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EnVision™ DuoFLEX Doublestain System, (Link) Code SK110

Edition/ Édition/ Auflage 12/18

This kit contains reagents sufficient for 100-150 tests. For Autostainer Link Instruments.

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Contents Page Intended Use ................................................................................................................................... 3 Summary and Explanation ............................................................................................................... 3 Reagents ......................................................................................................................................... 3 Precautions ...................................................................................................................................... 5 Storage ............................................................................................................................................ 7 Reagent preparation ........................................................................................................................ 8 Specimen Collection and Preparation ............................................................................................. 8 Procedure ........................................................................................................................................ 9 Quality Control ............................................................................................................................... 11 Interpretation of Results ................................................................................................................ 11 References .................................................................................................................................... 35

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Intended Use For in vitro diagnostic use. Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System is intended for use in immunohistochemistry together with Dako Autostainer Link instruments. The system is designed for the simultaneous detection of multiple different antigens within one specimen. The system detects primary mouse and rabbit antibodies and the reaction is visualized by EnVision™ DuoFLEX DAB+ and EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogens. The EnVision™ DuoFLEX reagents are intended for use on formalin-fixed, paraffin embedded tissue sections.

Summary and Explanation Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System is designed for optimal staining on Dako Autostainer Link instruments, when using the protocol recommended in this package insert. This system is useful for the simultaneous detection of multiple antigens present in low or high concentrations within one specimen. The visualization is based on peroxidase (HRP) using DAB+ as chromogen and alkaline phosphatase (AP) using Permanent Red as chromogen. The system is biotin-free, thus significantly reducing non-specific staining resulting from endogenous avidin-biotin activity. The procedure is a simultaneous double staining where two antigens are visualized using HRP/DAB+ and AP/Permanent Red, respectively. EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block inhibits endogenous alkaline phosphatase, peroxidase, and pseudoperoxidase activity present in some tissues. After endogenous enzyme block, the first step is incubation of the specimen with an optimally diluted primary mouse and rabbit antibody cocktail, followed by incubation with the EnVision™ DuoFLEX /HRP reagent and then EnVision™ DuoFLEX /AP. The reaction is visualized by EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen for mouse antibody and EnVision™ DuoFLEX Permanent Red for rabbit antibody. All specified reagents, except the primary antibodies, are provided with the kit. We recommend the use of Dako DuoFLEX Ready-to-Use Cocktailed Antibodies or Dako concentrated Primary Antibodies. EnVision™ FLEX Antibody Diluent (K8006) is recommended for the dilution of Dako concentrated Antibodies. NOTE: The reagents in this kit are designed to operate as a system and should be used as described in the Procedure section. In particular, all reagents prior to the application of chromogen solutions should be used as instructed, even if only one chromogen is to be applied. Failure to adhere to the specified protocol may result in inappropriate staining results, including the possibility of no observable staining.

Reagents

A: Materials provided with Code SK110

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block Ready-to-Use

Endogenous enzyme block solution pH 2, containing 1-<5% hydrogen peroxide, detergents, enzyme inhibitors, and preservative.

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/HRP

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Ready-to-Use

Horseradish peroxidase and affinity-isolated immunoglobulins in the form of dextran polymer conjugates. Supplied in Tris/HCl buffer containing stabilizing protein and preservative.

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/AP Ready-to-Use

Alkaline phosphatase and affinity-isolated immunoglobulins in the form of dextran polymer conjugates. Supplied in buffer containing stabilizing protein and a preservative.

2 x 36 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer

Substrate buffer solution, pH 7.5, containing <0.1% hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and an antimicrobial agent.

1 x 2.16 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen

3,3’-diaminobenzidine tetra hydrochloride chromogen solution.

2 x 36 mL EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Substrate Buffer

Substrate buffer solution.

1 x 0.72 mL EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen

Permanent Red Chromogen solution.

3 x 30 mL EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)

50x concentrated Tris/EDTA buffer, pH 9

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1 x 1 L EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x)

20x concentrated Tris-buffered saline solution containing Tween 20, pH 7.6 (±0.1).

3 x 12 mL User-Fillable Reagent Bottle, 12 mL capacity

The bottles should be used for mixing and containing DAB+ Working Solution and Permanent Red Working Solution (see also Reagent Preparation section).

B. Materials required, but not provided Autostainer Link instrument Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (if necessary) Dako DuoFLEX Ready-to-Use Cocktailed Antibodies or suitably diluted concentrated rabbit or mouse antibodies from Dako Dako Instrumentation utensils Microscope slides General laboratory reagents for deparaffinization of paraffin-embedded tissue sections Mounting medium (aqueous or organic-solvent-based) and coverslips C. Optional Reagents K8004 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)

3 x 30 mL, 50x concentrated Tris/EDTA buffer, pH 9

K8005 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)

3 x 30 mL, 50x concentrated Citrate buffer, pH 6.1

K8006 EnVision™ FLEX Antibody Diluent

120 mL, Ready-to-Use Tris buffer, pH 7.2, containing 15 mmol/L NaN3 and protein

K8007 EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x)

1 x 1L, 20x concentrated Tris-buffered saline solution containing Tween 20, pH 7.6 (±0.1)

K8008 EnVision™ FLEX Hematoxylin

Precautions 1. For professional users. 2. EnVision™ DuoFLEX/HRP, and DuoFLEX/AP, contain material of animal origin. As with any

product derived from biological sources, proper handling should be used.

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3. Do not expose EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen or EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen or the prepared DAB+ Working Solution or Permanent Red Working Solution to strong light.

4. EnVision™ DuoFLEX Endogenous Enzyme Block contains < 0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl-3(2H)- isothiazolone, and is labelled:

Danger H314 Causes severe skin burns and eye damage. H317 May cause an allergic skin reaction. P280 Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective

clothing. P261 Avoid breathing vapor. P264 Wash hands thoroughly after handling. P272 Contaminated work clothing should not be allowed out of the workplace. P304 + P340 + P310

IF INHALED: Remove victim to fresh air and keep at rest in a position comfortable for breathing. Immediately call a POISON CENTER or physician.

P301 + P310 + P330 + P331

IF SWALLOWED: Immediately call a POISON CENTER or physician. Rinse mouth. Do NOT induce vomiting.

P303 + P361 + P353 + P363 + P310

IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water or shower. Wash contaminated clothing before reuse. Immediately call a POISON CENTER or physician.

P302 + P352 IF ON SKIN: Wash with plenty of water/... P333 + P313 If skin irritation or rash occurs: Get medical attention. P305 + P351 + P338 + P310

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Immediately call a POISON CENTER or physician.

P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional,

national and international regulations. 5. EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen, contains 1–5% biphenyl-3,3',4,4'-

tetrayltetraammonium tetrachloride, and is labelled: Danger

H350 May cause cancer. H341 Suspected of causing genetic defects. P201 Obtain special instructions before use. P202 Do not handle until all safety precautions have been read and understood. P280 Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective

clothing. P308 + P313 IF exposed or concerned: Get medical attention. P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional,

national and international regulations. 6. EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen, contains Fast Red KL salt. Caution. This

product contains a substance which has not yet been fully tested. Safety data sheet available for professional users on request. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to Safety Data Sheet (SDS) for additional information.

7. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) contains 5-10% trometamol, 1-5% nonylphenol, ethoxylated, and 1-5% acetic acid, (ethylenedinitrilo)tetra-, disodium salt, dihydrate. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) is labeled:

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Warning H319 Causes serious eye irritation. H411 Toxic to aquatic life with long lasting effects. P280 Wear eye or face protection. P273 Avoid release to the environment. P264 Wash hands thoroughly after handling. P305 + P351+ P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional,

national and international regulations.

8. EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) contains 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride, and is labelled:9. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations.

Warning H319 Causes serious eye irritation. H315 Causes skin irritation. P280 Wear protective gloves. Wear eye or face protection. P264 Wash hands thoroughly after handling. P302 + P352 + P362-2 + P363

IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water. Take off contaminated clothing. Wash contaminated clothing before reuse.

P332 + P313 If skin irritation occurs: Get medical attention. P305 + P351 + P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention. 9. Optional reagent EnVision™ FLEX Antibody Diluent (Code K8006) contains sodium azide

(NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing.

10. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 11. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations.

Storage Store EnVision™ DuoFLEX and EnVision™ FLEX reagents at 2-8 °C. Store EnVision™ FLEX Hematoxylin (Code K8008) at room temperature. Do not use after expiration date stamped on the kit. Do not interchange kit components from different lots. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the conditions must be verified by the user. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the product is suspected, contact our Technical Services.

