embrapa 2007 30-11-2014

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Luciana Correia de Almeida RegitanoSimone Cristina Mo Niciura

Adriana Mrcia Guaratini IbelliJoo Jos de Simoni Gouveia

Protocolos de Biologia

MoLecuLar aplicada

Produo nimal

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Luciana Correia de Almeida Regitano

Mdica Veterinria, Dra., Pesquisadora da Embrapa Pecuria Sudeste, Rod.

Washington Luiz, km 234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.

Endereo eletrnico: 633

Simone Cristina Mo Niciura

Mdica Veterinria, Dra., Pesquisadora da Embrapa Pecuria Sudeste, Rod.

Washington Luiz, km 234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.

Endereo eletrnico: [email protected]

Adriana Mrcia Guaratini IbelliBiloga, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, So

Carlos, SP.

Endereo eletrnico: [email protected]

Joo Jos de Simoni Gouveia

Mdico Veterinrio, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km

235, So Carlos, SP.

Endereo eletrnico:MM63

Gisele Batista Veneroni

Biloga, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, So

Carlos, SP.

Endereo eletrnico: 6N33

Gustavo Gasparin

Bilogo, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, So

Carlos, SP.

Endereo eletrnico: A6N33

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NDICE

1. Regras de segurana no laboratrio...................................


1

2. Extrao de DNA .................................................................. Joo Jos de Simoni Gouveia Luciana Correia de Almeida Regitano

3

3. Extrao de RNA .................................................................. Adriana Mrcia Guaratini Ibelli Luciana Correia de Almeida Regitano

Simone Cristina Mo

9

4. Quantificao em espectrofotmetro ................................ Luciana Correia de Almeida Regitano

12

5. Reao em cadeia da polimerase (PCR) ............................ Adelita Carolina Santiago Gisele Batista Veneroni Luciana Correia de Almeida Regitano

14

6. Enzimas de restrio ........................................................... Gisele Batista Veneroni Luciana Correia de Almeida Regitano

18

7. Eletroforese de cidos nuclicos ....................................... Joo Jos de Simoni Gouveia Luciana Correia de Almeida Regitano

22

8. Seqenciamento .................................................................. Kerli Ninov Lilian Giotto Zaros

31

9. Sntese de DNA complementar (cDNA) ............................. Adriana Mrcia Guaratini Ibelli Luciana Correia de Almeida Regitano

38

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10. PCR quantitativo em tempo real ....................................... Helena Javiel Alves

42

11. Mapeamento de QTLs QTL Express .............................. Millor Fernandes do Rosrio

Ktia Nones

49

12. Arranjos de DNA ................................................................. Erika Cristina Jorge Luiz Lehman Coutinho

55

13. Preparo de Solues .......................................................... 61

Referncias ............................................................................... 64

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1. REGRAS DE SEGURANA EM LABORATRIOS


Segurana a prioridade nmero um em qualquer laboratrio qumico.

importante conhecer sempre o laboratrio como um ambiente global de

trabalho experimental.

J no incio deve-se familiarizar com todo equipamento de segurana

disponvel no laboratrio, sabendo onde encontr-lo e como utiliz-lo:

- lava-olhos;

- chuveiro de emergncia;

- extintores;

- sadas de emergncia;

Muitas regras de segurana envolvem apenas bom senso:

- no tocar em itens quentes;

- no comer, nem beber no laboratrio;

- no fumar dentro do laboratrio;

- no fazer brincadeiras;

O uso de Equipamentos de Proteo Individual (EPIs) obrigatrio, assim

como o uso de capela de exausto em caso de solventes.Manter vidrarias sempre em condies adequadas de trabalho.

Manter as solues sempre identificadas e com os cuidados a serem tomados

em caso de acidentes.

Manter os frascos de reagentes sempre limpos, sem respingos para manter

uma boa condio de uso dos tcnicos e estagirios.

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Usar sempre culos de segurana e avental de preferncias de algodo e

mangas longas.

No use saias, bermudas, ou calados abertos.

Pessoas de cabelos longos, mant-los sempre preso.

No trabalhe sozinho, principalmente fora do horrio de expediente.

Lave bem as mos ao deixar o laboratrio

Ao executar qualquer experimento esteja consciente de como proceder e os

cuidados.

Leia atentamente o protocolo at o fim, verificando se compreendeu todos os

procedimentos e se possui todo o material necessrio.

Nunca brinque no laboratrio.

Certifique-se da tenso de trabalho da aparelhagem antes de conect-lo

rede eltrica. Quando no estiverem em uso, os aparelhos devem ficar

desconectados.

No use nenhum equipamento para o qual no tenha sido autorizado ou

treinado a utilizar.

Respeite seus amigos de trabalho, no os distraindo com conversas

paralelas.

Caso perceba algo diferente ou mesmo anormal, recorra ao tcnicoresponsvel, para tirar suas dvidas.

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2. EXTRAO DE DNA



A extrao dos cidos nuclicos (DNA e RNA) o primeiro passo para a

realizao da maioria das metodologias de biologia molecular. Pode-se obter DNA a

partir de inmeros tipos de tecidos e clulas, e existe uma infinidade de protocolos

para realizao de tal procedimento. A escolha do protocolo de extrao de DNA

depender de diversos fatores como: tipo de tecido a ser utilizado, grau de pureza e

de integridade necessria para a aplicao em que o DNA ser utilizado (PCR,

seqenciamento, clonagem gnica, etc.) (Bartlett, 2003).

O primeiro relato sobre isolamento de DNA data de 1869 e foi realizado por

Friedrich Miescher, a partir de leuccitos presentes em pus. Miescher lisou estas

clulas com uma soluo alcalina e precipitou o material nuclear com soluo salina.

Este material nuclear que posteriormente seria conhecido como DNA, foi chamado

de nuclena (http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/historico2004.pdf, http://www.dnai.org ).

Basicamente, o processo de extrao de DNA consiste em duas etapas. A

primeira etapa a extrao propriamente dita e consiste no rompimento das

membranas celulares (e conseqente exteriorizao do DNA). A segunda fase

consiste na purificao do DNA em soluo, ou seja, retirada dos outros

componentes celulares da soluo (restos de membrana, protenas, RNA) (Romano,

1999).

O rompimento das membranas celulares geralmente feito com detergentes

(SDS ou CTAB). A utilizao de agentes caotrpicos como o tiocianato de guanidina

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impede o DNA de se ligar nas outras molculas, facilitando sua separao na

segunda fase do processo. Aps esta fase, deve-se separar o DNA dos outros

componentes celulares. Isto feito por meio da adio de substncias que faam

com que a soluo torne-se heterognea e que o DNA fique dissolvido em apenas

uma das fases, como por exemplo, quando se utiliza fenol para desnaturar as

protenas, ficando o DNA na fase aquosa e as protenas na interface entre as fases

orgnica e aquosa. Uma alternativa utilizao dos solventes orgnicos como o

fenol fazer a separao das protenas utilizando altas concentraes de sal

(salting-out). Aps separar o DNA dos outros componentes celulares, pode-se

proceder uma precipitao do DNA para garantir a mxima pureza do material, esta

precipitao geralmente faz-se utilizando lcool (etanol ou isopropanol) que, em

presena de ctions monovalentes, promove uma transio estrutural na molcula

de cido nuclico, resultando em agregao e precipitao (Regitano, 2001;

Azevedo, 2003; http://www.etall.hpg.ig.com.br/cursopcr.html).

Os protocolos abordados neste captulo so utilizados na rotina do laboratrio

de Biotecnologia Animal do Centro de Pesquisa de Pecuria do Sudeste e so

adaptaes dos protocolos descritos em Regitano (2001).

O objetivo deste captulo fazer com que o aluno entenda os princpios deste

processo, a finalidade de cada reagente em um protocolo de extrao de DNA e, a

partir da, possa utilizar e adaptar os protocolos j existentes de acordo com sua

necessidade e disponibilidade de reagentes.

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2.1. Extrao de DNA de Leuccitos

A) Obteno de Leuccitos

1. Coletar 5mL de sangue em tubos contendo EDTA potssico [50L de

EDTA(K3) a 15%]

O EDTA uma substncia anticoagulante. Existem outras substncias com

esta finalidade (citrato e heparina), porm se o DNA for utilizado para PCR no se

deve utilizar heparina, pois esta substncia interfere na atividade da enzima Taq

DNA polimerase.

2. Transferir 2,5 mL do sangue para um tubo Falcon de 15mL

3. Adicionar 10mL de Soluo A e vortexar at homogeneizar

4. Centrifugar por 10 min a 700 xg

5. Dispensar o sobrenadante

6. Ressuspender o pellet em 5mL de Soluo A

7. Vortexar at dissolver completamente o pellet

8. Centrifugar por 10 min a 700 xg

9. Repetir os passos 4 9 at obter somente as clulas brancas (o pellet

deve estar branco cremoso).

Resduos de hemoglobina inibem a reao de PCR

10. Ressupender o pellet em 500L de Soluo A e transferir para microtubos

de 1,5mL

11. Centrifugar 5 min a 16.000 xge descartar o sobrenadante.

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As clulas brancas assim preparadas podem ser armazenadas entre -20C e -

80C

B) Extrao e purificao do DNA

1. Ressuspender o pellet em 500L de Soluo B

2. Vortexar at o pellet desprender do fundo do tubo

3. Incubar a 55C por 4-6 horas (ou overnight). Vortexar periodicamente

durante a incubao para que a dissoluo do pellet seja completa

A Soluo B contm Tris HCl (pH 8,0) que uma soluo tampo, cuja

finalidade manter o pH constante. Como o pH timo para a ao de DNases

endgenas por volta de 7,0, este reagente ajuda a evitar a ao destas nucleases.

O SDS um detergente inico forte, cuja funo romper as membranas celulares,

o EDTA age quelando ons Mg2+ e Ca2+ (que so co-fatores de diversas enzimas

nucleares como as DNases) e a proteinase K hidrolisa as protenas.

Se houver disponibilidade de um bloco aquecido com agitador (termomixer),

deve-se deixar as amostras agitando durante a incubao.

4. Adicionar 210L de TE (pH 7,6) e 240L de NaCl 5M

O NaCl far com que as protenas precipitem por excesso de ons. O TE um

tampo.

5. Agitar os tubos por inverso at formar pequenos cogulos

6. Incubar em gelo por 10 min

7. Centrifugar por 15 min a 16.000xg

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8. Recolher o sobrenadante dividindo-o em dois microtubos de 1,5mL

limpos (mximo de 500L de sobrenadante por tubo)

9. Adicionar 1mL de etanol 100% (absoluto) gelado em cada tubo e

misturar por inverso

fundamental que o volume de etanol corresponda , no mnimo, 02 vezes

o volume da soluo para que a precipitao do DNA seja eficiente.

