Elucigene® CF-EU2v1 Guia do software de análise

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Análise no GeneMapper Introdução A secção que se segue descreve os procedimentos para a análise de amostras dos resultados do Elucigene CF-EU2v1 utilizando os pacotes de software GeneMapper (versão 3.7 ou superior) da Applied Biosystems. Processo de análise O processo de análise de amostras é resumido no fluxograma abaixo.

Executar amostras amplificadas no analisador genético

Abrir software GeneMapper

Adicionar ficheiros de amostras fsa ao projecto

Definir método analítico e padrão de tamanho para CF-EU2v1

Seleccionar painéis de mistura adequados

Executar análise da amostra

Guardar projecto

Seleccionar amostra e abrir janela do gráfico

Rever dados dos traçados e do genótipo

Imprimir traçados das amostras de Elucigene CF-EU2v1

Classificar genótipos da amostra

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GeneMapper Abra o ficheiro do programa GeneMapper e importe os ficheiros fsa necessários clicando no botão ‘add samples to project’ (adicionar amostras ao projecto) ( ).

Navegue para a pasta de execução pretendida utilizando a árvore de pastas no lado esquerdo da janela. Seleccione a pasta e clique no botão ‘Add to List >>’ (Adicionar à lista>>). A pasta de execução aparece agora na janela ‘Samples to add’ (Amostras a adicionar). Se fizer duplo clique no ícone da pasta de execução nesta janela mostra todos os ficheiros FSA a importar (Figura 1).

Figura 1: As amostras foram adicionadas à lista e estão prontas a adicionar

ao projecto.

De seguida, as amostras são adicionadas clicando no botão ‘Add’ (Adicionar) ( ). Importação de definições de análise do CF-EU2v1 pelo GeneMapper no GeneMapper Manager É necessário importar as definições de CF-EU2v1 para o GeneMapper. Este processo é controlado através da interface do ‘GeneMapper Manager’.

As definições do CF-EU2v1 para o GeneMapper são disponibilizadas no sítio Web da Gen-Probe: www.gen-probe.com. Estas devem ser transferidas para uma pasta adequada no sistema do utilizador.

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1. Abra o programa GeneMapper Manager clicando no ícone (Figuras 2 e 3).

Figura 2: Abertura do GeneMapper Manager.

Figura 3: A interface do GeneMapper Manager.

2. Seleccione o separador ‘Analysis Methods’ (Métodos analíticos) e clique depois no botão ‘Import’ (Importar).

3. Navegue para os ficheiros de definição das análises CFEU2 necessários e importe-os: 3130 ou 3500 (Figura 4).

Figura 4: Importação dos métodos analíticos.

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4. Repita o processo, seleccionando o separador adequado e importando os ficheiros correspondentes para: ● Table Settings (Definições da tabela) ● Plot Settings (Definições do gráfico) ● Size Standards (Padrões de tamanho)

Nota: As Cluster Plot Settings (Definições cluster de gráficos), as Matrices (Matrizes), os SNP Sets (Conjuntos de SNP) e as Report Settings (Definições de relatório) não requerem a importação de ficheiros.

Importação de definições do painel do CF-EU2v1 no Panel Manager (Gestor do painel) É necessário importar as definições do painel de CF-EU2v1 para o GeneMapper. Este processo é controlado através da interface ‘Panel Manager’ (Gestor do painel). 1. Abra o programa Panel Manager (Gestor do painel) do GeneMapper clicando no

ícone .

2. Clique em ‘Panel Manager’ (Gestor do painel) na janela de navegação esquerda. O gestor do painel surge agora realçado a azul.

3. Seleccione ‘File /Import Panels’ (Ficheiro/Importar painéis). Navegue para o ficheiro do painel CFEU2 ‘GeneMapper Panels’ .txt e importe-o (Figura 5).

4. Clique em ‘CFEU2 panel’ (Painel CFEU2) na janela de navegação esquerda. O painel CF-EU2v1 surge agora realçado a azul.

5. Seleccione ‘File/Import Bin Set’ (Ficheiro/Conjunto “Bin”). Navegue para o ficheiro “Bin” CFEU2 ‘GeneMapper Panels’ .txt e importe-o (Figura 6).

6. Clique em ‘Apply’ (Aplicar) e depois clique em OK.

Figura 5: Importação do ficheiro do painel de CFEU2.

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Figura 6: Importação do ficheiro do conjunto “Bin” do CFEU2.

Modificação do ficheiro de parâmetros analíticos Pode ser necessário modificar os ‘Analysis Ranges’ (Intervalos de análise) predefinidos nas definições analíticas do CF-EU2v1 para contemplar as suas condições durante a execução. O intervalo de análise mínimo depende do capilar e do polímero utilizados durante a recolha de dados. Para visualizar as suas definições de análise actuais: 1. Abra o ‘GeneMapper Manager’. 2. Seleccione o separador ‘Analysis Methods’ (Métodos analíticos). O ficheiro de

CF-EU2v1 importado estará indicado como ‘CFEU2 Analysis Method’ (Método analítico CFEU2).

