enzyme subtilisin chất tẩy rửa

7/27/2019 Enzyme subtilisin chất tẩy rửa

http://slidepdf.com/reader/full/enzyme-subtilisin-chat-tay-rua 1/18

Detergent proteases

Karl-Heinz Maurer

Over the past 20 years, the development of

subtilisins as typical detergent proteases has

employed all the tools of enzyme technology,

resulting in a constant flow of new and

improved enzymes. The number of molecules

identified and characteried, however, is in

clear opposition to the number of molecules

that are entering the market. Will the next-

generation detergent proteases be based on

new backbones different from subtilisins, or will

the use of all available technologies (rational

design, directed evolution and exploitation of

natural diversity) yield improved subtilisins,

ending the current era dominated by high

alkaline subtilisins? These questions will have to

be answered not only by the performance of

the molecules themselves, but also by their

yield in fermentation and their compatibility

with existing production technologies.

Addresses

Henkel, Enzyme Technology, Henkelstrasse 6740191, Duesseldorf,

Germany e-mail: [email protected]

Current Opinion in Biotechnology 2004, 15:330 –

334 This review comes from a themed issue on

Protein technologies and commercial enzymes

Edited by Karl-Erich Jaeger Available online 1st

July 2004 0958-1669/$ – see front matter @

2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.

DOI 10.1016/j.copbio.2004.06.005

Introduction

Apart from their importance in physiology (e.g.

in the activation of zymogenic preforms of clots,

the processing and transport of secretory

Ch ấ t t ẩy rửa protease

Trong 20 năm qua, sự phát tri ển của subtilisins

một ch ấ t t ẩy rửa protease điển hình đã được sử

dụng ở t ấ t cả các công cụ của công nghệ

enzyme, k ế t quả là liên tục đi mới và cải ti ế nenzym. S ố lượng phân tử được xác định và

được mô tả đặc điểm, Tuy nhiên, đối lập rõ ràng

với s ố lượng phân tử được đưa vo thị trường.

Sẽ là ch ấ t t ẩy rửa th ế hệ ti ế p theo protease

được dựa trên nn tảng mới khác nhau từ

subtilisins, hoặc sẽ sử dụng t ấ t cả các công nghệ

có s ẵn (thi ế t k ế hợp lý, chỉ đạo hát triển v

khai thác sự đa dạng tự nhiên) cải thiện sản

lượng subtilisins, k ế t thúc thời z ị chi ph ối cao

bởi subtilisins ki m? Những câu hỏi này sẽ đượctrả lời không chỉ bởi hiệu su ấ t của các phân tử,

nhưng cũng ởi năng suấ t của n trong quá

trình lên men và khả năng tương thích của n

với công nghệ sản xu ấ t hiện có.

Địa chỉ

Henkel, Enzyme Technology, Henkelstrasse67 40191, Duesseldorf,Germany

e-mail: [email protected]

Current Opinion in Biotechnology 2004,15:330 –334This review comes from a themed issue onProtein technologies and commercialenzymesEdited by Karl-Erich Jaeger

Available online 1st July 20040958-1669/$ – see front matter

_ 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.DOI 10.1016/j.copbio.2004.06.005

Ngoài t ầm quan trọng của n trong sinh l{ học

(ví dụ như trong ích hoạt các reforms blood

zymogenic của các enym, đông máu, làm tan

vón cục máu đông, chế bi ế n và vận chuy ển

mailto:[email protected]






clot-ting, the lysis of blood proteins across

membranes and as pathogenic factors)

proteases are highly relevant in technical

enzyme applications. Of these, their use in

detergents is the most prominent with respect

to market volume and tonnage. The idea of

using proteases in industry — and secifically in

detergents — goes back to the use of

pancreatic extracts by Roehm in 1913. Only

with the availability of enzymes from bacteria in

the 1960s, however, did their use become

efficient in the technical as well as in the

economic sense. From the beginning these

enzymes were produced using Bacillus species,

starting with Bacillus amyloliquefaciens and

Bacillus licheniformis. The alkaline proteases

from these species represent the lead

molecules for the sub-tilisins. Members of the

subtilisin superfamily of pro-teases have now

een identified, with different functions, in

practically all living organisms [1]. Nevertheless,

the subtilisins from Bacillus species still provide

all the proteases used in the detergent industry.

In the 1980s the high-alkaline subtilisins were

identified, and within a short time they had

relaced the ‘standard’ sutilisins in all ut

liquid detergents. In the mid-1980s the

subtilisins were shown to be an excellent model

for testing genetic engineering approaches, and

by the end of the decade they were amongst

the first technical enymes to e manufactured

using recombinant strains. Protein-engi-neered

enzymes entered the market at the beginning

of the 1990s and established themselves as

benchmarks in several applications. Their

importance is illustrated by the fact that the

amount of subtilisin produced and used in the

European Union in 2002 was 900 tons of pure

enzyme (Human Health and Environmental Risk

Assessment ‘ris assessment of detergent raw

materials’; htt://www.hera-project.org).

protein bài ti ế t qua màng và y ế u t ố gây bệnh)

protease có các ứng dụng liên quan nhi u trong

men kỹ thuật. Trong s ố này, ni ật nhất l sử

dụng trong ch ấ t t ẩy rửa với hối lượng v trọng

tải lớn liên quan đế n thị trường cha. Ý tưởng sử

dụng protease trong ngành công nghiệ v đặc

biệt trong ch ấ t t ẩy rửa, cho con người sử dụng

l các chấ t chi ế t xu ấ t từ tụy bởi Roehm trong

năm 1913. Chỉ với sự s ẵn có của các enzym từ vi

khu ẩn trong những năm 1960, tuy nhiên, đã sử

dụng chúng trở thành hiệu quả trong các kỹ

thuật cũng như trong { nghĩa inh tế . Ngay từ

đầu các enyme được sản xu ấ t sử dụng Loài vi

khu ẩn, b ắt đầu với vi khu ẩn Bacillus

amyloliquefaciens và vi khu ẩn Bacillus

licheniformis. Các protease ki m từ các loi đại

diện cho các phân tử subtilisins. Các thành viên

của lin họ subtilisin protease hiện nay đã được

xác định, với các chức năng hác nhau, trong t ấ t

cả các sinh vật s ống [1]. Tuy nhiên, subtilisins từ

các loài vi khu ẩn Bacillus v ẫn cung c ấ p t ấ t cả các

rotease được sử dụng trong ngành công

nghiệp ch ấ t t ẩy rửa. Trong những năm 1980 các

subtilisins ki m manh đã được xác định, và

trong vòng một thời gian ng ắn, họ đã thay thế

các subtilisins 'chu ẩn' trong t ấ t cả những ch ấ t

t ẩy rửa lỏng. Vào giữa những năm 1980,

sutilisins được th ể hiện là một mô hình tuyệt

vời để ti ế p cận hương há ỹ thuật thử

nghiệm di truy n, và vào cu ối thập kỷ n nằm

trong s ố những enzyme kỹ thuật đầu tiên được

sản xu ấ t sử dụng các chủng tái t hợ. nym

rotein-được thiế t k ế ước vào thị trường ngay

từ đầu của những năm 1990 v trở thnh các

tiêu chu ẩn trong nhi u ứng dụng. T ầm quan

trọng của n được minh họa bởi thực t ế là s ố

lượng sản xu ất v sutilisin được sử dụng trong

Liên minh châu Âu trong năm 2002 l 900 tấ n

enzyme tinh khi ế t (sức khỏe con người và rủi ro

môi trường "Đánh giá rủi ro của ch ấ t t ẩy rửa

nguyên vật liệu giám định; http://www.hera-

project.org).

http://www.hera-project.org/






Here, we review recent attempts to develop

new and improved proteases for use in

detergents — either through the protein

engineering of traditional subtilisins or by

searching the metagenome for new enzymes.

We also discuss aspects of production and

formulation and consider how these factors will

effect future develoments in the field.

Subtilisins

Subtilisins are defined y their catalytic

mechanism as serine proteases. Their amino

acid sequence and three-dimensional structure

can be clearly differentiated from the other

serine proteases, such as chymotrypsin, carbox-

ypeptidase and Peptidase A from Escherichia

coli. The catalytic triad of subtilisins consists of

aspartic acid, histidine and serine. Although the

size of subtilisins varies from 18 kDa to 90 kDa,

all the subtilisins used in detergents have a size

of approximately 27 kDa.

The success of subtilisins is based on several

factors, including their high stability and

relatively low sustrate secificity — features

common in extracellular proteases. Their

production as extracellular enzymes is of course

an important factor in itself, as this greatly

simlifies the separation of the enzyme from

the biomass and facilitates other downstream

processing steps. Another important point is

the ability of Bacillus strains to secrete enzymes

over a very short period of time into the

fermentation broth.

Subtilisins are used in all types of laundrydetergents and in automatic dishwashing

detergents. Their function is to degrade

proteinaceous stains [2,3,4]; typical stains

include blood, milk, egg, grass and sauces. For

testing purposes, such stains are commercially

available from test institutes.

Ở đây, chúng tôi xem xét nỗ lực g ần đây để

phát tri ển mới và cải thiện rotease để sử dụng

trong ch ấ t t ẩy rửa, hoặc thông qua các kỹ thuật

protein của subtilisins truy n th ống hoặc b ằng

tìm ki ế m các metagenome cho các enzyme mới.

Chúng tôi cũng thảo luận v các khía cạnh của

sản xu ấ t, xây dựng và xem xét làm th ế nào

những y ế u t ố này sẽ ảnh hưởng đế n sự phát

tri ển lĩnh vực trong tương lai

Subtilisins.

Sutilisins được xác định bởi cơ chế xúc tác của

n như rotease serine. cấ u trúc Chu ỗi axit

amin và three-dimensional có th ể được phân

biệt rõ ràng với các protease serine khác, ch ẳng

hạn như chymotrysin, caroxyetidase v

peptidase A từ Escherichia coli. Các bộ ba xúc

tác của subtilisins bao g ồm acid aspartic,

histidine và serine. Mặc dù ích thước của

sutilisins thay đi từ 18 Da đế n 90 kDa, t ấ t cả

các sutilisins được sử dụng trong ch ấ t t ẩy rửa

c ích thước khoảng 27 kDa.

Sự thành công của sutilisins được dựa trên

một s ố y ế u t ố, trong đ c sự n định cao và b

mặt tương đối th ấ đặc - tính năng h bi ế n

trong protease ngoại o. uá trnh Sản xu ấ t

các enzym ngoại bào là một y ế u t ố quan trọng

trong chính n, v điu ny lm đơn giản hóa

tách enzyme từ sinh kh ối và tạo điu kiện thuận

lợi các ước xử lý. Một v ấn đ quan trọng là khả

năng của các chủng vi khu ẩn Bacillus ti ế t ra

enzyme trong một thời gian r ấ t ng ắn canh

trường lên men.

Sutilisins được sử dụng trong t ấ t cả các loạich ấ t t ẩy rửa và trong ch ấ t t ẩy rửa chén tự động.

Chức năng của chúng là làm suy giảm các v ế t

b ẩn proteinaceous [2,3, 4?]; v ế t b ẩn điển hình

bao g ồm máu, sữa, trứng, cỏ v nước s ốt. để

thử nghiệm mục đích, vế t b ẩn như vậy là

thương mại s ẵn có từ các viện ki ểm tra. Để thử



For automatic dishwashing tests the prepara-

tion of stains has been described in great detail.

An aspect that has to be considered when

screening candidate enzymes for better

performance is that they are not acting on

soluble substrates in solution, but on substrates

bound to the surface of a solid, water-insoluble

substrate.

In contrast to more biochemical environments,

where the denaturation of protein substrates

normally leads to improved enzyme activity, the

denaturation of proteinac-eous stains by aging,

heating and oxidization makes them less

accessible to enzymic degradation. The effect of

oxygen bleach on heat-denatured blood or milkstains is an excellent example: the presence of

oxygen bleach transforms an otherwise easy

rotease target into an extremely difficult one.

Therefore, test results depend critically on the

type of stain, the composition of the detergent

and the nature and status of the textiles used in

the washing test as filler material (allast). The

same holds true for automatic dishwashing

detergents, where the nature, composition and

amount of ballast stain are crucial aspects in theevaluation of enzyme performance.

Te denficaon and opmsaon of

detergent proteases

At present, less than 15 different enzyme

molecules are used in detergents worldwide.

These enzymes originate from B.

amyloliquefaciens, B. licheniformis, Bacillus

clausii, Bacillus lentus, Bacillus alkaloophilus,

and Bacillus halodur-ans [2]. Some of these

species assignments have in recent years been

changed; for example, Savinase1 and Esper-

asee1 were assigned for several years to acillus

subtilis or B. lentus (see Table 1) [5 ,6].

nghiệm rửa chén tự động chu ẩn bị v ế t b ẩn đã

được mô tả r ấ t chi ti ế t. một khía cạnh mà phải

được xem xét khi sàng lọc chọn men cho hiệu

su ấ t t ốt hơn l họ hông tiến hnh trên chấ t

hòa tan trong dung dịch, nhưng trên n n hạm

vi b mặt của một ch ấ t r ắn, b mặt không tan

trong nước.

Trái ngược với nhi u môi trường sinh ha, nơi

sự bi ế n tính của ch ất rotein thường d ẫn đế n

hoạt động của enyme được cải thiện, sự bi ế n

tính của proteinaceous do v ế t b ẩn quá lâu, lm

nóng và oxy hóa làm cho họ khó ti ế p cận suy

thoái enzym. Ảnh hưởng của oxy t ẩy trên máu

hoặc sữa v ế t b ẩn nhiệt bi ế n tính là một ví dụ

tuyệt vời: sự hiện diện của ch ấ t t ẩy ôxy lmbi ến đi protease d ễ dàng n ế u không thành một

cực kz h hăn nhất. Do đ, k ế t quả ki ểm tra

phụ thuộc r ấ t nhi u vào loại v ế t b ẩn, các thành

ph ần của ch ấ t t ẩy rửa và tính ch ấ t, tình trạng

của hàng dệt may được sử dụng trong ki ểm tra

rửa như hụ liệu (ch ấn lưu). Cùng đúng với ch ấ t

t ẩy rửa rửa bát tự động, nơi tính chấ t, thành

ph ần và s ố lượng của ch ấn lưu vế t là khía cạnh

quan trọng trong việc đánh giá hiệu su ấ t

enzyme.

Vic xác định và t ố ư óa cấ t t ẩy rửa

protease.