Alternativamente, pode-se utilizar 01 volume de isopropanol temperatura

ambiente.

O lcool torna o meio muito hidrofbico para o DNA, fazendo com que ele

precipite sobre sua prpria estrutura.


11. Descartar o sobrenadante

12. Secar em papel

13. Adicionar 500L de etanol 70% gelado

O lcool 100% faz com que precipitem muitos sais juntamente com o DNA,

alm de dificultar a ressuspenso do DNA, por isso utiliza-se uma lavagem com

lcool 70%.


15. Descartar o etanol e secar o pellet

16. Adicionar 250L de TE+RNase (10g de RNase por mL de amostra) e

incubar por 1h a 37C

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Este protocolo isola juntamente com o DNA uma quantidade considervel de

RNA, por isso o tratamento com RNase se faz necessrio para remover este

contaminante.

2.2.EXTRAO DE DNA DE SANGUE UTILIZANDO O KIT GFX

Mrcia Cristina de Sena Oliveira

1. Colocar 300 L de sangue e 900 L de soluo de lise em microtubo de 1,5

mL

2. Homogeneizar, centrifugar a 21.000 xg por 5 minutos e descartar o

sobrenadante

3. Homogeneizar e adicionar 500 L de soluo de extrao

4. Incubar por 5 minutos temperatura ambiente e transferir o contedo do

tubo para a coluna de extrao acoplada a um tubo coletor

5. Centrifugar a 5.000 xg por 1 minuto

6. Adicionar coluna 500 L de soluo de extrao e centrifugar a 5.000 xg

por 1 minuto

7. Adicionar coluna 500 L de soluo de lavagem e centrifugar a 21.000 xg

por 3 minutos

8. Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL, limpo e livre de DNAses

9. Adicionar 100 L de gua bidestilada, autoclavada e aquecida a 70C.

Incubar por 1 minuto temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 xg por 1

minuto

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3. EXTRAO DE RNA

Adriana Mrcia Guaratini Ibelli


Simone Cristina Mo

A anlise do RNA pode fornecer informaes importantes sobre expresso

gnica. Para que isto seja possvel, necessrio que seja feito uma purificao

eficaz do RNA, mantendo sua integridade e qualidade.

Os mtodos para isolamento de RNA baseiam-se na lise e na desnaturao

das clulas que permitem a liberao dos cidos nuclicos totais e na presena de

inibidores que impedem a ao de ribonucleases (RNAses) (Ausubel, 1987).

A principal dificuldade na extrao de RNA a presena de grande

quantidade de ribonucleases (RNAses) estveis e ativas nos tecidos, que permitem

que o RNA (altamente instvel) seja rapidamente degradado. Desta maneira, a

primeira etapa em todos os mtodos de isolamento de RNA aps a pulverizao dos

tecidos, a exposio deste material a tampes de extrao. Estes apresentam

substncias como o cloreto de ltio que auxilia a precipitao do RNA e isotiocianato

de guanidina que permite a manuteno do RNA intacto nas etapas posteriores da

extrao, atravs da degradao das ribonucleases endgenas (Sambrook, 2002).Atualmente, h vrios reagentes comerciais como, por exemplo, Trizol

(Invitrogen) e Brazol (Lab Trade do Brasil) que possuem em sua composio

reagentes combinados, como isotiocianato de guanidina e fenol, possibilitando uma

extrao de RNA mais rpida que a dos protocolos convencionais e garantindo a

integridade do material (Sambrook, 2002).

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necessria ainda a adio de clorofrmio ao tampo contendo RNA que

solubiliza os lipdios permitindo a sua remoo. Aps a centrifugao, trs fases

podero ser observadas: uma rsea formada pela presena do fenol, uma interfase

formada pelo clorofrmio e DNA e uma fase aquosa, onde estar presente o RNA.

A precipitao do RNA feita com um lcool, como por exemplo, o

isopropanol. Nesta etapa, observa-se uma nuvem branca contendo o RNA.

Posteriormente, uma limpeza com lcool permite a retirada de sais que tenham

ainda aderido ao precipitado de RNA (Ausubel, 1987).

Na extrao de RNA, alguns fatores alm da escolha do protocolo utilizado,

so extremamente importantes para a obteno e a manuteno do RNA de

qualidade.

Primeiramente, todas as solues utilizadas devero ser feitas com gua

DEPC (dietilporocarbonato) autoclavada. O DEPC atua inativando RNAses, pois

degrada as histidinas presentes.

Os almofarizes, pistilos, vidrarias e outros utenslios devem ser previamente

esterilizados em estufa a 180 C por um perodo de quatro horas.

As ponteiras, tubos de polipropilenos devem ser novos e livres de RNAses.

As micropipetas devem ser utilizadas apenas para os procedimentos com

RNA.A bancada deve ser constantemente limpa com SDS 10% e com etanol 70%

e, se possvel, exclusiva para a manipulao de RNA.

E, principalmente, devem ser tomados cuidados com as luvas utilizadas, de

forma a mant-las livres das RNAses, normalmente liberadas abundantemente pelas

secrees da pele.

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3.1. Protocolo de Extrao de RNA (adaptado de Chomczynski, 1987)

1. Macerar o tecido em nitrognio lquido

2. Para cada 50 a 100 mg de tecido adicionar 1 mL de trizol (em tubo de

polipropileno de 1,5 mL). Homogeneizar em vrtex

3. Incubar 5 min a temperatura ambiente

4. Acrescentar 200 L de clorofrmio

5. Agitar vigorosamente com as mos por 15 segundos

6. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente

7. Centrifugar a 16.000 xg/4 C durante 15 min

8. Remover a fase aquosa para tubo limpo

9. Adicionar 500 L de isopropanol. Homogeneizar com as mos

10. Incubar por 10 min a temperatura ambiente

11. Centrifugar a 13.000 xg/4 C por 10 min

12. Descartar o sobrenadante

13. Lavar com 1 mL de etanol 75% (feito com gua DEPC)

(Neste ponto, pode armazenar em freezer -20C por at um ano)

14. Centrifugar a 10.500 xg/4C por 5 min

15. Secar o pelletdurante 15 min a temperatura ambiente

Obs. No pode ficar nada de etanol.

16. Ressuspender o pelletem gua DEPC (20 L a 50 L)

Obs. Verificar o tamanho do pellet, para avaliar em que volume ressuspender.

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4.QUANTIFICAO EM ESPECTROFOTMETRO:


Os cidos nuclicos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm. Para

fazer a leitura no espectrofotmetro, normalmente se utiliza uma diluio em gua.

Para estimar a concentrao de DNA utiliza-se a seguinte relao: 1 OD260= 50 g

DNA dupla-hlice (Regitano, 2001; Sambrook, 2002).

Dessa forma, a concentrao de DNA na amostra obtida pelo seguinte

clculo:

[DNA] =Valor da leitura em O.D. X 50 X Fator de diluio

As protenas absorvem luz no comprimento de onda de 280 nm. Sendo assim,

a relao A260/A280 fornece um parmetro de avaliao da qualidade das

preparaes de cidos nuclicos. Valores inferiores a 1,8 resultam de contaminao

com protena.

Utilize o espao abaixo para anotar o resultado da quantificao:

Amostra OD260 OD280 Razo Concentrao

A concentrao de RNA nas amostras tambm ser avaliada por

espectrofotometria, tendo uma alquota de amostra de RNA dissolvida em gua

deionizada, na proporo de 1:100 (5L de DNA: 495 L de gua deionizada

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autoclavada). O grau de pureza do RNA ser estimado pela razo entre as

absorbncias medidas a 260 e 280 nm, que deve ser igual ou superior a 1,75

(Sambrook, 2002). Para uma amostra de RNA pura tem-se que: OD260/OD280 =1,8 a

2,0. Uma densidade ptica igual 1,0 corresponde a 40 g de RNA (fita simples) por

mL. Desta forma a concentrao de RNA na amostra pode ser calculada atravs da

seguinte relao:

Concentrao de RNA (g/mL) = OD260X Fator de diluio (100) X 40

Utilize o espao abaixo para anotar o resultado da quantificao:

Amostra OD260 OD280 Razo Concentrao

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5. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Adelita Carolina Santiago



A reao em cadeia da polimerase nada mais do que a replicao in vitro do

DNA. Foi desenvolvida na dcada de 1980 por Karry Mullis, que conseguiu pela

primeira vez amplificar pequenos fragmentos de DNA. Em 1988, foi descoberta uma

enzima DNA polimerase termoestvel, isolada de Thermus aquaticus, permitindo

que este processo ganhasse automao (Saiki, 1988).

O impacto deste mtodo foi enorme, pois possibilitou facilidade, rapidez,

versatilidade na manipulao de cidos nuclicos, o que tornou a tcnica poderosa e

imprescindvel em grande parte dos procedimentos realizados atualmente.

utilizada, por exemplo, na realizao de seqenciamento, como diagnstico de

doenas, deteco de mutaes pontuais, entre outros.

Esta tcnica envolve trs etapas: desnaturao do DNA pelo calor entre 94-

95C, anelamento de primers seqncia alvo em fita simples, atuando de 3 a 5C

abaixo da temperatura de melting (35 a 60C) e uma etapa de extenso do primers

anelados por uma DNA polimerase termoestvel (72 a 78C)Alguns componentes so essenciais para que ocorra a PCR:

1. presena de uma DNA polimerase termoestvel, como por exemplo, Taq

(Termus aquaticus) a ou Tfl (T. flavus);

2. presena de um par de primers, oligonucleotdeos que funcionam como

ponto de incio da polimerizao;

3. ctions divalentes, como MgCl2;

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4. deoxinucleotdeos trifosfatados (dNTPs), com quantidades iguais de dATP,

dCTP, dTTP e dGTP;

5. DNA molde, podendo ser fita simples ou fita dupla;

6. Tampo para manuteno do pH, geralmente entre 8,3 e 9 temperatura

ambiente.

5.1. PROTOCOLO DE AMPLIFICAO DO MICROSSATLITE BMS1617

1. Retirar o DNA do freezer e deixar temperatura ambiente

2. Lavar as mos e colocar luvas

3. Limpar a bancada com lcool 70%

4. Marcar os tubos ou identificar a placa. Deve-se criar um registro das amostras

que sero amplificadas no caderno de laboratrio

5. Preparar o Mix de PCR.

Mix de PCR

Reagente [ ] doestoque

[ ] de uso Vol.(1 amostra)

Vol.(__ amostras)

H2O - - 8,235 LTampo* 10X 1X 1,25 LMgCl2* 20mM 1,5mM 0,94LdNTP 20mM 0,2mM 0,125L

Primer F 5M 0,1M 0,25LPrimer R 5M 0,1M 0,25LTaq 5U/L 1U 0,2LTOTAL 11,25 L

*Sempre verifique se o tampo contm ou no MgCl2. Caso j contenha, no h

necessidade de acrescentar. Acrescente o volume correspondente ao MgCl2 no

volume de gua.