3. Clique em ‘CFEU2 Analysis Method’ (Método analítico CFEU2). A linha fica agora realçada.

4. Clique no botão ‘Open’ (Abrir) e seleccione o separador ‘Peak Detector’ (Detector de picos) (Figura 7).

Os intervalos analíticos estão predefinidos para começar a 1600 e terminar a 8000.

Figura 7: Intervalos analíticos (realçados).

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Para encontrar o intervalo analítico correcto para o seu laboratório:

1. Na janela principal do GeneMapper, faça duplo clique na pasta de execução importada para visualizar a lista de ficheiros fsa que contém.

2. Seleccione um ficheiro fsa.

3. Clicando no separador ‘Raw data’ (Dados não tratados), surge um electroforograma dos dados não tratados.

4. Utilizando como guia o pico GS600v2 LIZ de 100 bp (Laranja), decida um ponto de dados aproximadamente 100 pontos de dados inferior (Figura 8).

Figura 8: Determinação do intervalo mínimo utilizando dados não tratados das amostras.

5. Assegure-se de que o intervalo analítico máximo têm em conta aproximadamente 100 pontos de dados após o pico de GS600v2 LIZ de 600 bp.

6. Introduza os novos valores no ficheiro CF-EU2v1 Analysis (acedendo-lhe da forma descrita acima).

Pode ser ainda necessário modificar os ‘Peak Amplitude Thresholds’ (Limiares de amplitude dos picos) de acordo com a concentração da amostra. Amostras muito fortes apresentam um nível elevado de ruído de fundo, que pode interferir na análise. Para o evitar, pode aumentar-se o limiar de amplitude do pico. Por exemplo, o corante verde pode definir-se para 100 em vez de 50. Mais uma vez, isto é feito no separador ‘Peak Detector’ (Detector de picos) do ‘CFEU2 Analysis method’ (CFEU2 Método analítico) (Figura 7).

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Análise e genotipagem de ficheiros de CF-EU2v1 importados 1. Na janela principal do GeneMapper, seleccione ‘CFEU2 Table Settings’

(Definições das tabelas) (Figura 9).

Figura 9: Utilize o menu pendente para seleccionar as definições da tabela de CFEU2.

2. Na janela principal do GeneMapper, seleccione a primeira célula sob ‘Analysis Method’ (Método analítico) e seleccione o método analítico adequado do menu pendente: CFEU2_3130 ou CFEU2_3500. Repita o processo para o padrão de tamanho seleccionando ‘CFEU2 size standard’ (Padrão de tamanho CFEU2) do menu pendente.

3. Seleccione o painel ‘CFEU2’ para cada amostra (Figura 10). Para a mistura A seleccione o subpainel contendo a mistura A e para a mistura B seleccione o subpainel que contém a mistura B.

4. Clique em ícone para iniciar a análise da amostra.

Figura 10: Selecção das definições do painel para CFEU2.

Revisão dos dados dos traçados e do genótipo do CF-EU2v1 1. Seleccione ‘Edit/Sort’ (Editar/Ordenar). Ordene as amostras por ‘Sample Name’

(Nome da amostra) e clique em OK.

2. Clique para ‘Display Plots’ (Apresentar gráficos).

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3. Utilize o menu pendente para seleccionar as definições de gráfico apropriadas para CF-EU2v1:

Para visualizar a mistura A com dados de Poli T, seleccione: ‘CFEU2 Plot PT-on’ (Gráfico CFEU2 PT ligado)

Para visualizar a mistura A sem dados de Poli T, seleccione: ‘CFEU2 Plot PT-off’ (Gráfico CFEU2 PT desligado)

Figura 11: Utilize o menu pendente para seleccionar as definições de gráfico

para CFEU2.

4. A janela do gráfico mostra os dados dos traçados da amostra (Figura 12).

5. Recomendamos que a função ‘Single click editing’ (Edição clique único) esteja activada na janela do gráfico. Para tal, seleccione ‘Alleles/set click editing’ (Alelos/definir edição clique) e assegure-se de que esta opção está marcada.

Figura 12: Janela do gráfico da amostra com representação dos dados dos

traçados marcados.

Elucigene CF-EU2v1 Mistura A

Elucigene CF-EU2v1 Mistura B

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Classificação dos picos de diagnóstico Cada indivíduo possui duas cópias do gene CFTR. Quando um determinado alelo possui a mesma sequência em ambas as cópias, diz-se que o indivíduo é homozigótico relativamente a este local. Se um determinado alelo possuir sequências diferentes em cada cópia, o indivíduo é considerado heterozigótico (Figura 13).