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Reagent preparation 1. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH Dilute a sufficient quantity of EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH using distilled or deionised water for the staining procedure that is planned. Unused diluted solution may be stored at 2-8 °C for one month. Discard solution if cloudy in appearance. When used in PT Link for 3-in-1 specimen preparation procedure, the diluted solution can be used 3 times within a 5 day period if stored at room temperature. 2. EnVision™ FLEX Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of EnVision™ FLEX Wash Buffer using distilled or deionised water for the staining procedure that is planned. Unused diluted solution may be stored at 2-8 °C for one month. Discard solution if cloudy in appearance.

3. DAB+ Working Solution DAB+ Working Solution is prepared by thoroughly mixing 1 mL of EnVision™ DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer with 1 drop (25-30 µL) of DAB+ Chromogen. Prepare only the volume required for the number of slides that shall be stained. Prepared DAB+ Working Solution is stable for approximately 5 days when stored at 2-8 °C. This solution should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate developing within 5 days in the solution does not affect staining quality. DAB+ Working Solution should be prepared in an Autostainer Link Reagent Bottle when used on the Dako Autostainer Link instrument.

4. Permanent Red Working Solution Permanent Red Working Solution is prepared by thoroughly mixing 100 parts of Permanent Red Substrate Buffer with 1 part of Permanent Red Chromogen, e.g. mix 1 mL Permanent Red Substrate Buffer with 10 µL Permanent Red Chromogen. Prepare only the volume required for the number of slides that shall be stained. Use the solution within 30 minutes. Permanent Red Working Solution should be prepared in an Autostainer Link Reagent Bottle when used on the Dako Autostainer Link instrument.

5. Guideline for optimal dilution of primary antibodies EnVision™ DuoFLEX Doublestain System is compatible with Dako DuoFLEX Ready-to-Use Cocktailed Antibodies. Optimal dilution should be determined by the user for other cocktailed antibodies made from concentrates.

Specimen Collection and Preparation The specimens may be formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. A variety of fixatives may be used for specimen preservation. Specimens should not be fixed in neutral buffered formalin for more than 24 hours and preferably for a shorter time.

The optimal thickness of paraffin-embedded sections is approximately 4µm.

The specimens should be mounted on microscope slides. The sections should be mounted on the slides as flat and wrinkle-free as possible. Too many wrinkles will have an impact on the staining results.

NOTE: The microscope slides must have a width suitable for the Dako Autostainer Link instruments. Please refer to the Operator’s manual for the individual Dako instrument for the definition of usable microscope slides.

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Paraffin sections should be mounted from a pre-heated water bath containing distilled or deionized water. The water bath should contain no additives (such as gelatine, poly-L-lysine etc.). Sections should be dried by heating; generally at a temperature < 60 °C for a minimum of 60 minutes (e.g. overnight). To ensure proper adherence of sections to slides it is important to drain the water from beneath the sections prior to the oven-drying process.

Procedure Dako Autostainer Link instruments use techniques based on different principles to obtain an optimal staining result. Before running protocols on your Dako Autostainer Link instrument, please read carefully the Operator’s Manual for the dedicated Dako instrument. In order to ascertain reproducible epitope retrieval, it is recommended always to load the slide holder fully with slides. This ensures an identical heating of sections in every run.

All reagents in the kit are provided in Autostainer Link Reagent Bottles. DAB+ Working Solution and Permanent Red Working Solution should both be prepared in Autostainer Link Reagent Bottles, when used on the Dako Autostainer Link instrument.

All reagents should be equilibrated to room temperature (20-25 °C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. The following pre-treatment steps should be carried out before using EnVision™ DuoFLEX Doublestain System on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. The specimen should be deparaffinized and hydrated. Please refer to section A.5 and the package insert of the individual Dako primary antibody cocktails for specific information on specimen preparation.

Recommended 3-in-1 specimen preparation procedure using PT link:

1. Prepare a working solution by diluting the EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution concentrate in distilled water or deionized water.

2. Fill the PT Link tanks with sufficient quantity (1.5 L) of working solution to cover the tissue sections.

3. Set PT Link to pre-heat the solution to 65 °C.

4. Immerse the mounted, formalin-fixed, paraffin-embedded tissues into the pre-heated EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (working solution), and incubate for 20-40 minutes at 97 °C. The optimal incubation time should be determined by the user.

5. Leave the sections to cool in the PT Link to 65 °C.

6. Remove each slide rack from the PT Link tank and immediately dip slides into a jar/tank (e.g., PT Link Rinse Station, Code PT109) with diluted, room temperature EnVision™ FLEX Wash Buffer Code K8007.

7. Leave slides in the diluted, room temperature EnVision™ FLEX Wash Buffer, Code K8007 for 1-5 minutes.

8. Place slides on a Dako Autostainer Link instrument and proceed with staining. The sections should not dry out during the treatment or during the immunohistochemical staining procedure. Dried specimens may display increased non-specific staining.

When used in the PT Link for HIER procedure, the diluted Target Retrieval Solution and diluted Wash Buffer can be used 3 times within a 5 day period if stored at room temperature.

HIER procedure using PT Link:

After deparaffinization and hydration to buffer (water), most tissue sections need to be subjected to heat-induced epitope retrieval (HIER).

1. Prepare a working solution by diluting the EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution concentrate in distilled water or deionized water.

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2. Fill the PT Link tanks with sufficient quantity (1.5 L) of working solution to cover the tissue sections.

3. Set PT Link to pre-heat the solution to 65 °C.

4. Immerse the manually deparaffinised/hydrated tissues into the pre-heated EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (working solution), and incubate for 20-40 minutes at 97 °C. The optimal incubation time should be determined by the user.

5. Leave the sections to cool in the PT Link to 65 °C.

6. Remove each slide rack from the PT Link tank and immediately dip slides into a jar/tank (e.g., PT Link Rinse Station, Code PT109) with diluted, room temperature EnVision™ FLEX Wash Buffer , Code K8007.

7. Leave slides in the diluted, room temperature EnVision™ FLEX Wash Buffer, Code K8007 for 1-5 minutes.

8. Place slides on a Dako Autostainer Link instrument and proceed with staining. The sections should not dry out during the treatment or during the immunohistochemical staining procedure. Dried specimens may display increased non-specific staining.

9. For offline hematoxylin staining, Immerse slides in a bath of hematoxylin. Length of incubation time depends on the strength of hematoxylin used. Follow hematoxylin counterstaining with a thorough rinse in distilled or deionised water.

10. For Coplin jars:

1. Place staining jars containing diluted EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution in water bath.

2. Heat water bath and jars filled with EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution to 95-99 °C. Cover jars with lids to stabilize the temperature and avoid evaporation.

3. Immerse the room temperature sections in the preheated EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution in the staining jars.

4. Bring temperature of the water bath and EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution back to 95-99 °C.

5. Remove the entire jar with slides from the water bath. Allow slides to cool in the EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution for 20 (± 1) minutes at room temperature.

6. Decant the EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution and rinse sections with EnVision™ FLEX Wash Buffer.

7. Place the rack with the rinsed sections in a Dako Autostainer Link instrument. Immediately begin the pre-programmed staining run.

NOTE: When used in Coplin jars HIER procedure, the diluted EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution and diluted EnVision™ FLEX Wash Buffer can be used only 1 time (single use).

A few epitopes do not tolerate the HIER and some require enzymatic pre-treatment. Please refer to the package insert for the individual Dako primary antibody cocktail.

The tissue sections should not dry out during treatment or during the following immunohistochemical staining procedure. For greater adherence of the tissue sections to glass slides, the use of Dako FLEX IHC Microscope Slides (Code K8020) is recommended.

Incubation with the primary antibody cocktail:

Dako DuoFLEX Ready-to-Use Cocktailed Antibodies can be used with Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain system, applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections.

The staining steps and incubation times are pre-programmed into the Autostainer Link software as protocol DuoFLEX. If the protocols are not available on the used Autostainer Link instrument please contact Dako Technical Services.

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Optimal incubation times of the primary antibody cocktail, EnVision™ DuoFLEX/HRP and EnVision™ DuoFLEX /AP are dependent on the applied primary antibody cocktail. Please refer to the package insert for the individual Dako primary antibody cocktail. The user must verify the applied protocol.

After staining the slides should be mounted. For aqueous mounting, mounting media such as Dako Glycergel™ Mounting Medium, Code C0563 or Faramount Aqueous Mounting Medium, Code S3025 is recommended.

For non-aqueous, permanent mounting, it is recommended that slides are air-dried completely at room temperature or air-dried for 1 hour at 60 °C, and then incubated in xylene or a xylene substitute for 5 minutes.