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6. Distribuir 11,25L do MIX de PCR sem o DNA em cada tubo

7. Adicionar 1,25L de DNA (40 ng/L) em cada tubo

8. Levar ao termociclador

9. Utilizar o programa touch_54 do termociclador

ProgramaTouch_54

O BMS1617 um marcador molecular do tipo microssatlite de repetio tg,

localizado a cerca de 56,3 cM no cromossomo cinco em bovinos. Seus alelos

apresentam tamanho entre 143 e 171 bp.

Resultados:

Animal Gentipo

94C2

94C30 64C*

30

94C30

54C

30

72C

30

72C

45

4C

20 ciclos 5 ciclos

* A cada ciclo, a temperatura de anelamento reduzida em0,5C, at atingir a temperatura ideal do primer.

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5.2. PROTOCOLO DE AMPLIFICAO DO GENE DA TIREOGLOBULINA

1. Retirar o DNA do freezer

2. Lavar as mos e colocar luvas novas

3. Limpar a bancada

4. Tirar o DNA, o gelinho e reagentes (menos a Taq) do freezer

5. Marcar os tubos ou identificar a placa

6. Preparar o Emix

1 X X

H2O Milli Q 15,54 L L10x PCR Buffer 2,5 L LMgCl2(20mM) 2,44 L LdNTP (20mM) 0,25 L LPr up (5 M) 0,82 L LPr down (5 M) 0,82 L LTaq (5u / l) 0,13 L L

6. Distribuir 22,5L do Emix / tubo ou poo (se for placa de PCR), sempre

sobre um gelinho

7. Distribuir 2,5L DNA / tubo ou poo (se for placa de PCR)

8. Colocar as amostras em um termociclador, escolher o programa correto

para amplificao: Programa RFLP55.

Programa : RFLP55

35 ciclos

94.0 94.0

55.0

72.0 72.0

4.0

2 30

30

30

10

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6. ENZIMAS DE RESTRIO



As enzimas de restrio, tambm chamadas de endonucleases de restrio,

reconhecem uma seqncia especfica de bases em uma molcula de DNA, e

clivam a molcula naquela seqncia ou prximo dela. A seqncia de

reconhecimento chamada de stio de restrio. Diferentes enzimas de restrio

reconhecem e clivam diferentes stios de restrio.

Elas so indispensveis na anlise da estrutura dos cromossomos, no

seqenciamento de DNA, no isolamento de genes, na criao de molculas novas

de DNA que podem ser clonadas e em tcnicas como RFLP. Uma caracterstica

marcante de muitos desses stios de clivagem que eles possuem uma dupla

simetria rotacional, isto , a seqncia de reconhecimento palindrmica e os stios

de clivagem so simetricamenteposicionados.

6.1. DIGESTO DO DNA Tireoglobulina

Emix 1X Emix X

gua Milli Q 0,5 L LBUFFER 10X 1,4 L LMboI(10 U/l) 0,1 L LTotal 2 L L

Por reao colocar: 2,0 l Emix de digesto + 12l DNA amplificado (produto

de PCR). Realizar esta reao em uma placa de PCR ou em microtubos mdios,

mas sempre sobre o gelinho.

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A reao de digesto ser incubada a 37C em aparelho Thermomixer 5436

(Eppendorff).

O volume final da reao ser de 14 L, sendo 12 L de produto de

amplificao e 2 L de Emix de digesto. Este ltimo consiste de 10 mM TrisHCl (pH

8.0); 50 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM 2-mercaptoetanol; 0,1 mg/mL de BSAe 1

unidade da endonuclease de restrio MboI (depende do fabricante). A reao de

digesto ser incubada a 37C (depende do fabricante) por 3 horas.

Para anlise dos gentipos, os produtos das digestes sero separados em

gel de agarose 4% com tampo de eletroforese TBE 1X (90 mM Tris base, 90 mM

cido brico e 2 mM EDTA pH 8,0), submetidos voltagem de 3 V/cm e, corados

com Brometo de Etdeo incorporado no gel. Em cada poo do gel sero aplicados 14

L do produto de digesto acrescidos de 2,8 L de loading buffernuma proporo

de 5:1 respectivamente e, no primeiro poo de cada fileira do gel ser aplicada uma

amostra de padro de tamanho de DNA de 100 pb tambm acrescido de loading

bufferna mesma proporo acima.

Os fragmentos sero detectados sob iluminao UV e registrados por uma

cmera fotogrfica digital. Os tamanhos dos fragmentos sero estimados por

comparao com padro de tamanho de DNA de 100 pb em cada gel e assim ser

possvel determinar os gentipos de cada animal.

Os primers utilizados na PCR amplificam uma regio de 545 pares de bases

do gene da tireoglobulina, como ilustrado a seguir:

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>gi|790|emb|X05380.1| Bovine thyroglobulin gene exon 1 and flanks

AAGCTTCCTGCTGCCTTTTGGTTGTCTGACGTCCTGGGACAGAGGGGAAAGGG

GGATGACTACGAGTATGACTGTGCGTGTGTTTGGCTTATCTCATCAAAATCTCTA

CATTCTGTGTTAATGGATCTGCCTGTTTTGTTCCCTGCCATATCCTCATGGCCT

AGAATAGTGTCTGCTTCTCTATCAGACTCTAAAGAAACATTGCTAGGAGGGAAG

GAAGGAGCATGGATGAGGAGGGAGGGAGCATTGTGTTTCTCTCACGGTGGGCC

TGAACGTGTGGCCCACCAAGTTGTTAACTTTGGCCTTTACCCCTGAAGATGAATT

ATGAAGCCACACCCCCAGTTCTTCCTTGGTGGCTCAGATGGTCAAGAATCCACC

TGCAATGCGGGAGACCTGGGTTTGATCCCTGGGTTGGGAAGATCCCCTGGA

GAAGGGAATGGCTACCCACTCCAGTATTCTGGCCTGGAGAATCCCATGGACAG

AGGAGCCTGGCGGGATGCAGTCCATGGGGTCTCAGAGAGTCAGATGTGACTGA

GCGACTTTCACACACATTCGTCCCTGGTTCTGCTCCCCTACAGCCTCCACAAGA

TTTTCAC*CCCACACTGGCCACATGAGTGTCCTCCAGGGGAACAGACGCAGGTG

GAGGACCTCCTTGTGACCAGCAGAGAAAACAGGGTGGGCACTGCTTCCCTGAG

TGCCTGTGGGTGGGGGCTAAGTACCCACAGCAGTGCTATAAAGGCTCCTTGGC

CAGAGCCCTAAGGTGGGCAGCAGCTTCTAACCCTTCTCCCTGGAAGGCTCCCA

AGATGGCCCTGGCCCTATGGGTCTTCGGTCTGCTGGACTTAATCTGCTTGGCAT

CCGCCAACATCTTTGGTAAGTTCTGACCCTGCGGTCTCAGAGCATCGGGTTGG

GAGGGACCTCTGAGGCCAACTCCTTGTTAGCCAGGACCTGCCCCAGGGCCATG

GAACATTTGTGACCTCATTTAATCCTCAGTGTCCCGAGGTCAGTTATGCACTCTT

TCCTTTTCAGATGAAGAGACAGAGGGTCTGAGAAGTCACAGAGTCAGTGATC

Obs. Os stios de anelamento dos primersesto sublinhados.

Em negrito, podem ser observados os stios de restrio

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Aps digesto com a enzima MboI, o alelo A caracterizado pela presena de

trs fragmentos de restrio, com 74, 193 e 278 pares de bases, respectivamente, o

alelo Bproduz fragmentos de 17, 74, 176 e 278 pares de bases.

Figura 1. Gel com fragmentos da tireoglobulina aps digesto com enzima de

restrio MboI. Na coluna 1, pode ser observado o padro de tamanho 100 pb, na

coluna 2, homozigoto AA, coluna 3, homozigoto BB e Coluna 4, heterozigoto AB.

Resultados

Animal Gentipo

1 2 3 4

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7. ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS



A eletroforese uma tcnica utilizada para separar, identificar e purificar

molculas carregadas (como DNA e protenas) (Maniatis, 1987). Este mtodo foi

introduzido por Tiselius, no ano de 1937 (Brammer e Iorczeski, 2002) e simples,

rpido e capaz de separar fragmentos que no so adequadamente separados por

outras tcnicas (Sambrook e Russel, 2002).

A tcnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por

exemplo), um tampo no qual est imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da

cuba onde esto contidos o tampo e o gel.

Sob a influncia de um campo eltrico, molculas carregadas e partculas

migram em direo ao plo oposto. A carga e a massa das molculas fazem com

que elas migrem em velocidades diferentes e, portanto, propiciam a separao

destas (Westermeier, 2005). Como os cidos nuclicos (DNA e RNA) possuem

carga eltrica negativa (devido ao grupamento fosfato) eles sempre migraro em

direo ao plo positivo. Ento, o fator determinante da taxa de migrao ser a

massa da molcula (quando se fala em cidos nuclicos, a massa diretamenteproporcional ao tamanho da molcula).

Existem vrios meios de suporte que podem ser utilizados (papel filtro,

membrana de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida). No caso dos gis, a

porosidade (que tem uma relao direta com a concentrao de agarose) determina

o poder de separao (Brammer, 2002).

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Na escolha do tampo, o principal fator a ser considerado sua capacidade

tamponante. Os dois tampes mais utilizados na eletroforese de cidos nuclicos

so o TAE (Tris, Acetato e EDTA) e o TBE (Tris, Borato e EDTA). O TAE mais

utilizado que o TBE, porm mais facilmente exaurido durante corridas longas ou

com alta voltagem. O TBE, apesar da melhor capacidade tamponante, deve ser

evitado quando se deseja purificar os cidos nuclicos do gel (Ausubel, 1994).

Alguns fatores alteram a migrao das molculas atravs do gel, dentre eles

podemos citar: concentrao de agarose, conformao do DNA e intensidade da

corrente.

A concentrao de agarose atua de forma importante na eletroforese, pois ela

determina a faixa de tamanho das molculas de DNA que podem ser separadas. As

relaes entre concentrao de agarose e resoluo de molculas lineares de DNA

so apresentadas na tabela abaixo (Maniatis et al., 1982).