A mistura A (mutante) determina se um indivíduo é portador de alguma mutação, o que é mostrado pela presença de um pico azul. A mistura mutante contém também iniciadores do alelo normal F508del, pelo que esta mistura consegue determinar se um indivíduo apresenta F508del normal (apenas pico verde), se é homozigótico para F508del (apenas pico azul) ou se é heterozigótico para este alelo (pico azul e pico verde).

Se for observada qualquer outra mutação, a amostra pode ser amplificada com a mistura B (WT) para determinar se é homozigótica ou heterozigótica. A presença de um pico verde para um determinado alelo na mistura WT indica que o indivíduo é heterozigótico e a ausência de um pico verde indica que é homozigótico para aquela mutação em particular.

Figura 13: Exemplos de a) indivíduo normal, b) indivíduo heterozigótico e c) indivíduo homozigótico para o alelo 711+1G>T

A B C

Indivíduos portadores de duas mutações diferentes são denominados heterozigóticos compostos (Figura 14).

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Figura 14: Exemplos de amostras heterozigóticas compostas. A) G85E/D1152H

B) F508del/E60X

A

B

São incluídos dois marcadores STR hipervariáveis (vermelhos) em ambas as misturas. Isto permite a comparação entre a amostra amplificada com a mistura mutante e a amostra amplificada com a mistura WT para reduzir a probabilidade de as amostras serem confundidas (Figura 15). A ausência destes marcadores STR indica que a amostra falhou. A presença de marcadores STR com RFU muito baixas indica uma amostra fraca, que deve ser analisada com cautela.

Figura 15: Gráficos da mistura A e da mistura B onde estão representados os dois marcadores STR para um indivíduo.

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Os marcadores STR hipervariáveis podem ser ocultados desligando os dados relativos ao corante vermelho na janela do gráfico. A desactivação dos dados dos corantes azul e verde facilita a visualização dos marcadores STR.

Designação dos marcadores no GeneMapper Quando se visualizam dados dos traçados analisados no GeneMapper, os picos de diagnóstico da mistura A são rotulados com o nome e o número do marcador. Os picos de diagnóstico da mistura B são rotulados apenas com o número do marcador.

Os dados dos picos de um marcador detectado rotulado podem ser examinados de forma ainda mais profunda passando o cursor do rato sobre o rótulo do marcador pretendido, surgindo o nome do marcador, o tamanho do pico e a altura do pico no fundo da janela do gráfico das amostras.

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A correlação entre os números dos marcadores e os marcadores é mostrada abaixo.

Marcadores detectados

N.º Marcador Marcador Intervalo de tamanho

em bp do produto (dados 3130/POP7)

01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195

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* Tamanhos de alelos 5T

Nota: Os intervalos de tamanho de cada marcador podem variar consoante o aparelho e o polímero utilizados.

Marcador CF-EU2v1 dI507del Devido à localização da deleção em I507 no gene CFTR, é possível detectar a presença deste marcador através de um desvio de 3 bp no tamanho do pico de F508del, assim como um pico específico da mutação I507del. Caso esteja presente um só alelo mutante I507del, o pico mutante que lhe corresponde será observado sob a forma de um pico azul a aproximadamente 159 bp. Será observado como presente um pico de estirpe selvagem para F508del, mas a altura do pico será cerca de metade da normalmente associada a um genótipo de estirpe selvagem homozigótico; este é observado sob a forma de um pico verde a cerca de 167 bp. Observar-se-á ainda um outro pico verde a cerca de 164 bp (Figura 16).

Figura 16: Amostra heterozigótica para I507del.

Uma amostra I507del/F508del produz um pico de estirpe selvagem verde para F508del desviado, a aproximadamente 164 bp (menos 3 bp que o normal), um pico mutante F508del azul a 166 bp e um pico mutante I507del azul a cerca de 159 bp. Uma amostra I507del/I507del resulta num pico azul a aproximadamente 159 bp e num pico verde único a cerca de 164 bp (3 bp inferior ao pico para F508del normal observado quando I507del não está presente). Há que notar que a presença de uma mutação F508del impede o iniciador de estirpe selvagem I507 de funcionar. Por conseguinte, indivíduos homozigóticos para F508del não possuirão um pico de estirpe selvagem I507 na mistura de estirpe selvagem e indivíduos heterozigóticos para F508del apresentarão um pico de estirpe selvagem I507 de altura reduzida na mistura de estirpe selvagem. Marcadores de Poli-T O Elucigene CF-EU2v1 contém iniciadores ARMS fluorescentes marcados com NED (amarelo) para a detecção de variantes IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. A informação sobre

