ENZIMI DI RESTRIZIONE

Reazioneligasica di frammenti direstrizione

Fig 4.20 separation of poly-A mRNA

mRNA Purification

1. Total RNA Purification

2. PolyA+ RNA purification using oligo(dT)

mRNA

primed mRNA

mRNA/cDNAhybrid

AAAAAn

AAAAAn

TTTTT

AAAAAn

TTTTT

Anneal oligo dT primer

Reverse Transcriptaseand dNTPs

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1

mRNA/cDNAhybrid

nicked RNA

AAAAAn

TTTTT

AAAAATTTTT

RNase H

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2

AAAAAn

TTTTT

DNA Pol I

nicked RNA usedas primers by Pol

2nd strand cDNAin pieces

ds cDNAAAAAATTTTT

cDNA Library

Clone into vector

E. coli DNALigase

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3

AAAAATTTTT

cDNA synthesisTTTTTTTTT

First strand

Nick translation

cDNA library

Vettori e clonaggio

Vettori

PlasmidiFagiCosmidiYAC

Vettori e clonaggio

Plasmide

Molecola circolare di DNA a doppiofilamento, normalmente presentenella cellula batterica, in gradodi replicarsi autonomamente

dal cromosoma.

VETTORI DI CLONAGGIO

Vettori e clonaggio

Replicazione di un plasmide

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

CLONAGGIO:

-TRASFORMAZIONE

-SELEZIONE

-CRESCITA COLONIE

IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA

BATTERICA DI INTERESSE

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)

Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble)

+

galactose

-galactosidase

Inserting chromosomal DNA into a vector

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

Vector

Chromosome

Cut with EcoRI and add DNA ligase

Recombinant vector

Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal)

LacZ gene codes for -galactosidase

Ampicillin resistance gene

Bacteria from ligation platedon ampicillin and X-Gal

Containswild typeplasmd

Containsrecombinantplasmd

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio

Lunghezza massima delDNA clonabile in un plasmide:

circa 20 Kb

Vettori e clonaggio

I virus sono piccoli parassitinon in grado di replicarsi.Dopo aver infettato una

cellula-ospite utilizzano i suoisistemi di replicazione e sintesi

delle proteine per riprodursi

Vettori e clonaggio

I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

Vettori e clonaggio

Ciclo litico del fago T4

Vettori e clonaggio

Il fago più utilizzato in biologiamolecolare è il fago

Vettori e clonaggio

Ciclolitico elisogenicodel fago

Vettori e clonaggio

Assemblaggiodi un fago

Vettori e clonaggio

Mappa del genoma del fago

Vettori e clonaggio

Clonaggio diframmenti diDNA nelfago

Vettori e clonaggio

Formazione di cloni fagici

Vettori e clonaggio

L’infezione dei batteri con il fago è circa 103 volte più efficiente

della trasformazione con un plasmide

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un fago:

20-25 Kb

Vettori e clonaggio

Un cosmide è un plasmidecontenente la sequenza COS

dal fago

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio

Clonaggio diframmenti diDNA in uncosmide

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un cosmide:

circa 45 Kb

EcoR I

Genomic LibraryInfect cells

AAAAAA AAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

cDNA synthesis

Infect cellscDNA library

• Preparing the insert– Partial digestion preferred

Genomic Library Construction

Ligation to vector

Genomic library cDNA library

Genomic DNA mRNASource

Species or strains Species or strainsTissuesDevelopmental stages

Variation

12k -- 20k 0.2k -- 6kInsert size

Equal Correlate with expression level

Representation

Only one Expression vs. nonexpression

Type

DNA DNA or antibody orprotein

Probe

Gene structureInfer protein identity

Encoded proteinInfer protein identity

Purpose

Screening a eukaryotic gene library

• Homologous gene from other organism– Mammalian genes are very similar– Thus if trying to get human gene screen with the

equivalent gene from another organism– Oligonucleotide based on protein sequence or

known sequence of homologous gene– Purify protein and determine sequence– Build a nucleotide sequence which codes for

protein sequence

Amino acid sequenceMet-Asn-Lys-Trp-Glu-Met

ATG AAT AAA TGG GAA ATGATG AAT AAA TGG GAG ATGATG AAT AAG TGG GAA ATGATG AAT AAG TGG GAG ATGATG AAC AAA TGG GAA ATGATG AAC AAA TGG GAG ATGATG AAC AAG TGG GAA ATGATG AAC AAG TGG GAG ATG

Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG; Trp = TGG; Glu = GAA or GAG

How many probes must we make?