Tabela 1. Limites de eficincia da separao de DNA em diferentes concentraes

de agarose (Maniatis, 1987)

Concentrao de agarose nogel (%)

Separao de molculas de DNA(Kb).

Limites de eficincia

0,3 60 5,00,6 20 1,0

0,7 10 0,8

0,9 7 0,5

1,2 6 0,4

1,5 4 0,2

2,0 3 0,1

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Para observar cidos nuclicos em gel de agarose, deve-se cor-los e

submet-los a uma luz ultravioleta. O corante mais comum o brometo de etdeo,

que se intercala entre as bases do DNA (Ausubel, 1994).

7.1. Protocolo para anlise de produtos de amplificao e fragmentos de

digesto em gel de agarose

gel 1% 0,3 g de agarose para 30 mL de gel, que deve ser preparado com

tampo Tris-Borato-EDTA 1X. Para isso, aplicar 5 l de produto de amplificao

+ 1 l deloading buffer.

gel 4% 1,2 g de agarose de baixo ponto de fuso para 30 mL de gel, que deve

ser preparado com tampo Tris-Borato-EDTA 1X. Utilizado para analisar o

resultado das digestes com enzimas de restrio. Aplicar todo o produto da

digesto (13 l) + 2,6 l deloading buffer.

1. Pesar a agarose

2. Coloc-la em um erlenmeyer contendo o volume necessrio de tampo TBE 1X

3. Aquecer no forno de microondas at iniciar a ebulio (aproximadamente 30

segundos em potncia mdia para um gel de 30 mL). Agitar o frasco e retornar

ao forno de microondas por mais alguns segundos

4. Aguardar a reduo da temperatura para aproximadamente 60 o C e adicionar

Brometo de Etdio, na quantidade indicada para cada gel

5. Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes

6. Aps a solidificao, colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampo

TBE 1X

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7. Aplicar as amostras acrescidas de loading buffere aplicar a corrente de acordo

com o tamanho do gel

A eletroforese deve ser realizada em TBE 1X, a uma voltagem constante na faixa

de 2 a 5 V/cm (considerando a distncia entre os eletrodos). Aps a corrida,

submergir o gel por 20 minutos em soluo de brometo de etdio a 0,5 g/mL e

visualiz-lo sob luz ultra-violeta. Caso o fundo do gel esteja muito corado, pode-

se lavar o excesso de brometo por submerso em TBE 1X por 5 a 10 minutos

O Brometo de etdio um potente agente mutagnico. Utilizar luvas e mscara

para preparar a soluo estoque e manipular os gis

A luz ultra-violeta produz queimaduras severas. Utilize mscara/culos de

proteo adequados

7.2. GEL DESNATURANTE PARA RNA


Para analisar molculas de RNA podem ser utilizados gis de agarose e

poliacrilamida, desnaturantes ou no. As propriedades desta eletroforese so

basicamente semelhantes s de eletroforese de DNA (Patel, 1994).A qualidade das molculas de RNA pode ser analisada em gel de agarose

normal, feito com tampo (TBE, TAE) com gua DEPC ou em gel desnaturante.

Devido a interaes intramoleculares, as molculas de RNA podem dobrar-se,

alterando a estrutura secundria e afetando a migrao das molculas no gel. O gel

desnaturante soluciona este problema, pois sob condies desnaturantes as pontes

de hidrognio so rompidas e o RNA migra como molcula de fita simples. Isto

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permite avaliar com acurcia a qualidade e o peso molecular do RNA (Sambrook,

2002; Maseka, 2005).

Dentre os desnaturantes existentes, o mais poderoso, alm de caro e

altamente txico o hidrxido de metil mercrio. Porm, o mais freqentemente

utilizado o formaldedo, mas pode haver variantes de gis utilizando tiocianato de

guanidina, formamida e DMSO. A utilizao de cada um deles apresenta vantagens

e desvantagens de acordo com a escolha do tipo de gel, poliacrilamida ou agarose,

diferentes nveis de toxicidade e potencial de desnaturao (Patel, 1994).

Os gis polimerizados com formaldedo no coram satisfatoriamente as

amostras, de forma que o brometo de etido deve ser colocado em cada amostra

individualmente, e no no gel, como comumente utilizado (Regitano, 2001).

Outro diferencial no gel desnaturante de agarose a utilizao de MOPS (3-

N-morfolino cido propanosulfnico). O MOPS um excelente tampo para

manuteno de sistemas biolgicos em pH neutro. muito utilizado em biologia

molecular e bioqumica.

Figura 2. Exemplo de separao eletrofortica. Nos nmeros 1 a 3 so mostradas

as bandas 28S, 18S e 5S do RNA, indicando integridade das amostras. O nmero 4

exemplifica uma amostra de RNA degradada.

28S

18S

5S

1 2 3 4

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7.2. PROTOCOLO DE GEL DESNATURANTE DE AGAROSE 1% COM

FORMALDEDO (adaptado de Lcia Elvira Alvares (2001):

Reagente QuantidadeAgarose (1%) 0,3 gBuffer 5X (1 x) 6,0 mLFormaldedo (2,2M)* 5,4 mLgua DEPC 18,6 mLTotal 30 mL

* verificar se o pH do formaldedo superior a 4

A vidraria utilizada para a preparao do gel, assim como a cuba de

eletroforese devem estar previamente tratadas contra ao de RNAses. Todas as

solues empregadas devem ser feitas com gua DEPC.

Tampo de corrida 5X

Reagente QuantidadeMOPS (100 mM) 20,6 g

Acetato de sdio 0,05 M (40 mM) 800 mL

EDTA 0,5 M pH 8,0 (5 mM) 10 mL

1. Pesar o MOPS

2. Dissolv-lo em acetato de sdio 0,05 M. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 2N

e completar o volume para um litro de gua DEPC

3. Adicionar o EDTA 0,5 M pH 8,0. Guardar protegido da luz

4. Diluir este tampo para concentrao final de 1X com gua DEPC

Tampo da Amostra

Reagente QuantidadeTampo de Corrida 5X 300 LFormamida (50 %) 750 LFormaldedo (10 %) 150 LAzul de bromofenol (0,4 %) 0,004 ggua DEPC 300 L

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1. Acrescentar 3 L do tampo da amostra para cada 1 L de RNA

2. Acrescentar 1 L de brometo de etdio (0,05 g/L)

3. Incubar as amostras por 15 minutos 65 C

4. Transferir para um recipiente contendo gelo

5. Centrifugar rapidamente para recolher o contedo no fundo do tubo

6. Manter em gelo at aplicar as amostras no gel

7.3. ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILARGustavo Gasparin

Durante dcadas, a eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose foi

intensamente utilizada como uma das ferramentas mais importantes dos laboratrios

de biotecnologia e bioqumica para a anlise de macromolculas. Nos ltimos anos,

porm, a eletroforese capilar tem apresentado vantagens em relao tcnica de

eletroforese em placas. Para a anlise simultnea de amostras, instrumentos de

eletroforese capilar com arranjo de capilares so os mais utilizados. Existem

aparelhos que possuem desde um nico capilar, at 384 capilares, possibilitando a

maximizao do tempo necessrio para as mais diferentes anlises, desde deteco

de resduos de explosivos e drogas, at testes de paternidade.

A separao das macromolculas conduzida em tubos de dimenses de 15

a 100 m de dimetro interno, e 36 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um

eletrlito. O uso do capilar fornece vantagens sobre as placas de gel devido s

razes geomtricas, em que h uma elevada relao entre a rea superficial e o

volume interno, permitindo a dissipao eficiente do calor gerado pela corrente

eltrica, e possibilitando a aplicao de campos eltricos elevados (100 a 500 V/cm),

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o que resulta em separaes de alta eficincia, alto poder de resoluo, e reduzido

tempo de anlise.

Em geral, um aparelho de eletroforese capilar bsico consiste de uma fonte

de alta tenso, capilares (geralmente de slica fundida), eletrodos (de platina,

normalmente), e um detector apropriado. A fonte de alta tenso aplicada nos

eletrodos de platina situados nos reservatrios contendo uma soluo eletroltica

apropriada. As extremidades do capilar so imersas nos reservatrios da soluo,

para completar o contato eltrico. As amostras normalmente so introduzidas no

capilar por mtodos eletrocinticos, nos quais uma diferena de potencial

estabelecida entre o capilar e o recipiente que contm a amostra, durante um tempo

pr-determinado.

O detector localiza-se em algum ponto do capilar, prximo ao reservatrio de

sada.

A eletroforese capilar em gel (CGE) utilizada exclusivamente para

separao de macromolculas, tais como oligonucleotdeos, fragmentos de DNA, e

protenas. Teve incio com a aplicao nas separaes de DNA por tamanho

molecular, utilizando colunas preenchidas com gel, denominados gis qumicos: um

capilar tratado com um reagente que estabiliza o gel junto parede do capilar,

atravs de ligaes covalentes. Esse mtodo foi descartado dado o grande nmerode problemas que surgiram, tais como aparecimento de bolhas (perda de

condutividade), introduo limitada de amostra, reteno de fragmentos com alto

peso molecular, e degradao do gel por hidrlise. Tais problemas levaram

formulao de novos sistemas, que foram denominados gis fsicos.

Gis fsicos so matrizes polimricas hidroflicas, dissolvidas em tampo

apropriado, que no so ligados parede do capilar, podendo assim ser substitudos

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a cada separao, o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por centenas

de vezes, sem perda de eficincia. A uma dada concentrao de polmero, as fitas

polimricas individuais comeam a interagir umas com as outras, formando uma

estrutura em rede dentro do capilar, possibilitando a separao dos fragmentos de

DNA. A concentrao polimrica tima depende do tamanho do DNA a ser

separado.

7.4. PROTOCOLO PARA ANLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAO EM

SISTEMA CAPILAR

Antes da injeo no capilar, as amostras so desnaturadas em presena de

formamida, para evitar que a formao de estruturas secundrias afete a velocidade

de migrao. Um padro de tamanhos conhecidos aplicado junto com as amostras

para permitir a estimativa do tamanho dos fragmentos analisados.

Procedimento:

1. Preparar o MIX de formamida + padro interno de tamanho de fragmentos:

para cada amostra, colocar 8,85 L de formamida Hi-Di e 0,15 L de padro

(GS 500 ROX).

2. Aplicar esses 9 L de MIX em um pocinho da placa de corrida3. Aplicar 1 L de produto de PCR da sua amostra por pocinho

4. Desnaturar as amostras (j na placa de corrida) durante 5 minutos 95C

5. Colocar as amostras imediatamente no gelo aps a desnaturao,

permanecendo por 5 minutos.

