeda melalui gel.
-
5/22/2018 elektroforesis
9/11
VI.Kesimpulan1. DNA dari hasil isolasi darah vena dan hasil amplifikasi dapat dilihat pita-
pita bandnya dengan menggunakan metode elektroforesis..
2.
Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampelDNA berdasarkan atas ukuran(berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
3. DNA dari hasil isolasi darah vena dan hasil amplifikasi dapat dilihat pita-
pita bandnya dengan menggunakan metode elektroforesis.
-
5/22/2018 elektroforesis
10/11
DAFTAR PUSTAKA
1. Buku pedoman Modul Biologi Molekuler. Fakultas kedokteran UniversitasPalangka Raya.2014.
2. Murray.RK.Granner.DK.,Rodwell.vw. Brahim. Biokimia Harper.Ed27.Jakarta.EGC.2009.
3. Yuwono T.Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.2005.4. Khopkar SM.Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.2002.5. Yepyhardi. 2009.Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular.
Sciencebiotech.net[web].http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-
penelitian-biologi-molekular
http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular -
5/22/2018 elektroforesis
11/11
LAMPIRAN
Gambar alat elektroforesis
beserta power suplly
Pita DNA Setelah Elektroforesis dan
Diamati di Bawah Sinar UV