Marcador Intervalo de tamanho em bp do produto POP7/3130

5T (9) 117,25 – 118,75 5T (10) 119,25 – 120,75 5T (11) 121,25 – 122,75 5T (12) 123,25 – 124,75 5T (13) 125,25 – 126,75

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Poli-T de uma amostra pode ser determinada activando a visualização dos dados do corante amarelo nas definições de CF-EU2v1 do GeneMapper. Por conseguinte, o operador pode optar por visualizar estes dados se considerar que são necessários no âmbito do procedimento de análise do laboratório. Nota: Não existem iniciadores de Poli-T na mistura B, pelo que os produtos só serão visualizados em amostras de mistura A. Análise de Poli-T Os exemplos GeneMapper que se seguem exibem morfologias de picos características das regiões variantes de IVS8 testadas. Exemplo 1: Amostra IVS8-5T / IVS8-9T O exemplo que se segue mostra o resultado da mistura A observado utilizando as definições do gráfico ‘CFEU2 Plot PT-on’ (Gráfico CFEU2 PT ligado).

A remoção da informação sobre as cores verde e azul nas definições do gráfico para a mesma amostra revela claramente o marcador de Poli-T, que é mostrado abaixo.

Exemplo 2: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T

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Exemplo 3: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T (variabilidade da repetição de TG)

Os dois picos devem-se à heterozigosidade da região de repetição de TG que se encontra no nosso produto da amplificação. Este efeito pode também ser observado em amostra homozigóticas com 5T e 9T. Por conseguinte, é possível determinar o número de repetições de TG dentro de cada variante de politimidina de IVS8. Exemplo 4: Amostra IVS8-9T / IVS8-9T

Aviso importante Em certas condições de ensaio, é possível que artefactos observáveis de corantes interfiram com as análises de rotina. É importante que o utilizador tenha noção da possibilidade de interferência para garantir que analisa correctamente os dados. Os artefactos de corantes marcados podem ser observados sob a forma de pequenos picos azuis ou verdes. Estes artefactos dos corantes são geralmente de dimensão inferior a 100 bp e não costumam interferir com a análise de dados. Em condições normais, estes picos de artefacto são insignificantes relativamente aos verdadeiros picos do produto da amplificação e não causam problemas de análise. No entanto, quando a quantidade de produto da amplificação carregada é pequena, talvez devido a um ADN genómico limitante, os picos dos artefactos dos corantes surgem com uma dimensão relativamente maior, havendo a possibilidade de serem analisados como verdadeiros picos do produto da amplificação.

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Análise no GeneMarker Introdução A secção que se segue descreve os procedimentos para a análise de amostras dos resultados do Elucigene CF-EU2v1 utilizando o pacote de software GeneMarker, versão 1.95, da SoftGenetics. Processo de análise O processo de análise de amostras é resumido no fluxograma abaixo.

Executar amostras amplificadas no analisador genético

Abrir software GeneMarker

Adicionar ficheiros de amostras fsa ao projecto

Seleccione devidamente o painel CF-EU2v1 e as definições de análise

Executar análise da amostra

Seleccione “Mutant + Wild-type” (Mutante + Estirpe selvagem) ou “Mutant Only” (Apenas mutante)

Seleccione a aplicação: ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa)

Seleccione Print (Imprimir)

Seleccione Preview (Pré-visualizar)

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Adição de ficheiros de amostras ao GeneMarker Abra o ficheiro do programa GeneMarker e, quando lhe for solicitado, seleccione ‘Open Data’ (Abrir dados). Surge a caixa Open Data Files (Abrir ficheiros de dados).

Clique no botão ’Add’. Surge a caixa de diálogo Open (Abrir).

Navegue para o directório que contém os ficheiros dos dados não tratados ● Seleccione todos os ficheiros premindo as teclas CTRL+A ou use as teclas

CTRL e/ou SHIFT para seleccionar amostras individuais. ● Clique no botão Open (Abrir) da caixa de diálogo Open

Os ficheiros seleccionados surgem no campo Data File List (Lista de ficheiros de dados) (Figura 1).

Clique no botão OK da caixa Open Data Files (Abrir ficheiros de dados) e as amostras são carregadas no GeneMarker.

Em seguida, o software abre automaticamente a janela Raw Data Analysis (Análise de dados não tratados) (Figura 2).

Figura 1: Amostras adicionadas à Data File List (Lista de ficheiros de dados).

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Figura 2: Janela Raw Data Analysis (Análise de dados não tratados).

Processamento de dados Depois de os ficheiros dos dados não tratados serem carregados no GeneMarker, estão prontos a ser processados. A etapa de processamento inclui a aplicação de um padrão de tamanho, da filtragem de picos de ruído e, caso se pretenda, a comparação com um painel alélico conhecido.

O GeneMarker combina todas estas etapas numa ferramenta simples denominada Run Wizard (Assistente de execução) (Figura 3). Para aceder ao Run Wizard (Assistente de execução), basta clicar no ícone Run Project (Projecto de execução) na barra de ferramentas principal.

Figura 3: Run Wizard (Assistente de execução) – Janela Template Selection (Selecção de modelo).

Árvore de amostras Imagem do gel sintética Traçado dos dados não tratados

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Run Wizard (Assistente de execução) – Janela Template Selection (Selecção de modelo)

Crie um modelo CF-EU2v1 e seleccione o padrão de tamanho, a cor do padrão e as definições do tipo de análise adequados (conforme mostra a Figura 3).

Seleccione o painel apropriado consoante a plataforma utilizado, por exemplo, CF-EU2v1_POP7. Estes são disponibilizados no sítio Web da Gen-Probe: www.gen-probe.com. Estas devem ser transferidas para uma pasta adequada no sistema do utilizador.

Clique em ‘Next’ (Seguinte) para continuar

Run Wizard (Assistente de execução) – Data Process (Processamento de dados)

A janela Data Process (Processamento de dados) do Run Wizard (Assistente de execução) permite ao utilizador seleccionar os parâmetros de filtragem dos picos.

Assegure-se de que as definições são seleccionadas da forma indicada na Figura 4 abaixo.

Clique em ‘Next’ (Seguinte) para continuar

Figura 4: Run Wizard (Assistente de execução) – Janela Data Process (Processamento de dados).

NOTA: Para dados de 3500, aumente a intensidade mínima para 300.

Run Wizard (Assistente de execução) – Additional settings (Definições adicionais)

Não são necessárias definições adicionais quando se efectua a análise CF-EU2v1.

Clique em ‘OK’ para continuar

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Figura 5: Run Wizard (Assistente de execução) – Additional settings (Definições adicionais).

Caixa Data Processing (Processamento de dados) Depois de clicar em Ok na caixa Additional Settings (Definições adicionais) do Run Wizard (Assistente de execução), surge a caixa Data Processing (Processamento de dados) (Figura 6). Os dados não tratados estão a ser processados e medidos, depois são aplicados os parâmetros de filtragem e o painel CF-EU2v1 seleccionado é aplicado.

Clique em ‘OK’ na caixa Data Processing (Processamento de dados) quando a análise estiver concluída.

Figura 6: Caixa Data Processing (Processamento de dados).

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Janela de análise principal A janela de análise principal (Figura 7) do GeneMarker tem um esquema fácil de utilizar. Este esquema inclui:

● A lista de ficheiros das amostras – apresentada no lado esquerdo da janela.

● A imagem do gel sintético – apresentada no topo da janela.

● Electroforogramas dos dados – por baixo da imagem do gel.

● Uma tabela de relatório – apresentada no lado direito da janela.

Nesta janela, é importante verificar se todos os picos apropriados de cada perfil foram chamados correctamente.

Sequencialmente, faça duplo clique em cada amostra na árvore de ficheiros de amostras do lado esquerdo do ecrã. Clique com o botão direito do rato em todos os picos em causa e, escolhendo de entre as opções da caixa de diálogo, p. ex. editar ou eliminar alelo, confirme ou cancele consoante necessário.

Quando um pico não tiver sido chamado por estar abaixo do limiar, pode atribuir-se manualmente um alelo. Seleccione o ‘Marker’ (Marcador) apropriado da caixa pendente, mantendo a tecla ‘Shift’ premida clique com o botão direito do rato no pico em questão, clique em ‘Insert Allele’ (Inserir alelo) e depois clique em ‘OK’. Quando se analisam dados das misturas A e B em conjunto, é importante assegurar que todos os picos STR foram chamados.

Concluído este processo para todas as amostras, pode passar-se à etapa seguinte da análise.

Figura 7: Janela de análise principal.

Árvore de ficheiros de amostras

Imagem do gel sintética Electroforograma Tabela de

relatório

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Análise apenas de mutantes (mistura A) Na janela de análise principal, seleccione a opção de menu pendente ‘Applications’ (Aplicações) no topo do ecrã.

Seleccione ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa) e, em seguida, ‘Mutant Only’ (Apenas mutantes). Na caixa de diálogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa), seleccione ‘Poly-T Analysis’ (Análise Poli-T) caso pretenda esta análise (Figura 8).

Clique em ‘Preview’ (Prever) na caixa de diálogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa) para visualizar o relatório Elucigene CF-EU2v1 Apenas Mutantes (Mistura A) (Figura 11). Nesta janela, o operador pode rever e imprimir cada um dos relatórios de amostras.

Clique em ‘OK’ na caixa de diálogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa) para imprimir o relatório Elucigene CF-EU2v1 Apenas Mutantes (Mistura A) (Figura 11) sem o rever.

Figura 8: Caixa de definições ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa.

Revisão do relatório Elucigene CF-EU2v1 Relatório apenas mutantes (Mistura A)

Clique em ‘Preview’ (Prever) na caixa de diálogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa) para visualizar o relatório Elucigene CF-EU2v1 Mistura A (Figura 11). Nesta janela, o operador pode rever e imprimir cada um dos relatórios de amostras.

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Figura 11: Janela do relatório CF-EU2v1 apenas mutantes (Mistura A).

O relatório Elucigene CF-EU2v1 inclui as seguintes características: ● Report Header (Cabeçalho do relatório): Contém informações acerca da

análise, do projecto, da amostra e dos parâmetros. ● Signature Box (Caixa de assinatura): Data e espaço inicial para revisores do

relatório. ● Electropherogram (Electroforograma): Semelhante à janela de

‘ARMS/Comparative analysis’ (ARMS/Análise comparativa), apresenta todas as cores dos corantes do traçado da amostra.

● Report Table (Tabela de relatório): A tabela principal apresenta todas as mutações testadas por este kit. A presença ou ausência de uma mutação é indicada por um 1 ou um 0. Note-se que só é possível obter um relatório do estado de zigosidade completo para o locus F508 quando se analisa apenas a mistura A. A segunda tabela mostra o estado de Poli-T da amostra se esta função tiver sido seleccionada.

Análise da mistura de mutantes + estirpe selvagem (A e B) Na janela de análise principal, seleccione a opção de menu pendente ‘Tools’ (Ferramentas) no topo do ecrã e, de seguida, ‘File Name Group Tool’ (Ferramenta de grupo de nomes de ficheiros). Isto abre o ecrã ‘File Name Group Editor’ (Editor do grupo de nomes de ficheiros). Na caixa ‘Compare by Section’ (Comparar por secção), escreva o número da coluna em que o nome da amostra aparece. Na caixa ‘Match to Identifier by Section’ (Corresponder com identificador por secção), escreva o número da coluna em que o tipo de mistura – A ou B – aparece. Na caixa ‘Control Identifier’ (Identificador de controlo), escreva ‘A’. Clique no botão ‘Match’ (Corresponder) e as amostras com correspondência surgem no lado direito da caixa de diálogo (Figura 9).

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Figura 9: Ecrã File Name Group Editor (Editor do grupo de nomes de ficheiros).

Guarde o grupo de correspondências numa pasta adequada clicando no ícone situado no topo da secção ‘Matched Groups’ (Grupos com correspondência).

Na janela de análise principal, seleccione a opção de menu pendente ‘Applications’ (Aplicações) no topo do ecrã.

Seleccione ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa) e, em seguida, ‘Mutant + Wildtype’ (Mutante + estirpe selvagem). Na caixa de diálogo ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa), seleccione o ‘Group File’ (Ficheiro de grupo) relevante e depois seleccione ‘Poly-T Analysis’ (Análise de Poli-T) caso pretenda esta análise e/ou ‘STR Check’ (Verificação STR) (Figura 10a). Em seguida, clique em ‘OK’ para visualizar a janela ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa) (Figura 10b).

Figura 10a: Caixa de definições ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa).

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Figura 10b: Janela ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Análise comparativa).

Revisão do relatório Elucigene CF-EU2v1

Relatório mutantes + estirpe selvagem (mistura A + B)

Clique no ícone de impressão da janela ‘ARMS/ComparativeAnalysis’ (ARMS/Análise comparativa). Seleccione ‘Poly-T Analysis’ (Análise de Poli-T) caso pretenda esta análise e/ou ‘STR Check’ (Verificação STR) (Figura 12a). Clique em ‘Preview’ (Previsão) para visualizar o relatório Elucigene CF-EU2v1 A + B (Figura 12b). Nesta janela, o operador pode rever e imprimir cada um dos relatórios de amostras.

Figura 12a: Caixa ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Definições de impressão comparativa).

Ficheiros agrupados

Electroforogramas Histograma da diferença

Tabela de relatório

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Figura 12b: Janela do relatório CF-EU2v1 mutantes + estirpe selvagem (misturas A + B)

O relatório Elucigene CF-EU2v1 inclui as seguintes características: ● Report Header (Cabeçalho do relatório): Contém informações acerca da análise, do

projecto, da amostra e dos parâmetros. ● Signature Box (Caixa de assinatura): Data e espaço inicial para revisores do relatório.

É fornecida uma coluna de verificação adicional para as iniciais do revisor. ● Electropherogram (Electroforograma): Semelhante à janela de ‘ARMS/ Comparative

analysis’ (ARMS/Análise comparativa), apresenta todas as cores dos corantes do traçado da amostra.

● Report Tables (Tabelas de relatório): A tabela principal apresenta todas as mutações testadas por este kit. O estado de homozigosidade ou heterozigosidade é indicado pelo número de alelos de estirpe selvagem ou mutantes relatados para cada locus. A segunda tabela mostra o estado de Poli-T da amostra se esta função tiver sido seleccionada.

● Trace Comparison Histogram (Histograma de comparação de traçados): O GeneMarker calcula as diferenças alélicas entre os traçados das misturas A e B e apresenta-as num histograma localizado abaixo dos electroforogramas das amostras.

Rótulos dos picos Os rótulos dos picos são codificados por cores segundo a qualidade da correspondência entre o pico detectado e os “bins” dos painéis observados. No electroforograma, os marcadores são barras cinzentas horizontais e o centro dos picos é marcado por uma barra cinzenta vertical.

Os picos que não recaem nos marcadores ou nos “bins” do painel são marcados a vermelho como Off Ladder (Fora do padrão) (OL).

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Nota: As variações no tipo de polímeros e padrões de tamanho do aparelho podem requerer a optimização dos “bins” dos marcadores para adaptar o software às condições de execução em uso. Pode encontrar mais informações sobre a modificação de “bins” dos painéis no manual do GeneMarker fornecido com o software.

Classificação dos picos de diagnóstico Cada indivíduo possui duas cópias do gene CFTR. Quando um determinado alelo possui a mesma sequência em ambas as cópias, diz-se que o indivíduo é homozigótico relativamente a este local. Se um determinado alelo possuir sequências diferentes em cada cópia, o indivíduo é considerado heterozigótico (Figura 13). A mistura A (mutante) determina se um indivíduo é portador de alguma mutação, o que é mostrado pela presença de um pico azul. A mistura mutante contém também iniciadores do alelo normal F508del, pelo que esta mistura consegue determinar se um indivíduo apresenta F508del normal (apenas pico verde), se é homozigótico para F508del (apenas pico azul) ou se é heterozigótico para este alelo (pico azul e pico verde). Se for observada qualquer outra mutação, a amostra pode ser amplificada com a mistura B (WT) para determinar se é homozigótica ou hete rozigótica. A presença de um pico verde para um determinado alelo na mistura WT indica que o indivíduo é heterozigótico e a ausência de um pico verde indica que é homozigótico para aquela mutação em particular. Figura 13: Exemplos de a) indivíduo normal, b) indivíduo heterozigótico e c) indivíduo homozigótico para o alelo 711+1G>T.

A B C

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Indivíduos portadores de duas mutações diferentes são denominados heterozigóticos compostos (Figura 14).

Figura 14: Exemplos de amostras heterozigóticas compostas. A) W1282X/S1251N

B) F508del/R560T.

A

B

São incluídos dois marcadores STR hipervariáveis (vermelhos) em ambas as misturas. Isto permite a comparação entre a amostra amplificada com a mistura mutante e a amostra amplificada com a mistura WT para reduzir a probabilidade de as amostras

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serem confundidas (Figura 15). A ausência destes marcadores STR indica que a amostra falhou. A presença de marcadores STR com RFU muito baixas indica uma amostra fraca, que deve ser analisada com cautela.

Figura 15: Gráficos da mistura A e da mistura B onde estão representados os dois marcadores STR para um indivíduo.

Os marcadores STR hipervariáveis podem ser ocultados anulando a selecção de ‘STR Check’ (Verificação STR) na caixa ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa) se estiver apenas a analisar a mistura A ou na caixa ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa) se estiver a analisar as misturas A e B. A apresentação apenas dos dados do corante vermelho na janela ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa) permite uma visualização mais fácil dos marcadores STR.

Designação dos marcadores no GeneMarker Quando se visualizam dados dos traçados analisados no GeneMarker, os picos de diagnóstico na mistura A são rotulados com o nome do marcador. Os picos de diagnóstico da mistura B apenas são rotulados com o número do marcador, apresentando o sufixo ‘WT’ quando visualizados quando apenas o corante verde está seleccionado.

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A correlação entre os números dos marcadores e os marcadores é mostrada abaixo.

Marcadores detectados

N.º Marcador Marcador Intervalo de tamanho em bp

do produto (dados 3130/POP7)

01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195

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* Tamanhos de alelos 5T

Nota: Os intervalos de tamanho de cada marcador podem variar consoante o aparelho e

o polímero utilizados.

Marcador CF-EU2v1 dI507del Devido à localização da deleção em I507 no gene CFTR, é possível detectar a presença deste marcador através de um desvio de 3 bp no tamanho do pico de F508del, assim como um pico específico da mutação I507del. Caso esteja presente um só alelo mutante I507del, o pico mutante que lhe corresponde será observado sob a forma de um pico azul a aproximadamente 159 bp. Será observado como presente um pico de estirpe selvagem para F508del, mas a altura do pico será cerca de metade da normalmente associada a um genótipo de estirpe selvagem homozigótico; este é observado sob a forma de um pico verde a cerca de 167 bp. Observar-se-á ainda um outro pico verde a cerca de 164 bp (Figura 16).

Figura 16: Amostra heterozigótica para I507del.

Uma amostra I507del/F508del produz um pico de estirpe selvagem verde para F508del desviado, a aproximadamente 164 bp (menos 3 bp que o normal), um pico mutante F508del azul a 166 bp e um pico mutante I507del azul a cerca de 159 bp. Uma amostra I507del/I507del resulta num pico azul a aproximadamente 159 bp e num pico verde único a cerca de 164 bp (3 bp inferior ao pico para F508del normal observado quando I507del não está presente).

Marcador Intervalo de tamanho em bp do produto POP7/3130 Intervalo POP7/3130

5T (9) 117.25 – 118.75 5T (10) 119.25 – 120.75 5T (11) 121.25 – 122.75 5T (12) 123.25 – 124.75 5T (13) 125.25 – 126.75

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Há que notar que a presença de uma mutação F508del impede o iniciador de estirpe selvagem I507 de funcionar. Por conseguinte, indivíduos homozigóticos para F508del não possuirão um pico de estirpe selvagem I507 na mistura de estirpe selvagem e indivíduos heterozigóticos para F508del apresentarão um pico de estirpe selvagem I507 de altura reduzida na mistura de estirpe selvagem. Marcadores de Poli-T O Elucigene CF-EU2v1 contém iniciadores ARMS™ fluorescentes marcados com NED (amarelo) para a detecção das variantes IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. A informação de Poli-T para uma amostra pode ser determinada activando a visualização dos dados do corante amarelo na janela de análise principal do GeneMarker (Figura 7). Os marcadores de Poli-T podem ser ocultados anulando a selecção de ‘Poly-T Analysis’ (Análise de Poli-T) na caixa ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa) se estiver apenas a analisar a mistura A ou na caixa ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Análise comparativa) se estiver a analisar as misturas A e B. Por conseguinte, o operador pode optar por visualizar estes dados se considerar que são necessários no âmbito do procedimento de análise do laboratório. Nota: Não existem iniciadores Poli-T na mistura B, pelo que os produtos só serão

visualizados em amostras de mistura A. Análise de Poli-T Os exemplos GeneMarker que se seguem exibem morfologias de picos características das regiões variantes de IVS8 testadas.

Os exemplos abaixo mostram o resultado da mistura A observados quando se selecciona ‘Poly-T Analysis’ (Análise de Poli-T) na caixa de diálogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (ARMS/Definições de impressão comparativa) quando se analisa apenas a mistura A. Exemplo 1: Amostra IVS8-5T / IVS8-7T

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Exemplo 2: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T

Exemplo 3: Amostra IVS8-7T / IVS8-7T (variabilidade da repetição de TG)

Os dois picos devem-se à heterozigosidade da região de repetição de TG que se encontra no nosso produto da amplificação. Este efeito pode também ser observado em amostra homozigóticas com 5T e 9T. Por conseguinte, é possível determinar o número de repetições de TG dentro de cada variante de politimidina de IVS8.

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Exemplo 4: Amostra IVS8-9T / IVS8-9T

Aviso importante Em certas condições de ensaio, é possível que artefactos observáveis de corantes interfiram com as análises de rotina. É importante que o utilizador tenha noção da possibilidade de interferência para garantir que analisa correctamente os dados. Os artefactos de corantes marcados podem ser observados sob a forma de pequenos picos azuis ou verdes. Estes artefactos dos corantes são geralmente de dimensão inferior a 100 bp e não costumam interferir com a análise de dados. Em condições normais, estes picos de artefacto são insignificantes relativamente aos verdadeiros picos do produto da amplificação e não causam problemas de análise. No entanto, quando a quantidade de produto da amplificação carregada é pequena, talvez devido a um ADN genómico limitante, os picos dos artefactos dos corantes surgem com uma dimensão relativamente maior, havendo a possibilidade de serem analisados como verdadeiros picos do produto da amplificação. ELUCIGENE é uma marca comercial registada da Gen-Probe Life Sciences Ltd. ARMS é uma marca comercial registada da AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP é uma marca comercial registada da Qiagen GmbH. GENEMARKER é uma marca comercial registada da SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED, POP-7, HI-DI e PET são marcas comerciais registadas da Life Technologies Corporation. AVISO AO COMPRADOR: LICENÇA LIMITADA Os polinucleóticos marcados com corantes VIC, NED e PET e/ou a sua utilização podem estar abrangidos por uma ou mais patentes detidas pela Applied Biosystems, LLC. O preço de aquisição deste produto inclui os direitos limitados e não transmissíveis ao abrigo de determinadas reivindicações de certas patentes detidas pela Applied Biosystems, LLC, para a utilização pelo comprador apenas desta quantidade do produto e exclusivamente em actividades de detecção de alvo(s) no domínio do diagnóstico humano. Não são transmitidos outros direitos. Podem obter-se mais informações acerca da aquisição de licenças relacionadas com os corantes atrás mencionados contactando o Director de Licenciamento da Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EUA. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd.

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