6. Preparar a injeo das amostras no computador, atravs do software Data

Collection

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8. SEQENCIAMENTO

Kerli Ninov

Lilian Giotto Zaros

As duas tcnicas mais importantes para o seqenciamento de DNA so o

mtodo qumico de degradao de bases desenvolvido por Allan Maxam e Walter

Gilbert em 1977 e o mtodo didesoxi ou terminao da cadeia de Fred Sanger e

colaboradores em 1978.

Os dois mtodos so baseados na produo de um conjunto de fitas simples

de DNA que so separadas pelo princpio de eletroforese (Okubo, 1992). Se

comparado ao seqenciamento de Maxam e Gilbert, o mtodo de terminao da

cadeia de Sanger gera dados que so mais facilmente interpretados. Por isso, essa

tem sido a tcnica mais utilizada em Projetos Genoma (Sterky & Lundeberg, 2000).

SEQENCIAMENTO DIDESOXI OU POR TERMINAO DA CADEIA

baseado na incorporao de desoxinucleotdeos (dNTPs) e de

didesoxinucleotdeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como

molde o DNA de interesse.

Quando os ddNTPs so adicionados, a extenso da cadeia interrompida

pois esses didesoxinucleotdeos no apresentam um grupo hidroxila (OH) 3

necessrio para a ligao do prximo desoxinucleotdeo (dNTP). Como esses

ddNTPs so marcados, podem ser detectados e a seqncia dos nucleotdeos,

identificada.

Esse mtodo apresenta duas modalidades:

Seqenciamento Manual

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No mtodo manual, a sequncia de bases do DNA lida manualmente, aps

a exposio das bases identificadas em um filme de raio-X. Para isso so

preparados 4 tubos de reao, cada um contendo o DNA molde, a DNA polimerase

e um primer. Cada tubo recebe uma pequena quantidade de um dos ddNTP (dATP,

ddTTP, ddCTP e ddGTP) junto com um dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP ou dGTP)

marcados com fsforo radioativo (P32).

Em qualquer um dos 4 tubos sero produzidos vrios comprimentos de

cadeia, cada um correspondente ao ponto no qual o respectivo ddNTP desse tubo

foi incorporado e ocasionando o trmino do crescimento da cadeia. As amostras de

cada tubo so submetidas eletroforese e posterior exposio em filme de raio-X

para que a posio das bases correspondentes possa ser determinada lendo-se ao

longo das 4 colunas do gel (www.dnai.org).

Seqenciamento Automtico

O seqenciamento automtico utiliza seqenciadores com eletroforese

vertical em placa ou eletroforese em capilar onde cada ddNTP possui marcao

fluorescente, ao contrrio do mtodo manual, em que estes apresentam uma mesma

marcao radioativa.

Para a gerao de fragmentos durante a reao de seqenciamento, os

dNTPs so adicionados nova fita e no momento da adio de um ddNTP, aextenso da cadeia interrompida e conseqentemente marcada com o ltimo

didesoxinucleotdeo incorporado. No final de vrios ciclos tem-se vrias cadeias de

DNA de diferentes tamanhos terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente

sero identificados (lidos em seqenciador automtico).

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A reao de seqenciamento ocorre em termociclador e caracterizada por

vrias etapas ou ciclos em diferentes temperaturas, repetidos por vrias vezes por

um determinado perodo de tempo. Suas etapas so:

1- Desnaturao - a primeira etapa da reao de seqenciamento na qual a

molcula de DNA separada em fita simples. Para ocorrer a desnaturao eleva-se

a temperatura a 96C durante 2 minutos.

2- Anelamento - Caracterizada pela utilizao de um nico primer que ir se

anelar fita de DNA na regio complementar sua seqncia. Para ocorrer o

anelamento diminui-se a temperatura para 50C durante 15 segundos.

3- Extenso - Aps o anelamento do primer, ocorre a extenso do fragmento

atravs da insero dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) pela Taq DNA

Polimerase. Como os ddNTPs esto em concentraes muito menores que os

dNTPs, a sua insero na cadeia menos freqente. Essa etapa ocorre a 60C

durante 4 minutos. Quando os ddNTPs so inseridos no lugar dos dNTPs, a

extenso pra.

Aps a reao de seqenciamento, os produtos so submetidos

eletroforese capilar no seqenciador automtico. Os fragmentos marcados com

fluorescncia migram ordenadamente no interior dos capilares e medida que so

excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de ondaque so detectados por uma cmara CCD. Em seguida essa informao

transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados

possam ser recuperados em formato de eletroferograma ou de texto (fasta),

seguindo-se da anlise de bioinformtica.

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8.1. PROTOCOLO DE REAO DE SEQENCIAMENTO

Para a realizao de uma reao de seqenciamento so necessrios os

seguintes componentes:

- DNA template na concentrao de 100 a 150 ng/L para DNA plasmidial e

de 50 a 80 ng/L para produto de PCR;

- Primer: oligonucleotdeo complementar determinada regio do fragmento

de interessse (Ex: primeruniversal M13 R ou F);

- dNTPs: Desoxinucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

- ddNTPs: Didesoxinucleotdeos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP);

-Tampo contendo magnsio (Mg+2 ) e Tris-HCl, que atuam como co-fator

enzimtico e tampo para manuteno do pH, respectivamente;

- Enzima Taq DNA Polimerase

OBS: A enzima, os dNTPs e ddNTPs esto contidos no Kit ABI PRISMBig

Dye terminator v. 3.1 cycle sequencing.

Procedimentos:

1-Retirar as amostras e os reagentes do freezer e mant-los no gelo. Todos

devem estar totalmente descongelados;

2-Preparar o seguinte mix em microtubo de 1,5 mL:

Mix 1X

Big dye (2,5 X) 2 LBuffer Big Dye (5X) 1 LPrimer (3,2 pmol) 1 Lgua milliQ 5 LDNA (10 ng) 1 L

Total 10 L

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3 - Manter o mixno gelo e vortex-lo por alguns segundos;

4 - Dispensar o mixna placa de seqenciamento de acordo com a quantidade

estipulada;

5 - Adicionar a quantidade desejada de DNA ressuspendendo a soluo e

observando se o DNA est se misturando ao mix;

6 - Cobrir a placa com um tapete de borracha e lev-la ao termociclador

utilizando o programa adequado, como por exemplo:

Pr-incubao: 94 C por 2 minutos

Amplificao:

96 C por 20 segundos


60 C por 04 minutos

Resfriamento: 4 C por .

A tabela abaixo mostra a quantidade de amostra utilizada em uma reao de

seqenciamento:

25 ciclos de

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8.2. PURIFICAO DA REAO DE SEQENCIAMENTO

Aps a reao de seqenciamento necessrio purificar o material para que

os ddNTPs, dNTPs , primerse enzima no incorporados no interfiram na leitura no

seqenciador.

1. Adicionar 40L de isopropanol 65% a temperatura ambiente;

2. Vortexar alguns segundos e incubar no escuro a TA por 15 minutos;

3. Centrifugar por 25 minutos a 3000 xg a TA;

4. Descartar o sobrenadante por inverso e dar um pulso em centrfuga com a

placa invertida em um papel absorvente at 40 xg;

5. Adicionar 200L de etanol 60% e centrifugar por 5 minutos a 3000 xg a TA;

6. Descartar o sobrenadante por inverso e dar um pulso em centrfuga com a

placa invertida em um papel absorvente at 90 xg;

7. Secar no escuro por 1 hora;

8. Caso a aplicao em seqenciador automtico no seja feita imediatamente,

selar a placa com adesivo, embalar em papel alumnio e armazenar em

freezer 20C.

8.3. APLICAO EM ABI 3100

1. Ressuspender as amostras com 10L de formamida Hi-Di;

2. Desnaturar as amostras em termociclador por 5 minutos a 95 C;

3. Verificar a validade e a quantidade do polmero (POP6) e tampo (EDTA 10X).

O polmero vlido por cinco dias quando j no equipamento e o tampo tem

validade de 48 horas ou duas placas corridas. recomendvel a cada 15 dias retirar

o capilar, desmontar o aparelho e realizar uma limpeza em seus componentes;

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4. Enquanto isso, montar a planilha de corrida no software Data Collection em

Plate View;

5. Nesse momento aberta uma nova planilha:

- Sample name (.g)

- Dye Set (F);

- Mobility File (DT3100POP6- BDV3-V1.mob);

- Bio LIMS (3100Project);

- Run Module 1 (StsSeq50_POP6 Default Module);

- Analysis Module 1 (BC_3100_SeqOffFtoff.saz);

- OK

6. Esfriar a placa em gelo;

7. Montar a placa nos acessrios prprios do seqenciador;

8. Colocar a placa no seqenciador verificando na planilha Run View se ela

est corretamente instalada;

9. Clicar em Status View (Verificar voltagem, laser e temperatura);

10. Caso esteja tudo OK, clicar em Run.

11. Aguardar para verificar possveis erros durante o incio da corrida;

12. Aps 40 minutos, possvel o acompanhamento da corrida pela visualizao

da imagem de cada capilar;13. Ao trmino da corrida analisar os dados pelo software Sequence Analysis;

14. Adicionara corrida desejada atravs do Add Files e clicar em Start;

15. Aguardar a execuo da tarefa;

16. Abrir os eletroferogramas e avaliar os resultados obtidos.

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9. SNTESE DE DNA COMPLEMENTAR (cDNA)



A converso enzimtica de mRNA para cDNa foi descoberta na dcada de

1970 por Kacia, Ross, Verma e colaboradores (Sambrook, 2002).

A sntese da primeira fita de cDNA realizada por uma enzima transcriptase

reversa dependente de RNA, geralmente isoladas de vrus, que usa amostras de

RNA mensageiro (poli A) ou RNA total como molde. Atualmente, diversas espcies

de transcriptases reversas so comercialmente utilizadas, como Mo-MLV, ALV e

SuperScript RT II (manual do usurio, 2003).

Para que esta converso seja feita, so necessrios:

- dNTPs: altas concentraes de dNTPs so importantes para a obteno de

boa eficincia na sntese do cDNA.Em baixas concentraes (< 50 M) h

decrscimo significativo na produo da primeira fita. Geralmente, so utilizados

cerca de 200 a 250 M de cada dNTP (Maniatis, 1987).

- um oligonucleotdeo, sendo o mais utilizado o oligo dT, pois sintetiza a

primeira fita a partir de RNAs de cadeia poli A (manual do usurio, 2003).