Note that in some instances small, punctate artifacts may be observed with slides subjected to air drying prior to application of coverslips. This can be addressed by treating the slides according to one of the following procedures:

Option 1: Direct transfer of tissue slides from the Autostainer Link instrument to alcohol, which may be either:

a) 99% alcohol with incubation for maximum 2 min, or b) Three successive 100% alcohol baths, 10 dips in each.

Then slides should be dipped 10 times in each of two successive xylene baths followed by permanent mounting.

Option 2: Direct transfer of tissue slides from the Autostainer Link instrument to a graded alcohol series, but only for 30 sec in each step and without xylene exposure, followed by permanent mounting.

Longer alcohol and/or xylene exposures can lead to chromogen extraction and hence inferior staining.

It is noted that these procedures have not been tested on every primary antibody, and should therefore only be interpreted as guidelines. Accordingly, the performance of the adjusted dehydration protocol followed by permanent mounting must be verified to ensure that it is still valid regarding the primary antibody in question. Each primary antibody in use should be evaluated with the adjusted dehydration protocol to confirm that the staining pattern is identical to the staining pattern described in “Performance Characteristics” of the primary antibody.

Quality Control Each staining run should include a known positive control specimen to ascertain a proper performance of all the applied reagents. If the positive control specimen fails to demonstrate positive staining, labelling of test specimens should be considered invalid.

Interpretation of Results The antigen recognized by mouse antibody is stained brown with DAB+ Chromogen. The antigen recognized by rabbit antibody is stained red with Permanent Red Chromogen. Both colours allow for visualization against a hematoxylin counterstain. If non-specific staining is present, this will be recognized as a diffuse, brown or red staining. Nuclei will be stained blue by the hematoxylin counterstain. It is possible to observe background staining associated with certain tissues during small Autostainer Link runs (i.e. approximately nine slides or fewer). This background staining can be addressed by increasing rinse times in the staining protocol. For further guidance please contact Dako Technical Services.

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EnVision™ DuoFLEX Doublestain System, (Link) Réf. SK110

Édition 12/18

Les réactifs contenus dans ce kit permettent d'effectuer 100 à 150 tests. Pour les instruments Autostainer Link.

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Table des matières Page

Utilisation prévue ........................................................................................................................... 14

Résumé et explication ................................................................................................................... 14

Réactifs .......................................................................................................................................... 15

Précautions .................................................................................................................................... 17

Conservation ................................................................................................................................. 19

Préparation des réactifs ................................................................................................................. 19

Prélèvement et préparation des échantillons ................................................................................ 20

Procédure ...................................................................................................................................... 20

Contrôle qualité ............................................................................................................................. 23

Interprétation des résultats ............................................................................................................ 23

Bibliographie .................................................................................................................................. 35

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Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. Le système de détection EnVision™ DuoFLEX Doublestain System est destiné à être utilisé en immunohistochimie avec les instruments Dako Autostainer Link. Le système est conçu pour le dépistage simultané de plusieurs antigènes différents dans un échantillon. Le système détecte les anticorps primaires de souris et de lapin et la réaction est visualisée à l'aide des solutions de chromogènes EnVision™ DuoFLEX DAB+ et EnVision™ DuoFLEX Permanent Red. Les réactifs EnVision™ DuoFLEX sont destinés à être utilisés sur des coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine.

Résumé et explication Le système Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System est conçu pour une coloration optimale sur les appareils Dako Autostainer Link, à l'aide du protocole recommandé sur cette notice. Ce système est utile pour le dépistage simultané d'antigènes multiples, présents à des concentrations faibles ou élevées dans un échantillon. La visualisation se base sur l'utilisation de la peroxydase (HRP) avec la solution DAB+ comme chromogène, de la phosphatase alcaline (AP) avec la solution Permanent Red comme chromogène. Le système ne contient pas de biotine, réduisant ainsi de façon significative les colorations non spécifiques résultant de l'activité biotine-avidine endogène. La procédure est une double coloration simultanée dans laquelle deux antigènes sont visualisés à l'aide des HRP/DAB+ et AP/Permanent Red, respectivement. Le réactif EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block inhibe l'activité endogène de la phosphatase alcaline, de la peroxydase et de la pseudo peroxydase, présente dans certains tissus. Après le blocage enzymatique endogène, la première étape est l'incubation de l'échantillon avec un cocktail d'anticorps primaires de lapin et de souris, dilués de façon optimale, suivie de l'incubation avec le réactif EnVision™ DuoFLEX /HRP puis avec le EnVision™ DuoFLEX /AP. La réaction est visualisée par les chromogènes EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen pour l'anticorps de souris et le EnVision™ DuoFLEX Permanent Red pour l'anticorps de lapin. Tous les réactifs spécifiés, à l'exception des anticorps primaires, sont fournis dans le kit. L’utilisation du cocktail d'anticorps Dako DuoFLEX prêt à l'emploi ou des anticorps primaires concentrés Dako est recommandée. Le diluant EnVision™ FLEX Antibody Diluent (réf. K8006) est recommandé pour la dilution des anticorps primaires concentrés Dako. REMARQUE : les réactifs de ce kit ont été conçus de façon à fonctionner en tant que système et ils doivent être utilisés comme décrit à la section Procédure. En particulier, tous les réactifs doivent être utilisés tel qu’indiqué avant l’application des solutions de chromogène, même si un seul chromogène doit être appliqué. Ne pas adhérer au protocole spécifié peut se traduire par des résultats de coloration inappropriés, y compris la possibilité de n’observer aucune coloration.

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Réactifs

A : Matériaux fournis avec le produit référence SK110

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block Prêt à l'emploi

Solution de blocage enzymatique endogène, de pH 2, contenant 1-<5 % de peroxyde d'hydrogène, des détergents, des inhibiteurs enzymatiques et un conservateur.

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/HRP Prêt à l'emploi

Peroxydase de raifort et immunoglobulines isolées par affinité sous la forme de conjugués de polymères de dextrane. Fourni dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un conservateur.

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/AP Prêt à l'emploi

Phosphatase alcaline et immunoglobulines isolées par affinité sous la forme de conjugués de polymères de dextrane. Fourni dans un tampon contenant une protéine stabilisante et un conservateur.


Solution tampon de substrat, pH 7,5, contenant du peroxyde d'hydrogène <0,1 %, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien.

1 x 2,16 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen

solution chromogène de tétra-chlorhydrate de 3, 3’-diaminobenzidine à 5 %.


Solution de tampon substrat.

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1 x 0,72 mL EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen

Solution chromogène Permanent Red.


Tampon Tris/EDTA, pH9 concentré 50x


Solution saline de tampon Tris contenant du Tween 20, pH 7,6 (± 0,1), concentré 20x.

3 x 12 mL Flacon de réactif à remplir par l'utilisateur, d'une contenance de 12 mL

Les flacons doivent être utilisés pour mélanger et contenir les solutions de travail DAB+ et Permanent Red (voir également le paragraphe Préparation des réactifs).

B. Matériel requis mais non fourni Instrument Autostainer Link Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (si nécessaire) Cocktail d'anticorps primaires Dako FLEX prêt à l'emploi ou anticorps primaires de lapin ou de souris concentrés dilués de façon appropriée obtenus auprès de Dako Ustensiles pour l'appareillage Dako Lames de microscope Réactifs généraux de laboratoire pour le déparaffinage des coupes de tissus incluses en paraffine Milieu de montage (aqueux ou organique à base de solvant) et lamelles C. Réactifs en option K8004 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)

Tampon Tris/EDTA, pH 9 concentré 50x, 3 x 30 mL


Tampon citrate, pH 6,1 concentré 50x, 3 x 30 mL


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120 mL, prêt à l'emploi Tampon Tris, pH 7,2, contenant 15 mmol/L de NaN3 et des protéines


Solution saline de tampon Tris contenant du Tween 20, pH 7,6 (± 0,1) concentré 20x, 1 L.


Précautions 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Les EnVision™ DuoFLEX/HRP et DuoFLEX/AP contiennent des produits d'origine animale.

Comme avec tout produit d’origine biologique, respecter les procédures de manipulation appropriées.

3. Protéger les solutions chromogènes EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen ou EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen ou les solutions de travail préparées DAB+ ou Permanent Red de la lumière violente.

4. Le EnVision™ DuoFLEX Endogenous Enzyme Block contient moins de 0,1 % de 5-chloro-2-méthyl-3(2H)-isothiazolone mélangé à du 2-méthyl-3(2H)-isothiazolone et est étiqueté comme:

Danger H314 Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires graves. H317 Peut provoquer une allergie cutanée. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection des

yeux ou du visage. Porter des vêtements de protection. P261 Éviter de respirer les vapeurs. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P272 Les vêtements de travail contaminés ne devraient pas sortir du lieu de

travail. P304 + P340 + P310

EN CAS D'INHALATION : Transporter la victime à l'extérieur et la maintenir au repos dans une position où elle peut confortablement respirer. Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P301 + P310 + P330 + P331

EN CAS D'INGESTION : Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin. Rincer la bouche. Ne PAS faire vomir.

P303 + P361 + P353 + P363 + P310

EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU (ou les poils) : Enlever immédiatement tous les vêtements contaminés. Rincer la peau à l'eau ou se doucher. Laver les vêtements contaminés avant réutilisation. Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P302 + P352 EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU: Laver abondamment à l'eau/... P333 + P313 En cas d'irritation ou d'éruption cutanée : Consulter un médecin. P305 + P351 + P338 + P310

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes

réglementations locales, régionales, nationales, et internationales.

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5. Le EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen, contient entre 1 et 5% de tétrachlorure de biphényle-3,3',4,4'-tétrayltétraammonium et est étiqueté comme:

Danger H350 Peut provoquer le cancer. H341 Susceptible d’induire des anomalies génétiques. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d'avoir lu et compris toutes les précautions de

sécurité. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection des

yeux ou du visage. Porter des vêtements de protection. P308 + P313 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée: Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes

réglementations locales, régionales, nationales, et internationales. 6. Attention : Ce produit contient une substance qui n'a pas encore été testée intégralement. La

fiche de données de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande.

7. Le EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) contient 5 à 10% de trométamol, 1 à 5% d'éthoxylates de nonylphénol et 1 Le EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) et est étiqueté comme:

Attention H319 Provoque une sévère irritation des yeux. H411 Toxique pour les organismes aquatiques, entraîne des effets néfastes à

long terme. P280 Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. P273 Éviter le rejet dans l'environnement. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P305 + P351+ P338

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.

P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes

réglementations locales, régionales, nationales, et internationales. 8. Le EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) contient entre 10 et 30% de 2-Amino-2-

(hydroxyméthyl)propane-1, 3-diol chlorhydrate et est étiqueté comme:

Attention H319 Provoque une sévère irritation des yeux. H315 Provoque une irritation cutanée. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection du

visage ou des yeux. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P302 + P352 + P362-2 + P363

EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU : Laver abondamment à l'eau et au savon. Enlever les vêtements contaminés. Laver les vêtements contaminés avant réutilisation.

P332 + P313 En cas d'irritation cutanée : Consulter un médecin. P305 + P351 + P338

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.

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P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin. 9. Le produit EnVision™ FLEX Antibody Diluent (réf. K8006) contient de l’azide de sodium

(NaN3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, l’azide de sodium peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations et former des accumulations d’azides métalliques hautement explosives. Lors de l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azide métallique dans les canalisations.

10. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau. 11. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales

et nationales.

Conservation Conserver les réactifs EnVision™ DuoFLEX et EnVision™ FLEX entre 2 et 8 °C. Conserver la EnVision™ FLEX Hematoxylin (Réf. K8008) à température ambiante. Ne pas utiliser après la date de péremption imprimée sur l’emballage. Ne pas échanger les composants de kit provenant de lots différents. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l’utilisateur. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d’un problème avec le réactif, contacter notre service technique.

Préparation des réactifs 1. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH Diluer une quantité suffisante de EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH, à l'aide d’eau distillée ou dé-ionisée pour la procédure de coloration prévue. La solution diluée restante peut être conservée entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jeter la solution si elle semble trouble. Quand on l’utilise sur un appareil PT Link pour une procédure de préparation des échantillons 3 en 1, la solution diluée peut être réutilisée 3 fois sur une période de 5 jours si elle est conservée à température ambiante. 2. EnVision™ FLEX Wash Buffer Diluer une quantité suffisante de EnVision™ FLEX Wash Buffer à l'aide d’eau distillée ou dé-ionisée pour la procédure de coloration prévue. La solution diluée restante peut être conservée entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jeter la solution si elle semble trouble.

3. Solution de travail DAB+ La solution de travail DAB+ est préparée en mélangeant soigneusement 1 mL de tampon substrat EnVision™ DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer avec une goutte de chromogène DAB+. La solution de travail DAB+ préparée est stable durant environ 5 jours si elle est conservée entre 2 et 8 °C. Cette solution doit être soigneusement mélangée avant utilisation. La formation d’un précipité dans la solution au cours de ces 5 jours n'affecte pas la qualité de la coloration. La solution de travail Permanent Red doit être préparée dans un flacon de réactif Autostainer Link lorsqu'on l'utilise avec l'appareil Dako Autostainer Link.

4. Solution de travail Permanent Red (rouge permanent) La solution de travail Permanent Red est préparée en mélangeant soigneusement 100 volumes de tampon de substrat Permanent Red avec 1 volume de chromogène Permanent Red, par ex., mélanger 1 mL de tampon substrat Permanent Red avec 10 µL de chromogène Permanent Red. Ne préparer que le volume nécessaire pour le nombre de lames à colorer. Utiliser la solution dans les 30 minutes après préparation. La solution de travail Permanent Red doit être préparée dans un flacon de réactif Autostainer Link lorsqu'on l'utilise avec l'appareil Dako Autostainer Link.

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5. Directives pour une dilution optimale des anticorps primaires Le système Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System est compatible avec les cocktails d'anticorps primaires Dako DuoFLEX, prêts à l'emploi. Concernant les autres mélanges d'anticorps primaires, préparés à partir de concentrés, la dilution optimale doit être déterminée par l'utilisateur.

Prélèvement et préparation des échantillons Les échantillons peuvent être des coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine. Divers fixateurs peuvent être utilisés pour la préservation des échantillons. Les échantillons ne doivent pas être fixés dans du formol tamponné neutre durant plus de 24 heures, et de préférence durant moins longtemps. L’épaisseur optimale des coupes incluses en paraffine est d’environ 4 µm.

Les échantillons doivent être montés sur des lames de microscope. Les coupes doivent être montées sur les lames, en restant aussi plates que possible et avec le moins de plis possible. Trop de plis aurait un impact sur les résultats de la coloration. REMARQUE : les lames de microscope doivent être d'une largeur adaptée à l'instrument Dako Autostainer Link. Prière de se reporter au manuel de l’opérateur de chaque appareil Dako pour la définition des lames de microscope utilisables.

Les coupes en paraffine doivent être montées depuis un bain préchauffé contenant de l’eau distillée ou dé-ionisée. Le bain-marie ne doit contenir aucun additif (tel que de la gélatine, de la poly-L-lysine, etc.). Les coupes doivent être séchées à la chaleur, en général à une température <60 °C durant un minimum de 60 minutes (par ex., toute une nuit). Pour garantir une bonne adhérence des coupes aux lames, il est important d’égoutter l’eau se trouvant sous les coupes avant de passer à la procédure de séchage dans une étuve.

Procédure Les instruments Dako Autostainer Link utilisent des techniques basées sur différents principes afin d’obtenir un résultat de coloration optimal. Avant d’exécuter des protocoles sur votre instrument Dako Autostainer Link, lire attentivement le Manuel de l’opérateur spécifique à l’instrument Dako utilisé.

Pour assurer une restauration reproductible des épitopes, il est recommandé de toujours remplir complètement le portoir à lames. Ceci assure un chauffage identique des coupes lors de chaque cycle.

Tous les réactifs du kit sont fournis dans des flacons de réactifs Autostainer Link. Les solutions de travail DAB+ et Permanent Red doivent toutes deux être préparées dans des flacons de réactif Autostainer Link lorsqu'elles sont utilisées sur l'appareil Dako Autostainer Link.

Tous les réactifs doivent être portés à température ambiante (20-25 °C) avant la coloration immunologique. De même, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Les étapes de prétraitement suivantes doivent être exécutées avant d'utiliser le système EnVision™ DuoFLEX Doublestain System sur des coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine. L'échantillon doit être déparaffiné et réhydraté. Se reporter au paragraphe A.5 et à la notice individuelle des cocktails d'anticorps primaires Dako pour les informations spécifiques à la préparation de l'échantillon.

Procédure 3 en 1 recommandée pour la préparation des échantillons à l’aide du PT Link :

1. Préparer une solution de travail en diluant le concentré EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution dans de l’eau distillée ou dé-ionisée.

2. Remplir les cuves du PT Link avec une quantité de solution de travail suffisante (1,5 L) pour recouvrir les coupes tissulaires.

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3. Régler le PT Link afin de préchauffer la solution à 65 °C.

4. Plonger les coupes tissulaires se trouvant à température ambiante dans la solution de travail EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution préchauffée et incuber à 97 °C pendant 20 à 40 minutes. L’utilisateur doit déterminer la durée d’incubation optimale.

5. Laisser les coupes refroidir dans le PT Link jusqu’à 65 °C.

6. Retirer chaque portoir à lames de la cuve du PT Link et plonger immédiatement les lames dans un récipient/cuve (par ex., PT Link Rinse Station, réf. PT109) contenant du tampon Dako EnVision™ FLEX Wash Buffer, réf. K8007, dilué et à température ambiante.

7. Laisser les lames dans le tampon EnVision™ FLEX Wash Buffer, réf. K8007, dilué et à température ambiante pendant 1 à 5 minutes.

8. Placer les lames sur un instrument Dako Autostainer Link et procéder à la coloration. Les coupes ne doivent pas sécher lors du traitement ou lors de la procédure de coloration immunohistochimique. Les échantillons séchés peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante.

Lors d'une utilisation pour une procédure HIER sur un appareil PT Link, la solution de restauration des cibles et le tampon de lavage dilués peuvent être utilisés 3 fois sur une période de 5 jours à condition d'être conservés à température ambiante. Procédure HIER à l’aide du PT Link :

Après un déparaffinage et une réhydratation dans un bain de tampon (eau), la plupart des coupes tissulaires doivent être soumises à une restauration d’épitope induite par la chaleur (HIER). 1. Préparer une solution de travail en diluant le concentré EnVision™ FLEX Target Retrieval

Solution dans de l’eau distillée ou dé-ionisée.

2. Remplir les cuves du PT Link avec une quantité de solution de travail suffisante (1,5 L) pour recouvrir les coupes tissulaires.

3. Régler le PT Link afin de préchauffer la solution à 65 °C.

4. Plonger les coupes tissulaires se trouvant à température ambiante dans la solution de travail EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution préchauffée et incuber à 97 °C pendant 20 à 40 minutes. L’utilisateur doit déterminer la durée d’incubation optimale.

5. Laisser les coupes refroidir dans le PT Link jusqu’à 65 °C.

6. Retirer chaque portoir à lames de la cuve du PT Link et plonger immédiatement les lames dans un récipient/cuve (par ex., PT Link Rinse Station, réf. PT109) contenant du tampon Dako EnVision™ FLEX Wash Buffer, réf. K8007, dilué et à température ambiante.

7. Laisser les lames dans le tampon EnVision™ FLEX Wash Buffer, réf. K8007, dilué et à température ambiante pendant 1 à 5 minutes.

8. Placer les lames sur un instrument Dako Autostainer Link et procéder à la coloration. Les coupes ne doivent pas sécher lors du traitement ou lors de la procédure de coloration immunohistochimique. Les échantillons séchés peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante.

9. Pour une coloration à l'hématoxyline hors du système, immerger les lames dans un bain d'´hématoxyline. La durée d’incubation dépend de la puissance de l’hématoxyline utilisée. Faire suivre la contre-coloration à l'hématoxyline d'un rinçage soigneux dans de l'eau distillée ou dé-ionisée.

Pour les cuves de Coplin :

1. Placer les récipients de coloration contenant la solution EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution dilué dans un bain-marie.

2. Porter le bain-marie et les récipients remplis de solution EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (solution de travail) à 95–99 °C. Couvrir les récipients pour stabiliser la température et éviter toute évaporation.

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3. Plonger les coupes se trouvant à température ambiante dans la solution de restauration des cibles EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution contenue dans les récipients de coloration.

4. Rééquilibrer la température du bain-marie et de la solution EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution à 95-99 °C.

5. Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Laisser les lames refroidir dans la solution EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution pendant 20 minutes (±1 minute) à température ambiante.

6. Décanter la solution EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution et rincer les coupes au tampon EnVision™ FLEX Wash Buffer.

7. Placer le portoir avec les coupes rincées dans un appareil Dako Autostainer Link. Lancer immédiatement le cycle de coloration préprogrammé.

REMARQUE : lors d'une procédure HIER avec des cuves de Coplin, n’utiliser qu'une seule fois la solution EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution et le tampon EnVision™ FLEX Wash Buffer dilués (usage unique). Quelques épitopes ne tolèrent pas la procédure HIER et certains requièrent un prétraitement enzymatique. Se reporter à la notice individuelle de chaque cocktail d'anticorps primaires Dako. Les coupes tissulaires ne doivent pas sécher lors du traitement ni lors de la procédure de coloration immunohistochimique qui suit. Pour une meilleure adhérence des coupes tissulaires sur les lames de verre, il est recommandé d’utiliser des lames Dako FLEX IHC Microscope Slides (réf. K8020).

Incubation avec le cocktail d'anticorps primaires :

Les cocktails d'anticorps Dako DuoFLEX prêts à l'emploi peuvent être utilisés avec le système Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain system, appliqué sur des coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine. Les étapes de coloration et les temps d’incubation sont préprogrammés dans le logiciel Autostainer Link comme protocole DuoFlex. Si les protocoles ne sont pas disponibles sur l’appareil Autostainer Link utilisé, contacter le service technique de Dako. Les durées d'incubation optimales du cocktail d'anticorps primaires, du EnVision™ DuoFLEX/HRP et du EnVision™ DuoFLEX/AP dépendent du cocktail d'anticorps primaires utilisé. Se reporter à la notice individuelle de chaque cocktail d'anticorps primaires Dako. L’utilisateur doit vérifier le protocole appliqué.

Après la coloration, les lames doivent être montées. Pour un montage aqueux, un milieu de montage de type Dako Glycergel™ Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount Aqueous Mounting Medium (réf. S3025) est recommandé. Pour un montage permanent non aqueux, il est recommandé de sécher les lames complètement à l’air, à température ambiante, ou de les sécher à l’air durant 1 heure à 60 °C, puis de les incuber dans du xylène ou un substitut du xylène pendant 5 minutes.

Noter que, dans certains cas, il est possible d’observer de petits artefacts ponctuels sur les lames ayant séchées à l’air libre avant l’application des lamelles. Ceci peut être adressé en traitant les lames selon l’une des procédures suivantes :

Option 1 : transfert direct des lames de tissu depuis l’appareil Autostainer Link dans de l’alcool, celui-ci pouvant être soit :

c) de l’alcool à 99 % avec une incubation de 2 minutes maximum, ou

d) trois bains successifs d’alcool à 100 %, 10 trempages dans chaque. Les lames doivent ensuite être plongées 10 fois dans chacun des deux bains successifs de xylène, suivi par un montage permanent.

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Option 2 : transfert direct des lames de tissu depuis l’appareil Autostainer Link dans une série de gradients d’alcool, mais uniquement pendant 30 secondes à chaque étape et sans exposition à du xylène, suivi par un montage permanent.

Des expositions prolongées dans l’alcool et/ou dans du xylène peuvent entraîner l’extraction du(des) chromogène(s) et donc entraîner une coloration moindre.

Il est noté que ces procédures n’ont pas été testées sur chaque anticorps primaire, et que par conséquent, elles ne doivent être interprétées qu’à titre indicatif. En conséquence, les performances du protocole de déshydratation ajusté suivi d’un montage permanent doivent être vérifiées afin de s’assurer qu’il est toujours valide pour l’anticorps primaire en question. Chaque anticorps primaire utilisé doit être évalué avec le protocole de déshydratation ajusté afin de confirmer que le profil de coloration est identique à celui décrit à la section « Performances » de la notice de l’anticorps primaire.

Contrôle qualité Chaque cycle de coloration doit comprendre un échantillon de contrôle positif connu pour vérifier la bonne performance de tous les réactifs appliqués. Si l’échantillon de contrôle positif ne présente pas de coloration positive, le marquage des échantillons à analyser doit être considéré comme non valide.

Interprétation des résultats L'antigène reconnu par l'anticorps de souris est coloré en brun avec le chromogène DAB+. L'antigène reconnu par l'anticorps de lapin est coloré en rouge par le chromogène Permanent Red (rouge permanent). Les deux couleurs permettent une visualisation par rapport à une contre-coloration à l'hématoxyline. Si une coloration non spécifique est obtenue, elle sera reconnue comme une coloration diffuse, rouge ou brune. Les noyaux seront colorés en bleu par la contre-coloration à l'hématoxyline. Il est possible de constater une coloration de fond pour certains tissus lors des petits cycles en Autostainer (par ex. environ neuf lames ou moins). Cette coloration de fond peut être évitée en augmentant la durée de rinçage dans le protocole de coloration. Pour plus d'informations, veuillez contacter le support technique Dako.

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EnVision™ DuoFLEX Doublestain System, (Link) Code SK110

Ausgabe 12/18

Die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien sind ausreichend für 100−150 Tests. Für Autostainer Link-Geräte.