Hiện nay, có ít nh ấ t 15 phân tử enzyme khác

nhau được sử dụng trong ch ấ t t ẩy rửa trên toàn

th ế giới. Các men này b ắt ngu ồn từ B.

amyloliquefaciens, B. licheniformis, Bacillus

clausii, LENTUS trực khu ẩn, vi khu ẩn Bacillus

alkaloophilus, và vi khu ẩn Bacillus halodurans

[2]. Một s ố các công việc trong những năm gần

đây v các loi được thay đi, ví dụ, Savinase1

v serasee1 được chỉ định trong nhi u năm

để Bacillus subtilis hoặc B. LENTUS (xem Bảng 1)

[5?, 6].



Protein engineering methods

Since protein engineering with subtilisins began

in 1984, all the amino acid positions have been

modified either y site-directed mutagenesis

based on rational design or, later, by variousmethods of random mutagenesis. Most of this

work is published in patents and not in the

scientific literature. The example of replacing

Met222 (adjacent to the active Ser221) with

amino acid residues that are stable towards

hydrogen peroxide has become a textbook

example of a rational approach to site-directed

mutagenesis [7]. Hydrogen peroxide and peroxo

acids are typical bleaching agents generated in

the cleaning process of bleach-containingproducts. The oxidation of certain methionine

residues to sulfoxides was known for more than

a decade efore the first aroaches to site-

directed mutagenesis were realized. In 1991 the

first roteases modified in this way for

hydrogen peroxide stability were marketed,

even though the performance of these variants

did not fulfil their romise. By 1996

substitutions at nearly every position in the

mature 275 amino acid BPN0 sub-tilisin (BacillusProtease Novo type, subtilisin from B.

amyloliqefaciens) had been claimed in patents.

The BPN0 subtilisin is generally considered to

be the lead molecule for subtilisin

modifications, and mutations in other su-

tilisins often refer to the homologous position

in this lead molecule. There are some excellent

general reviews on the protein engineering of

sutilisin, as well as articles on more secific

detergent applications [8,9]. Since 1997, several

gene shuffling aroaches have een

performed with subtilisins. Interesting results

from the shuffling of 26 rotease genes

Pương páp kỹ thuật protein

K ể từ khi kỹ thuật protein với subtilisins b ắt đầu

vo năm 1984, tấ t cả các vị trí amino acid đã

được sửa đi ằng hướng bi ến đi-vị trí dựa

trên dự iến hợ l{ hoặc, sau đ, ằng cáchương há hác nhau của đột bi ế n ng ẫu

nhiên. công việc quan trong ny được công b ố

trong b ằng sáng ch ế v hông c trong ti liệu

khoa học. Ví dụ thay th ế Met222 (ti ế p giáp với

hoạt động Ser221) với amino acid được n định

đối với hydrogen eroxide đã trở thành một

sách giáo khoa ví dụ v một cách ti ế p cận hợp lý

để định hướng vị trí đột bi ế n [7]. Hydrogen

peroxide và axit peroxo là ch ấ t t ẩy tr ắng điển

hnh được tạo ra trong quá trình làm sạch cóchứa các sản ph ẩm thu ốc t ẩy. Quá trình oxy hóa

của một s ố dư lượng methionine để sulfoxides

được bi ết đế n nhi u hơn hơn một thập kỷ trước

hi các hương há tiế p cận đầu tiên vo định

hướng vị trí đột bi ến đã được thực hiện. Năm

1991, rotease đầu tiên sửa đi theo cách này

cho hydro eroxide được sự n định trên thị

trường, mặc dù hiệu su ấ t của các bi ế n th ể

hông đúng với dự tính. Năm 1996 mỗi vị trí

được thay thế ỹ cng trong 275 axit amin BN0subtilisin (Bacillus Protease loại Novo, subtilisin

từ B. amyloliqefaciens) đã được kh ẳng định

trong các b ằng sáng ch ế . các BPN0 subtilisin

thường được coi là các phân tử d để sửa đi

sutilisin, v các đột bi ế n trong subtilisins khác

thường đ cậ đế n vị trí tương đồng trong điu

này phân tử d. C một s ố đánh giá chung tuyệt

vời trên các kỹ thuật protein của sutilisin, cũng

như các i viế t v ứng dụng cụ th ể hơn chấ t

t ẩy rửa [8?, 9].

Từ năm 1997, một s ố hương há xáo trộn

gen đã thực hiện với subtilisins. K ế t quả thú vị

từ việc xáo trộn của 26 gen rotease đã được

thử nghiệm khả năng hoạt động với dung



have been described for properties such as

activity in organic solvents, tempera-ture

stability, and activity at high or low pH [10 –12].

Little, however, has been published on stain

removal. Owing to the large number of variant

molecules gener-ated y shuffling and otherrandom techniques, screening methods with

high-throughput and increased relevance have

had to be developed. Unfortunately, these

methods are still not entirely satisfactory,

Which might explain why no outstanding new

subtilisin variant created by one of the gene

shuffling technologies is yet present indetergents.

Phage display, because of the close link between

the polypeptide and its encoding gene, is

considered to be an excellent method for the

selection of enzymes with desired properties.Legendre et al. used subtilisin 309 to illustrate

the potential of this method, modifying its

substrate specificity with respect to the aminoacid at the P4 site of the substrate. Soumillion

and Fastrez give further examples of phage-

display applications with subtilisins.

môi hữu cơ, thử nghiệm ở điu kiện nhiệt độ n

định và hoạt động ở các giá trị pH cao hay th ấ p

[10-12], tuy nhiên, đã được sản xuất để loại bỏ

v ế t b ẩn. Do s ố lượng lớn các phân tử tạo ra bi ế n

th ể bởi xáo trộn và kỹ thuật ng ẫu nhiên khác,

hương há sng lọc phù hợp với số lượng cao

v tăng đã được mở rộng. Thật không may, các

hương há vẫn không hoàn toàn thỏa đáng,

có thể giải thích tại sao không có biến thể

subtilisin mới đượ c tạo ra bở i một trong những

công nghệ xáo tr ộn gen vẫn chưa có mặt phổ

biến trong chất tẩy r ửa.

thực khuẩn hiển thị, vì các liên k ết chặt chẽ giữa

polypeptide và gen mã hóa của nó, đượ c coi là

một phương pháp tuyệt vờ i cho việc lựa chọn

của các enzym với đặc tính mong

muốn.Legendre et al. sử dụng subtilisin 309 để minh họa cho khả năng của phương pháp này,thay đổi đặc trưng bề mặt của nó đối vớ i các bề

mặt acid amin tại vị tr 4 oumillion vàFastrez cho ví dụ về các ứng dụng thực khuẩn-

hiển thị vớ i subtilisins



As all mutations affecting the specificity of subtilisins may also influence the autoproteolytic

processing of the proen-zyme to the mature

form, the engineering of the pro-region or its

uncoupling from this biosynthesis step has

become relevant. So far, no further informationon the success of such approaches has become

publicly available.

The search for new proteases

New interest in properties such as low-

temperature performance, as well as the

complexity of the patent situation, has led to

renewed interest in screening for novel enzymes

in nature. The search for new proteases is, of

course, not limited to subtilisins, but is alsodirected at finding completely new protease

backbones. Some inter-esting molecules have

been identified, but none of them has as yetmade it into a detergent product . Every year

approximately ten new wild-type subtilisins are

now being described in the scientific or patentliterature. Interesting enzymes are still being

found by classical microbiological screening

methods; for example, theoxidation-stable

subtilisin found by Seiki and colleagues. In

addition to microbiological screening methods

based on the cultivation of protease-producing

microor-ganisms, the exploitation of genome

programs and meta-genomic screening methods

have been established and have enlarged the

screening pool.