- tampo: a presena deste reagente importante, pois a alterao do pH

acarreta a diminuio da eficincia da incorporao e da produo de transcritos. O

pH timo geralmente 8,3. J foi observado que pequenas alteraes de pH, de at

0,5 resultam em diminuio de at 5X na produo do cDNA (Maniatis, 1987).

- MgCl2: os ctions divalentes so importantes na transcrio reversa pois

auxiliam na produo de transcritos completos em concentraes de 6 a 10 mM.

Quando fragmentos muito longos sero transcritos, podem ser utilizados ctions

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monovalentes, dentre eles, o mais indicado o potssio, que auxiliam na

manuteno da eficincia da transcrio.

- RNAse OUT (Invitrogen): degrada RNAses presentes durante a sntese do

cDNA (Manual do usurio, 2003).

- DTT ou ditiotreitol: um agente redutor que tem como principal funo

proteger oxidao de enzimas e protenas (Roche, 2004).

- RNAse H: utilizada no final da reao para remover hbridos RNA:cDNA

com a funo de aumentar a sensibilidade e a eficincia do PCR. A presena de

RNAse H durante a sntese do cDNA degrada o mRNA, causando um dficit na

produo desta molcula. Por isso, foram desenvolvidas transcriptases reversas que

apresentam atividade reduzida de RNAse H durante a produo da primeira fita e

que so adicionadas apenas no final da reao, para remoo de molculas hbridas

(Manual do usurio, 2003).

importante considerar que para que este procedimento tenha sucesso, o

RNA das amostras deve ser intacto e sua quantificao, precisa, para evitar

variaes na utilizao deste molde em tcnicas futuras, como por exemplo, em

arranjos de DNA ou PCR quantitativo.

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9.1.PROTOCOLO DE SNTESE DE CDNA

1. Descongelar e homogeneizar brevemente cada componente abaixo.

Preparar o mixRNA/primer:

Componente Para uma amostraAt 5 g de RNA total Mximo de 8 L*10 mM dNTP mix 1 LOligo dT 0,5 g/L 1 Lgua DEPC (do kit) Completar para 10 L*

*o volume deste mix deve ser 10 L. Assim, o volume mximo de RNA a ser

utilizado 8 L contendo de 1 ng a 5 g de RNA total. Se for utilizado 8 L, a gua

DEPC do kit no adicionada ao mix.

2. Incubar a 65 C por 5 minutos;

3. Esfriar em gelo por 1 minuto;4. Preparar o mix de reao adicionando cada componente a partir da

primeira linha da tabela. Este mixpode ser preparado em um tubo separado, junto

com a preparao do mixanterior. Se isso for feito, mant-lo sempre em gelo:

Componente Para uma amostraBuffer RT 10 X 2 LMgCl2(25 mM) 4 L

0,1 M DTT 2 LRNAse out 1 LTotal 9 L

5. Adicionar os 9 L do mixacima em cada tubo contendo o RNA/primer. Dar

um spin;


7. Adicionar 1 L (50 U) da enzima SuperScript RTII em cada tubo

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obs. Os tubos no podem ser colocados em gelo para adio da enzima RTII. A

temperatura deve continuar de 42 C;


9. Terminar a reao a 70 C por 15 minutos;

10. Esfriar no gelo e dar um spin;

11. Adicionar 1 L de RNAse H e incubar por 20 minutos a 37 C;

12. Estocar em freezer 20 C.

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10. PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL

Helena Javiel Alves

O mtodo de PCR quantitativa em tempo real muito sensvel e pode ser

usado quando necessrio quantificar a expresso de RNAs mensageiros em

baixos nveis. Esse procedimento permite a deteco direta dos produtos da PCR

durante a fase exponencial da reao, combinando amplificao e deteco em um

s passo.

O princpio da tcnica de PCR em tempo real pode se utilizar de duas

descobertas importantes: a primeira a atividade exonuclease 53 da enzima Taq

DNA polimerase e a segunda a construo de sondas de oligonucletdeos

marcadas duplamente. Essas sondas so baseadas no princpio FRET (do ingls,

Fluorescence Resonance Energy Transfer) e emitem sinal de fluorescncia somente

quando clivadas. Com o objetivo de detectar o sinal de fluorescncia durante as

reaes foram desenvolvidas vrias tcnicas. Em PCR em tempo real utilizando

sondas TaqMan(Figura 3), a sonda, especfica para o gene de interesse, marcada

duplamente com um fluorforo reprter em uma extremidade e um fluorforo

silenciador na outra. Na forma ntegra, a transferncia de energia fluorescente

ocorre de forma que a emisso pelo reprter absorvida pelo silenciador. Quando

ocorre a degradao da sonda pela atividade exonuclease da enzima Taq DNA

polimerase, durante a PCR, os fluorforos reprter e silenciador so separados e a

emisso de fluorescncia do reprter no ser mais absorvida pelo silenciador

resultando em aumento de emisso de fluorescncia pelo reprter que ser

detectada e quantificada.

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Figura 3.Sistema TaqMan. (A) Aps a desnaturao, os primerse a sonda anelam-

se seqncia alvo. A emisso de fluorescncia no ocorre devido proximidade

entre o reprter e o silenciador. (B) Durante a fase de extenso, a sonda clivada

(53) pela atividade nuclease da enzima TaqDNA polimerase. Ento, reprter e

silenciador so separados, permitindo a emisso de fluorescncia pelo reprter.

Mais recentemente, outros sistemas sofisticados tm sido desenvolvidos

como, por exemplo, molecular beacons, scorpions e sondas para hibridizao.

Esses sistemas so baseados no princpio FRET, porm sem a necessidade de

hidrlise por atividade nuclease.

Outra forma de deteco a utilizao de corantes como SYBR Green

(Figura 4), que se liga ao DNA dupla fita emitindo fluorescncia. O uso desse

mtodo de deteco tem sido bastante empregado em ensaios de PCR quantitativa

em tempo real, pois tem a vantagem de ser mais barato em relao construo de

sondas marcadas. Um aspecto importante no uso de SYBR Green que os primers

utilizados na reao de PCR devem ser desenhados cuidadosamente para evitar a

primer direto

primer reverso

reprter

silenciador

polimerase polimerase

silenciadorreprter

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amplificao de produtos inespecficos e formao de dmeros, uma vez que esse

corante se liga a qualquer DNA dupla fita.

Figura 4. Sistema SYBR Green. (A) O corante livre na soluo no emite

fluorescncia. (B) Quando o corante se liga ao DNA fita dupla ocorre a emisso de

fluorescncia.

Usando qualquer uma das qumicas apresentadas, o aumento na emisso de

fluorescncia pode ser lido por um detector em tempo real, durante a reao de PCR

e uma conseqncia direta da amplificao da seqncia de DNA de interesse.

Um programa de computador calcula um Rn usando a seguinte equao:

Rn= Rn+- Rn-

Onde: Rn+= emisso de fluorescncia em cada ponto;

Rn-= emisso de fluorescncia na linha de base.

SYBR Green

Seqncia alvo

fluorescncia

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O computador constri os plotsde amplificao usando os dados de emisso

de fluorescncia durante a PCR. Os valores de Rn so plotados vezes o nmero

de ciclos de amplificao. Durante os ciclos iniciais da amplificao por PCR, os

valores de Rn no excedem a linha de base. Portanto, um ciclo limiar (Ct)

arbitrrio escolhido baseado na variao da linha de base. Os valores de Ct so

ento calculados por determinao do ponto no qual a fluorescncia excede esse

limiar escolhido. O Ct definido como o nmero de ciclos nesse ponto (Figura 5).

Figura 5.Exemplo de construo dos plots de amplificao, onde Rn plotado

contra o nmero de ciclos.

Existem dois mtodos mais comumente utilizados para analisar dados de

experimentos de PCR quantitativa em tempo real, so eles: o mtodo de

quantificao absoluta (mtodo da curva padro) e o mtodo de quantificao

relativa.

Mtodo de quantificao absoluta O nmero de cpias do gene de interesse

determinado relacionando-se o sinal da PCR com uma curva padro. Para a

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construo da curva padro, so utilizadas diluies seriais de uma amostra de

concentrao conhecida. Esse mtodo tem a vantagem de que a curva padro

includa em cada PCR fornece um controle extra e correo na eficincia da PCR de

cada amostra individual, tornando mais confiveis as comparaes entre

experimentos.

Mtodo de quantificao relativa Esse mtodo mais usado quando existem

muitos genes a serem testados em muitas amostras. Nesse caso, feita a relao

entre o sinal da PCR de um gene de interesse entre um grupo tratado com uma

amostra controle (por exemplo, uma amostra no-tratada). Esse procedimento tem a

vantagem de no necessitar da construo de curvas padro. Por outro lado, as

eficincias de amplificao dos genes de interesse e controle tm que ser similares

para a obteno de resultados confiveis.

Em ambos mtodos so utilizados genes constitutivos para a normalizao

das amostras. Tais genes devem ter expresso constante em todos os tecidos e em

todas as fases de desenvolvimento, bem como no serem afetados pelos

tratamentos experimentais. O gene mais utilizado com esta finalidade o gene da -

actina.

O mtodo de PCR quantitativa em tempo real tem se mostrado uma

ferramenta de extrema importncia na quantificao de RNAs mensageiros em

baixos nveis, tornando a quantificao mais rpida e acurada.

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10.1. PROTOCOLO DE UMA PCR EM TEMPO REAL

1. Preparar o Sybr Green mix* para 50 reaes. Este procedimento realizado

com o objetivo de padronizar os componentes da reao que sero distribudas para

cada amostra. O mixconsta de:

100 L de tampo de reao 10X (tampo da enzima TaqDNA polimerase)

2 L de Sybr GreenI 10X concentrado **

73 L de gua (ultra-pura)

25 L de DMSO

** Manter a soluo contendo Sybr Greenao abrigo da luz

2. Preparo do mixde PCR em tempo real:

Reagente Volume1 reao (L)

Concentraofinal

Vol.(__ amostras)

dNTP (10 mM) 0,4 0,2 mMPrimer F (2,5 pmol/L) 1,0 0,125 pmol/LPrimer R (2,5 pmol/L) 1,0 0,125 pmol/L

MgCl2(50 mM) 1,0 2,5 mMTaq (5U/L) 0,3 1,5 USybr Green mix * 4,0BSA (20 mg) 0,25 0,25 g/reaogua 11,05Volume final 19

3. Colocar 19 L do mixde PCR em cada pocinho da placa;

4. Colocar 1 L do cDNA (25 ng/L) de cada amostra no respectivo pocinho da

placa; . Homogeneizar bem a mistura (amostra + mix);

5. Dar um pulso cuidadosamente (por centrifugao a 3000 rpm);

6. Colocar a placa no aparelho de PCR em tempo real;

7. Escolher o programa de amplificao do gene de interesse. Para o gene MCP-

1, utiliza-se o seguinte programa :

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Pr-incubao: 95 C por 5 minutos

Amplificao:


56 C por 5 segundos


78 C por 3 segundos

Curva de melting:

95 C por 0 min

68 C por 15 min

95 C por 0 min

Resfriamento: 40 C por 30 s

55 ciclos de

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11. MAPEAMENTO DE QTLs QTL EXPRESS

Millor Fernandes do Rosrio

Ktia Nones

O QTL EXPRESS (Seaton, 2002) o programa mais utilizado para mapear

QTLs em populaes parcialmente endogmicas, como nas espcies de animais

domsticos. Este programa pode ser acessado atravs de: http://qtl.cap.ed.ac.uk/.