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Inhalt Seite Verwendungszweck ....................................................................................................................... 26

Zusammenfassung und Erklärung ................................................................................................. 26

Reagenzien ................................................................................................................................... 27

Vorsichtsmaßnahmen .................................................................................................................... 29

Lagerung ....................................................................................................................................... 31

Vorbereitung der Reagenzien ........................................................................................................ 31

Entnahme und Vorbereitung der Probe ......................................................................................... 31

Verfahren ....................................................................................................................................... 32

Qualitätskontrolle ........................................................................................................................... 35

Auswertung der Ergebnisse .......................................................................................................... 35

Literaturhinweise ........................................................................................................................... 35

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Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Das Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System ist für immunhistochemische Verfahren mit Dako Autostainer Link-Geräten bestimmt. Das System wurde so konzipiert, dass es mehrere unterschiedliche Antigene in einer Probe gleichzeitig nachweisen kann. Das System weist primäre Maus- und Kaninchen-Antikörper nach und zeigt die Reaktion durch EnVision™ DuoFLEX DAB+ und das Chromogen EnVision™ DuoFLEX Permanent Red an. Die EnVision™ DuoFLEX-Reagenzien sind zur Verwendung auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten vorgesehen.

Zusammenfassung und Erklärung Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System wurde als System konzipiert, das bei Verwendung des in dieser Packungsbeilage angegebenen Protokolls optimale Färbeergebnisse auf Dako Autostainer Link-Geräten liefert. Dieses System dient dem gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antigene, die in geringer oder hoher Konzentration in einer Probe vorliegen. Die Visualisierung beruht auf Peroxidase (HRP) mit DAB+ als Chromogen und alkalischer Phosphatase (AP) mit Permanent Red als Chromogen. Da es sich um ein biotinfreies System handelt, werden unspezifische Färbungen aus endogenen Avidin-Biotin-Aktivitäten deutlich abgeschwächt. Das Verfahren ist eine gleichzeitige Doppelfärbung, bei der zwei Antigene mit Hilfe von HRP/DAB+ bzw. AP/Permanent Red dargestellt werden. EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block hemmt die in einigen Geweben vorhandene endogene alkalische Phosphatase-, Peroxidase- und Pseudoperoxidase-Aktivität. Nach der Blockierung endogener Enzyme ist der erste Schritt die Inkubation der Probe mit einem optimal verdünnten Cocktail aus primären Maus- oder Kaninchen-Antikörpern, gefolgt von der Inkubation mit dem EnVision™ DuoFLEX/HRP-Reagenz und dann dem EnVision™ DuoFLEX/AP-Reagenz. Die Reaktion wird mit dem Chromogen EnVision™ DuoFLEX DAB+ für den Maus-Antikörper und EnVision™ DuoFLEX Permanent Red für den Kaninchen-Antikörper visualisiert. Alle angegebenen Reagenzien, außer den primären Antikörpern, sind im Kit enthalten. Wir empfehlen Dako DuoFLEX-Cocktails aus gebrauchsfertigen primären Antikörpern oder die konzentrierten primären Antikörper von Dako. Zur Verdünnung von konzentrierten primären Antikörpern von Dako wird EnVision™ FLEX Antibody Diluent (Code-Nr. K8006) empfohlen. HINWEIS: Die Reagenzien in diesem Kit sind als System konzipiert und sollten wie im Abschnitt Verfahren beschrieben verwendet werden. Insbesondere sind alle Reagenzien vor jeder Applikation von Chromogenlösungen wie beschrieben anzuwenden, auch wenn nur ein Chromogen aufgebracht werden soll. Ein Nichtbeachten des vorgeschriebenen Protokolls kann zu fehlerhaften Färbeergebnissen führen, einschließlich der Möglichkeit fehlender Färbung.

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Reagenzien

A: Materialien im Lieferumfang von Code-Nr. SK110

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block Ready-to-Use

Endogene Enzym-Blockierungslösung, pH 2, enthält 1-<5% Wasserstoffperoxid, Tenside, Enzymhemmer und Konservierungsmittel.

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/HRP Ready-to-Use

Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierte Immunglobuline in Form von Dextranpolymerkonjugaten. Geliefert in Tris/HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und Konservierungsmittel.

1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/AP Ready-to-Use

Alkalische Phosphatase und affinitätsisolierte Immunglobuline in Form von Dextranpolymerkonjugaten. Geliefert in Puffer mit Stabilisatorprotein und einem Konservierungsmittel.


Substratpufferlösung, pH 7,5, enthält <0,1% Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Beschleuniger und eine antimikrobielle Substanz.

1 x 2,16 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen

5% 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Chromogenlösung


Substratpufferlösung

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1 x 0,72 mL EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen

Permanent Red Chromogen-Lösung


50fach konzentriert Tris/EDTA-Puffer, pH 9


20fach konzentriert Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20, pH 7,6 (±0,1)

3 x 12 mL Vom Anwender füllbares Reagenzfläschchen, Füllvolumen 12 ml

Die Fläschchen sind zur Mischung und Aufbewahrung der DAB+- und Permanent Red-Arbeitslösung vorgesehen (siehe auch Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien).

B. Erforderliches, aber nicht mitgeliefertes Material Autostainer Link-Gerät Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (falls erforderlich) Dako DuoFLEX Cocktails aus gebrauchsfertigen Antikörpern oder entsprechend verdünnte konzentrierte Kaninchen- bzw. Maus-Antikörper von Dako Zubehör für Dako-Geräte Objektträger Für die Entparaffinierung bei paraffineingebetteten Gewebeschnitten gebräuchliche Laborreagenzien Eindeckmedium (wässrig oder auf Basis organischer Lösungsmittel) und Deckgläser C. Optionale Reagenzien K8004 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)

3 x 30 mL, 50fach konzentriert Tris/EDTA-Puffer, pH 9


3 x 30 mL, 50fach konzentriert Citrat-Puffer, pH 6,1


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120 mL, gebrauchsfertig Tris-Puffer, pH 7,2, mit 15 mmol/L NaN3 und Protein.


1 x 1 L, 20fach konzentriert Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20, pH 7,6 (±0,1)


Vorsichtsmaßnahmen 1. Zur Anwendung durch Fachpersonal. 2. EnVision™ DuoFLEX/HRP und DuoFLEX/AP enthalten Material tierischen Ursprungs. Wie

alle Produkte biologischen Ursprungs muss auch dieses entsprechend gehandhabt werden. 3. EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen oder EnVision™ DuoFLEX Permanent Red

Chromogen oder die angesetzte DAB+-Arbeitslösung oder Permanent-Arbeitslösung keinem starken Lichteinfall aussetzen.

4. EnVision™ DuoFLEX Endogenous Enzyme Block enthält < 0,1% 5-Chlor-2-methyl-3(2H)-isothiazolon, gemischt mit 2-Methyl-3(2H)-isothiazolon, und ist gekennzeichnet:

Gefahr H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. P280 Schutzhandschuhe tragen. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen.

Schutzkleidung tragen. P261 Einatmen von Dampf vermeiden. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P272 Kontaminierte Arbeitskleidung nicht außerhalb des Arbeitsplatzes tragen. P304 + P340 + P310

BEI EINATMEN: Bei Atembeschwerden die betroffene Person an die frische Luft bringen und in einer Position ruhigstellen, in der sie leicht atmet. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

P301 + P310 + P330 + P331

BEI VERSCHLUCKEN: Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen.

P303 + P361 + P353 + P363 + P310

BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen oder duschen. Kontaminierte Kleidung vor erneutem Tragen waschen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

P302 + P352 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/…/waschen. P333 + P313 Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P305 + P351 + P338 + P310

BEI BERÜHRUNG MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und

internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen. 5. EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen, enthält 1-5% Biphenyl-3,3',4,4'-

tetrayltetraammoniumtetrachlorid und ist gekennzeichnet:

Gefahr H350 Kann Krebs erzeugen. H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P202 Vor Gebrauch alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen.

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P280 Schutzhandschuhe tragen. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen. Schutzkleidung tragen.

P308 + P313 BEI Exposition oder falls betroffen Ärztliche Hilfe anfordern. P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und

internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen. 6. Vorsicht. Dieses Produkt enthält eine Substanz, die noch nicht vollständig erforscht wurde.

Auf Anfrage ist ein Sicherheitsdatenblatt für Fachpersonal erhältlich. 7. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) enthält 5-10% Trometamol, 1-5%

Nonylphenol, ethoxyliert, und 1-5% (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure, Dinatriumsalz-Dihydrat. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) ist gekennzeichnet:

Achtung H319 Verursacht schwere Augenreizung. H411 Giftig für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. P280 Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P273 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P305 + P351+ P338

BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen.

P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und

internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen. 8. EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) enthält 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-

diol-Hydrochlorid und ist gekennzeichnet:

Achtung H319 Verursacht schwere Augenreizung. H315 Verursacht Hautreizungen. P280 Schutzhandschuhe tragen. Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P302 + P352 + P362-2 + P363

BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser und Seife waschen. Kontaminierte Kleidung ausziehen. Kontaminierte Kleidung vor erneutem Tragen waschen.

P332 + P313 Bei Hautreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P305 + P351 + P338

BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.

P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. 9. Das optionale Reagenz EnVision™ FLEX Antibody Diluent (Code-Nr. K8006) enthält

Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von Natriumazid können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.

10. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 11. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen

Richtlinien zu entsorgen.

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Lagerung EnVision™ DuoFLEX- und EnVision™ FLEX-Reagenzien bei 2–8 °C lagern. EnVision™ FLEX Hematoxylin (Code-Nr. K8008) im Dunkeln bei Raumtemperatur lagern. Nach Ablauf des auf dem Kit aufgedruckten Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Kitkomponenten aus unterschiedlichen Chargen nicht austauschen. Werden die Reagenzien unter anderen als den angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen diese Bedingungen vom Benutzer validiert werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht durch Unterschiede bei Laborverfahren erklären lässt und auf ein Problem mit dem Produkt hindeutet, ist unser technischer Kundendienst zu verständigen.

Vorbereitung der Reagenzien 1. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH Eine für das geplante Färbeverfahren ausreichende Menge EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnen. Nicht verwendete, bereits verdünnte Lösung kann bei 2−8 °C einen Monat lang aufbewahrt werden. Getrübte Lösung verwerfen. Bei Verwendung im PT Link für die 3-in-1-Probenvorbereitung kann die verdünnte Lösung 3-mal innerhalb von 5 Tagen verwendet werden, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wird. 2. EnVision™ FLEX Wash Buffer Eine für das geplante Färbeverfahren ausreichende Menge EnVision™ FLEX Wash Buffer mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnen. Nicht verwendete, bereits verdünnte Lösung kann bei 2−8 °C einen Monat lang aufbewahrt werden.

3. DAB+-Arbeitslösung DAB+-Arbeitslösung wird durch gründliches Vermischen von 1 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer mit 1 Tropfen (25-30 µL) DAB+-Chromogen zubereitet. Nur so viel ansetzen, wie für die zu färbenden Objektträger erforderlich ist. Die angesetzte DAB+-Arbeitslösung ist bei Aufbewahrung zwischen 2−8 °C etwa 5 Tage haltbar. Diese Lösung ist vor Gebrauch gründlich zu mischen. Die Qualität der Färbung wird durch ein innerhalb von 5 Tagen in der Lösung auftretendes Präzipitat nicht beeinträchtigt. Ist die DAB+-Arbeitslösung für den Dako Autostainer Link vorgesehen, diese in einem Reagenzglas des Autostainer Link ansetzen.

4. Permanent Red-Arbeitslösung Eine Permanent Red-Arbeitslösung wird durch gründliches Mischen von 100 Teilen Permanent Red-Substratpuffer mit einem (1) Teil Permanent Red-Chromogen angesetzt, z.B. durch Mischen von 1 mL Permanent Red-Substratpuffer mit 10 µL Permanent Red-Chromogen. Nur so viel ansetzen, wie für die zu färbenden Objektträger erforderlich ist. Lösung innerhalb von 30 Minuten verbrauchen. Ist die Permanent Red-Arbeitslösung für den Dako Autostainer Link vorgesehen, diese in einem Reagenzglas des Autostainer Link ansetzen.

5. Richtlinie für die optimale Verdünnung primärer Antikörper Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System ist kompatibel mit den Dako DuoFLEX gebrauchsfertigen Antikörper-Cocktails. Optimale Verdünnungen für andere Cocktail-Antikörper, die aus Konzentraten hergestellt wurden, sind vom Anwender selbst zu ermitteln.

Entnahme und Vorbereitung der Probe Als Proben kommen formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte in Betracht. Für die Konservierung der Proben sind verschiedene Fixiermittel geeignet. Die Proben sollten höchstens 24 Stunden (vorzugsweise kürzer) in neutral gepuffertem Formalin fixiert werden. Die optimale Dicke paraffineingebetteter Schnitte beträgt etwa 4 µm.

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Die Proben auf Mikroskop-Objektträgern fixieren. Die Schnitte so flach und faltenfrei wie möglich auf den Objektträgern aufbringen. Zu viele Falten wirken sich negativ auf die Färbeergebnisse aus. HINWEIS: Die Größe der Objektträger muss zum Dako Autostainer Link-Gerät passen. Angaben zu geeigneten Mikroskop-Objektträgern bitte dem Bedienungshandbuch des jeweiligen Dako-Geräts entnehmen.

Paraffineingebettete Schnitte sollten aus einem vorgewärmten Wasserbad mit destilliertem oder deionisiertem Wasser heraus fixiert werden. Dieses Wasserbad darf keine Additive enthalten (wie z.B. Gelatine, Poly-L-Lysin usw.). Die Schnitte werden mindestens 60 Minuten lang (z.B. über Nacht) durch Wärme getrocknet, gewöhnlich bei einer Temperatur von unter 60 °C. Damit die Schnitte gut auf den Objektträgern haften, muss vor dem Trockenprozess im Ofen alles Wasser unter den Schnitten entfernt worden sein.

Verfahren Um optimale Färbeergebnisse zu erzielen, arbeiten die Dako Autostainer Link-Geräte mit auf verschiedenen Prinzipien beruhenden Verfahren. Bitte lesen Sie vor der Durchführung von Färbungen mit Ihrem Dako Autostainer Link-Gerät das Benutzerhandbuch des jeweiligen Dako-Geräts gründlich durch.

Um für eine reproduzierbare Epitopdemaskierung zu sorgen, wird empfohlen, den Objektträgerhalter immer voll zu beladen. Dadurch wird eine gleichmäßige Erhitzung der Schnitte in jedem Durchlauf erreicht.

Alle Reagenzien des Kits werden in Autostainer Link-Reagenzfläschchen geliefert. Für die Arbeit mit dem Dako Autostainer Link-Gerät sollten sowohl DAB+-Arbeitslösung als auch Permanent Red-Arbeitslösung in Reagenzfläschchen des Autostainer Link angesetzt werden.

Vor Beginn der Immunfärbung alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20−25 °C) bringen. Alle Inkubationen sollten ebenfalls bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Folgende Vorbehandlungsschritte vor Anwendung des EnVision™ DuoFLEX Doublestain System auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten durchführen. Die Probe entparaffinieren und hydrieren. Detaillierte Angaben zur Probenvorbereitung bitte Abschnitt A.5 und der Packungsbeilage des jeweiligen Cocktails aus primären Antikörpern von Dako entnehmen.

Empfohlenes Verfahren zur 3-in-1-Probenvorbereitung mit PT Link:

1. Eine Arbeitslösung durch Verdünnen der konzentrierten EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution mit destilliertem oder deionisiertem Wasser herstellen.

2. Die Behälter des PT Link mit einer ausreichenden Menge Arbeitslösung (1,5 L) füllen, um die Gewebeschnitte zu bedecken.

3. PT Link auf Erwärmen der Lösung auf 65 °C einstellen.

4. Die aufgebrachten, manuell entparaffinierten/hydrierten Gewebe in die vorgewärmte EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (Arbeitslösung) in den PT Link-Tank geben und 20−40 Minuten bei 97 °C inkubieren. Die optimale Inkubationszeit muss vom Anwender bestimmt werden.

5. Die Schnitte im PT Link auf 65 °C abkühlen lassen.

6. Die Gestelle aus dem PT Link-Tank nehmen und die Objektträger sofort in einen Behälter/Tank (z.B. PT Link Rinse Station, Code-Nr. PT109) mit verdünntem, auf Raumtemperatur gebrachtem EnVision™ FLEX Wash Buffer, Code-Nr. K8007 tauchen.

7. Die Objektträger für 1–5 Minuten im verdünnten und auf Raumtemperatur gebrachten EnVision™ FLEX Wash Buffer, Code-Nr. K8007, belassen.

8. Objektträger in ein Dako Autostainer Link-Gerät einsetzen und mit der Färbung fortfahren. Die Gewebeschnitte dürfen während der Behandlung oder des immunhistochemischen Färbeverfahrens nicht austrocknen. Trockene Proben können unspezifische Färbungen aufweisen.

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Bei Verwendung im PT Link für das HIER-Verfahren können die verdünnte Target Retrieval Solution und der verdünnte Wash Buffer 3-mal innerhalb von 5 Tagen verwendet werden, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert werden.

HIER-Verfahren mit PT Link:

Nach der Entparaffinierung und Hydrierung mit Puffer (Wasser) ist bei den meisten Gewebeschnitten eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER) erforderlich. 1. Eine Arbeitslösung durch Verdünnen der konzentrierten EnVision™ FLEX Target Retrieval

Solution mit destilliertem oder deionisiertem Wasser herstellen.

2. Die Behälter des PT Link mit einer ausreichenden Menge Arbeitslösung (1,5 L) füllen, um die Gewebeschnitte zu bedecken.

3. PT Link auf Erwärmen der Lösung auf 65 °C einstellen.

4. Die manuell entparaffinierten/hydrierten Gewebe in die vorgewärmte EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (Arbeitslösung) in den PT Link-Tank geben und 20−40 Minuten bei 97 °C inkubieren. Die optimale Inkubationszeit muss vom Anwender bestimmt werden.

5. Die Schnitte im PT Link auf 65 °C abkühlen lassen.

6. Die Gestelle aus dem PT Link-Tank nehmen und die Objektträger sofort in einen Behälter/Tank (z.B. PT Link Rinse Station, Code-Nr. PT109) mit verdünntem, auf Raumtemperatur gebrachtem Dako EnVision™ FLEX Wash Buffer, Code-Nr. K8007 tauchen.

7. Die Objektträger für 1–5 Minuten im verdünnten und auf Raumtemperatur gebrachten EnVision™ FLEX Wash Buffer, Code-Nr. K8007, belassen.

8. Objektträger in ein Dako Autostainer Link-Gerät einsetzen und mit der Färbung fortfahren. Die Gewebeschnitte dürfen während der Behandlung oder des immunhistochemischen Färbeverfahrens nicht austrocknen. Trockene Proben können unspezifische Färbungen aufweisen.

9. Für die getrennte Hämatoxylin-Färbung die Objektträger in ein Hämytoxylin-Bad tauchen. Die Inkubationsdauer hängt von der Stärke der verwendeten Hämatoxylinlösung ab. Nach der Hämatoxylin-Gegenfärbung gründlich in destilliertem oder deionisiertem Wasser spülen.

10. Bei Coplin-Schalen:

1. Die Färbeschalen mit verdünnter EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution in ein Wasserbad stellen.

2. Die Schalen mit der EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution im Wasserbad auf 95−99 °C erwärmen. Zur Temperaturstabilisierung und zum Vermeiden von Verdunstung die Schalen mit Deckeln abdecken.

3. Die auf Raumtemperatur gebrachten Gewebeschnitte in die vorgewärmte EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution in den Färbeschalen eintauchen.

4. Die Temperatur von Wasserbad und EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution wieder auf 95−99 °C bringen.

5. Die Schale mit den Objektträgern aus dem Wasserbad nehmen. Die Objektträger in der EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution bei Raumtemperatur 20 (±1) Minuten abkühlen lassen.

6. Die EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution ausgießen und die Schnitte mit EnVision™ FLEX Wash Buffer spülen.

7. Das Gestell mit den gespülten Schnitten in ein Dako Autostainer Link-Gerät einsetzen. Sofort mit dem vorprogrammierten Färbedurchlauf beginnen.

HINWEIS: Bei Verwendung von Coplin-Schalen für das HIER-Verfahren können die verdünnte EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution und der verdünnte EnVision™ FLEX Wash Buffer nur ein Mal verwendet werden (Einmalgebrauch).

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Einige Epitope vertragen das HIER-Verfahren nicht und andere erfordern enzymatische Vorbehandlung. Angaben bitte der Packungsbeilage des jeweiligen Cocktails von primären Antikörpern von Dako entnehmen. Die Gewebeschnitte dürfen während der Behandlung oder des anschließenden immunhistochemischen Färbeverfahrens nicht austrocknen. Für eine bessere Haftung der Gewebeschnitte an den Glas-Objektträgern werden Dako FLEX IHC Microscope Slides (Code-Nr. K8020) empfohlen.

Inkubation mit dem Cocktail aus primären Antikörpern:

Dako DuoFLEX gebrauchsfertige Antikörper in einem Cocktail können mit dem Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten verwendet werden. Die Färbeschritte und Inkubationszeiten sind in der Autostainer Link-Software als Protokoll DuoFlex vorprogrammiert. Sollten die Protokolle auf dem verwendeten Autostainer Link-Gerät nicht vorhanden sein, wenden Sie sich bitte an den technischen Kundendienst von Dako. Optimale Inkubationszeiten für den Cocktail aus primären Antikörpern, EnVision™ DuoFLEX/HRP und EnVision™ DuoFLEX/AP, hängen vom angewendeten Cocktail aus primären Antikörpern abhängig. Angaben bitte der Packungsbeilage des jeweiligen Cocktails von primären Antikörpern von Dako entnehmen. Die Verifizierung des verwendeten Protokolls obliegt dem Anwender.

Nach der Färbung sollten die Objektträger eingedeckt werden. Zum Eindecken in wässrigem Medium werden Eindeckmedien wie Dako Glycergel™ Mounting Medium, Code-Nr. C0563, oder Faramount Aqueous Mounting Medium, Code-Nr. S3025, empfohlen.

Für permanentes Eindecken in nichtwässrigem Medium wird empfohlen, die Objektträger vollständig bei Raumtemperatur oder bei 60 °C für 1 Stunde luftzutrocknen und dann in Xylol oder einem Xylolersatz 5 Minuten lang zu inkubieren.

In einigen Fällen können bei Objektträgern, die vor dem Versiegeln luftgetrocknet wurden, kleine, punktförmige Artifakte auftreten. Dies kann verhindert werden, indem die Objektträger nach einem der folgenden Verfahren behandelt werden:

Option 1: Direkter Transfer der Objektträger mit Patientengewebe vom Autostainer-Gerät in Alkohol, entweder:

e) 99% Alkohol mit einer Inkubationszeit von maximal 2 Min., oder f) Drei sukzessive Bäder in 100% Alkohol, jeweils 10 mal eintauchen.

Danach die Objektträger jeweils 10 mal in 2 sukzessive Xylolbäder eintauchen, anschließend permanent eindecken.

Option 2: Direkter Transfer der Objektträger mit Patientengewebe vom Autostainer-Gerät in Alkohol mit unterschiedlichen Verdünnungsstufen, bei jedem Schritt nur für 30 Sek. und ohne Xylol-Exposition, anschließend permanent eindecken.

Längere Alkohol- und/oder Xylol-Exposition kann zu Chromogenextraktion und damit zu ungenügender Färbung führen.

Diese Verfahren wurden nicht für alle primären Antikörper getestet und sind deshalb lediglich als Richtlinien anzusehen. Dementsprechend muss das angepasste Dehydrierungsprotokoll mit anschließendem permanentem Eindeckeln überprüft werden, um sicherzustellen, dass es auch für den fraglichen Antikörper gilt. Jeder verwendete primäre Antikörper ist mit dem angepassten Dehydrierungsprotokoll zu beurteilen, um sicherzustellen, dass das Färbemuster mit dem unter “Leistungsmerkmale” des primären Antikörpers beschriebenen Färbemuster identisch ist.

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Qualitätskontrolle Bei jedem Färbedurchlauf sollte eine als positiv bekannte Kontrollprobe mitgeführt werden, um die Leistung aller verwendeten Reagenzien zu bestätigen. Wenn das positive Kontrollgewebe keine Färbung aufweist, muss die Markierung der Testproben für ungültig erklärt werden.

Auswertung der Ergebnisse Das vom Maus-Antikörper erkannte Antigen wird mit DAB+ Chromogen braun angefärbt. Das vom Kaninchen-Antikörper erkannte Antigen wird mit Permanent Red-Chromogen rot angefärbt. Beide Farben ermöglichen eine Visualisierung gegen eine Hämatoxylin-Gegenfärbung. Falls eine unspezifische Färbung vorliegt, ist dies an einer diffusen braunen oder roten Färbung zu erkennen. Zellkerne werden durch die Hämatoxylin-Gegenfärbung blau gefärbt. Es ist möglich, dass während kleiner Autostainer Link Läufe (d. h. höchstens neun Objektträger) bei bestimmten Geweben Hintergrundfärbung beobachtet wird. Diese Hintergrundfärbung kann durch eine Erhöhung der Spülzeiten im Färbeprotokoll behoben werden. Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte den technischen Kundendienst von Dako. References Bibliographie Literaturhinweise 1. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby

Company; 1980

Produced by: Produit par : Hersteller: Dako North America, Inc. 6392 Via Real Carpinteria, CA 93013, USA

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