estructura cristalina del dominio n quinasa de la gne acetil-manosa-amina
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INTEGRANTES:
CONTRERAS CASTAÑEDA, NANCY
SALINAS PARDO, JESSICA
GERRA CHUQUILLANQUI, JESSICA
VASQUEZ CIEZA, MARITZA
GONSALES CUADROS, ANAMELVA
PONCE ISIDRO , ELIZABETH
TERESA
Docente: MsC QF. ANGELICA MINAYA
ÁCIDO SIÁLICO
El ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico es un
monosacárido acido derivado del ácido neuramínico
(un compuesto base de 9 átomos de carbono)
mediante acetilación.
El ácido siálico está presente en los
gangliósidos
Se encuentra en la membrana
plasmática de las células de los
ganglios del SNC
BIOSÍNTESIS DEL ÁCIDO SIÁLICO
Uridina difosfato
N-
acetilglucosamina
Ácido N-
acetilneuramínic
o
Se sintetiza mediante la epimerización de la UDP-N-acetilglucosamina en N-acetilgalactosamina, queacaba dando lugar a N-acetilmanosamina-6-fosfato. Esta última reacción es catalizada por laenzima UDP-GlcNAc 2-epimerasa/ManNAc 6-quinasa (GNE).
ENZIMA BIFUNCIONAL IMPORTANTE PARA LA FORMACIÓN DEL ÁCIDO SIÁLICO
UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa
GNE: Tiene 2 dominiosDominio N-
terminal de
epimerasa
Dominio C-
terminal
quinasa
EPIMERASA
Es una enzima que convierte una
molécula en otro.
Participa en la síntesis del ácido
siálicoEnzima que utiliza ATP
DOMINIO
EPIMERASA
UDP- GlcNAc a N-
acetylmannosamine
(ManNAc)
convierte
Fosforilado en
posición 6
DOMINIO
QUINASA
Al grupo
ROK
(Represor,
ORF, la
quinasa)
pertenece
Conjunto de
proteínas
bacterianas
BIOSÍNTESIS DEL ÁCIDO SIÁLICO
Forma activa de Neu5Ac
Citidina –
monofosfato de
acido n- acetil –
(CMP –Neu5Ac)
Tres isoformas de proteínas GNE
Isoforma 1
Isoformas 2 y 3Para uso
humano
Responsable
de la formación
básica de los
ácidos siálicos
Se han
reducido las
actividades de
epimerasa
Pero las actividades quinasa permanecen casi
intactas
Puede ajustar la
producción de
ácidos siálicos
La clonación del ADN puede definirse como la
recombinación in vitro de un fragmento de
ADN con un vector de ADN con capacidad de
replicación.El fragmento de ADN se
replicará junto con el vector de ADN en la
célula hospedadora y así será posible obtenerlo
en un número elevado de copias.
CLONACION DE ADN
CLONACION DE ADN
OBTENCIÓN DEL ADN
Básicamente consiste en una lisis
celular y la purificación del ADN,con la
finalidad de que este resulte libre de
contaminantes. Luego cromatografía y
cristalografía
El ADN podrá obtenerse mediante la
extracción a partir de la célula, generalmente con
la finalidad de construir una genoteca.
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
Las endonucleasas son enzimas
que tienen como función
reconocer y cortar el ADN
foráneo. El ADN de la célula no
se corta y esto es porque la
secuencia que reconocería la
enzima se encuentra metilada y
por tanto no podrá actuar.
FRAGMENTACIÓN DEL
ADN
El conjunto formado por la
metilasa y la endonucleasa es
lo que se denomina sistema de
modificación - restricción.
Aunque los enzimas varían en
algunos aspectos de sus
condiciones de actuación, se ha
observado que todos ellos
requieren Mg y actúan a un Ph
óptimo de entre 7.2 y 7.8.
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
Una vez que se ha fragmentado el ADN,
podemos separar el fragmento que nos
interesa mediante una electroforesis en gel
de agarosa. Sin embargo debido a la
digestión obtendremos numerosos
fragmentos de distintos tamaños, por ello es
mucho más práctico construir, antes de
clonar nuestro fragmento, una librería de
ADN
AMPLIFICACIÓN POR PCR
La reacción en cadena de la
polimerasa es una técnica que nos
permite obtener artificialmente y de
una forma más rápida, múltiples
copias de nuestro fragmento de
DNA.
A medida que se repiten los
ciclos los productos de DNA
unidos a los cebadores se
amplifican en proporciones
geométricas: 2,4, 8, 16…
UNIÓN DEL ADN CLONADO AL
VECTOR
Un vector es una molécula de DNA con
un origen de replicación autónomo y
que posee zonas donde pueden
introducirse fragmentos de ADN
exógeno. Así, el ADN exógeno se
replica como parte del vector en la
célula receptora y hospedadora.
La infección viral permite que
cada célula hospedadora
contenga muchas copias del
gen exógeno y que éste se
exprese abundantemente
Se utilizan el
vector(virus
bacteriófagos)
pET28
ósea virus de
bacteria. Como
todos los virus,
un fago se hace
reproducir por
la célula a la
cual infecta
TRANSFORMACIÓN DE LA CÉLULA
HOSPEDERA
Cuando el ADN exógeno ha sido
ligado en el vector, debe entonces
introducirse en la célula hospedadora.
Las más usada es E. coli.
Mediante este paso se puede formar
nuevas copias de ADN o permitir la
síntesis de las proteínas cuya
información contiene el ADN clonado.
EXTRACCIÓN DE LA PROTEÍNA
En el presente trabajo, la E. coli fue cultivada en
Terrífic Broth y después congeladas en nitrógeno
líquido .
Posteriormente fueron descongeladas y
resuspendidas en tampón HEPES antes de la
extracción de las proteínas.
Las proteínas formadas por E. coli a partir
del ADN clonado en su genoma, se extraen
mediante lisis de su membrana celular y
centrifugación. Con el propósito de separar
las moléculas según su tamaño molecular.
HEPES o ácido 4 (2-
hidroxietil), 1- piperazin-
ethano-sulfónico
PURIFICACION DE PROTEINAS
Las proteínas obtenidas mediante
centrifugación son captadas mediante
perlas de níquel Ni, y luego son eluidas
antes de pasar a la cromatografía de
exclusión molecular.
PROCEDIMIENTOS
2. Fragmentación del ADN
3. Amplificación del ADN
con PCR.
4. Introducción del ADN en un
vector.
5. Infección de bacterias E.
coli con el vector.
6. Cultivo de E. Coli en Terrífic
Broth.
7. Extracción de las proteínas.
1.Seleccionar al ADN
PROCEDIMIENTOS
8. Cromatografía de
exclusión.
9. Cristalización con método de
sitting-drop
10. Análisis cristalográfico.
CRISTALIZACION
Es un proceso mediante el cual las
moléculas se van a ordenar y van a formar
los cristales.
GOTA COLGANTE
GOTA SENTADA
CRISTALIZACIÓN POR
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Instrumentos Reactivos cristalización de difusión del vapor
19ID LINEA SE LUZ DE LA
ADVANCED PHOTON SOURCE
(APS) EN NA LONG. DE ONDA DE
0.9792ANSTRON
COOT
REFMAX
PHENIX
MOLPROBITY
ADVANCED PHOTON SOURCE
(APS)
5mM DE ADP
1:100 quimiotripsina (w/w)Y 0.5ul
solución de proteína también
contiene 15% de glicol
polietileno(PEG)400
de acetato de amonio
citrato de sodio 0.1 M, pH 5.6.
cristal SeMet se cultivo 14.555
PEG4000,acetato de amonio0.2 M,
0.1M de citrato de sodio
ESTRUCTURA DEL DOMINIO QUINASA DE LA GNE
La estructura general
adopta una tipica
arquitectura bilobal.
Tanto el lóbulo –N como
el lóbulo –C tienen la
doble α/β.
Cada lóbulo consta de
una β-hoja central
flanqueada por alfa-
hélices en ambos lados
de la hoja.
ESTRUCTURA DEL DOMINIO QUINASA DE LA GNE
El dominio quinasa GNE contiene un motivo
unido al zinc de tipo I que forma un tipo de
dedo de zinc HC3 con residuos H569 y
C579 y C581 y C586. El motivo de unión al
zinc es un rasgo característico de todos los
miembros de la familia ROK.
El dominio de la quinasa también contiene
un tipo de motivo DxGxT que se une al ATP
y está localizado en la hendidura entre los
dos lóbulos.
El dominio quinasa de GNE es responsable de la dimerización, mientras que un segmento de los residuos entre la epimerasa y dominios quinasa, residuos 360-382, es un sitio potencial para la trimerización.
Datos obtenidos por filtración en gel muestran que el dominio quinasa existe principalmente como un dímero en la solución, con pequeñas cantidades de monómero y un oligómero de orden superior. El peso molecular aparente del oligómero se ajusta a un hexámero del dominio quinasa, aunque no se puede descartar la posibilidad de un tetrámero.
DÍMERO DEL DOMINIO QUINASA DE LA GNE
A: Representación del dímero del
dominio quinasa de la GNE
B: Vista ortogonalde la superficie deun monómero
ANÁLISIS OLIGOMÉRICO DEL DOMINIO QUINASA DE LA GNE
A: Hexámero cristalográfic
o obtenido por rotación
de un trímero.
B: Vista desde abajo del hexámero cristalográfico tras un giro de 90 grados.
HEXÁMERO CRISTALOGRÁFICO DE LA GNE
La búsqueda de homología estructural
del dominio quinasa de la GNE con el
FatCat del servidor reveló los cuatro
primeros éxitos no redundantes como
los códigos PDB 2aa4, 1xc3, 1z05 y
1z6r.Todas estas estructuras
contienen el característico motivo
vinculado a zinc de la familia de los
ROK.
A: Alineación estructural de la quinasa deGNE (rojo, 3eo3) con la glucoquinasa de E.coli + complejo de glucosa (gris, 1sz2).
B: Alineación estructural del segmento vinculadoal azúcar en las dos proteínas (GNE yglucoquinasa de E. coli). Se indican los residuosclave (verde), los residuos unidos al zinc (azul) ylos residuos cuya mutación está implicada con elHIBM (rojo).
Al comparar la GNE con la glucoquinasade E. coli (AP: 1sz2), la más cercanaestructura homóloga según la base dedatos PDB, se observa que los cincoresiduos implicados en la unión deazúcar se conservan en GNE (N516,D517, E566, H569, E588, numeraciónde GNE). Dos residuos, H569 y E588,están situados en el motivocaracterístico vinculado a zinc de lafamilia ROK y H569 directamentecoordina el ion zinc.
ANALISIS ESTRUCTURAL DE MUTTACIONES PUNTIFORMES
ASOCIADASA HIBM EN EL DOMINIO QUINASA DE GNE
MUTACIONES PUNTIFORMES
TIPO I EN EL DOMINIO QUINASA
DE LA GNE
• Está formado por los residuos I557, G559, V572
y G576; los dos últimos se encuentran en la
interfase de dimerización del lóbulo -C y la
mutación de estos residuos pueden interferir
con la dimerización del dominio quinasa.
• La dimerización del dominio quinasa no afecta
la accesibilidad disolvente de G576, indicando
que G576 no está directamente implicada en la
dimerización.
MUTACIONES PUNTIFORMES
TIPO II EN EL DOMINIO QUINASA
DE LA GNE
El segundo grupo de residuos
incluye los situados en las hélices
interfaciales entre el lóbulo -N y el
lóbulo-C, es decir, N519, A524,
F528, G708, y M712.
Como éste es el sitio de unión al
ATP y los hidratos de carbono, la
mutación de estos residuos puede
cambiar el movimiento interlobular
durante la catálisis y por lo tanto
afectar a la actividad de la quinasa
de la proteína.
El tercer grupo incluye al residuo P511, elcual tiene la mayor accesibilidad relativacomo disolvente (> 40%) de los 23 sitios demutación y está situado en una región debucle de la estructura. La mutación de unaprolina a cualquier otro tipo de residuo, va acambiar la flexibilidad de la región de buclealrededor de este residuo y podría cambiar elalosterismo de longitud completa de GNE enel estado oligomérico de orden superior.
MUTACIONES PUNTIFORMES TIPO
III EN EL DOMINIO QUINASA DE LA
GNE
MUTACIONES PUNTIFORMES
TIPO IV EN EL DOMINIO
QUINASA DE LA GNE
El cuarto grupo de residuos incluye todo elresto de los sitios de mutación. Todos tienencadenas laterales hidrófobas y de bajaaccesibilidad a solventes, y se encuentrandentro de los elementos estructuralessecundarios. Las mutaciones de estosresiduos podrían interferir con lasinteracciones hidrofóbicas de los elementosde la estructura secundaria que estabilizan laestructura de la proteína cuaternaria.
Son trastornos neuromusculares
caracterizados por debilidad muscular es
más común en la etapa del adulto
En lo cual se ve comprometiendo
los cuádriceps y los flexores
profundos de los dedos de la
mano.
INCLUSIÓN MIOPATÍA
HEREDITARIA DEL CUERPO
(HIBM)
Miopatías hereditarias comprenden tanto autonómica
recesiva y autonómica dominante de trastornos
musculares que tienen una expresión variable
( fenotipo ) en los pacientes individuales
CLASIFICACIO
N Una forma autosómica dominante (IBM1), donde
los cuádriceps son uno de los primeros músculos que se
debiliten.
Una forma autosómica recesiva como Nonaka miopatía distal
MIOPATIA DISTAL TIPO
NONAKA
Se caracteriza por ser una Enfermedad de los músculos
distales porque afectan sobre todo a las extremidades.
Genéticamente la miopatía distal de Nonaka se hereda
en forma autosómica recesiva y el defecto genético se
ha localizado en el cromosoma 9p1-q1(23
COMO SE MANIFIESTA
La afectación se manifiestan presentando debilidad muscular en el
compartimento anterior de las piernas, y en los músculos extensores. Los
pacientes presentan pie caído con mucha dificultad de flexionar. también
puede originar deformaciones articulares. Posteriormente se ven afectados
los muslos y los miembros superiores.
¿CUAL ES LA
CAUSA?La miopatía de Nonaka está asociada a la alteración del gen GNE
(UDP-N-acetilglucosamina-2-epimera-sa/N-acetilmanosamina
quinasa) ) implicada en la ruta biosintética del ácido siálico .es decir
originando carencia de acido sialico
SIGNOS Y SINTOMAS
• Calambres
• Dificultad para caminar sobre los
talones
• Dificultad para correr
• Pérdida de equilibrio.
• Miotonia
• Fatiga
El diagnóstico clínico de la HIBM se
confirma:
• Estudio electrofisiológico (EMG)
• Examen de sangre para la creatina
quinasa sérica (CK o CPK)
• Biopsia muscular
• Resonancia Magnética (RM) o
tomografía computarizada (TC)
DIAGNOSTICO
El dominio Quinasa de la Proteína GNE es
la única proteína humana conocida que
forma parte del grupo de proteínas
bacterianas ROK
Al comparar la proteína GNE con otras
proteínas estudiadas como las proteínas ROK,
se revelo que hay sitios en común que son
básicamente los Sitios de Unión a Sustrato
ubicados en la Fisura Interlobular y también en
lo referido al Motivo unido al Zinc
CONCLUCIONES
Se han encontrado Mutaciones
Puntiformes asociadas con la Miopatía
Hereditaria con Cuerpos de Inclusión
(HIBM).
La estructura cristalina del dominio
Quinasa de la GNE es la base para
comprender las Mutaciones causantes de
enfermedades como la Miopatía de
Cuerpos de Inclusión (HIBM
CONCLUCIONES