Ele implementa o mapeamento por intervalo (Lander e Botstein, 1989) atravs da

aproximao de quadrados mnimos (Haley et al., 1994), realizando uma varredura

dos intervalos entre dois locos adjacentes, testando a hiptese inicial de que no h

QTL no intervalo considerado.

O programa considera que h fixao dos alelos contrastantes do possvel

QTL nas linhagens fundadoras da populao utilizada para mapear os QTLs.

Operacionalmente, a primeira linhagem parental relacionada no arquivo degentipos considerada como fixada para o alelo QTL Q e a segunda fixada para q.

Tambm se baseia na estimao das probabilidades de identidade por

descendncia (IBD) dos alelos em cada loco considerando um conjunto de dados

multilocos, alm de testar um modelo estatstico, podendo incluir efeitos fixos e

covariveis para as observaes (fentipos) e os coeficientes IBD.

O programa possui diferentes opes de anlises de acordo com o

delineamento utilizado na populao a ser estudada (F2 e half-sib so os mais

usados). Em cada uma dessas opes so encontradas instrues sobre os

formatos dos arquivos a serem utilizados no programa.

A seguir descrito o formato dos trs arquivos (gentipos, mapa e fentipos)

que devem ser criados para realizar as anlises no QTL EXPRESS utilizando a

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opo F2ANALYSIS. Todos os arquivos devem ser tipo texto, onde os dados so

separados por espaos ou tabulao.

ARQUIVO DE GENTIPOS:

1 linha Nmero de marcadores

2 linha Lista dos nomes dos marcadores qualquer caracter alfanumrico.

3 linha Nome dado a cada gerao (nome das linhagens parentais, F1e F2)

4 linha Indicao de sexo (1-macho e 2-fmea, ou M-macho e F-fmea)

5 linha Smbolo que representa dados perdidos (*, ou -, ou 0)

6 linha Dados de cada indivduo, na seguinte ordem:

1) Identificao do indivduo, qualquer caracter alfanumrico.

2) Identificao do pai; no caso dos parentais onde a identificao do pai

desconhecida utilizar *, ou , ou 0.

3) Identificao da me, igual do pai.

4) Sexo, de acordo com o definido na linha 4.

5) Linhagem ou gerao, como definido na linha 3

6) Gentipos dos marcadores, cada dois valores correspondem aos alelos de

um marcador; os gentipos devem estar na mesma ordem da lista dos

marcadores (linha 2)

Este arquivo pode ser obtido reformatando o arquivo .gen do CRIMAP oucriado atravs do EXCEL.

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EXEMPLO:

14

MK1 MK2 MK3 MK4 MK5 MK6 MK7 MK8 MK9 MK10 MK11 MK12 MK13 MK14

LW MS F1 F2

1 2

0

1039 1529 1530 1 F1 4 1 4 7 1 2 1 2 5 2 1 1 2 5 4 2 1 2 1 3 2 4 6 3 1 2 5 2

1040 1529 1530 2 F1 4 1 4 7 1 2 1 2 7 2 1 1 2 5 2 5 1 2 1 3 2 4 1 3 4 2 0 0

ARQUIVO DO MAPA DE LIGAO:

1 linha Nmero de cromossomos.2 linha Intervalo para clculo das probabilidades genotpicas e coeficientes em

cM.

3 linha Nome do primeiro cromossomo, nmero de marcadores deste

cromossomo, determinar se o mapa ser construdo para os dois sexos (=1) ou no

(=2).

4 linha Para o primeiro cromossomo ou grupo de ligao, indicar os nomes dos

marcadores em ordem, separados pelas distncias entre eles em cM. Os nomes dos

marcadores devem ser os mesmos utilizados no arquivo de gentipos. Se for feita a

opo pela utilizao do mesmo mapa para os dois sexos, esta linha aparece

apenas uma vez, se os dois sexos tiverem mapas separados esta linha aparece

duas vezes com diferentes distncias.

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Repetir as linhas 3 e 4 para cada cromossomo.

EXEMPLO:

2

1

SSC1 7 1

MK2 42 MK1 28 MK7 8 MK10 28 MK3 3 MK4 22 MK5

SSC7 7 1

MK6 35 MK8 25 MK9 17 MK11 22 MK12 25 MK13 21 MK14

ARQUIVO DE FENTIPOS:

1 linha Nmero de efeitos fixos, covariveis e caractersticas, respectivamente.

2 linha Nome de cada efeito fixo, covarivel e caracterstica.

3 linha Cdigo para dados perdidos; os indivduos podem ter dados perdidos para

as caractersticas fenotpicas, mas todos devem ter valores para efeitos fixos e

covariveis.

4 linha Identificao do indivduo (mesma do arquivo de gentipos), seguida dos

valores de efeitos fixos, covariveis e caractersticas.

EXEMPLO:

2 1 1

Sexo Grupo Peso Esp_Toucinho

-999

1117 1 1 67800 19

1118 2 1 75400 24

1119 2 1 69800 29

1124 1 1 64800 18

1125 1 1 65800 19

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Depois dos arquivos organizados conforme os modelos acima, seleciona-se o

delineamento a ser utilizado na anlise (Ex: F2Analysis). Nesta janela temos acesso

aos arquivos atravs de um browse para cada um dos arquivos (gentipos, mapa e

fentipos) clicando em seguida no boto SUBMIT. Neste momento os gentipos

so checados para erros, pela comparao dos alelos nos parentais e nas

prognies, em famlias de irmos completos e meio-irmos. Os erros so indicados

em uma janela (Fatal errors) para anlise e correes.

Se no forem encontrados erros, a anlise avanar e uma nova janela

estar disponvel, indicando o nmero de famlias de irmos completos e o nmero

total da prognie que ser utilizada na anlise. Estar tambm disponvel uma tabela

indicando o nome e nmero de marcadores, suas distncias e o nmero de alelos

observados em cada marcador.

Para continuar o procedimento de anlise deve ser clicado o boto

CONTINUE; uma nova janela aparecer.

Nesta nova janela temos vrios campos para a escolha dos parmetros e dos

modelos a serem utilizados na anlise, juntamente com as caractersticas que se

deseja analisar. Depois de escolhidos todos os parmetros, clicar no boto

SUBMIT.Uma nova janela se abrir apresentando o resultado do mapeamento por

intervalos (em cM), da anlise estatstica (F, razo de verossimilhana e LOD) e

estimativas do efeito aditivo e de dominncia, alm dos grficos do mapeamento por

intervalo, dos efeitos de aditividade e dominncia e das permutaes.

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As permutaes so implementadas de acordo com a metodologia proposta

por Churchill e Doerge (1994) e tm por objetivo determinar os nveis de

significncia ou thresholdno cromossomo ou no genoma. O QTL EXPRESS tambm

permite que os intervalos de confiana de cada QTL mapeado sejam estimados de

acordo com a proposta de Visscher et al. (1996) por meio do procedimento de

bootstrapcom reamostragem.

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12. ARRANJOS DE DNA

Erika Cristina Jorge

Luiz Lehmann Coutinho

O seqenciamento de etiquetas de seqncias expressas (do ingls,

Expressed Sequence Tags, ESTs) e de genomas de organismos modelo resultam

na identificao de inmeras seqncias-motivo, cujos domnios estruturais

conservados fornecem pistas sobre as funes biolgicas que estes genes exercem

no organismo. No entanto, nem sempre possvel definir a funo biolgica dos

genes apenas com a informao da seqncia. A deteco e a quantificao do

nvel de expresso dos genes tambm contribuem para adicionar informaes

funcionais quelas obtidas pelo seqenciamento, revelando transcritos que so co-

expressos espacial e temporalmente, e tambm as relaes existentes entre eles.

O uso de ferramentas tradicionais de quantificao da expresso gnica

como Northern blot, dot blot e RT-PCR, por exemplo, apesar de precisos e robustos,

no apresentam a eficincia e a rapidez necessrias para acompanhar o ritmo de

descoberta de genes novos imposta pelo seqenciamento. Abordagens mais

eficientes para a anlise da expresso gnica constituem um desafio presente para

o estudo de um grande nmero de genes simultaneamente.

Os arranjos de DNA foram desenvolvidos justamente para permitir estudos de

expresso gnica em escala genmica. Surgiram como resultado da disponibilidade

das seqncias obtidas em projetos genoma e da robtica de alta preciso, capaz

de depositar inmeras pequenas amostras de DNA em superfcies slidas,

usualmente em uma lmina de microscpio ou membranas de nlion. O poder do

mtodo se deve ao fato de que os nveis de expresso de inmeros genes de

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interesse podem ser mensurados em um nico experimento de hibridizao,

fornecendo tanto a informao de qual tecido o gene expresso, quanto a

informao dinmica da expresso, revelando como o padro de expresso de um

gene se relaciona com os outros.

A principal aplicao dos arranjos de DNA a anlise comparativa da

expresso gnica em larga escala. Outras aplicaes incluem ainda a anlise da

variao no DNA em escala genmica (genmica comparativa), caracterizao de

interaes moleculares e a descoberta de reagentes antisenso efetivos (Southern et

al., 1999). Arranjos tambm vm sendo desenvolvidos para promover a

genotipagem de polimorfismos de base nica (do ingls, single nucleotide

polimorphisms, SNPs) em larga escala (Meaburn et al., 2005) e a determinao do

nmero de cpias de um segmento de DNA no genoma (Shaffer et al., 2006).

Este texto abordar os principais aspectos prticos da metodologia de

microarranjos para estudos de expresso gnica, procurando indicar os passos

desde a construo de uma plataforma at a anlise dos dados.

A construo da plataforma microarranjo

O primeiro passo do mtodo a seleo do conjunto de molculas de DNA

de interesse que sero impressas sobre a plataforma. Neste mtodo, as molculas

impressas so denominadas sondas e podem ser (1) colnias de bactrias fixadas

em membranas, contendo os fragmentos de DNA genmico ou cDNAs; (2) DNA ou

cDNA isolados, (3) produtos de PCR ou (4) oligonucleotdeos sintticos desenhados

para ensaiar genes particulares. A coleo de sondas imobilizadas no arranjo pode

representar genomas completos dos organismos de interesse, transcriptomas

tecido-especficos ou qualquer outro conjunto de genes de interesse.

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Alm das sondas representando os genes de interesse, o arranjo deve ainda

incluir espaos aleatoriamente distribudos para genes referncia, usados no

processo de normalizao dos dados de expresso. Estas referncias so tanto

controles positivos, que correspondem a genes que no alteram o nvel de

expresso entre os tratamentos testados (tambm conhecidos como genes

constitutivos), quanto controles negativos (plasmdio vazio) e espaos vazios, que

so teis para conferir e estabelecer o valor de backgroud usado nos clculos de

expresso. A escolha destes controles e a distribuio no arranjo crtica para a

qualidade dos dados gerados.

O nmero de molculas de DNA que podem ser impressas em um arranjo

varia de acordo com a plataforma utilizada e o tipo de sonda a ser impressa sobre

ela, sendo que os microarranjos de oligonucleotdeos sintticos, sintetizados in situ

sobre lminas de microscpio, os que comportam uma maior densidade. A

Affymetrix (www.affymetrix.com), umas das empresas que fabricam microarranjos

comercialmente, garante a sntese de DNA-chips contendo at 500.000 oligos em

uma nica lmina. J os arranjos de membranas suportam no mximo, ~9.200

clones impressos.

12.1. O MTODOO princpio deste mtodo baseia-se na hibridizao de cidos nuclicos, que

bastante sensvel e especfica, em conseqncia das propriedades de

complementaridade entre fitas de cidos nuclicos (Duggan et al., 1999). A amostra

biolgica de interesse fornece a populao de RNAs mensageiro (RNAm) que se

pretende quantificar, aqui denominada alvo. A cintica de hibridizao linear e a

quantidade de alvo hibridizado em cada sonda proporcional abundncia de

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RNAm do alvo e, portanto, correspondente ao nvel de expresso do gene na clula

ou no tecido do qual o alvo foi obtido.

Tipicamente, a transcrio reversa usada para obter os alvos, a partir de um

oligo-dT e na presena de nucleotdeos modificados, produzindo produtos marcados

na extremidade 3 de cada gene, diretamente complementar s sondas imobilizadas

no arranjo. Freqentemente, poolsde RNA total so marcados, para maximizar a

quantidade de mensagem que pode ser obtida de uma dada quantidade de tecido.

A pureza do RNA um fator crtico na performance da hibridizao, uma vez que

lipdios, protenas e carboidratos celulares podem interferir e causar ligaes no-

especficas dos alvos com as sondas. Para a deteco radioativa, P33-dCTP o

mais usado por ser um emissor de alta energia, permitindo distinguir os sinais entre

elementos fisicamente prximos um do outro. Para a deteco com marcadores

fluorescentes, Cye-3-dUTP e Cye-5-dUTP so os mais usados porque so de maior

eficincia de incorporao pela transcriptase reversa, apresentam boa

fotosensibilidade e rendimento, alm de serem altamente separveis em espectros

de emisso, permitindo a discriminao por filtragem ptica (Duggan et al., 1999).

Quando hibridizado ao DNA impresso na plataforma, o alvo marcado emite

um sinal, que detectado por um filme especfico (chamado phosphor imager), no

caso dos experimentos radiativos; ou diretamente pelo scanner, no caso dos

fluorescentes, resultando em imagens digitalizadas dos arranjos. Estas imagens so

ento, utilizadas em programas especficos (ArrayVision ou ImageQuant, por

exemplo), que geram gridscapazes de localizar cada um dos sinais no arranjo e de

convert-los em uma leitura quantitativa, relativa ao nvel de expresso do gene (Hal

et al., 2000).

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12.2. A ANLISE DOS DADOS

Experimentos seqenciais de hibridizao de arranjos geram resultados que

consistem basicamente em listas de genes e de valores correspondentes que

representam o nvel relativo de expresso dos transcritos detectados. Estas listas

podem ser extremamente complexas, uma vez que os arranjos apresentam uma alta

densidade de genes e, para cada um deles, os experimentos geram informaes

quantitativas referentes expresso em tratamentos diferentes (a anlise de dois

tratamentos com trs repeties em um arranjo contendo 5.000 clones, por exemplo,

permite gerar uma matriz com 30.000 entradas). O enorme volume de dados torna

imperativo o uso de programas computacionais para administrar e maximizar a

quantidade de informaes extradas.

Harrington e colaboradores (2000) definiram os passos necessrios para uma

anlise eficiente dos dados de arranjos gerados aps a obteno da imagem

processada: (1) normalizao dos dados, (2) filtragem dos dados e (3) identificao

do padro. A normalizao necessria para permitir a comparao direta do

padro de expresso e deve ser efetuada tanto entre amostras no mesmo arranjo,

quanto para o conjuntos de experimentos. A filtragem importante para restringir o

volume de dados. Por exemplo, comum considerar apenas os genes expressos

acima de um determinado valor estipulado pelo experimentador, desconsiderando

aqueles que no apresentarem variao do nvel de expresso entre os tratamentos.

O ltimo passo talvez seja o mais complexo. Encontrar o padro ou os grupos

de dados que podem ser usados para a determinao do significado biolgico dentro

de um enorme volume de dados pode no ser uma tarefa direta. A interpretao dos

dados varia desde uma lista de genes que so induzidos e reprimidos em funo do

tratamento, at anlises de agrupamentos sofisticadas, como por agrupamento

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hierrquico ou por sefl organizing maps (SOM). O agrupamento hierrquico tem

sido tradicionalmente utilizado em anlises filogenticas e usa uma combinao

progressiva de elementos mais similares para agrupar os genes por padro de

expresso. Os sefl organizing maps amostram o conjunto completo dos dados para

determinar as distncias entre eles e escolhe aleatoriamente pontos chamados

centrides, a partir dos quais, os genes so organizados (Harrington et al., 2000).

12.3. VANTAGENS E LIMITAES DO MTODO

Os arranjos fornecem um acesso ilimitado ao perfil de expresso dos genes

caractersticos de um tecido ou de um organismo, porque os genes, as ORFs (open

reading frames) e at mesmo regies intergnicas podem estar representadas na

plataforma. As informaes geradas por diversos experimentos podem ainda ser

integradas e utilizadas para a determinao de funes biolgicas dos genes

desconhecidos, para gerar uma viso global da atividade transcricional de um

genoma em resposta a qualquer estmulo ou para compreender os mecanismos que

controlam o desenvolvimento (Harrington et al., 2000).

Mas como todo mtodo, os arranjos tambm apresentam algumas limitaes.

A necessidade de conhecimento prvio da seqncia do gene preso plataforma

uma delas. Por isso, arranjos so construdos apenas para espcies que possuem

seqncias genmicas ou ESTs disponveis (Calsa Junior et al., 2004). Outras

limitaes incluem o alto custo dos equipamentos e a disponibilidade dos arranjos,

tais como: problemas associados com hibridizao cruzada entre transcritos e

seqncias-alvo (causada pela duplicao de genes); e a restrita sensibilidade dos

arranjos de ESTs para transcritos pouco freqentes, pobremente representados nas

bibliotecas e normalmente genes regulatrios importantes.

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13. PREPARO DAS SOLUES

Tris.HCl [tris(hydroxymethyl)aminomethane] - 1M

Dissolva 121g de Tris Base em 800 mL de gua MiliQ

Ajuste o pH desejado com HCl concentrado

Adicione gua at 1L

Autoclave

Cerca de 70 mL de HCl so necessrios para pH de 7,4 ; e cerca de 42 mL para pH

de 8,0.

Nota importante: O pH dos tampes com Tris muda significativamente com a

temperatura, caindo cerca de 0,028 para elevao de cada 1oC. O pH das solues

tamponadas com Tris deve ser ajustado na temperatura na qual as solues sero

usadas. Como o pK do Tris 8,08, o tampo no deve ser usado a pH abaixo 7,2

nem acima de 9,0.

No adicione DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) em solues com Tris, porque o DEPC

inativa essa substncia.

EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) - 0,5M (pH 8,0)

Dissolva 186,1g de Na2EDTA.2H20 em 700 mL de guaAjuste o pH para 8,0 com NaOH 10M (cerca de 50 mL)

Adicione gua MiliQ para 1 L.

Autoclave

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TE pH 7,6 (tampo Tris/EDTA)

Reagente Concentrao finalTris HCl pH 7,6 10mM

EDTA pH 8,0 1mMVolume para uma amostra 510 L

TBE(Tris/Borate/EDTA) 10X Tampo de Eletroforese

Soluo Estoque

Reagente QuantidadeTris Base (890 mM) 108 gcido brico (890 mM) 55 gEDTA 0,5M pH 8,0 (20 mM) 40 mLgua deionizada Completar para 1LTotal 1L

SOLUO DE RNase (10mg/mL)

Dissolver a enzima Ribonuclease A livre de DNase (Sigma R- 6513) em soluo

Tris.HCl 10mM (pH 7.5), NaCl 15mM.

Armazenar a -20C.

SOLUO DE PROTEINASE K (20mg/mL)

Dissolver 100 mg da enzima em 5 mL de soluo Tris-HCl 10mM (pH 7.5),

Cloreto de Clcio 20mM, Glicerol 50%.

Armazenar a -20C.

Loading Buffer 6 x

Bromophenol Blue 0,25%

Xileno Cianol 0,25%

Glicerol 30% em gua (estocar a 4C).

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Soluo A (Tampo de Hemlise)

Para 1 amostra (25mL):

Reagente Concentrao final X 1 amostraTris.Cl pH 7,6 1M 10mM 250 LMgCl20,5M 5mM 250 LNaCl 5M 10mM 50 Lgua deionizada Completar para 25 mL

Soluo B (Soluo de lise)

Reagente Volume x 1 amostra Concentrao finalTris.Cl pH 8,0 1 M 5L 10mMNaCl 5 M 10L 100mMEDTA pH 8,0 0,5 M 10L 10mMSDS 20% 12,5L 0,5%Proteinase K (20 mg/mL) 2,5Lgua deionizada 460,5 LVolume final 500 L

gua DEPC (dietilpirocarbonato):

Adicionar 100 L de DEPC para cada 100 mL de gua deionizada.

Agitar bem e incubar a 37C por 12 horas.

Autoclavar a gua DEPC por 45 minutos a 1 atm.

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