Chemical modifications

The chemical modification of amino acids insubtilisins has a long tradition, but owing to the

high costs of such processes no application indetergents has yet been put into practice. The

value of chemically modifying amino acids

currently lies in testing various aspects of

enzyme action, such as the effect of net charge

on substrate specificity

tất cả các đột biến ảnh hưởng đến đặc trưng của

subtilisins cũng có thể ảnh hưởng đến việc xử lý

autoproteolytic của proen-zyme mẫu trưở ng

thành, k ỹ thuật của các khu vực-chuyên nghiệ phoặc tách cặ p từ bướ c sinh tổng hợp này đã trở

thành có liên quan Cho đến nay, không có thêmthông tin về sự thành công của cách tiế p cận nàyđã được cng hai

Việc tìm kiếm các protease mớ i

Quan tâm mới trong các đặc tnh như hiệu suất

nhiệt độ thấp, cũng như sự phức tạ p của trạngthái cụ thể, đã dẫn đến sự ưa chuộng trong sàng

lọc cho các enzyme mớ i lạ trong tự nhiên. Việc

tìm kiếm các protease mớ i là, tất nhiên, không

giớ i hạn subtilisins, nhưng cũng hướ ng vào việctìm kiếm protease hoàn toàn mớ i.Một số phân tử

thú vị đã được xác định, nhưng hng ai trongsố họ đã làm cho nó thành một sản phẩm chất

tẩy r ửa. Mỗi năm hoảng mườ i subtilisins hoang

dại mớ i hiện đang đượ c mô tả trong các tài liệu

khoa học hoặc bằng sáng chế. Enzyme thú vị vẫn đang đượ c tìm thấy bởi phương pháp iểm

tra vi sinh vật cổ điển, ví dụ, các subtilisin quá

trình oxy hóa ổn định đượ c tìm thấy bở i Seiki và

các đồng nghiệp Ngoài các phương pháp iểm

tra vi sinh vật dựa trên việc sản xuất protease

microor-ganisms, hai thác các chương trình genvà meta-gen phương pháp sàng lọc đã đượ cthành lập và đã mở r ộng vng sàng lọc.

Biến đổi hóa học

Các biến đổi hóa học của các axit amin trong

subtilisins có một truyền thống lâu đời, nhưng

do chi phí cao của các quá trình như vậy khôngcó ứng dụng trong chất tẩy r ửa vẫn chưa đượ cđưa vào thực hiện. Giá tr ị của việc sửa đổi hóa

học axit amin hiện đang nằm trong thử nghiệm

các khía cạnh khác nhau của hoạt động enzym,

chẳng hạn như tác động của điện tích trên bề

mặt đặc hiệu.



Production aspects

Production strains

All major subtilisins for detergents are produced

in Bacillus, because these species are able to

secrete large amounts of extracellular enzymes.

The control mechanisms involved in the

production of proteases in Bacillus are

extremely complex and still not fully under-

stood. An example is the two-component

regulatory sys-tem that acts as a quorum sensing

mechanism in B. subtilis and which has been

found to control the expression of the alkaline

protease. This regulatory system is encoded on

the chromosome and on endogenous plasmids.

Industrial strain improvement programs usingclassical microbiological methods have been

carried out over many years and have resulted in

the development of several highly productive

strains. These have often been used as hosts for

the expression of recombinant genes; however,

these industrial production strains have

frequently been described as resistant to

transformation. As plasmid-based production

strains commonly display instability pro-blems,

it is now standard practice to generate strains in

which the recombinant gene is integrated into

the chro-mosome in multiple copies.

Fermentation considerations

The fermentation of subtilisins is subject to a

large number of variables. Recent publications

by C¸alik and colleagues give detailed

descriptions of investi-gations into the

fermentation parameters for SAP (B.

licheniformis alkaline protease; subtilisin

Carlsberg). The parameters range from the

media composition, pHand oxygen-transfer rate

to the different Bacillus species used as hosts for

recombinant production. Industrial production

processes are normally run as large-scale, fed-

batch fermentations at high cell density. Con-

tinuous fermentations are used to analyse critical

các khía cạnh sản xuất

chủng sản xuất

Tất cả subtilisins chính cho chất tẩy r ửa đều

đượ c sản xuất trong vi khuẩn Bacillus, bở i vì

những loài này có khả năng tiết ra một lượ ng lớ ncác enzym ngoại bào Các cơ chế kiểm soát liên

quan đến việc sản xuất của protease trong

Bacillus là vô cùng phức tạ p và vẫn chưa hoàntoàn tối ưu Một ví dụ là hai thành phần điều tiết

hệ thống hoạt động như một cơ chế cảm biến đạidiện trong subtilis và đã đượ c tìm thấy để

kiểm soát sự biểu hiện của các protease. Hệ

thống quản lý này đượ c mã hóa trên nhiễm sắc

thể và trên plasmid nội sinh Chương trình cải

tiến giống công nghiệ p sử dụng phương pháp visinh vật cổ điển đã đượ c thực hiện trong nhiều

năm và đã dẫn đến sự phát triển của một số

chủng có năng suất cao Đây thường đượ c sử

dụng như là máy chủ cho sự biểu hiện của gen

tái tổ hợ p, tuy nhiên, các chủng sản xuất công

nghiệ p đã thường xuyên đượ c mô tả như hả

năng chống chuyển đổi. Làm giống sản xuất dựa

trên plasmid thườ ng hiển thị không ổn định ,bây

giờ là tiêu chuẩn thực hành để tạo ra những dòng

trong đó gen tái tổ hợp đượ c tích hợ p vào

xem xét quá trình lên men

Quá trình lên men của subtilisins là tùy thuộc

vào một số lượ ng lớ n của các biến thể sản phẩm

gần đây của C ¸ Ali và các đồng nghiệ p mô tả

chi tiết của investi-gations vào các thông số quá

trình lên men cho SAP (B. protease

licheniformis; subtilisin Carlsberg). Các thông

số dao động từ các thành phần mi trường, độ

pH và tố độ truyền oxy các loài vi khuẩn

acillus hác nhau đượ c sử dụng như là trungtâm sản xuất tái tổ hợ p. Quy trình sản xuất công

nghiệp thườ ng chạy như quy m lớ n, sự khó

hăn hàng loạt quá trình lên men ở mật độ tế bào

cao.Quá trình lên men liên tục đượ c sử dụng để

phân tích các thông số sản xuất, nhưng hng



produc-tion parameters, but are not used for

production [30].

The media used in industrial fermentations have,

above all, to fulfill economic requirements;

therefore, these media are often based on

complex, inexpensive nitrogen sources. The

composition of fermentation media and the

details of the fermentation processes and yields

are nor-mally considered company secrets and

thus almost no reliable information is available

in the public domain. The general principles on

fermentation and downstream processing have

been published, however Recently, publications

on the production of industrial Bacillus strains

have described yields in the range of 20 – 25 g/L

enzyme in fermentation broth .

Granulation processes

Subtilisin preparations are marketed either as a

stabilized enzyme solution or as encapsulated

and coated granu-lates. The liquid preparations

normally have a reduced water content and

contain significant amounts of 1,2-propane diol.

The original granulate type (prill), which was

based on a mixture of enzyme and polyethylene

glycol, has now practically disappeared from the

market. Granulation processes include the use of

extrusion, highshear mixing and fluidised beds The equipment 332 Protein technologies and

commercial enzymes Current Opinion in

Biotechnology 2004, 15:330 – 334

www.sciencedirect.comused for granulation also

determines the type of granulate generated in the

process with respect to shape, chemical

composition and structure. In all cases, one or

several coating layers ensure that granulateshave low dusting properties. This requirement

results from the recognition in 1970 that enzyme

dust, generated during the detergent

manufacturing process, can lead to the

sensitisation of exposed workers. Granulation

technology was developed to avoid the release

đượ c sử dụng cho sản xuất [30].

Các mi trường đượ c sử dụng trong tất cả quá

trình lên men công nghiệp tất cả ở trên, để đápứng yêu cầu kinh tế, do đó, những mi trườ ng

dựa trên, nguồn nitơ rẻ tiền phức tạ p. Các thành

phần của mi trườ ng lên men và các chi tiết của

quá trình lên men và sản lượ ng nor-Mally coi là

bí mật cng ty và do đó hầu như hng có thngtin đáng tin cậy là có sẵn trong phạm vi chung.

Các nguyên tắc chung về quá trình lên men và

chế biến sâu đã đượ c công bố, tuy nhiên gần

đây, các ấn phẩm về sản xuất các chủng vi

khuẩn Bacillus công nghiệp đã m tả sản lượ ng

trong khoảng 20-25 g / L enzyme trong canh

trườ ng lên men.

Xử lý sản phẩm

Chuẩn bị subtilisin đượ c bán trên thị trườ ng

hoặc như là một giải pháp enzym ổn định hoặc

đóng gói và tráng granu-Lates. Các chế phẩm

lỏng thường có hàm lượng nướ c giảm và chứa

một lượng đáng ể 1,2-propan diol. Loại nghiền

gốc (prill), dựa trên một hỗn hợ p enzyme và

polyethylene glycol, hiện thực tế đã biến mất

khỏi thị trườ ng. Quá trình tạo hạt bao gồm việc

sử dụng phun, tr ộn và lò sấy tầng sôi. Thiết bị công nghệ protein 332 và đánh giá enzyme

thương mại hiện tại trong công nghệ sinh học

2004, 15:330-334 www.sciencedirect.com sử

dụng cho các hạt xác định loại nghiền tạo ra

trong quá trình này liên quan đến hình dạng,

thành phần hóa học và cấu trúc. Trong mọi

trườ ng hợ p, một hoặc một số lớ p phủ đảm bảo

r ằng granulates có tính chất bụi thấ p. K ết quả

yêu cầu này từ ghi nhận vào năm 1970 rằng bụi

men, tạo ra trong quá trình sản xuất chất tẩy r ửa,

có thể dẫn đến sự nhạy cảm của công nhân tiế pxúc. Công nghệ hạt đượ c phát triển để tránh việc

phát hành này bụi có chứa enzyme. Công nghệ

này hiện đã đượ c tiế p tục cải thiện và bổ sung

các bướ c trong quá trình sản xuất (ví dụ đónggói và thng gió) đã đượ c giớ i thiệu để loại bỏ

problem Đào tạo và cơ chế kiểm soát khác

http://www.sciencedirect.com/




of this enzyme-containing dust. This technology

has now been further improved and additional

steps in the production process (e.g.

encapsulation and ventilation) have been

introduced to eliminate the pro-blem. Training

and various control mechanisms, as part of occupational safety programs, have also been

establishedin the detergent industry.

Formulation in detergents

Granulated enzymes place few restrictions on

the for-mulation of powder detergents and

tablets Intensified contact with bleachingcomponents, encountered for example in the

pressing of tablets, necessitates higher levels of

storage stability. This in turn has promoted thedevelopment and use of oxidation-stable enzyme

variants.

The stabilization of proteases in liquid

preparations is still a field for research [34,35]The major problem in aqueous environments is

autoproteolysis. Some general principles in

formulating liquid detergents include the

reduction of the free water concentration and the

use of reversible inhibitors like borate or phenyl

boronic acid derivatives. In addition, the

composition and nature of the surfactantsin the

liquid detergent greatly influence the storagestability of the enzyme. Liquid detergents have

to be formulated around the needs of the

enzymes they con-tain, optimising ways to

stabilize and inhibit them reversibly.

Conclusions

Enormous efforts over the past 20 years to findimproved detergent proteases and to improve

known ones have not succeeded in bringing

forth a single new enzyme as versatile and

universally applicable as the high-alkaline

subtilisins. The promise offered by gene-

shuffling tech-niques has not resulted in

successful products. One reason for this might

nhau, như là một phần của chương trình an toànlao động, cũng đã đượ c thành lậ p trong ngành

công nghiệ p chất tẩy r ửa.

iến đề nghị trong chất tẩy rử a

Men tán nhỏ cn vài hạn chế về for-mulation các

chất tẩy r ửa bột và mảng Tăng cườ ng tiế p xúc

vớ i các thành phần tẩy tr ắng, gặ p ví dụ nhưtrong các bức xúc của máy tính bảng, đi hỏi

mức độ cao hơn của sự ổn định lưu trữ Điều

này lần lượt đã thúc đẩy sự phát triển và sử dụng

các biến thể enzyme oxy hóa ổn định.

Sự ổn định của protease trong các chế phẩm

dạng lỏng vẫn còn là một lĩnh vực nghiên cứu

[34,35]. Vấn đề chnh trong mi trườ ng dung

dịch nướ c là autoproteolysis. Một số nguyên tắc

chung trong xây dựng chất tẩy r ửa lỏng bao gồm

việc giảm nồng độ nướ c miễn phí và việc sử

dụng các chất ức chế đảo ngược như borat hoặc

phenyl

dẫn xuất của acid boronic. Ngoài ra, thành phần

và tính chất của bề mặt trong các chất tẩy r ửa

lỏng ảnh hưở ng r ất nhiều đến sự ổn định lưu trữ

của các enzyme.Chất tẩy r ửa lỏng phải đượ c xây

dựng xung quanh các nhu cầu của các họ enzymcon-tain, tối ưu hóa cách để ổn định và hạn chếthuận nghịch.

K ết luận

Những nỗ lực to lớn trong 20 năm qua để tìmđượ c cải thiện protease chất tẩy r ửa và để cải

thiện những ngườ i nổi tiếng đã hng thànhcông trong việc đưa ra một enzym mớ i duy nhất

là linh hoạt và phổ biến áp dụng như cácsubtilisins cao-kiềm. Lờ i hứa đượ c cung cấ p bở igen xáo tr ộn công nghệ niques đã không dẫn đến

sản phẩm thành công. Một lý do cho điều này có



be that the conditions in detergents are by no

means extreme when compared with those

where the shuffling technologies have giventheir best results. In general, it might be that so

much work has already been done on subtilisins

that intellectual property considera-tions make itextremely difficult to combine various positiveattributes and to transfer results quickly into

production strains. Nevertheless, there is an

expectation that significantly improved proteases

can still be made by combining shufflingtechnology with rational design or by using

metagenome screening. In both cases, the

applica-tion of improved screening methods

represents a crucial step .With time running out

for some major sub-tilisin protein engineering

patents, the opportunities for the production and

application of improved molecules will increase.

If this expectation is not fulfilled proteasedevelopment will continue incrementally. In any

case, it is probable that we will see an increasing

number of more specialized proteases designed

to perform well in niche applications.

Future achievements will include a much greater

appre-ciation of structure – function relationships

in proteases, leading to a deeper understanding

of the f actors influen-cing the cleaning

performance of detergent proteases, and an

improved knowledge of functional genomics

relevant to production. The future will also bring

an increasing number of enzymes suitable for

use in more specificenvironments (eg low-

temperature applications and applications in

automatic dishwashing detergents). As improved

performance must be based on both enzyme

development and on screening using detergent

composi-tions and relevant stains, new andspecialized enzymes will most probably emerge

from the joint efforts of enzyme producers and

detergent formulators.

thể là các điều kiện trong chất tẩy r ửa cũngkhông phải là cực đoan hi so sánh vớ i những

nơi mà các cng nghệ xáo tr ộn đã cho ết quả

tốt nhất của họ. Nói chung, r ất nhiều công việc

đã đượ c thực hiện trên subtilisins để sở hữu đặc

tnh considera-tions làm cho nó vô cùng khóhăn để k ết hợ p các thuộc tính tích cực khác

nhau và chuyển giao k ết quả một cách nhanh

chóng vào các chủng sản xuất. Tuy nhiên, có

một k ỳ vọng r ằng protease cải thiện đáng ể vẫn

có thể đượ c thực hiện bằng cách k ết hợ p công

nghệ xáo tr ộn vớ i thiết k ế hợ p lý hoặc bằng cách

sử dụng sàng lọc metagenome. Trong cả hai

trườ ng hợp, sự ết nối các phương pháp cải tiến

sàng lọc đại diện cho một bướ c quan tr ọng. Vớ ithờ i gian chạy cho ra một số cng nghệ ỹ thuật

protein sub-tilisin lớn, cơ hội cho ngườ i sản xuất

và ứng dụng của các phân tử đượ c cải thiện sẽ

tăng lên Nếu k ỳ vọng này hng hoàn thành thì phát triển protease sẽ tiế p tục tăng lên Trongmọi tr ườ ng hợ p, r ất có thể chúng ta sẽ thấy một

số lượng ngày càng tăng của nhiều proteasetrong dự iến để thực hiện tốt trong các ứng

dụng thích hợ p.Thành tựu trong tương lai sẽ bao

gồm một appre-ciation lớn hơn nhiều các mối

quan hệ cấu trúc chức năng trong protease,

dẫn đến một sự hiểu biết sâu sắc hơn về các yếu

tố influen-cing hiệu suất làm sạch của chất tẩy

r ửa protease, và mở mang iến thức của gen

chức năng có liên quan đến sản xuất Tương laicũng sẽ mang lại một số lượng ngày càng tăngcủa các enzym phù hợp để sử dụng trong nhiều

mi trườ ng cụ thể (ví dụ như các ứng dụng ở nhiệt độ thấ p và các ứng dụng trong chất tẩy r ửa

chén tự động) Như cải thiện hiệu suất cả hai

phải đượ c phát triển dựa trên enzyme và phân

loại sử dụng chất tẩy r ửa Composi-tions và cácvết bẩn có liên quan, các enzyme mới và đặc

biệt nhất có lẽ là sẽ nổi lên từ sự nỗ lực của các

nhà sản xuất enzyme và formulators chất tẩy

r ửa.



Acknowledgements

I want to thank Nicholas Kennedy for his help

and careful proofreading of the manuscript.

References and recommended reading

Papers of particular interest, published within

the annual period of review, have been

highlighted as :

1. Siezen RJ, Leunissen JAM: Subtilases: the

superfamily of subtilisin-like serine proteases.

Protein Sci 1997, 6:501-523.

2. Egmont MR: Application of proteases in

detergents. In Enzymes in Detergency. Edited by

Van Ee J, Misset O, Baas EJ. New York: MarcelDekker Inc., Surfactant Science Series 1997, 69:

61- 74.

3. Enzymes in household detergents:In Enzymes

in Industry Edited by Aehle W Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry Chapter

5.2.1. Weinheim: Wiley-VCh Verlag 2004:155-

180. Detailed overview on enzyme effects in

laundry detergents in relation todetergent

composition and geographic differences in

washing condi-tions, including the test materialsused for enzyme evaluation.

4. Enzymes in automatic dishwashing:In

Enzymes in Industry. Edited by Aehle W.

Ullmann’s Encyclopedia of Industrial

ChemistryChapter 5.2.2. Weinheim: Wiley-VCh

Verlag 2004:180-194.

5.Outtrup H, Jørgensen ST: The importance of

Bacillus species in the production of industrial

enzymes.In Applications and Systematics of

Bacillus and Relatives. Edited by Berkeley R,

Heyndrickx M, Logan N, De Vos P. Oxford,

UK: Blackwell Science Ltd. 2002: 206-218.

Review on the relevance of Bacillus for

Lờ i cảm ơn

Tôi muốn cảm ơn Nicholas Kennedy anh ấy đãgiúp đỡ và cẩn thận đọc lại bản thảo.

Tài liệu tham khảo và đề nhị đọc sch

ài báo quan tâm đặc biệt, đượ c công bố hàng

năm trong hoảng thời gian xem xét, đã đượ cnhấn mạnh như:

1. Siezen RJ, Leunissen JAM: Subtilases: the

superfamily of subtilisin-like serine proteases.

Protein Sci 1997, 6:501-523.

2. Egmont MR: Application of proteases in

detergents. In Enzymes in Detergency. Edited by

Van Ee J, Misset O, Baas EJ. New York: MarcelDekker Inc., Surfactant Science Series 1997, 69:

61- 74.

3. Enzymes in household detergents:In Enzymes

in Industry. Edited by Aehle W Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry Chapter

5.2.1. Weinheim: Wiley-VCh Verlag 2004:155-

180. Detailed overview on enzyme effects in

laundry detergents in relation todetergent

composition and geographic differences in

washing condi-tions, including the test materialsused for enzyme evaluation.

4. Enzymes in automatic dishwashing:In

Enzymes in Industry. Edited by Aehle W.

Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistryChapter 5.2.2. Weinheim: Wiley-VCh

Verlag 2004:180-194.

5.Outtrup H, Jørgensen ST: The importance of

Bacillus species in the production of industrial

enzymes.In Applications and Systematics of

Bacillus and Relatives. Edited by Berkeley R,

Heyndrickx M, Logan N, De Vos P. Oxford,

UK: Blackwell Science Ltd. 2002: 206-218.

Review on the relevance of Bacillus for



industrial enzyme production from the position

of the market leader.

6. Ito S, Kobayashi T, Ara K, Ozaki K, Kawai S,

Hatada Y: Alkaline detergent enzymes from

alkaliphiles: enzymatic properties, genetics, and

structures. Extremophiles 1998, 2:185-190.

7. Estell DA, Graycar TP, Wells JA:

Engineering an enzyme by site-directed

mutagenesis to be resistant to chemical

oxidation. J Biol Chem 1985, 260:6518-6521.

8.Bryan PN: Protein engineering of subtilisin.

Biochim Biophys Acta 2000, 1543:223-238.

Detergent proteases Maurer 333

www.sciencedirect.com Current Opinion in


Comprehensive review of the protein

engineering work on subtilisin published in the

scientific literature

9. Bott R: Development of new proteases for

detergents.In Enzymes in Detergency. Edited by

Van Ee J, Misset O, Baas EJ. New York: Marcel

Dekker Inc., Surfactant Science Series 1997, 69:

75-91.

10. Ness JE, Welch M, Giver L, Bueno M,

Cherry JR, Borchert TV, Stemmer WPC,

Minshull J: DNA shuffling of subgenomic

sequences of subtilisin. Nat Biotechnol 1999,

17:893-896.

11. Ness JE, Kim S, Gottman A, Pak R, Krebber

A, Borchert TV, Govindajaran S, Mundorff EC,

Minshull J: ynthetic shuffling expandsfunctional protein diversity by allowing amino

acids to recombine independently. Nat

Biotechnol 2002, 20:1251-1255.

12. Wintrode PL, Miyazaki K, Arnold FH: Cold

adaptation of a mesophilic subtilisin-like

protease by laboratory evolution. J Biol Chem

2000, 275:31635-31640.

industrial enzyme production from the position

of the market leader.

6. Ito S, Kobayashi T, Ara K, Ozaki K, Kawai S,

Hatada Y: Alkaline detergent enzymes from

alkaliphiles: enzymatic properties, genetics, and

structures. Extremophiles 1998, 2:185-190.

7. Estell DA, Graycar TP, Wells JA:

Engineering an enzyme by site-directed

mutagenesis to be resistant to chemical

oxidation. J Biol Chem 1985, 260:6518-6521.

8.Bryan PN: Protein engineering of subtilisin.

Biochim Biophys Acta 2000, 1543:223-238.

Detergent proteases Maurer 333

www.sciencedirect.com Current Opinion in


Comprehensive review of the protein

engineering work on subtilisin published in the

scientific literature

9. Bott R: Development of new proteases for

detergents.In Enzymes in Detergency. Edited by

Van Ee J, Misset O, Baas EJ. New York: Marcel

Dekker Inc., Surfactant Science Series 1997, 69:

75-91.

10. Ness JE, Welch M, Giver L, Bueno M,

Cherry JR, Borchert TV, Stemmer WPC,

Minshull J: DNA shuffling of subgenomic

sequences of subtilisin. Nat Biotechnol 1999,

17:893-896.

11. Ness JE, Kim S, Gottman A, Pak R, Krebber

A, Borchert TV, Govindajaran S, Mundorff EC,

Minshull J: ynthetic shuffling expandsfunctional protein diversity by allowing amino

acids to recombine independently. Nat

Biotechnol 2002, 20:1251-1255.

12. Wintrode PL, Miyazaki K, Arnold FH: Cold

adaptation of a mesophilic subtilisin-like

protease by laboratory evolution. J Biol Chem

2000, 275:31635-31640.



Borchert TV, Fastrez J: Display of active

subtilisin 309 on phage: analysis of parameters

13. Legendre D, Laraki N, Gra¨ slund T,

Bjørnvad ME, Bouchet M, Nygren P-A,

influencing the selection of subtilisin variantswith changed substrate specificity from librariesusing phosphonylating inhibitors. J Mol Biol

2000, 296:87-102.

14. Soumillion P, Fastrez J: Investigation of

phage display for the directed evolution of

enzymes.In Directed Molecular Evolution of

Proteins. Edited by Brakmann S, Johnsson K.

Weinheim: Wiley – VCH Verlag; 2002: 79-110.

General review on phage display and its

application to enzyme devel-opment. Publishedexamples for subtilisin are also covered.

15. Takagi H, Takahashi M: A new approach for

alteration of protease functions: pro-sequence

engineering. Appl Microbiol Biotechnol 2003,

63:1-9.

16. Almog O, Gallagher T, Tordova M, Hoskins

J, Bryan P, Gilliland GL: Crystal structure of

calcium-independent subtilisin BPN0 with

restored thermal stability folded without the prodomain. Proteins 1998, 31:21-32.

17. Cherry JR, Fidantsef AL: Directed evolution

of industrial enzymes: an update. Curr Opin

Biotechnol 2003, 14:438-443. Most recent

review on the directed evolution of enzymes,

including a section on proteases.

18. Saeki K, Hitomi J, Okuda M, Hatada Y,

Kageyama Y, Takaiwa M, Kubota H, Hagihara

H, Kobayashi T, Kawai S, Ito S: A novel species

of alkaliphilic Bacillus that produces an

oxidatively stable alkaline serine protease.

Extremophiles 2002, 6:65-72.


Kobayashi T, Ito S, Takami H, Horikoshi K:

Borchert TV, Fastrez J: Display of active

subtilisin 309 on phage: analysis of parameters

13. Legendre D, Laraki N, Gra¨ slund T,

Bjørnvad ME, Bouchet M, Nygren P-A,

influencing the selection of subtilisin variantswith changed substrate specificity from librariesusing phosphonylating inhibitors. J Mol Biol

2000, 296:87-102.

14. Soumillion P, Fastrez J: Investigation of

phage display for the directed evolution of

enzymes.In Directed Molecular Evolution of

Proteins. Edited by Brakmann S, Johnsson K.

Weinheim: Wiley – VCH Verlag; 2002: 79-110.

General review on phage display and its

application to enzyme devel-opment. Publishedexamples for subtilisin are also covered.

15. Takagi H, Takahashi M: A new approach for

alteration of protease functions: pro-sequence

engineering. Appl Microbiol Biotechnol 2003,

63:1-9.

16. Almog O, Gallagher T, Tordova M, Hoskins

J, Bryan P, Gilliland GL: Crystal structure of

calcium-independent subtilisin BPN0 with

restored thermal stability folded without the prodomain. Proteins 1998, 31:21-32.

17. Cherry JR, Fidantsef AL: Directed evolution

of industrial enzymes: an update. Curr Opin

Biotechnol 2003, 14:438-443. Most recent

review on the directed evolution of enzymes,

including a section on proteases.


Kageyama Y, Takaiwa M, Kubota H, Hagihara

H, Kobayashi T, Kawai S, Ito S: A novel species

of alkaliphilic Bacillus that produces an

oxidatively stable alkaline serine protease.

Extremophiles 2002, 6:65-72.


Kobayashi T, Ito S, Takami H, Horikoshi K:



Novel oxidatively stable subtilisin-like serine

proteases from alkaliphilic Bacillus spp.:

enzymatic properties, sequences and

evolutionary relationships. Biochem Biophys

Res Commun 2000, 279:313-319.

20. Gupta R, Beg QK, Lorenz P: Bacterial

alkaline proteases: molecular approaches and

industrial application. Appl Microbiol

Biotechnol 2002, 59:15-32.

21. Lorenz P, Liebeton K, Niehaus F, Eck J,

Zinke H: Novel enzymes from unknown

microbes — direct cloning of the metagenome.

Int Symp Biocatal Biotransfrom 2001, 5:379.

The first example of protease cloning from

genetic screening. Based on this methodologymany completely new protease genes are

expected.

22. Davis BG, Khumtaveeporn K, Bott RR,

Jones J: Altering the specificity of subtilisinBacillus lentus through the introduction of

positive charge at single amino acid sites.

Bioorg Med Chem 1999, 7:2303-2311.

microbial alkaline proteases. Appl Microbiol

Biotechnol 2002, 60:381-395. A good overviewof the available information on microbial

alkaline pro-teases (mostly subtilisins) published

in the scientific literature to date

24. Koetje EJ, Hajdo-Milasinovic A, Kiewiet R,

Bron S, Tjalsma H: A plasmid borne Rap-Phr

system of Bacillus subtilis can mediate cell-

density controlled production of extracellular

proteases. Microbiol 2003, 149:19-28.

25. Van der Laan JC, Gerritse G, Mulleners LJ,

van der Hoek RA, Quax WJ: Cloning,

characterization, and multiple chromosomal

integration of a Bacillus alkaline protease gene.

Appl Environ Microbiol 1991, 57:901-909.

26. Jørgensen PL, Tangney M, Pedersen PE,

Hastrup S,

Novel oxidatively stable subtilisin-like serine

proteases from alkaliphilic Bacillus spp.:

enzymatic properties, sequences and

evolutionary relationships. Biochem Biophys

Res Commun 2000, 279:313-319.

20. Gupta R, Beg QK, Lorenz P: Bacterial

alkaline proteases: molecular approaches and

industrial application. Appl Microbiol

Biotechnol 2002, 59:15-32.

21. Lorenz P, Liebeton K, Niehaus F, Eck J,

Zinke H: Novel enzymes from unknown

microbes — direct cloning of the metagenome.

Int Symp Biocatal Biotransfrom 2001, 5:379.

The first example of protease cloning from

genetic screening. Based on this methodologymany completely new protease genes are

expected.

22. Davis BG, Khumtaveeporn K, Bott RR,

Jones J: Altering the specificity of subtilisinBacillus lentus through the introduction of

positive charge at single amino acid sites.

Bioorg Med Chem 1999, 7:2303-2311.

microbial alkaline proteases. Appl Microbiol

Biotechnol 2002, 60:381-395. A good overviewof the available information on microbial

alkaline pro-teases (mostly subtilisins) published

in the scientific literature to date

24. Koetje EJ, Hajdo-Milasinovic A, Kiewiet R,

Bron S, Tjalsma H: A plasmid borne Rap-Phr

system of Bacillus subtilis can mediate cell-

density controlled production of extracellular

proteases. Microbiol 2003, 149:19-28.

25. Van der Laan JC, Gerritse G, Mulleners LJ,

van der Hoek RA, Quax WJ: Cloning,

characterization, and multiple chromosomal

integration of a Bacillus alkaline protease gene.

Appl Environ Microbiol 1991, 57:901-909.

26. Jørgensen PL, Tangney M, Pedersen PE,

Hastrup S,



Diderichsen B, Jørgensen ST: Cloning and

sequencing of an alkaline protease gene from

metabolic reaction network. Enzyme Microb

Technol 2003, 32:706-720. Bacillus lentus and

amplification of the gene on the B. lentus

chromosome by an improved technique. ApplEnv Microbiol 2000, 66:825-827.

27. Çalik P, Çelik E, Ilkin ET, Oktar C, O¨

zdemir E: Protein-based complex medium

design for recombinant serine alkaline protease

production. Enzyme Microb Technol 2003,

33:975-986.

28. Çalik P, Kalender N, O¨ zdamar TH:

Overexpression of serine alkaline protease

encoding gene in Bacillus species: performanceanalyses. Enzyme Microb Technol 2003,

33:967-974.

29. Çalik P, Takaç S, Çalic G, O¨ zdamar TH:

Overexpression of serine alkaline protease in

Bacillus licheniformis and its impact

30. Christiansen T, Nielsen J: Production of

extracellular protease and glucose uptake in

Bacillus clausii in steady-state and transient

continuous cultures. J Biotechnol 2002, 97:265-273.

31. Herrmann HA, Good I, La¨ ufer A:

Manufacturing and downstream processing of

detergent enzymes.In Enzymes in Detergency.

Edited by Van Ee J, Misset O, Baas EJ. New

York: Marcel Dekker Inc., Surfactant Science

Series 1997, 69: 251-297.

32. Schallmey M, Singh A, Ward OP:

Developments in the use of Bacillus species for

industrial productions. Can J Microbiol 2004,

50:1-17.

33. Becker T, Park G, Gaertner AL: Formulating

of detergent nzymes.In Enzymes in Detergency.


Diderichsen B, Jørgensen ST: Cloning and

sequencing of an alkaline protease gene from

metabolic reaction network. Enzyme Microb

Technol 2003, 32:706-720. Bacillus lentus and

amplification of the gene on the lentus

chromosome by an improved technique. ApplEnv Microbiol 2000, 66:825-827.

27. Çalik P, Çelik E, Ilkin ET, Oktar C, O¨

zdemir E: Protein-based complex medium

design for recombinant serine alkaline protease

production. Enzyme Microb Technol 2003,

33:975-986.

28. Çalik P, Kalender N, O¨ zdamar TH:

Overexpression of serine alkaline protease

encoding gene in Bacillus species: performanceanalyses. Enzyme Microb Technol 2003,

33:967-974.

29. Çalik P, Takaç S, Çalic G, O¨ zdamar TH:

Overexpression of serine alkaline protease in

Bacillus licheniformis and its impact

30. Christiansen T, Nielsen J: Production of

extracellular protease and glucose uptake in

Bacillus clausii in steady-state and transient

continuous cultures. J Biotechnol 2002, 97:265-273.

31. Herrmann HA, Good I, La¨ ufer A:

Manufacturing and downstream processing of

detergent enzymes.In Enzymes in Detergency.



Series 1997, 69: 251-297.

32. Schallmey M, Singh A, Ward OP:

Developments in the use of Bacillus species for

industrial productions. Can J Microbiol 2004,

50:1-17.

33. Becker T, Park G, Gaertner AL: Formulating

of detergent nzymes.In Enzymes in Detergency.





Series 1997, 69: 299-325.

34. Russell GL, Britton LN: Use of certain

alcohol ethoxylates to maintain protease stability

in the presence of anionic surfactants. J

Surfactants Detergents 2002, 5:5-10.

35. Stoner MR, Dale DA, Gualfetti PJ, Becker

T, Manning MC, Carpenter JF, Randolph TW:

Protease autolysis in heavy-duty liquid detergent

formulations: effects of thermodynamic

stabilizers and protease inhibitors. Enz Microb

Technol 2004, 34:114-125.

36. Kirk O, Borchert TV, Fuglsang CC:

Industrial enzyme applications. Curr Opin

Biotechnol 2002, 13:345-351. Excellent

overview of the field of industrial enzymeapplications and the development of enzymes

for use in the field334 rotein technologies andcommercial enzymes Current Opinion in


www.sciencedirect.com


Series 1997, 69: 299-325.

34. Russell GL, Britton LN: Use of certain

alcohol ethoxylates to maintain protease stability

in the presence of anionic surfactants. J

Surfactants Detergents 2002, 5:5-10.

35. Stoner MR, Dale DA, Gualfetti PJ, Becker

T, Manning MC, Carpenter JF, Randolph TW:

Protease autolysis in heavy-duty liquid detergent

formulations: effects of thermodynamic

stabilizers and protease inhibitors. Enz Microb

Technol 2004, 34:114-125.

36. Kirk O, Borchert TV, Fuglsang CC:

Industrial enzyme applications. Curr Opin

Biotechnol 2002, 13:345-351. Excellent

overview of the field of industrial enzymeapplications and the development of enzymes

for use in the field334 rotein technologies andcommercial enzymes Current Opinion in


www.sciencedirect.com





enzyme subtilisin chất tẩy rửa

Documents