CLONAGGI MULTIPLI

VETTORI DI ESPRESSIONE

PROTEINE DI FUSIONE

PRODUZIONE DI LIBRERIE

Screening the Library

ATTAGCGCCTTTACGCA……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………

Screening with DNA probe

• Probe is identified cloned– From other organism

– Same organism• Looking for variants

• Chromosome walk

Chromosome walk

Expression vector

cDNA library

Clone cDNAs

Screen for gene of interest based on activity or antibodies

Genome Projects

• Whole genome sequencing

• Fragment and clone• Sequence ALL clones!• Computer assembles

Genome Projects

   Bee             Cat             Chicken             Cow             Dog             Fruit fly    Human    Malaria parasite    Microbial Genomes    Mosquito     Mouse    Nematode    Pig              Plant Genomes Central    Rat    Retroviruses     Sea urchin Tribolium            Sheep             Zebrafish

• Multiple organisms provide suitable systems for experimentation– Zebrafish-development– Rat-physiology– Dog- genetic disease– Fruit fly- behavior

• Some of practical significance– Mosquito/Malaria parasite

Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento

Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da

•Elevata processività•Bassa attività esonucleasica 5’-3’•Bassa attività esonucleasica 3’-5’

(es. Klenow, Sequenasi)

oriAp

BamHI

Promotore/operatore

TerminatoreShine-Dalgarno

Evoluzione dei vettori d’espressione

lacI

oriC

TAG

M13

Denaturazione del vettoreUtilizzo di un fago helperPer M13 e produzione dellaForma a singolo filamento

(1) Produzione dello stampo a filamento singolo

Utilizzodella PCR

Utilizzo di fagemidi

Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

1) Uno stampo a singola elica ha bisogno di:

5’-A T C T T T T A G A GT A C C3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

PRIMER DNA Polimerasi

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi

PRIMER

(2,3) Sintesi del filamento marcato

Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegueindefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché

posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

ddCTPddCTP

ddCTPddCTP

ddCTPddCTP

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi

PRIMER

+ ddNTP ( per es. ddCTP)

5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

STOP

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni dCTP

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC5’ 3’

Ibridazione conIl primer

+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC-C ddC

-CC ddG-CCGATT ddG

-CCGA ddT-CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG

A C G T

-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC

GT

T

AGCC

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione dilettura

Nuovi metodi di sequenziamento

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)

Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena

terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

DNA stampo

ddATPPCR con un solo primer

ddA

ddA

ddA

ddA

ddA

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddC

ddT

ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing

A G T A C T G G G A T C

GelElectrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA

DNA FragmentsSeparated by

Electrophoresis

Output to Computer

Scanning Laser Excites

Fluorescent Dyes

Optical Detection System

Fluorescent DNA Sequencing Data

Fluorescent DNA Sequence Trace

Size of gene library

N = ln(1-P) ln (1-A/B)

N = Number of clones P = 95 % probability of finding geneA = Average size of DNA fragmentsB = Total size of genome

E. coli has genome of 4,800,000 nucleotidesAverage size of insert is 10,000 nucleotidesNumber of clones for 95 % probability is 1700

Size of gene library

• If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed)

• Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA– I.e. if each vector contains a large piece of DNA

you don’t need so many clones to make a gene library

What vectors for what libraries?

VectorInsertsizeWhat librariesPlasmid<10 kbBacteriaLambda phage18-25 kbYeastCosmid34-45 kbIntermediateeukaryotesYAC etc0.1 – 1 MbHigher Eukaryotes

Human library requires 14000 YAC clones

Human library requires >1,000,000 plasmid clones

Vettori e clonaggio

YAC=yeast artificial chromosome

Vettori e clonaggio

Dimostrazionesperimentaledegli elementifunzionali diun cromosoma

Vettori e clonaggio

Vettore YAC:sequenze ARS CEN TEL

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in uno YAC:

fino a 1000 Kb

Vettori e clonaggio

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors

Vector Type Cloned DNA (kb)

Plasmid

λ phage

Cosmid

P1 phage

BAC (bacterial artificial chromosome)

YAC (yeast artificial chromosome)

20

25

45

100

300

1000

Whole Genome ShotgunWhole Genome Shotgun • Celera Genomics

Fragment and sequence entire genome

Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

Overview of Facts Asserted

• 2.91 billion base pairs (bp)

• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA

• 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)

• less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

Structure of the genome

http://genome.ucsc.edu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov