estudio de inhibidores de la ruta pi3k/akt/mtor en líneas...
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“Estudio de inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR
en líneas celulares de carcinoma de mama con
sobre-expresión de HER2, resistentes a
Trastuzumab”
Trabajo de Fin de Máster
Realizado por:
Estefanía Alejandra Espín Armas
Directora:
Ph. D. Pilar Eroles Asensio
Director UPV:
Ph. D. José Ramón Murguía Ibáñez
Valencia, 2014
Estudio de inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR en líneas
celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2,
resistentes a Trastuzumab
Estefanía Alejandra Espín Armas
Trabajo de Investigación presentado como requisito parcial para optar al título de
Máster en Biotecnología Biomédica
Directora:
Ph. D. Pilar Eroles Asensio
Director UPV:
Ph. D. José Ramón Murguía Ibáñez
Línea de Investigación:
Identificación de mecanismos de resistencia a nuevos anticuerpos anti-HER2 en cáncer de
mama, Proyecto de Investigación en Salud, Expediente Nº
PI12/01421. Investigadora Principal: Ana Lluch Hernández
Grupo de Investigación:
Unidad de laboratorios del Servicio de Hematología y Oncología Médica pertenecientes a
la FIHCUV/INCLIVA, situados en la Unidad Central de Investigación, UCIM de la Facultad de
Medicina de Valencia.
Universidad Politécnica de Valencia
Máster Universitario en Biotecnología Biomédica
Departamento de Biotecnología
Valencia, España
2014
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar a la Dra. Pilar Eroles, por su apoyo y asesoría durante la
dirección de este trabajo, y principalmente por su calidez humana durante mi estancia en
los laboratorios. A la Dra. Ana Lluch Hernández por esta oportunidad.
A mi tutor, el Dr. José Ramón Murguía por sus enseñanzas, consejos y apoyo
durante la realización de este trabajo.
A mi país y su gente, quiénes hicieron posible esto, mediante la Secretaria de
Educación Superior Ciencia, Tecnología e Innovación del Ecuador y su programa de becas.
A mis compañeros del laboratorio Begoña, Eduardo, Sandra y Ariadna, por
haberme acogido desde el inicio, por su apoyo diario, por el cariño, los consejos y todos
los buenos momentos compartidos. A Jaume, Enrique, Raymundo, Alberto y Joan por su
apoyo, compañía, preocupación y fundamentalmente por las risas compartidas.
A quiénes me acompañaron durante este tiempo de estancia en este país. A Sofía
por su apoyo y cariño. A Fernando por sus enseñanzas y soporte. A mis primos Iván,
Myriam y María José que compartieron importantes momentos de esta aventura con
nosotros. Y a mis amigos de varios rincones Oscar, Pablo, Elsa, Nicolás, Daniela, María,
Dani y Wanda.
A Daniel, mi compañero de vida, mi apoyo y felicidad. A mis padres, mi ejemplo y
razón de ser. A mi hermano, mi cómplice de vida. A Melissa e Inés mi segunda familia. A
mis hermanas y hermanos del camino, mi apoyo a la distancia, Pamela, Andrea, María Sol,
Elena, Andrés, Juan José, Cristian, Daniel A. y Daniel C.
A Susana, Ramiro, María Belén, Andrea y Sofía por su apoyo y cariño incondicional.
A María, Mariano y Carlos por habernos extendido una mano.
Al resto de mi familia, tíos/as, primos/as y amigos/as queridos/as y a toda la gente
que he podido conocer durante esta experiencia.
AUTORIZACIÓN DE LA DIRECTORA
Certifico que el presente trabajo titulado “Estudio de inhibidores de la ruta
PI3K/AKT/mTOR en líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de
HER2, resistentes a Trastuzumab” ha sido realizado por Estefanía Alejandra Espín Armas,
bajo mi dirección en la Unidad de laboratorios del Servicio de Hematología y Oncología
Médica pertenecientes a la FIHCUV/INCLIVA, situados en la Unidad Central de
Investigación, UCIM de la Facultad de Medicina de Valencia.
Y autorizo la presentación del Trabajo de Fin de Máster el cual se adecua plenamente a los
requisitos formales, metodológicos y de contenido que requiere un Trabajo de Fin de
Máster, de acuerdo con la normativa publicada por la Comisión Académica del Máster en
Biotecnología Biomédica de la Universidad Politécnica de Valencia.
Directora del Trabajo de Fin de Máster:
Ph. D. Pilar Eroles Asensio
En Valencia, 29 de Mayo del 2014
AUTORIZACIÓN DEL TUTOR
Certifico que el presente trabajo titulado “Estudio de inhibidores de la ruta
PI3K/AKT/mTOR en líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de
HER2, resistentes a Trastuzumab” ha sido realizado por Estefanía Alejandra Espín Armas,
bajo mi tutoría en la Unidad de laboratorios del Servicio de Hematología y Oncología
Médica pertenecientes a la FIHCUV/INCLIVA, situados en la Unidad Central de
Investigación, UCIM de la Facultad de Medicina de Valencia.
Y autorizo la presentación del Trabajo de Fin de Máster el cual se adecua plenamente a los
requisitos formales, metodológicos y de contenido que requiere un Trabajo de Fin de
Máster, de acuerdo con la normativa publicada por la Comisión Académica del Máster en
Biotecnología Biomédica de la Universidad Politécnica de Valencia.
Tutor del Trabajo de Fin de Máster:
Ph. D. José Ramón Murguía
En Valencia, 29 de Mayo del 2014
Resumen
El carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2 es un subtipo agresivo y de mal
pronóstico, cuya terapia dirigida es el anticuerpo anti-HER2, Trastuzumab. A pesar de su
efectividad terapéutica, se han incrementado los casos de resistencia primaria y adquirida.
El mecanismo de resistencia más frecuente es la activación de la ruta de señalización
celular PI3K/AKT/mTOR. En este trabajo se evaluó la actividad de los inhibidores: BKM-120
(inhibidor de PI3K), MK-2206 (inhibidor de AKT), GDC-0980 (inhibidor dual de PI3K y
mTOR) y Everolimus (inhibidor de mTOR) combinados con Trastuzumab, como estrategia
para revertir la resistencia presente en líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-
expresión de HER2. Los inhibidores mencionados redujeron significativamente la
viabilidad de la línea celular HCC1954 con una mutación en el dominio catalítico de PI3K y
de la línea celular HCC1569, con pérdida de PTEN. En la línea celular JIMT-1, con menor
sensibilidad a los inhibidores de la ruta PI3K, se evaluó el inhibidor de MEK1/2, GSK. Sin
embargo, GSK no demostró ser más efectivo que los inhibidores de la ruta PI3K,
sugiriendo la presencia de otras o múltiples alteraciones en esta línea celular.
Adicionalmente, BKM-120 y GDC-0980 potenciaron el efecto de Trastuzumab sobre la
viabilidad de la línea celular HCC1954. Los inhibidores estudiados además disminuyeron
los niveles de pAKTThr308 y pAKTSer473 y redujeron la expresión de microRNAs considerados
oncogénicos, relacionados con la ruta PI3K/AKT y con la resistencia a Trastuzumab: miR-
21, miR-221, miR-26a y miR-30b. Adicionalmente, GDC-0980 y Everolimus incrementaron
la expresión de miR-491-5p, considerado supresor tumoral, en la línea celular HCC1954. La
sobre-expresión de miR-21, miR-221 y miR-30b en la línea celular HCC1954, por
transfección transitoria con microRNAs miméticos, incrementó la viabilidad celular y
disminuyó la sensibilidad de las células a BKM-120. Esto apoya la idea de que estos
microRNAs favorecen la supervivencia celular, especialmente miR-30b. En conjunto,
nuestros resultados sugieren que el uso de inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR podría
ser una estrategia válida para revertir la resistencia a Trastuzumab y resalta la necesidad
del estudio de microRNAs oncogénicos y supresores de tumores que podrían tener un
papel clave en la supervivencia celular y resistencia al anticuerpo anti-HER2.
Abstract
HER2-overexpressing breast cancer has an aggressive phenotype and poor prognosis.
Trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, has demonstrated therapeutic efficacy
on this breast cancer subtype. Nonetheless, primary and acquired resistance has
increased. The most common mechanism for Trastuzumab resistance is the activation of
the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. This study evaluated the efficacy of the PI3K
pathway inhibitors: BKM-120 (PI3K inhibitor), MK-2206 (AKT inhibitor), GDC-0980 (dual
inhibitor of PI3K and mTOR) and Everolimus (mTOR inhibitor) alone or in combination with
Trastuzumab as a strategy to reverse Trastuzumab resistance of HER2-overexpressing
breast cancer cell lines. Mentioned inhibitors significantly reduced the viability of
HCC1954 cell line, which has a mutation in the PI3K catalytic domain. Similar results were
obtained in HCC1569 cell line, which is PTEN null. On the other hand, we tested GSK, a
MEK 1/2 inhibitor in JIMT-1 cell line, which was less sensitive to PI3K pathway inhibitors.
Though, GSK was not more effective than PI3K inhibitors in this cell line, suggesting other
or multiple alterations present. Furthermore, BKM-120 and GDC-0980 potentiated
Trastuzumab activity over cell viability of HCC1954 cell line. PI3K/AKT pathway inhibitors
also reduced pAKTThr308 and pAKTSer473 levels. In addition, PI3K pathway inhibitors reduced
the expression of miR-21, miR-221, miR-26a and miR-30b, probable oncogenic miRNAs
related to PI3K/AKT pathway and Trastuzumab resistance. Moreover, GDC-0980 and
Everolimus increased expression of miR-491-5p, which is considered as tumor suppressor.
Induced transient over-expression of miR-221, miR-30b, and miR-21 in HCC1954 cell line,
increased cell viability and reduced its sensitivity to BKM-120. It supports the idea of a
probable oncogenic role of these microRNAs, in particular miR-30b. In brief, our results
suggest that inhibitors of PI3K/AKT/mTOR pathway combined with Trastuzumab could be
a valid strategy to overcome Trastuzumab resistance. This study additionally highlights the
importance of microRNAs related to PI3K pathway as they could have an essential role
over cell survival and Trastuzumab resistance.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
1.1 Carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2 ........................................................... 2
1.2 Terapia Dirigida anti-HER2: ................................................................................................. 3
1.3 Mecanismos de Resistencia a Trastuzumab: ...................................................................... 4
1.3.1 Efectos estéricos: ........................................................................................................ 4
1.3.2 Incremento de expresión de otros receptores tirosina-quinasa................................. 4
1.3.3 Alteraciones en rutas de Señalización Intracelulares .................................................. 5
1.4 Señalización Intracelular de la ruta PI3K/AKT/mTOR .......................................................... 6
1.5 Alteraciones de la Ruta PI3K en carcinoma de mama con amplificación de HER2 ............. 8
1.6 Inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR ............................................................................... 9
1.7 MicroRNAs asociados a la ruta PI3K/AKT/mTOR y a la resistencia a Trastuzumab en
carcinoma de mama que sobre-expresa HER2 ............................................................................. 11
2. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 13
2.1 OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................... 13
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................... 13
3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................... 14
3.1 Líneas celulares ................................................................................................................. 14
3.2 Cultivos celulares ............................................................................................................... 15
3.3 Inhibidores de proteínas PI3K/AKT/mTOR y MEK1/2 ....................................................... 16
3.4 Ensayos de viabilidad celular............................................................................................. 16
3.5 Extracción y Cuantificación de Proteínas .......................................................................... 17
3.6 Western Blot ..................................................................................................................... 18
3.7 Extracción de microRNAs .................................................................................................. 19
3.8 PCR cuantitativa en Tiempo Real ...................................................................................... 20
3.9 Transfección transitoria con microRNAs miméticos en la línea celular HCC1954 ............ 21
3.10 Análisis Estadístico ............................................................................................................ 23
4. RESULTADOS ............................................................................................................................. 24
4.1 Determinación del IC50 de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR............................ 24
4.2 Los inhibidores de la ruta PI3K reducen la viabilidad celular de las líneas celulares
resistentes a Trastuzumab ............................................................................................................ 25
4.2.1 Efecto de la Inhibición de PI3K con BKM-120 sobre la viabilidad celular ................. 25
4.2.2 Efecto de la Inhibición de AKT con MK-2206 sobre la viabilidad celular .................. 26
4.2.3 Efecto de la Inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980 sobre la viabilidad
celular ................................................................................................................................... 28
4.2.4 Efecto de la Inhibición de mTOR con Everolimus sobre la viabilidad celular ............ 28
4.2.5 Efecto de la inhibición de MEK1/2 con GSK sobre la viabilidad de la línea celular
JIMT-1 ................................................................................................................................... 29
4.3 Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR reducen la fosforilación de AKT ................... 30
4.3.1 Efecto de la inhibición de PI3K con BKM-120 sobre la fosforilación de AKT ............ 31
4.3.2 Efecto de la inhibición de AKT con MK-2206 sobre la fosforilación de AKT ............. 32
4.3.3 Efecto de la inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980 sobre la fosforilación de
AKT ................................................................................................................................... 33
4.3.4 Efecto de la inhibición de mTOR con Everolimus sobre la fosforilación de AKT ....... 33
4.3.5 Efecto de Trastuzumab sobre la fosforilación de AKT ............................................... 33
4.4 Efecto de la inhibición de MEK1/2 sobre la fosforilación de ERK en la línea celular JIMT-1
........................................................................................................................................... 34
4.5 Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR afectan la expresión de microRNAs
oncogénicos y supresores de tumores .......................................................................................... 35
4.5.1 Expresión basal de microRNAs oncogénicos y supresores de tumores .................... 36
4.5.2 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs oncogénicos miR-21 y miR-221 .............................................................................. 37
4.5.3 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs miR-26a y miR-30b ................................................................................................. 40
4.5.4 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs supresores tumorales miR-491-5p y miR-342-5p ................................................... 43
4.6 Efecto de la sobre-expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 sobre la viabilidad de la línea
celular HCC1954 ............................................................................................................................ 44
5. DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 50
5.1 Efecto de la Inhibición de PI3K con BKM-120 ................................................................... 50
5.2 Efecto de la inhibición de AKT con MK-2206 .................................................................... 53
5.3 Efecto de la inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980 ............................................ 54
5.4 Efecto de la inhibición de mTOR con Everolimus .............................................................. 55
5.5 Efecto de la inhibición de MEK 1/2 con GSK en la línea celular JIMT-1 ............................ 56
5.6 Efecto de Trastuzumab sobre la fosforilación de AKT y ERK1/2 ....................................... 57
5.7 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de microRNAs
oncogénicos y supresores tumorales ............................................................................................ 58
5.7.1 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de miR-21 y
miR-221 ................................................................................................................................... 59
5.7.2 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de miR-26a y
miR-30b ................................................................................................................................... 61
5.7.3 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de miR-491-
5p y miR-342-5p ........................................................................................................................ 63
6. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 66
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................. 69
INTRODUCCIÓN
1
1. INTRODUCCIÓN
El carcinoma de mama es el tipo de cáncer más frecuente en mujeres a nivel
mundial1,2. En el 2012, se diagnosticaron 1,7 millones de casos nuevos en todo el mundo1.
En los últimos cinco años, la incidencia de esta enfermedad ha incrementado en un 20% y
la mortalidad en un 14%1. El carcinoma de mama es la principal causa de muerte por
cáncer, en mujeres de países desarrollados y en vías de desarrollo1,2.
El carcinoma de mama es una enfermedad heterogénea desde el punto de vista
clínico, morfológico y molecular2,3. Estudios recientes de expresión génica global han
establecido cinco subtipos moleculares: Basal, Luminal A, Luminal B, HER2 positivo y
normal2,3 . Los tumores HER2 positivos representan el 15-30% y se caracterizan por
amplificación del gen erbb2 que codifica para el receptor HER2 y genes relacionados con
su ruta de señalización intracelular. Son tumores altamente proliferativos, tienen un alto
grado histológico y el 70% de éstos sobre-expresan el receptor HER22-4. Este subtipo se
correlaciona con un mal pronóstico2,3. En este sentido, la terapia anti-HER2 con
anticuerpos monoclonales como Trastuzumab (Herceptin®, Genentech), ha mejorado la
supervivencia5 en estadios iniciales y metastásicos en un 33% y ha reducido la reincidencia
de la enfermedad en un 50%3. Sin embargo, algunos tumores presentan resistencia a
Trastuzumab y desarrollan metástasis 2-4. Por esta razón, la investigación actual tiende a
buscar nuevas dianas terapéuticas asociadas a la ruta de señalización intracelular de HER2
para mejorar la respuesta a la terapia anti-HER23. La ruta PI3K/AKT/mTOR puede estar
relacionada con esta resistencia debido a que está frecuentemente alterada por
mutaciones activadoras de las subunidades catalíticas de PI3K y AKT2,3. El desarrollo de
inhibidores de la ruta PI3K para revertir la resistencia a Trastuzumab demanda un mejor
conocimiento de los cambios moleculares que inducen estos inhibidores en las células.
INTRODUCCIÓN
2
1.1 Carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2
El receptor HER2 pertenece a la familia de los receptores del factor de crecimiento
epidérmico humano, la cual incluye también HER1/EGFR, HER3 y HER46,7. HER2 es una
glicoproteína transmembrana de 185KDa con tres regiones: un dominio intracelular
tirosina quinasa, un dominio transmembrana de hélice alfa y un dominio extracelular de
unión a ligando, N terminal5,7,8. El dominio extracelular está compuesto por cuatro
subdominios, los dominios II y IV permiten su homo-dimerización y hetero-dimerización.
Cuando HER2 forma hetero-dímeros con los demás miembros de la familia HER, induce
una potente señal de transducción intracelular para regular funciones como
diferenciación, crecimiento y supervivencia celular5,7. Las rutas de señalización activadas
por HER2 son: PI3K (fosfatidilinositol-3-quinasa), MAPK (proteína quinasa activada por
mitogenos) y PLCγ (fosfolipasa Cγ)7,9. El patrón de dimerización de HER2 influye en las
cascadas de señalización subsecuentes. El hetero-dímero HER2/HER3 es el más potente y
activa selectivamente la ruta PI3K debido a que HER3 tiene varios sitios de unión a la
subunidad catalítica p85 de PI3K. Por el contrario, la ruta MAPK puede ser activada por los
homo-dímeros HER2/HER2 y hetero-dímeros HER1/HER2 y HER2/HER47.
En cáncer de mama, HER2 actúa como un oncogen cuando está sobre-expresado
debido a que tiene un papel importante en la supervivencia celular6,7. La tumorogénesis
mamaria está directamente influenciada por la amplificación o sobre-expresión de HER2,
siendo éste un mecanismo de transformación celular6,7. Como se ha mencionado antes la
sobre-expresión de HER2 está presente en aproximadamente un 25% de los casos de
cáncer de mama7,9, está asociada a un fenotipo agresivo4 y resistencia a la terapia
hormonal. Adicionalmente, la sobre-expresión de HER2 en cáncer de mama se ha
detectado en células madre cancerígenas5 y tiene efectos importantes sobre otros
procesos tumorales. HER2 disminuye la expresión de receptores PR/ER, incrementa la
expresión de VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular), y suprime la expresión
de la proteína E-cadherina7. En consecuencia, la amplificación de HER2 se traduce en
INTRODUCCIÓN
3
aumento de la proliferación y motilidad celular, invasión, metástasis, angiogénesis
acelerada, menor apoptosis y resistencia a la terapia antitumoral10.
1.2 Terapia Dirigida anti-HER2:
El receptor HER2 ha sido una diana terapéutica atractiva por su papel clave en la
tumorogénesis, por su expresión en membrana y ausencia de ligando natural, lo que
facilita el tratamiento dirigido mediante anticuerpos anti-HER25. El anticuerpo monoclonal
humanizado anti-HER2, Trastuzumab fue aprobado por la FDA en 1998 para el
tratamiento de carcinoma de mama metastásico con sobre-expresión de HER2.
Posteriormente, la FDA aprobó su uso como tratamiento adyuvante de mujeres con
carcinoma de mama con sobre-expresión de HER27,9. Trastuzumab se une al subdominio
IV del dominio extracelular de HER2 e impide así su dimerización y fosforilación del
dominio quinasa7. Este anticuerpo monoclonal tiene varios mecanismos de acción para
inducir apoptosis en células de carcinoma de mama9,10.
Trastuzumab induce la internalización y degradación de HER2 reclutando a la
tirosina-quinasa ubiquitina-ligasa c-Cbl, que ubiquitina HER2 y promueve su proteólisis9.
Otro mecanismo de acción de Trastuzumab es la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo (ADCC)5,10. Se ha observado que el anticuerpo unido a HER2 atrae a células NK
(natural killer) y a proteínas citotóxicas11. Otras acciones de Trastuzumab son la
restitución de p27kip, la disminución de la expresión de VEGF, y por lo tanto, inhibición de
la angiogénesis y migración celular7,9. El principal mecanismo de acción de Trastuzumab es
la interrupción de la formación de hetero-dímeros HER2/HER3, independiente de ligando5.
En consecuencia, se inhibe la activación de las rutas de señalización intracelular PI3K/AKT,
MAPK y la proliferación celular10,11. Trastuzumab impide también la homo-dimerización de
HER2 evitando su fosforilación, bloquea a su vez la activación de la tirosina-quinasa Src, e
incrementa la cantidad y actividad fosfatasa del supresor tumoral PTEN (homólogo de
fosfatasa y tensina)9.
INTRODUCCIÓN
4
A pesar de la efectividad de Trastuzumab para mejorar la supervivencia de
pacientes con carcinoma de mama HER2 positivo, la duración media de la respuesta es
baja9,11. Solamente el 35% de los tumores que sobre-expresan HER2 responden a la
terapia, lo cual sugiere una resistencia primaria alta. Adicionalmente, el 70% de los
pacientes que responden a la terapia inicial, desarrollan resistencia en el período de un
año9,10. Estos datos, subrayan la importancia de elucidar los mecanismos de resistencia al
anticuerpo.
1.3 Mecanismos de Resistencia a Trastuzumab:
Se han propuesto varios mecanismos moleculares responsables de la resistencia a
Trastuzumab, entre los que figuran: efectos estéricos por mutaciones en la proteína HER2,
incremento de expresión de otros receptores tirosina-quinasa, y alteraciones en las rutas
de señalización subsecuentes9-11.
1.3.1 Efectos estéricos:
Mutaciones en HER2 pueden inducir la proteólisis del dominio extracelular del
receptor, generando una isoforma p95HER2 truncada, que tiene actividad quinasa
constitutiva y carece de un dominio de unión a Trastuzumab4,5,9. Esta alteración se ha
detectado en pacientes con menor respuesta a Trastuzumab4. Otra alteración es la
expresión elevada de una proteína de membrana altamente glicosilada denominada
mucina MUC4 que recubre el dominio de unión de Trastuzumab al receptor HER25,9,12.
1.3.2 Incremento de expresión de otros receptores tirosina-quinasa
Uno de los receptores también involucrado en la resistencia a Trastuzumab es
HER3, debido a que el anticuerpo anti-HER2 no impide la hetero-dimerización
HER2/HER3 dependiente de ligando4,9. Este hetero-dímero activa las rutas de
señalización intracelular aún en presencia de Trastuzumab4,9. En líneas celulares
resistentes a Trastuzumab se han detectado altos niveles de EGF, ligando de
EGFR/HER1, otro receptor capaz de formar hetero-dímeros con HER24. Otro receptor
activo es el receptor de insulina (IGF-1R), cuya elevada expresión se relacionó con
menores niveles de p27Kip1, p21Cip1 y altos niveles de CDK2. Se ha observado que al
INTRODUCCIÓN
5
suprimir la actividad de este receptor se revierte la resistencia a Trastuzumab4,9.
Adicionalmente, c-Met es un oncogen que codifica para el receptor tirosina-quinasa
HGFR (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos). Se ha evidenciado que
HGFR interactúa con HER2 y su nivel de expresión se encuentra elevado en líneas
celulares y tejidos de carcinoma de mama que sobre-expresan HER2. La supresión de
la expresión de HGFR sensibiliza a las células frente a Trastuzumab, por lo que se
considera un receptor relacionado con la resistencia al anticuerpo9.
1.3.3 Alteraciones en rutas de Señalización Intracelulares
Entre los mecanismos de resistencia descritos, las alteraciones en la ruta de
señalización PI3K/AKT, es el más importante. Esta ruta es crítica en la respuesta a las
terapias anti-HER210,11. Existen varias alteraciones intracelulares en pacientes con
carcinoma de mama HER2 positivos. Una de ellas es la pérdida de PTEN, presente en el
36% de muestras de tumores HER2 positivas. Los pacientes con pérdida de PTEN
tienen menor sensibilidad al tratamiento con Trastuzumab que los pacientes con PTEN
normal4. Otra alteración es la activación constitutiva de PI3K por mutaciones en su
subunidad catalítica, el 25% de las pacientes con carcinoma de mama tiene
mutaciones en el gen PI3KCA13. Los pacientes con mutaciones activadoras de PI3K
tienen una menor supervivencia libre de progresión. Así mismo, las líneas celulares
con activación constitutiva de PI3K son resistentes a Trastuzumab9. La proteína Src
forma parte de la familia de tirosinas quinasas intracelulares que participan en la
traducción de señales de varias rutas de señalización, entre ellas las de los receptores
HER11. Se ha observado un interacción entre el dominio quinasa de HER2 y Src,
incrementando la actividad de esta última por fosforilación de Src en Y41614. La
activación de Src está asociada con la resistencia primaria y secundaria a Trastuzumab,
por lo tanto se considera un mediador central de las rutas de resistencia al anticuerpo
y una diana terapéutica importante9,15.
INTRODUCCIÓN
6
1.4 Señalización Intracelular de la ruta PI3K/AKT/mTOR
La ruta PI3K/AKT/mTOR es central a varias funciones celulares y tiene un complejo
mecanismo de transducción de señales, en donde participan las tres proteínas
moduladoras principales: PI3K, AKT y mTOR.
PI3K es un hetero-dímero que consta de una subunidad catalítica p110 y una
subunidad reguladora p85, cada una con múltiples isoformas16. Las ocho isoformas de la
subunidad catalítica de PI3K se han dividido en tres clases de acuerdo a su estructura,
regulación y selectividad de sustrato17. La clase IA, que comprende las isoformas PIK3Cα,
PIK3Cβ y PIK3Cδ, es de particular interés en cáncer. En carcinoma de mama es frecuente la
activación constitutiva de PI3K a causa de mutaciones en el gen PI3KCA que codifica para
la isoforma PI3KCα de la subunidad catalítica p1105,16,18. La subunidad reguladora p85
estabiliza, inactiva y captura los residuos de tirosina fosforilados de los receptores
transmembrana o moléculas adaptadoras para inducir la activación de la subunidad
catalítica p11016. Por lo tanto, esta subunidad está regulada por la unión de factores de
crecimiento a los receptores tirosina-quinasas y receptores asociados a proteínas G16,19. Su
función es fosforilar 4,5-PIP2 (4,5-fosfo-inositol) y generar el segundo mensajero 3,4,5-PIP3
(3,4,5-fosfo-inositol trifosfato)10,17,20. El supresor de tumores PTEN actúa a este nivel como
regulador negativo de la ruta PI3K, defosforilando PIP3 en PIP213,19.
La función del segundo mensajero PIP3 es activar varias proteínas, entre ellas, las
proteínas AKT (serina/threonina quinasa) y PDK1 (quinasa dependiente de fosofo-inositol).
PDK1 activa parcialmente AKT fosforilándola en Thr308 (pAKTThr308) y PDK2 completa su
activación fosforilando AKT Ser473 (pAKTSer473)17,19,20. AKT tiene tres isoformas: AKT1 está
presente en todos los tejidos, AKT2 en tejidos de respuesta a insulina y AKT3 en el cerebro
y testículos16. AKT regula procesos de metabolismo, proliferación, supervivencia, invasión,
migración, apoptosis y reparación de DNA, modulando proteínas como mTOR, Bad,
Caspasa 9, Tuberina, GSK3b y factores de transcripción de la familia forkhead 17,20. AKT
libera a mTOR de sus reguladores negativos TSC1 y TSC2 (proteínas del complejo de
esclerosis tuberosa). AKT fosforila TSC2, inactivando la hidrólisis GTP-Rheb (homólogo de
INTRODUCCIÓN
7
ras enriquecido en el cerebro), esta unión activa el dominio quinasa de mTOR13. mTOR es
una proteína importante en la tumorogénesis debido a que regula la síntesis de proteínas
y la biogénesis de ribosomas. AKT también inactiva por fosforilación a PRAS40 (sustrato de
AKT rico en prolina), otro regulador negativo de mTOR. El complejo TSC1/2 está regulado
a su vez por las rutas MAPK y LKB1-AMPK en función del estado nutricional celular17.
mTOR existe en dos complejos multi-proteicos: mTORC1 y mTORC2. mTORC1
consta de mTOR, raptor, LST8 de mamífero y PRAS40. El complejo mTORC1 controla la
síntesis de proteínas por fosforilación de 4EBP1 (proteína de unión al factor de iniciación
eucariótico) y S6K1 (quinasa ribosomal p70). Raptor se une a s6K y 4EBP1 para facilitar su
fosforilación por mTOR y promover la iniciación de la traducción de proteínas. Por su
parte, el complejo mTORC2 consiste en mTOR, mSIN-1, mLST-8, PRR5 (proctor) y rictor
(acompañante de mTOR insensible a rapamicina). La activación de este complejo parece
ser de forma independiente a AKT mediante factores de crecimiento. mTORC2 fosforila
AKTSer473, induciendo la activación de AKT y BAD. A su vez, regula la polaridad celular y el
citoesqueleto17. Los fármacos análogos a rapamicina inhiben mTORC1, pero no mTORC219.
La inhibición de mTORC1 puede producir activación de la ruta PI3K/AKT debido a que S6K1
(sustrato de mTORC1) regula negativamente PI3K, fosforilando el sustrato del receptor de
insulina IRS-1, para evitar la unión de éste a PI3K17,19. Por lo tanto, la inhibición de
mTORC1 puede bloquear esta regulación negativa induciendo la re-activación de
PI3K/AKT17. En la Figura 1 se resume la cascada de señalización de la ruta PI3K/AKT/mTOR.
INTRODUCCIÓN
8
Figura 1. Señalización intracelular de la ruta PI3K/AKT/mTOR en respuesta a las activación de los receptores
HER. Modificado de Leary et al. 2013
1.5 Alteraciones de la Ruta PI3K en carcinoma de mama con amplificación de HER2
Las alteraciones en la ruta de señalización PI3K/AKT/mTOR son frecuentes en
carcinoma de mama y pueden ser: mutaciones en el gen PIK3CA que codifica para PI3K,
pérdida de expresión de PTEN por deleción o metilación en el cromosoma 10,
amplificación de AKT u otras proteínas de la ruta y modificaciones post-traduccionales de
las mismas como fosforilación o regulación epigenética16. La principal alteración en los
tumores HER2 positivos es la activación constitutiva de PI3K por pérdida de PTEN o por
mutaciones en el gen PIK3CA. La presencia de este tipo de alteraciones son marcadores de
resistencia al tratamiento con Trastuzumab. La respuesta a Trastuzumab depende de la
presencia de PTEN, por lo que es importante diferenciar entre tumores con mutaciones en
PI3K o con pérdida de PTEN. En líneas celulares sensibles a Trastuzumab, éste disminuye la
fosforilación de AKT y por lo tanto la proliferación celular4. En consecuencia, la activación
de la ruta PI3K tiene un papel fundamental en la resistencia a Trastuzumab. La
inactivación de esta ruta con inhibidores de la misma combinados con el anticuerpo,
INTRODUCCIÓN
9
promete ser una estrategia terapéutica eficiente en células resistentes4,17. Sin embargo,
las interacciones entre las diferentes rutas de señalización celular dificultan el desarrollo
de una terapia efectiva.
1.6 Inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR
Las proteínas que componen la ruta PI3K/AKT/mTOR han sido dianas terapéuticas
ampliamente estudiadas en los últimos años. Los ensayos clínicos y pre-clínicos actuales
están evaluando la combinación de inhibidores de la ruta con tratamientos
convencionales como radioterapia, quimioterapia o terapias biológicas dirigidas como
Trastuzumab17. Los primeros resultados in vitro sugieren que la resistencia a Trastuzumab
es revertida en presencia de los inhibidores de la ruta11.
El primer inhibidor de PI3K, LY294002, apareció en 199013,17. En la actualidad,
varios inhibidores de PI3K con mayor especificidad y actividad farmacológica se
encuentran en ensayos clínicos de mujeres con carcinoma de mama13. BKM-120 o
Buparlisib es un inhibidor de múltiples isoformas de PI3K que se encuentra en estudios
clínicos13,17. El Grupo Internacional de Mama (BIG), el grupo Alemán (GBG) y el grupo
español de estudio de carcinoma de mama (SOLTI) están realizando un estudio en fase II
combinando BKM-120 con Trastuzumab y Paclitaxel en carcinoma de mama HER2
positivo13. La tendencia en el desarrollo de nuevos inhibidores es mejorar la especificidad
para isoformas de PI3K17.
Existen varios inhibidores de AKT en desarrollo, éstos pueden ser péptidos pseudo-
sustratos, análogos de PIP3, competidores de ATP e inhibidores alostéricos. MK-2206
(Merck) es un inhibidor alostérico de las tres isoformas de AKT que se encuentra en
estudios clínicos en fase II. Los inhibidores alostéricos son la estrategia más específica
debido a que impiden la fosforilación de AKT, por PDK1 bloqueando su sitio de unión17.
El primer inhibidor de mTOR, la Rapamycina descubierto en 1974, es un inhibidor
alostérico de mTORC1. La Rapamycina y sus análogos regulan la síntesis de proteínas,
impidiendo la fosforilación de S6K y 4EBP1/4EBP213,17. La inhibición de mTOR ha sido
INTRODUCCIÓN
10
ampliamente estudiada debido a la aprobación de Temsirolimus para carcinoma renal13,17.
En cáncer de mama, la inhibición de mTOR mejora la respuesta a tratamientos
convencionales quimioterapéuticos como Paclitaxel17. Everolimus (RAD-001) es un
inhibidor de mTOR que está siendo usado en carcinoma de mama metastásico. Sin
embargo, la eficacia de estos inhibidores es limitada porque actúan sobre mTORC1 y no
sobre mTORC2, responsable de la fosforilación de AKTSer473 17. Por esta razón se están
desarrollando nuevos inhibidores que compitan con ATP para bloquear la actividad
quinasa de mTOR y en consecuencia inhibir mTORC1 y mTORC2 a la vez. Adicionalmente,
este tipo de inhibidores actúan sobre el dominio quinasa de PI3K, similar al de mTOR, y se
convierten en inhibidores duales de PI3K y mTOR13. Uno de estos inhibidores es GDC-0980
que tiene una mayor eficacia al evitar la activación de las ruta PI3K por
retroalimentación17. En la Figura 2 se representa el punto de actuación de los inhibidores
en la ruta PI3K/AKT/mTOR.
Los inhibidores de la ruta MEK no han sido tan estudiados como los de la ruta PI3K.
Selumetinib o GSK1120212 es un inhibidor no competitivo de ATP de MEK1/2, selectivo y
potente. Ha demostrado ser efectivo en estudios pre-clínicos de carcinoma de mama13.
Figura 2. Inhibidores de la ruta PI3K/Akt/mTOR. Modificado de Hernández-Aya & González-Angulo, 2011.
INTRODUCCIÓN
11
1.7 MicroRNAs asociados a la ruta PI3K/AKT/mTOR y a la resistencia a Trastuzumab
en carcinoma de mama que sobre-expresa HER2
En los últimos años ha se ha empezado el estudio de las alteraciones epigenéticas
presentes en el carcinoma de mama. Un mecanismo importante de regulación de la
expresión génica es el de los microRNAs. Los microRNAs son RNAs no codificantes, de
aproximadamente 22 nucleótidos, que regulan la expresión génica a nivel post-
transcripcional21,22. Los microRNAs se unen a la región 3´UTR (región no traducida) del
RNA mensajero causando inestabilidad del mismo y reprimiendo su traducción21,22. La
secuencia de reconocimiento del microRNA es de apenas 7 nucleótidos22, por lo que es
difícil predecir con exactitud sus dianas. Se ha estimado que los microRNAs regulan la
expresión del 60% de los genes codificantes humanos22. En consecuencia, los microRNAs
están involucrados en procesos fisiológicos y patológicos, entre ellos el carcinoma de
mama21,22. Estudios previos de perfiles de expresión de microRNAs han identificado
microRNAs desregulados en carcinoma de mama, que funcionan como oncogenes o
supresores de tumores22,23.
En este sentido, se han descrito microRNAs que modulan el receptor HER2 y las
rutas de señalización celular PI3K y ERK. Algunos microRNAs inducen la activación de la vía
de señalización HER2, se consideran oncogénicos y están asociados a la resistencia a
Trastuzumab. Mientras que otros microRNAs inhiben la vía de señalización HER2,
considerándose supresores de tumores que favorecen la acción terapéutica de
Trastuzumab.
Entre los microRNAs oncogénicos se encuentran miR-21 y miR-221. Estos
favorecen la activación de la ruta PI3K/AKT y la supervivencia tumoral, disminuyendo la
expresión de PTEN23,24. Tanto miR-21 como miR-221 se han encontrado sobre-expresados
en líneas celulares y tejidos de pacientes con carcinoma de mama HER2 positivo y
resistencia a Trastuzumab24.
INTRODUCCIÓN
12
Por el contrario, miR-491-5p y miR-342-5p, se consideran supresores de tumores,
ya que disminuyen la expresión de HER2, suprimen la activación de AKT y ERK e inhiben el
crecimiento celular en líneas celulares de carcinoma de mama resistentes a
Trastuzumab22. Adicionalmente, un estudio con microarrays en líneas celulares sensibles a
Trastuzumab, identificó a miR-26a y miR-30b como microRNAs de respuesta al
anticuerpo25. Se observó un aumento de la expresión de miR-26a y miR-30b posterior al
tratamiento con Trastuzumab25.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
13
2. HIPÓTESIS
Alteraciones en la ruta de señalización celular PI3K/Akt/mTOR en líneas celulares
de carcinoma de mama que sobre-expresan HER2 son una de las causas de resistencia al
tratamiento con el anticuerpo anti-HER2, Trastuzumab. En consecuencia, inhibidores de
esta ruta, inducirían cambios moleculares a nivel de proteína y regulación génica que
sensibilizarían a las células en estudio, con resistencia primaria al anticuerpo.
2.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto de inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR a nivel molecular en
células de carcinoma de mama que sobre-expresan HER2 y presentan resistencia primaria
al anticuerpo anti-HER2 Trastuzumab.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la concentración mínima inhibitoria (IC50) de los inhibidores de la ruta
PI3K/AKT/mTOR en líneas celulares de carcinoma de mama resistentes a
Trastuzumab.
Evaluar la acción de los inhibidores solos y en combinación con Trastuzumab, sobre
la viabilidad de las líneas celulares en estudio.
Determinar el estado de fosforilación de la proteína AKT para confirmar la
inhibición de la ruta PI3K/AKT/mTOR en las líneas celulares, por acción de los
inhibidores.
Evaluar los cambios de expresión de microRNA´s asociados a la ruta
PI3K/AKT/mTOR en las líneas celulares tratadas con los inhibidores y Trastuzumab.
MATERIALES Y MÉTODOS
14
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Líneas celulares
Se usaron líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2 y
resistencia a Trastuzumab. HCC1569 es una línea celular con ausencia de receptores de
estrógenos y progesterona en membrana10,26. Tiene una mutación en el gen FHIT26 y
carece de PTEN y p5310. HCC1954 es una línea celular tetraploide con 35 re-arreglos
estructurales en todos sus cromosomas excepto el 11 y el 16. Esta línea celular presenta
una mutación en la región que codifica para el dominio quinasa del gen PIK3CA (H1047R) y
no expresa el receptor de estrógenos, ni el receptor de progesterona10,27. La línea celular
JIMT-1 proviene de una paciente con carcinoma de mama con progresión del tumor en
presencia de Trastuzumab28. Carece de los receptores de estrógenos y progesterona.
Expresa normalmente PTEN y p5328. Adicionalmente, se ha descrito la sobre-expresión de
la mucina MUC4 en esta línea celular12.
Figura 3. Líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2 y resistencia a Trastuzumab.
A: HCC1569, B: HCC1954 y C: JIMT-1.
La resistencia primaria de las líneas celulares que sobre-expresan HER2, se
determinó en un estudio anterior a este trabajo. Para ello se sembraron las líneas
celulares en placas de 12 pocillos a una densidad de 8000-12000 células por pocillo y se
trataron con Trastuzumab durante 7 días. La respuesta a Trastuzumab se cuantificó por el
cambio en la tasa de crecimiento de las células en presencia o ausencia del fármaco. Se
calculó el tiempo de duplicación celular con la ecuación: ( ) (
) ( ) .
A B C
MATERIALES Y MÉTODOS
15
En donde: N0 es el contaje inicial de células, Nt es el contaje de células en el segundo
punto, T es el tiempo entre ambos puntos y DT es el tiempo de duplicación celular. El
cambio en la tasa de crecimiento de cada línea celular, se obtuvo a partir de la razón entre
el tiempo de duplicación celular en presencia de la droga sobre el tiempo de duplicación
en ausencia de la droga. Se estableció un punto de corte para sensibilidad o resistencia al
fármaco del 20%. Las líneas celulares con un incremento en la tasa de crecimiento ≥ 1,2 o
una disminución en el número de colonias ≥ al 20% en respuesta a Trastuzumab, se
consideraron sensibles (Tabla 1)4.
Tabla 1. Panel de líneas celulares que sobre-expresan HER2 y su respuesta a Trastuzumab (O´Brien, et al. 2010).
3.2 Cultivos celulares
La línea celular JIMT-1 fue cultivada en medio DMEM (Dulbeco Modified Eagle
Medium) F/12, suplementado con 1% de L-glutamina 200mM, 10% de FBS (Suero Bovino
Fetal) y 1% de antibióticos (Penicilina-Estreptomicina). Las líneas celulares HCC1954 y
HCC1569 fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute
Medium) suplementado con 1% de L-glutamina 200mM, 10% de FBS y 1% de antibióticos.
Todas las líneas celulares se mantuvieron en sus respectivos medios de cultivo, en
MATERIALES Y MÉTODOS
16
incubador a 37°C, con atmósfera húmeda y 5% de CO2. Las células se mantuvieron en
cultivo hasta sub-confluencia, realizando pases continuos. Los pases se realizaron lavando
las células con PBS, añadiendo tripsina al 0,05% e inactivando la misma con medio de
cultivo y FBS.
3.3 Inhibidores de proteínas PI3K/AKT/mTOR y MEK1/2
Los inhibidores provistos por la empresa Sellekchem se disolvieron en DMSO y se
almacenaron en alícuotas a una temperatura de -80°C (Tabla 2).
Tabla 2. Inhibidores de proteínas PI3K/AKT/mTOR y MEK1/2 usados y sus proteínas diana.
Inhibidor Diana
BKM-120 o Buparlisib (Novartis) PI3K (p110α/β/δ/γ)
MK-2206 (Merck) AKT1/2/3
GDC-0980 (Genentech, Inc.) PI3K (p110α/β/δ/γ) y mTOR
Everolimus (Novartis) mTOR
GSK1120212 o Trametinib (GlaxoSmithKline) MEK 1/2
3.4 Ensayos de viabilidad celular
Para evaluar la actividad de los inhibidores BKM-120, MK-2206, GDC-0980,
Everolimus y GSK1120212 en las líneas celulares resistentes a Trastuzumab, se realizaron
ensayos de viabilidad celular con MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-bromuro de tetrazolio
difenilo). Este método determina la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial de las
células viables, por la formación de cristales violetas de formazan insolubles en agua, que
se detectan por espectrofotometría a 570nm.
Se determinó el IC50 de cada uno de los inhibidores en las tres líneas celulares en
estudio: JIMT-1, HCC1954 y HCC1569. Se sembraron por triplicado, 8x103 células, en
placas de 96 pocillos. Tras 24 horas se trataron con varias concentraciones de cada uno de
los inhibidores (Tabla 3), o con medio conteniendo la misma concentración de DMSO
como control, durante 48 y 72 horas. Finalmente, se removió el medio de cultivo de las
MATERIALES Y MÉTODOS
17
células y se añadió medio RPMI incoloro combinado con MTT al 10%. Se incubaron las
células durante 3 horas y se disolvieron los cristales formados en isopropanol acidificado.
Se determinó la viabilidad celular por espectrofotometría a 570nm, la absorbancia de
fondo del reactivo se detectó a 690nm y se restó de la absorbancia medida a 570nm. Se
determinó el IC50 en relación al porcentaje de viabilidad celular respecto del control.
Tabla 3. Concentraciones de inhibidores BKM-120, MK-2206, GDC0-980, Everolimus y GSK evaluadas en los
ensayos de viabilidad celular con las líneas celulares resistentes a Trastuzumab HCC1954, HCC1569 y JIMT1.
Inhibidor Concentraciones
BKM-120 1nM 5nM 10nM 50nM 100nM 500nM 1000nM 5000nM
MK-2206 0,005nM 0,05nM 0,5nM 500nM 5nM 50nM 500nM 5000nM 10000nM
GDC-0980 0,005nM 0,05nM 0,5nM 5nM 50nM 500nM 1000nM 5000nM
Everolimus 0,01nM 0,1nM 1nM 2nM 5nM 25nM 100nM 500nM 1000nM
GSK112021 0,01nM 0,1nM 1nM 10nM 50nM 100nM 500nM 1000nM 5000nM
Para determinar la actividad de los inhibidores en combinación con Trastuzumab
en las líneas celulares, se realizaron ensayos de viabilidad celular. En placas de 24 pocillos
se sembraron por triplicado, 10 x103 células de las líneas celulares HCC1954 y JIMT-1 y
50x103 células de la línea celular HCC1569. Tras 24 horas se trataron las células con
Trastuzumab (15µg/mL) o medio. En el cuarto día se añadieron los inhibidores BKM-120
(1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980 (1000nM), Everolimus (25nM) y GSK1120212
(1000nM) solos, en combinación con Trastuzumab o con el medio conteniendo la misma
concentración de DMSO como control. Al completar 7 días se evaluó la viabilidad celular
por MTT.
3.5 Extracción y Cuantificación de Proteínas
Se sembraron 2,5 x 106 células de la línea celular HCC1954 en placas de 75cm2.
Transcurridas 24 horas, se lavaron las células con PBS y se privaron de suero bovino fetal
(0,5%) durante 7 horas. Se lavaron nuevamente las células con PBS y se trataron durante
24 horas con los inhibidores BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980
(1000nM), Everolimus (25nM) solos, en combinación con Trastuzumab o con el medio
MATERIALES Y MÉTODOS
18
conteniendo la misma concentración de DMSO como control. Las línea celular JIMT-1 se
sembró en placas de 25cm2 (7 x 105 células). Transcurridas 24 horas, se lavaron las células
con PBS y se privaron de suero bovino fetal (0,5%) durante 24 horas. Se lavaron
nuevamente las células con PBS y se trataron con los inhibidores y Trastuzumab de igual
forma que con la primera línea celular.
Se recogieron las células y se re-suspendieron en un tampón de lisis (Hepes pH 7,4
200mM, NaCl 100mM, Tritón X-100 al 1%, NaF 50mM, β-glicerofosfato 10mM, PMSF
1mM, Ortovadanadato 30µL/mL e Inhibidor de proteasas 2µL/mL) en frío. Las proteínas
extraídas se cuantificaron por el método de Lowry/Folin que consiste en una detección
colorimétrica. Se preparó una curva patrón con albúmina de suero bovino (BSA) en
diluciones seriadas (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10µg/µL). Se incubaron las muestras con el
reactivo de Lowry durante 20 minutos, posteriormente se incubaron con el reactivo de
Follin durante 30 minutos. Se usó el tampón de lisis como blanco para calibrar el
espectrofotómetro y se midió la absorbancia de la curva patrón y los extractos de
proteínas a una longitud de onda de 660nm.
3.6 Western Blot
Se separaron las proteínas (30µg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
sodio dodecil sulfato (SDS/PAGE), al 12%. La electroforesis se realizó a 120V durante dos
horas. Se transfirieron las proteínas a membranas de nitrocelulosa, en frío, durante dos
horas a 118V. Se bloquearon las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con
BSA al 5% en TBS-T (TBS1X y Tween 0,5%) para AKT, AKT fosforilado en Ser473
(pAKTSer473), AKT fosforilado en Thr308 (pAKTThr308), ERK1/2 y ERK1/2 fosforilado en
Thr202/Tyr204 (pERK1/2) y en leche al 5% en TBS-T para la β-actina. Las membranas
bloqueadas se incubaron en agitación, con las diluciones apropiadas de los anticuerpos
primarios de cada proteína (Tabla 4), durante toda la noche a 4°C. Se lavaron las
membranas con BSA 1% y Leche 1% en TBS-T. Se incubaron las membranas lavadas con el
anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a
MATERIALES Y MÉTODOS
19
temperatura ambiente. Finalmente se lavaron las membranas con TBS-T y se revelaron
por quimioluminiscencia usando el sistema ECL.
Tabla 4. Diluciones de los anticuerpos usados en los Western Blots.
Anticuerpo Dilución
Anti-AKT (Cell Signalling) 1:1000 BSA5% en TBS-T
Anti-pAKT Thr308
(Cell Signalling) 1:1000 BSA5% en TBS-T
Anti-pAKT Ser473
(Cell Signalling) 1:1000 BSA5% en TBS-T
Anti-β-Actina (Sigma) 1:4000 leche desnatada 5% en TBS-T
Anti-ERK1/2 (Cell Signalling) 1:1000 BSA5% en TBS-T
Anti-pERK1/2 (Cell Signalling) 1:1000 BSA5% en TBS-T
Anti-Mouse-HRP (Cell Signalling) 1:2000 leche desnatada 5% en TBS-T
Anti-Rabbit-HRP (Cell Signalling) 1:2000 BSA5% en TBS-T
3.7 Extracción de microRNAs
Se sembraron 1 x 105 células de las líneas celulares HCC1954 y JIMT-1 y 3x105
células de la línea celular HCC1569 en placas de 25cm2. Transcurridas 24 horas, se trataron
las células con Trastuzumab o medio de cultivo. En el quinto día se trataron las células con
los inhibidores BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980 (1000nM), Everolimus
(25nM) solos, combinados con Trastuzumab o con el medio conteniendo la misma
concentración de DMSO como control. Se recogieron las células y se extrajo el RNA total
de acuerdo a las instrucciones del kit mirVana de aislamiento de microRNA (Ambion). Se
re-suspendieron las células en el tampón de lisis. Se incubaron las células en frío y se
añadió ácido-fenol cloroformo. Se recogió la fase acuosa, se le añadió etanol absoluto y se
pasó la mezcla a través de una columna. Se lavó la columna con los tampones de lavado y
se eluyó el RNA en 50µL de tampón de elución pre-calentado a 95°C. Se cuantificó el RNA
mediante Nanodrop y se almacenó en alícuotas a -80°C hasta su uso.
MATERIALES Y MÉTODOS
20
3.8 PCR cuantitativa en Tiempo Real
En primer lugar se realizó la transcripción reversa de las muestras de RNA. Se
usaron 350ng de RNA en todas las muestras de las líneas celulares HCC1954 y JIMT-1 y
155ng en las muestras de la línea celular HCC1569. Se usaron cebadores específicos para
los microRNAs: miR-21, miR-221, miR-26a, miR-30b, miR-491-5p, miR-342-5p y miR-
RNU43 como control endógeno. Se preparó la reacción de retro-transcripción de acuerdo
a la tabla 5. El programa térmico consistió en: anillamiento durante 30 minutos a 16°C,
extensión durante 30 minutos a 42°C e inactivación de la transcriptasa reversa durante 5
minutos a 85°C.
Tabla 5. Preparación de la reacciones de transcripción reversa y PCR cuantitativa en tiempo real.
RT-PCR PCR cuantitativa
Componente Volumen por Reacción
Componente Volumen por Reacción
RNA 2,00µL Sondas 20X TaqMan® MicroRNA Assay
0,35µL
Cebadores 0,05X 4,00µL cDNA proveniente de la retro-transcripción
0,16µL
dNTP´s con dTTP (100mM)
0,20µL
Mezcla Maestra TaqMan® Universal II, No AmpErasa® UNG (2x)
3,50µL
Trasncriptasa Reversa MultiScribe (50U/ µL)
2,00µL Agua libre de nucleasas
2,99µL
Tampón 10X RT 1,00µL Total 7,00µL
Inhibidor de RNAsas 0,13µL
Agua libre de nucleasas 0,67µL
Total 10,00µL
Posteriormente, con el cDNA obtenido, se preparó la reacción de la PCR
cuantitativa de acuerdo a la Tabla 5, en placas de 384 pocillos. Se usaron sondas Taqman
con marcaje FAM (6-carboxifluoresceina) para cada uno de los microRNAs. El programa
térmico consistió en denaturación inicial durante 10 minutos a 95°C, y posteriormente 40
ciclos de: denaturación a 95°C durante 15 segundos y anillamiento y extensión a 60°C
durante 1 minuto. Se cuantificaron los niveles de expresión de microRNAs por el método
de cuantificación relativa, normalizando los valores al RNA endógeno RNU-43 y
MATERIALES Y MÉTODOS
21
relativizándolos a su calibrador o control (células sin tratamiento con inhibidores, ni
Trastuzumab). Los cambios de expresión se expresaron como fold change en relación al
control y se calcularon con la fórmula 2-ΔΔCT.
3.9 Transfección transitoria con microRNAs miméticos en la línea celular HCC1954
Para los ensayos de transfección, se usó el sistema de internalización celular
polimérico, no liposomal TransIT-X2TM de Mirus.
En una primera etapa de estandarización del protocolo de transfección en la línea
celular HCC1954 se usó como microRNA a transfectarse el CyTM3 Dye-Labeled Pre-miRTM
Negative Control #1, que consiste en una molécula de RNA de doble cadena, mimética de
una secuencia al azar de un microRNA endógeno, marcado con fluorescencia en el
extremo 5´. Este microRNA mimético permite monitorizar la eficiencia de transfección en
la célula mediante microscopio de fluorescencia.
En la etapa de estandarización del protocolo de transfección se probaron tres
concentraciones del agente de transfección TransIT-X2 (0,5X, 0,4X y 0,3X) y tres
concentraciones del microRNA mimético marcado con fluorescencia (25nM, 50nM y
100nM). Se utilizó el método de transfección directa, que consiste en sembrar las células
24 horas antes de la transfección. Se sembraron 8x103 células por pocillo en una placa de
96 pocillos. Transcurridas 24 horas, se realizó la transfección de acuerdo a las
instrucciones del kit TransIT-X2TM de Mirus. Se prepararon los complejos de transfección
en medio Opti-MEM I, añadiendo el microRNA marcado con fluorescencia (25nM, 50nM o
100nM) y el agente de transfección TransIT-X2TM (0,5X, 0,4X o 0,3X). Se homogeneizó la
mezcla y se dejó en reposo durante 30 minutos para permitir que se formen los complejos
de transfección. A continuación se añadió el medio de cultivo completo RPMI 1640 con
una mínima concentración de antibiótico (0,2%) a los complejos de transfección.
Posteriormente, se añadió esta mezcla a las células y se incubaron las mismas. Al cabo de
24 horas, se tiñeron los núcleos con el reactivo Hoechst y se observó la eficiencia de
transfección en las células mediante microscopio de fluorescencia. Se estableció una
MATERIALES Y MÉTODOS
22
concentración de 0,5X de TransIT-X2TM TX y 50nM de microRNA como las mejores
condiciones para los posteriores ensayos.
Una vez estandarizado el protocolo, se transfectó la línea celular HCC1954, como
se ha descrito previamente, usando 0,5X de TransIT-X2TM y 50nM de cada uno de los
microRNAs miméticos de interés en este estudio: miR-221, miR-30b y miR-21, en placas de
6 pocillos. Se comprobó la eficiencia de la transfección por PCR cuantitativa en tiempo real
para determinar la expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 en las células transfectadas y
no transfectadas usadas como control. Se usaron dos tipos de controles, uno con el medio
de cultivo sin agentes de transfección y un control de transfección con los reactivos de
transfección sin los microRNAs miméticos. A continuación se extrajeron los microRNAs de
las células transfectadas y células control, con la metodología descrita previamente en el
apartado 3.7. Posteriormente se llevó a cabo la transcripción reversa y la PCR cuantitativa
en tiempo real mediante el protocolo descrito en el apartado 3.8.
Para determinar el efecto de los microRNAs miR-221, miR-30b y miR-21 sobre la
viabilidad de la línea celular HCC1954 se estableció un ensayo de transfección y posterior
tratamiento de las células con el inhibidor BKM-120 y Trastuzumab. Se sembraron 3x103
células HCC1954 por pocillo en placas de 96 pocillos. Tras 24 horas, se transfectaron las
células con los miRNAs miméticos de miR-221, miR-30b y miR-21 mediante el protocolo
estandarizado previamente descrito. Se partió entonces de cinco grupos de células: 1)
transfectadas con miR-221, 2) transfectadas con miR-30b, 3) transfectadas con miR-21, 4)
control con medio de cultivo sin reactivos de transfección y 5) control con reactivos de
transfección sin microRNAs miméticos. A cada grupo de células, se trató con Trastuzumab,
BKM-120, la combinación de ambos y medio con DMSO como control. Trastuzumab se
añadió en el primer día posterior a la transfección y en el cuarto día se añadió el inhibidor
BKM-120. Se determinó la viabilidad celular mediante MTT (descrito previamente en el
apartado 3.4) en el primero, cuarto y séptimo día.
MATERIALES Y MÉTODOS
23
3.10 Análisis Estadístico
Se realizaron pruebas T de student para dos muestras independientes, para
determinar diferencias significativas. Se consideraron diferencias estadísticamente
significativas de dos colas, desde un valor de p <0,05. Los niveles de significancia
estadística fueron *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001.
RESULTADOS
24
0
50
100
150
200
% d
e v
iab
ilid
ad c
elu
lar
BKM-120 HCC1954
JIMT-1
020406080
100120140160
% d
e vi
abili
dad
cel
ula
r MK-2206
HCC1954
JIMT-1
0
20
40
60
80
100
120
140
% d
e vi
abili
dad
cel
ula
r
GDC-0980*
0
20
40
60
80
100
120
% d
e vi
abili
dad
cel
ula
r
Everolimus HCC1954
JIMT-1
4. RESULTADOS
4.1 Determinación del IC50 de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR
Se determinó el IC50 de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR: BKM-120 (Fig.
4, A), MK-2206 (Fig. 4, B), GDC-0980 (Fig. 4, C) y Everolimus (Fig. 4, D) en las líneas
celulares HCC1954 y JIMT-1 a las 72 horas y 48 horas (datos no presentados). Las curvas
del porcentaje de viabilidad celular se establecieron en relación al control con DMSO. Se
observó una mayor actividad de los inhibidores a las 72 horas, por lo que se estableció
este período para los ensayos en las tres líneas celulares. Se establecieron los siguientes
valores de IC50: BKM-120: 1000nM, MK-2206: 5000nM, GDC-0980: 1000nM y Everolimus:
25nM.
Figura 4. Determinación de los IC50 de los inhibidores en las líneas celulares HCC1954 y JIMT-1. A BKM-120
(1000nM), B MK-2206 (5000nM), C GDC-0980 (1000nM) (*se calculó el IC50 únicamente en base a la línea
celular JIMT-1) y D Everolimus (25nM). Medición de viabilidad celular por MTT a las 72 horas en placas de 96
pocillos, densidad celular inicial de 8x103 células por pocillo. Se trataron las células con varias
concentraciones de los inhibidores y con medio de cultivo y DMSO como control. Se observa el porcentaje
de viabilidad celular respecto al control con DMSO en cada punto.
A B
C D
RESULTADOS
25
4.2 Los inhibidores de la ruta PI3K reducen la viabilidad celular de las líneas celulares
resistentes a Trastuzumab
Las alteraciones de la ruta PI3K/Akt/mTOR se consideran el principal mecanismo
de supervivencia y resistencia a Trastuzumab en las líneas celulares que sobre-expresan
HER211. Con el objetivo de determinar si el uso de inhibidores de esta ruta revierte la
resistencia a Trastuzumab, se evaluó la viabilidad de las células tratadas con los
inhibidores específicos de PI3K, AKT y mTOR solos o en combinación con Trastuzumab.
4.2.1 Efecto de la Inhibición de PI3K con BKM-120 sobre la viabilidad celular
En la línea celular HCC1954, la inhibición de PI3K con BKM-120 redujo
significativamente su viabilidad (***p<0,0001), comparada con el control (Fig. 5, A). La
combinación de BKM-120 con Trastuzumab tuvo un mayor efecto que el inhibidor sólo
(***p<0,0001), sobre la viabilidad de las células HCC1954 (Fig. 5, A). Esta línea celular
tiene una mutación activadora en el dominio catalítico de PI3K10, por lo que la
inhibición de PI3K resulta efectiva y potencia el efecto de Trastuzumab.
En la línea celular HCC1569, la inhibición de PI3K con BKM-120, tuvo un menor
efecto sobre la viabilidad celular, que en la línea HCC1954. BKM-120 por sí solo, no
redujo significativamente la viabilidad celular respecto al control (Fig. 5, B). La
combinación de BKM-120 con Trastuzumab redujo la viabilidad celular (*p=0,04)
respecto al control pero no tuvo un efecto significativo al compararlo con el efecto de
BKM-120 sólo. Esto sugiere que Trastuzumab no presenta un sinergismo con BKM-120
sobre la viabilidad de la línea celular HCC1569.
En la línea celular JIMT-1 la inhibición de PI3K no resultó ser efectiva (Fig. 5, C).
La viabilidad celular no disminuyó significativamente respecto al control, en presencia
de BKM-120 solo o combinado con Trastuzumab. Por lo tanto, es posible que en ésta
línea se encuentren varias rutas de señalización activas en paralelo que compensan la
inhibición de PI3K.
RESULTADOS
26
En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición de PI3K para re-sensibilizar
las células a Trastuzumab es efectiva en la línea celular HCC1954, que tiene una
mutación activadora en PI3K como mecanismo de resistencia. No ocurre lo mismo en
las líneas celulares JIMT-1, ni HCC1569 que carece de PTEN.
4.2.2 Efecto de la Inhibición de AKT con MK-2206 sobre la viabilidad celular
La inhibición de AKT1/2/3 con el inhibidor alostérico MK-2206 redujo la
viabilidad celular de las tres líneas celulares respecto al control.
En la línea celular HCC1954 se observó un efecto pronunciado de MK-2206 sólo
(***p<0,001) o combinado con Trastuzumab (***p<0,001) sobre la viabilidad celular,
respecto al control (Fig. 5, A).
De igual forma, en la línea celular HCC1569 se observó un efecto significativo
de MK-2206 solo (*p=0,02) o combinado con Trastuzumab (*p=0,03) sobre su
viabilidad, respecto al control (Fig.5, B).
En la línea celular JIMT-1 se obtuvieron similares resultados. MK-2206 sólo
(*p=0,01) o combinado con Trastuzumab (*p=0,01) redujo la viabilidad de las células,
respecto al control (Fig. 5, C).
Estos resultados sugieren que la inhibición de AKT tiene un mayor efecto sobre
la viabilidad de las líneas celulares resistentes a Trastuzumab, que la inhibición de
PI3K. Sin embargo, no se observó un efecto sinérgico del inhibidor MK-2206 con
Trastuzumab en ninguna de las líneas celulares.
RESULTADOS
27
Figura 5. Los inhibidores de la ruta PI3K/Akt/mTOR: BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980
(1000nM) y Everolimus (25nM) afectan la viabilidad de las tres líneas celulares A HCC1954 B HCC1569 y C
JIMT-1. Se midió la viabilidad celular por MTT a los 7 días de tratamiento con Trastuzumab. Los inhibidores
se añadieron en el cuarto día. Se trataron las células con los inhibidores solos o combinados con
Trastuzumab y el control con medio de cultivo con DMSO. Se observa la viabilidad celular respecto al control
con DMSO. Las barras de error representan la desviación estándar de 6 réplicas. La línea representa las
diferencias estadísticamente significativas respecto al control y la línea representa las diferencias
estadísticamente significativas entre el inhibidor sólo y su combinación con Trastuzumab. (Test T: *p<0,05
**p<0,01, *** p<0,001).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM-120 MK-2206 GDC-0980 Everolimus
Via
bili
dad
cel
ula
r re
lati
va a
l co
ntr
ol
HCC1954 A
***
**
***
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM-120 MK-2206 GDC-0980 Everolimus
Via
bili
dad
cel
ula
r re
lati
va a
l co
ntr
ol HCC1569 B
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM-120 MK-2206 GDC-0980 Everolimus
Via
bili
dad
cel
ula
r re
lati
va a
l co
ntr
ol
JIMT-1 C
* * ** ** **
RESULTADOS
28
4.2.3 Efecto de la Inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980 sobre la viabilidad
celular
El inhibidor dual de PI3K y mTOR, GDC-0980, demostró ser más efectivo que los
demás inhibidores sobre la viabilidad celular de las tres líneas en estudio.
En la línea celular HCC1954, GDC-0980 sólo (***p<0,001) y combinado con
Trastuzumab, disminuyó significativamente la viabilidad celular respecto al control
(***p<0,001). Además, la combinación de GDC-0980 con Trastuzumab demostró ser
más efectiva que GDC-0980 sólo (**p=0,005) (Fig. 5, A). Esto sugiere que GDC-0980
potencia la actividad de Trastuzumab en la línea celular HCC1954.
En la línea celular HCC1569, GDC-0980 sólo y combinado con Trastuzumab
redujo la viabilidad de las células respecto al control (*p=0,01) (Fig. 5, B).
De igual forma, en la línea celular JIMT-1 se observó una reducción de la
viabilidad celular en presencia de GDC-0980 solo (**p=0,001) y en combinación con
Trastuzumab (**p=0,001) (Fig. 5, C).
Estos resultados evidencian que la inhibición de la ruta PI3K/AKT/mTOR en
varios niveles es más efectiva, ya que podría suprimir la reactivación de la misma por
retroalimentación o intercomunicación con otras vías de señalización.
4.2.4 Efecto de la Inhibición de mTOR con Everolimus sobre la viabilidad celular
Everolimus, el inhibidor de mTOR, mostró un menor efecto que los demás
inhibidores sobre la viabilidad de las tres líneas celulares (Fig. 5, A, B y C).
En la línea celular HCC1954 se observó una reducción significativa de la
viabilidad celular respecto al control en presencia de Everolimus (***p<0,001) y de su
combinación con Trastuzumab (***p<0,001) (Fig. 5 A).
Por otro lado, en la línea celular HCC1569 no se observó un efecto significativo
de Everolimus sobre la viabilidad celular (Fig. 5 B).
RESULTADOS
29
En la línea celular JIMT-1 se observó una reducción de la viabilidad celular
respecto al control solamente en presencia de Everolimus (**p=0,007) (Fig. 5, C) y no
en combinación de éste con Trastuzumab.
Estos resultados sugieren que la inhibición de mTOR no sería la estrategia más
efectiva y tampoco potenció la actividad de Trastuzumab, independientemente de las
alteraciones presentes en las células como mecanismos de resistencia al anticuerpo.
4.2.5 Efecto de la inhibición de MEK1/2 con GSK sobre la viabilidad de la línea
celular JIMT-1
Se observó una menor sensibilidad de la línea celular JIMT-1 a la inhibición de
la ruta PI3K/AKT/mTOR comparada con las demás líneas celulares. Se desconocen las
alteraciones en la ruta PI3K de las células JIMT-1. Se ha descrito en esta línea celular,
que la sobre-expresión de la mucina MUC4 podría impedir la unión de Trastuzumab al
receptor HER212. Adicionalmente, se ha relacionado la expresión de MUC4 con la
activación de la ruta Raf/MEK/ERK29,30. Por lo tanto, nos planteamos la hipótesis de
que la supervivencia y resistencia a Trastuzumab de las células JIMT-1 podría depender
de la ruta Raf/MEK/ERK. Evaluamos la sensibilidad de estas células al inhibidor de
MEK1/2, GSK sólo o combinado con Trastuzumab. Se probaron dos concentraciones de
GSK: 500nM (Fig. 6, A) y 1000nM (Fig. 6, B) pero no se consiguió reducir la viabilidad
celular en un porcentaje mayor al 40%. Adicionalmente, el inhibidor GSK no potenció
la acción de Trastuzumab sobre las células. Se probó la inhibición simultánea de las
dos rutas, PI3K/AKT y MEK/ERK, combinando MK-2206 con GSK. La combinación de los
dos inhibidores tuvo un mayor efecto sobre la viabilidad celular, que cada uno de ellos
por separado (Fig. 6, A); sin embargo, no resultó ser estadísticamente significativo.
Estos resultados sugieren que en esta línea celular se encuentran presentes varias
alteraciones, en las dos rutas de señalización evaluadas o en otras rutas, que aseguran
la supervivencia celular.
RESULTADOS
30
Figura 6. La línea celular JIMT-1 no presenta mayor sensibilidad al inhibidor de MEK 1/2, GSK, que al
inhibidor de AKT, MK-2206. Las barras de error representan la desviación estándar de 3 réplicas. Se midió la
viabilidad celular por MTT a los 7 días. Se trataron las células con Trastuzumab desde el primer día, y en el
cuarto día se añadieron los inhibidores MK-2206 (5000nM) y GSK (A 500nM, B 1000nM). El control se trató
con medio de cultivo y DMSO. Se sembraron las células en placas de 24 pocillos, con una densidad celular
inicial de 10x103 células por pocillo. Se observa la viabilidad celular respecto al control con DMSO.
4.3 Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR reducen la fosforilación de AKT
La activación de la ruta PI3K se traduce en la fosforilación de AKT como señal de
supervivencia celular y posible resistencia a Trastuzumab. En las líneas celulares HCC1954
y JIMT-1, se evaluó mediante Western Blot la fosforilación de AKT, tras 24 horas de
tratamiento con los inhibidores de PI3K, AKT y mTOR y su combinación con Trastuzumab.
Se detectó AKT total, AKT fosforilado en Thr308 o pAKTThr308 y AKT fosforilado en Ser473 o
pAKTSer473.
Se compararon los niveles basales pAKTThr308 y pAKTSer473 de las dos líneas celulares
(Fig. 7). Se observaron niveles más altos de pAKTSer473 en la línea celular HCC1954. Los
niveles de pAKTThr308 fueron similares para las dos líneas celulares.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
_ T _ T _ T
Control MK-2206 GSK MK+GSKVia
bili
dad
cel
ula
r re
lati
va a
l co
ntr
ol
Inhibidor AKT vs Inhibidor MEK en JIMT-1 A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T
Control GSK
Via
bili
dad
cel
ula
r (r
elat
iva
al
con
tro
l)
GSK en JIMT-1 B
RESULTADOS
31
Figura 7. Niveles basales de pAKTSer473
y pAKTThr308
respecto a AKT total de las líneas celulares HCC1954 y
JIMT-1. Se cuantificaron las imágenes del Western Blot por densitometría de imagen en Image J. Se
referenció inicialmente pAKTSer473
y pAKTThr308
a su β-actina y luego esos valores de pAKTSer473
y pAKTThr308
respecto a AKT total referenciado a su β-actina también.
4.3.1 Efecto de la inhibición de PI3K con BKM-120 sobre la fosforilación de AKT
En la línea celular HCC1954, la inhibición de PI3K con BKM-120 redujo los
niveles de pAKTThr308 y pAKTSer473 (Fig. 8, A y B). Se observó menor fosforilación de AKT
con la combinación de BKM-120 con Trastuzumab, que con BKM-120 solo. Los niveles
de AKT total se mantuvieron estables y la disminución de fosforilación de AKT
concuerda con el efecto del inhibidor sobre la viabilidad de esta línea celular.
En la línea celular JIMT-1, el inhibidor BKM-120 no redujo la fosforilación de
pAKTThr308 ni de pAKTSer473. La combinación de BKM-120 con Trastuzumab redujo la
fosforilación de pAKTThr308 e incrementó la fosforilación de pAKTSer473 (Fig. 8, C y D). El
incremento en la fosforilación de pAKTSer473 en presencia de BKM-120 y Trastuzumab
podría ser causado por una activación compensatoria de AKT mediante otras rutas de
supervivencia implicadas en la resistencia al anticuerpo. En general, BKM-120 no
disminuye globalmente la fosforilación de AKT en la línea celular JIMT-1. Estos
resultados concuerdan con los datos de viabilidad celular, en donde no se observó una
sensibilidad significativa de JIMT-1 al inhibidor BKM-120.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
pAKT Ser pAKT Thr
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Niveles basales de fosforilación de AKT
HCC1954
JIMT-1
RESULTADOS
32
4.3.2 Efecto de la inhibición de AKT con MK-2206 sobre la fosforilación de AKT
La inhibición directa de AKT con MK-2206 disminuyó considerablemente los
niveles de pAKTThr308 y pAKTSer473 en ambas líneas celulares (Fig. 8, A, B, C y D). El
inhibidor MK-2206 sólo o en combinación con Trastuzumab bloqueó la fosforilación de
AKT y esta inhibición tuvo efecto sobre la viabilidad de ambas líneas celulares.
Figura 8. Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR: BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980
(1000nM) y Everolimus (25nM) afectan la fosforilación de AKT en las líneas celulares resistentes a
Trastuzumab: A, B HCC1954 y C, D JIMT-1. Se trataron las células durante 24 horas con los inhibidores solo o
en combinación con Trastuzumab y el control con medio de cultivo con DMSO. Se cuantificaron las imágenes
del Western Blot por densitometría. Se observa la intensidad relativa de pAKTSer473
y pAKTThr308
respecto a
AKT total, referenciada al control. Para esto se calculó previamente la intensidad relativa de AKT respecto a
su β actina, de pAKTSer473
respecto a su β actina y de pAKTThr308
respecto a su β actina también. Abreviaturas:
C: control con DMSO, T: Trastuzumab, B: BKM-120, M: MK-2206, G: GDC-0980, E: Everolimus, B+T: BKM-120
con Trastuzumab, M+T: MK-2206 con Trastuzumab, G+T: GDC-0980 con Trastuzumab y E+T: Everolimus con
Trastuzumab.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
C T B M G E B+T M+T G+T E+TIn
ten
sid
ad r
elat
iva
Cuantificación de pAKT/AKT en HCC1954
pAKT Ser/AKT
pAKT Thr/AKT
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
C T B M G E B+T M+T G+T E+T
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Cuantificación de pAKT /AKT en JIMT-1
pAKT Ser/AKTpAKT Thr/AKT
D
A HCC1954
C T B M G E B+T M+T G+T E+T
AKT
β actina
pAKT Thr
β actina
pAKT Ser
β actina
AKT
β actina
pAKT Thr
β actina
pAKT Ser
Β-actina
C JIMT-1
C T B M G E B+T M+T G+T E+T
RESULTADOS
33
4.3.3 Efecto de la inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980 sobre la
fosforilación de AKT
En la línea celular HCC1954, GDC-0980, el inhibidor dual de PI3K y mTOR,
redujo la fosforilación tanto de pAKTSer473 como de pAKTThr308 (Fig. 8, A y B). La
disminución de la fosforilación de AKT se evidenció en la reducción significativa de la
viabilidad de esta línea celular.
Al contrario, en la línea celular JIMT-1, GDC-0980 no redujo la fosforilación de
pAKTSer473 ni de pAKTThr308 (Fig. 8, C y D). La combinación de GDC-0980 con
Trastuzumab en esta línea celular aumentó la fosforilación de pAKTSer473. El estado de
fosforilación de AKT en presencia de GDC-0980, detectado en el Western Blot, no
coincide con el efecto del inhibidor sobre la viabilidad celular. Estos resultados
aparentemente contradictorios podrían sugerir, como se ha mencionado antes que
JIMT-1 interacciona con otras vías para asegurar la fosforilación de AKT. Sin embargo,
la inhibición downstream de mTOR con GDC-0980, afecta la viabilidad celular,
independientemente de la activación de AKT.
4.3.4 Efecto de la inhibición de mTOR con Everolimus sobre la fosforilación de AKT
Por otro lado, Everolimus (inhibidor de mTOR) disminuyó pAKTThr308 y pAKTSer473
en ambas líneas celulares (Fig. 8, A, B, C y D), y este efecto en la fosforilación de AKT se
vio reflejado en la viabilidad celular de las dos líneas celulares.
4.3.5 Efecto de Trastuzumab sobre la fosforilación de AKT
Si bien la fosforilación de AKT por acción de Trastuzumab disminuyó en ambas
líneas celulares, especialmente en pAKTThr308 (Fig. 8, A, B, C y D), estos cambios no
fueron suficientes para afectar la viabilidad de las células que presentaron resistencia
al anticuerpo anti-HER2. Es relevante mencionar que en la línea celular JIMT-1,
Trastuzumab en combinación con BKM-120 y con GDC-0980, aumentó la fosforilación
RESULTADOS
34
de pAKTSer473, sugiriendo que la inhibición de PI3K combinada con Trastuzumab induce
en las células una respuesta de compensación, todavía por elucidar.
4.4 Efecto de la inhibición de MEK1/2 sobre la fosforilación de ERK en la línea celular
JIMT-1
Se probó el efecto de la inhibición de MEK1/2 con el inhibidor GSK, en la línea
celular JIMT-1, para comprobar una posible activación de la vía Ras/MEK/ERK como
mecanismo de resistencia a Trastuzumab. Sin embargo, no se observó una disminución
de la fosforilación de ERK1/2 en presencia del inhibidor GSK sólo o combinado con
Trastuzumab (Fig. 9, A y B). El estado de activación de ERK1/2 concuerda con los datos
de viabilidad celular que tampoco mostraron una mayor sensibilidad al inhibidor GSK
que los inhibidores de la ruta PI3K/AKT. Se observó que la presencia de Trastuzumab
disminuye la fosforilación de ERK1/2.
Figura 9. Se trató la línea celular JIMT-1 durante 24 horas con Trastuzumab, el inhibidor de MEK1/2 GSK
(1000nM), la combinación de Trastuzumab con GSK y el control con medio de cultivo y DMSO. Se
cuantificaron las imágenes del Western Blot por densitometría. B Intensidad de las bandas de pERK1/2
respecto a ERK total y relativo al control. Para esto se calculó previamente la intensidad relativa de ERK1/2 y
de pERK1/2 respecto a β actina. Abreviaturas: C: control con DMSO, T: Trastuzumab, GSK+T: GSK con
Trastuzumab.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
C T GSK GSK+T
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Cuantificación de pERK/ERK en JIMT-1 B
pERK1/2
β actina
A JIMT-1
C T GSK GSK+T
ERK1/2
RESULTADOS
35
4.5 Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR afectan la expresión de microRNAs
oncogénicos y supresores de tumores
Se determinó el efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR en la
expresión de microRNAs relacionados con la misma, y consecuentemente con la respuesta
o resistencia a Trastuzumab. Se trataron las células con Trastuzumab durante 6 días y se
añadieron los inhibidores de la ruta PI3K en el quinto día. Se determinaron por PCR
cuantitativa los niveles de expresión de los microRNAs: miR-21, miR-221, miR-26a, miR-
30b, miR-491-5p y miR-342-5p en las tres líneas celulares HCC1954, JIMT-1 y HCC1569. Se
expresaron los cambios de expresión génica como fold change normalizados al RNA
endógeno RNU43 y relativizados al control.
Los cambios de expresión de los microRNAs estudiados se resumen en la siguiente
tabla (Tabla. 6), y se explicarán a detalle en los siguientes apartados.
miR-21 miR-221 miR-26a miR-30b miR-491-5p miR-342-5p HCC 1954
JIMT -1
HCC 1569
HCC 1954
JIMT -1
HCC 1569
HCC 1954
JIMT -1
HCC 1569
HCC 1954
JIMT -1
HCC 1569
HCC 1954
JIMT -1
HCC 1569
HCC 1954
JIMT -1
HCC 1569
Control ND ND
Trastuzumab ↑ ↓ ↓ ↑ ND ND
BKM-120 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ND ND ↓
BKM-120 + T ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ND ND
MK-2206 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ND ND
MK-2206 + T ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ND ND
GDC-0980 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ND ND ↓
GDC-0980 + T ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ND ND
Everolimus ↓ ↓ ↑ ND ND
Everolimus + T ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ND ND
Tabla 6. Resumen global de cambios de expresión estadísticamente significativos de microRNAs miR-21,
miR-221, miR-26a, miR-30b, miR-491-5p y miR-342-5p en presencia de los inhibidores: BKM-120 (1000nM),
MK-2206 (5000nM), GDC-0980 (1000nM) y Everolimus (25nM) solos y en combinación con Trastuzumab, en
las líneas celulares. Se representa ↑ incremento de expresión o ↓ disminución de la expresión de los
microRNAs en relación al control, ND: no detectado. El color resalta los puntos en los que también se
redujo la viabilidad celular por acción de los inhibidores.
RESULTADOS
36
4.5.1 Expresión basal de microRNAs oncogénicos y supresores de tumores
Se compararon los niveles basales de expresión de los microRNAs: miR-21, miR-
221, miR-26a, miR-30b y miR-491-5p en las tres líneas celulares (Fig. 10). miR-342-5p
no se detectó en las líneas celulares HCC1954 y JIMT-1, por lo que no se incluyó en
esta comparación.
Se observaron mayores niveles de expresión de miR-21 (Fig. 10) en la línea
celular HCC1954 respecto a HCC1569 (***p<0,001) y a JIMT-1 (***p<0,001). A su vez,
la línea celular JIMT-1 tiene mayores niveles de expresión de miR-21 que HCC1569
(***p<0,001). Se encontraron resultados similares para miR-221 (Fig. 10). La línea
celular HCC1954 tiene mayores niveles de expresión de miR-221 respecto a HCC1569
(*p=0,01) y a JIMT-1 (*p=0,01). La línea celular JIMT-1 presentó también mayores
niveles de expresión de miR-221 comparada con HCC1569 (**p=0,003).
Figura 10. Niveles de expresión basal de los microRNAs miR-21, miR-221, miR-26a, miR-30b y miR-491-5p en
las líneas celulares HCC1954, HCC1569 y JIMT-1. Se observa el fold change normalizado al microRNA
endógeno RNU43 y relativizado la línea celular HCC1954. Las barras representan la desviación estándar de 3
réplicas. Se muestran las diferencias significativas del Test T (*p<0,05 **p<0,01, *** p<0,001).
Los niveles de expresión de miR-26a fueron similares para las tres líneas
celulares (Fig. 10). En cuanto a miR-30b (Fig. 10), la línea celular HCC1569 mostró altos
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
miR-21 miR-221 miR-26a miR-30b miR-491-5p
Fold
ch
ange
Niveles basales de expresión de miRNAs en estudio
HCC1954
HCC1569
JIMT-1***
***
***
*
*
**
*
* *
*
RESULTADOS
37
niveles de expresión del microRNA respecto a las líneas celulares HCC1954 (*p=0,04) y
JIMT-1 (*p=0,04). Ocurre lo mismo con la expresión de miR-491-5p (Fig. 10). La línea
celular HCC1569 mostró altos niveles de expresión del microRNA, comparada con la
línea celular HCC1954 (*p=0,01) y con JIMT-1 (*p=0,01).
4.5.2 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs oncogénicos miR-21 y miR-221
Se ha descrito que en líneas celulares de carcinoma de mama, miR-21 y miR-
221, están relacionados con la resistencia a Trastuzumab, regulando la expresión de
PTEN31,32.
En la línea HCC1954 se observó una disminución significativa de la expresión
de miR-21 en relación al control (Fig. 11, A), en presencia de los inhibidores BKM-120
(***p<0,01), MK-2206 (***p<0,01), GDC-0980 (***p<0,001) y Everolimus
(***p<0,001). También se redujo la expresión de miR-21 respecto al control, en
presencia de Trastuzumab con los inhibidores BKM-120 (**p<0,01), MK-2206
(**p<0,01), GDC-0980 (**p<0,01) y Everolimus (***p<0,001). Trastuzumab por sí solo
no alteró la expresión de miR-21 en esta línea celular. La disminución de la expresión
de miR-21 en presencia de los inhibidores solos o combinados con Trastuzumab,
coincide con la inhibición de la fosforilación de AKT y la reducción de la viabilidad en
las células HCC1954.
Se observó además que la expresión de miR-221 (Fig. 11, B) en esta línea
celular disminuyó, respecto al control, únicamente en presencia de Trastuzumab
combinado con los inhibidores MK-2206 (*p=0,03), GDC-0980 (*p=0,02) y Everolimus
(**p=0,007) y no en presencia de los inhibidores solos.
En la línea celular HCC1569, el tratamiento con los inhibidores BKM-120
(**p=0,005) y MK-2206 (*p=0,01) disminuyó la expresión de miR-21 en relación a su
control (Fig. 11, C). La expresión de miR-21 se redujo a su vez, con la combinación de
RESULTADOS
38
Trastuzumab con los inhibidores BKM-120 (*p=0,03), MK-2206 (*p=0,01), GDC-0980
(*p=0,02) y Everolimus (*p=0,02). En adición, la expresión de miR-221 (Fig. 11, D) en
relación al control, disminuyó en presencia de los inhibidores BKM-120 (*p=0,01) y
GDC-0980 (*p=0,03) por si solos y en la combinación de Trastuzumab con los
inhibidores BKM-120 (*p=0,03), MK-2206 (*p=0,01), GDC-0980 (*p=0,03).
Trastuzumab por sí solo no afectó a la expresión de miR-21, ni de miR-221 en esta
línea celular.
En la línea celular JIMT-1 se detectó una reducción de la expresión de miR-21
(Fig. 11, E) respecto al control, en presencia del inhibidor GDC-0980 combinado con
Trastuzumab. Adicionalmente, Trastuzumab por sí solo y combinado con Everolimus
incrementó significativamente la expresión de miR-21 (***p<0,001). La expresión de
miR-221 (Fig. 11, F) disminuyó significativamente, respecto al control, en presencia de
Trastuzumab (*p=0,04), BKM-120 (**p=0,005) y GDC-0980 (*p=0,03) por sí solos y con
las combinaciones de Trastuzumab con BKM-120 (**p=0,002), MK-2206 (**p=0,006),
GDC-0980 (**p=0,006) y Everolimus (*p=0,01).
RESULTADOS
39
Figura 11. Los inhibidores de la ruta PI3K/Akt/mTOR: BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980
(1000nM) y Everolimus (25nM) afectan la expresión de microRNAs oncogénicos miR-21 y miR-221 en las
líneas celulares. Cambios en la expresión de A miR-21 y B miR-221 en HCC1954. Cambios en la expresión de
C miR-21 y D miR-221 en HCC1569. Cambios en la expresión de E miR-21 y F miR-221 en JIMT-1. Se trataron
las células durante 6 días con Trastuzumab, los inhibidores se añadieron en el quinto día. Las células control
se trataron con medio de cultivo con DMSO. Se observa el fold change normalizado al microRNA endógeno
RNU43 y relativizado al control. Las barras representan la desviación estándar de 3 réplicas. En todos los
casos se muestra la significancia estadística respecto al control y la línea representa las diferencias
estadísticamente significativas entre el inhibidor sólo y su combinación con Trastuzumab. (Test T: *p<0,05
**p<0,01, *** p<0,001).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-21, HCC1954 A
*** *** *** ***
** *** ** ***
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
ch
ange
miR-221, HCC1954 B
* **
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-21, HCC1569 C
*
* **
* * *
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-221, HCC1569 D
* * *
*
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-21, JIMT-1 E
**
*** ***
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-221, JIMT-1 F
* *
** **
** * **
RESULTADOS
40
4.5.3 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs miR-26a y miR-30b
Se ha descrito que miR-26a y miR-30b están relacionados con la respuesta a
Trastuzumab en líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2,
sensibles al anticuerpo25. En el presente trabajo se evaluó la expresión de estos
microRNAs en las tres líneas celulares resistentes a Trastuzumab.
En la línea celular HCC1954 la expresión de miR-26a (Fig. 12, A) respecto al
control, decreció en respuesta a BKM-120 (***p<0,001) solo o combinado con
Trastuzumab (**p=0,002). Además, se observaron menores niveles de expresión de
miR-26a, al ser tratado con la combinación de Trastuzumab con los inhibidores MK-
2206 (***p<0,001), GDC-0980 (**p=0,002), y Everolimus (***p<0,001), que con los
inhibidores solamente. En cuanto a miR-30b, éste disminuyó significativamente (Fig.
12, B), respecto al control, en presencia de los inhibidores BKM-120 (*p=0,04) y GDC-
0980 (*p=0,03) solos. Así mismo, miR-30b se redujo significativamente con la
combinación de Trastuzumab y los inhibidores MK-2206 (*p=0,04) y GDC-0980
(*p=0,02). Al tratar las células HCC1954 con Trastuzumab y Everolimus en conjunto, se
observaron menores niveles de expresión de miR-30b que con el tratamiento con
Everolimus solo (*p=0,02).
En la línea celular HCC1569 se observó el mismo patrón de cambios en la
expresión de miR-26a y miR-30b (Fig. 12, C y D), respecto al control. Los inhibidores
BKM-120 y MK-2206 disminuyeron significativamente la expresión de miR-26a y miR-
30b solos y combinados con Trastuzumab. BKM-120 redujo la expresión de miR-26a
solo y en conjunto con Trastuzumab (*p=0,01 para ambos casos). MK-2206 disminuyó
la expresión de miR-26a combinado con Trastuzumab (*p=0,02) y por sí solo
(**p=0,003). En cuanto a miR-30b, BKM-120 redujo su expresión en relación al control,
combinado con Trastuzumab y por sí solo (*p=0,02 para ambos). De forma similar, MK-
2206 disminuyó la expresión de miR-30b (*p=0,01) sólo y en conjunto con
Trastuzumab (*p=0,03). Por otro lado, los inhibidores GDC-0980 y Everolimus
RESULTADOS
41
combinados con Trastuzumab redujeron la expresión de miR-26a (**p=0,004 y
*p=0,02 respectivamente) y de miR-30b (**p=0,006 y *p=0,03, respectivamente).
Trastuzumab no afecto la expresión de miR-26a y de miR-30b.
En la línea celular JIMT-1 se detectó también una disminución de la expresión
de miR-26a y miR-30b (Fig. 12, E y F) respecto a sus controles, en presencia de los
inhibidores y de Trastuzumab. MK-2206 y Trastuzumab por sí solos, redujeron
significativamente la expresión de miR-26a, respecto al control (*p=0,01 y **p=0,001).
Los niveles de expresión de miR-26a disminuyeron por acción de los inhibidores BKM-
120 y Everolimus solos (*p=0,03 y **p=0,008) y combinados con Trastuzumab
(**p=0,003 y ***p<0,001). En el caso de miR-30b, los inhibidores BKM-120 y GDC-
0980 solos (*p=0,01 y **p=0,004) o combinados con Trastuzumab (**p=0,004 ambos),
redujeron su expresión respecto al control. Se observó además que las combinaciones
de Trastuzumab con MK-2206 (*p=0,04) y con Everolimus (*p=0,02) disminuyeron la
expresión de miR-30b, significativamente respecto a los inhibidores solos.
RESULTADOS
42
Figura 12. Los inhibidores de la ruta PI3K/Akt/mTOR: BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980
(1000nM) y Everolimus (25nM) afectan la expresión de microRNAs supresores de tumores en las líneas
celulares. Cambios en la expresión de A miR-26a y B miR-30b en HCC1954. Cambios en la expresión de C
miR-26a y D miR-30b en HCC1569. Cambios en la expresión de E miR-26a y F miR-30b en JIMT-1. Se trataron
las células durante 6 días con Trastuzumab, los inhibidores se añadieron en el quinto día. Las células control
se trataron con medio de cultivo con DMSO. Se observa el fold change normalizado al microRNA endógeno
RNU43 y relativizado al control. Las barras representan la desviación estándar de 3 réplicas. En todos los
casos se muestra la significancia estadística respecto al control y la línea representa las diferencias
estadísticamente significativas entre el inhibidor sólo y su combinación con Trastuzumab. (Test T: *p<0,05
**p<0,01, *** p<0,001).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
ch
ange
miR-26a, HCC1954 A ***
** ***
*** **
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
ch
ange
miR-30b, HCC1954 B
* * * * *
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-26a, HCC1569 C
** * ** ** ** **
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-30b, HCC1569 D
** * ** ** ** **
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
ch
ange
miR-26a, JIMT-1 E
* * ** ** **
***
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
ch
ange
miR-30b, JIMT-1 F
* * *
** **
**
RESULTADOS
43
4.5.4 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs supresores tumorales miR-491-5p y miR-342-5p
En un estudio con técnicas de alto rendimiento se identificaron los microRNAs:
miR-491-5p y miR-342-5p como supresores tumorales y moduladores de la
señalización celular vía HER2, que se encuentran infra-expresados en líneas celulares y
tumores de pacientes resistentes a Trastuzumab22.
En la línea celular HCC1954, se observó una sobre-expresión de miR-491-5p
(Fig. 13, A) respecto al control, en presencia de todos los inhibidores y de
Trastuzumab. Sin embargo, el incremento de la expresión fue estadísticamente
significativo solamente al tratar con Trastuzumab (*p=0,01), Everolimus (*p=0,03) y
Everolimus combinado con Trastuzumab (*p=0,04).
En la línea celular HCC1569, se observó una disminución significativa de la
expresión de miR-491-5p (Fig. 13, B), respecto al control, en presencia de MK-2206
(*p=0,04). En contraste, el inhibidor GDC-0980 incrementó significativamente la
expresión de miR-491-5p (*p=0,03).
En la línea celular JIMT-1 se observó una disminución significativa de la
expresión de miR-491-5p (Fig. 13, C), respecto al control en presencia de Trastuzumab
combinado con BKM-120 (**p=0,007) y con GDC-0980 (*p=0,03).
En el presente trabajo, microRNA-342-5p fue indetectable en repetidos
experimentos en las líneas celulares HCC1954 y JIMT-1. En consecuencia, es posible
que miR-342-5p se encuentre infra-expresado en estas líneas celulares. Sin embargo,
en la línea celular HCC1569, miR-342-5p fue detectable (Fig. 13, D) y se determinó una
reducción significativa de miR-342-5p en presencia de BKM-120 (*p=0,01) y GDC-0980
(*p=0,01).
RESULTADOS
44
Figura 13. Los inhibidores de la ruta PI3K/Akt/mTOR: BKM-120 (1000nM), MK-2206 (5000nM), GDC-0980
(1000nM) y Everolimus (25nM) afectan la expresión de microRNAs supresores de tumores en las líneas
celulares. Cambios en la expresión de miR-491-5p A HCC1954, B HCC-1569 y C JIMT-1. D Cambios en la
expresión de miR-342-5p en HCC1569. miR-342-5p no fue detectable en las líneas celulares JIMT-1 y
HCC1954. Se trataron las células durante 6 días con Trastuzumab, los inhibidores se añadieron en el quinto
día. Las células control se trataron con medio de cultivo con DMSO. Se observa el fold change normalizado al
microRNA endógeno RNU43 y relativizado al control. Las barras representan la desviación estándar de 3
réplicas. En todos los casos se muestra la significancia estadística respecto al control. (Test T: *p<0,05
**p<0,01, *** p<0,001).
4.6 Efecto de la sobre-expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 sobre la viabilidad de
la línea celular HCC1954
Considerando, que los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR combinados con
Trastuzumab afectaron la expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 de forma común en las
tres líneas celulares, nos planteamos profundizar su estudio. Para determinar el efecto de
los microRNAs miR-221, miR-30b y miR-21 sobre la viabilidad celular, se realizó una
transfección transitoria con microRNAs miméticos en la línea celular HCC1954.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-491-5p, HCC1954 A
* * *
0
0,5
1
1,5
2
2,5
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-491-5p HCC1569 B
*
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-491-5p, JIMT-1 C
** *
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
_ T _ T _ T _ T _ T
Control BKM MK GDC Eve
Fold
Ch
ange
miR-342-5p, HCC1569 D
* *
RESULTADOS
45
Partimos de la hipótesis de que estos microRNAs favorecen la proliferación celular.
En paralelo, BKM-120 demostró reducir la viabilidad de la línea celular HCC1954 sólo y en
combinación con Trastuzumab. Por lo tanto, propusimos que al transfectar las células con
miR-221, miR-30b y miR-21, y tratarlas con BKM-120, la sobre-expresión de estos
microRNAs reduciría el efecto de BKM-120 sobre la viabilidad celular.
En primer lugar se comprobó la eficiencia de la transfección mediante PCR
cuantitativa en tiempo real, determinando la expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 en
las células transfectadas, en las células control no transfectadas y en las células control
con reactivos de transfección sin microRNAs miméticos. Se observó un incremento
significativo en la expresión de miR-221 (***p<0,001), miR-30b (***p<0,001) y miR-21
(***p<0,001) de las células transfectadas, respecto a los dos tipos de células control. En
consecuencia, se comprobó la eficiencia de la transfección en la línea celular HCC1954
(Fig. 14).
Figura 14. Expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 en la línea celular HCC1954 transfectadas con los
microRNAs miméticos. Se observa el fold change normalizado al microRNA endógeno RNU43 y relativizado
al control sin transfección. Abreviaturas: C: control sin transfección, CTr: control con reactivos de
transfección sin microRNAs miméticos y Tr: células transfectadas con uno de los microRNAs miméticos. Las
barras representan la desviación estándar de 3 réplicas. (Test T: *p<0,05 **p<0,01, *** p<0,001).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
C C Tr. Tr. C C Tr. Tr. C C Tr. Tr.
miR-221 miR-30b miR-21
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Fold
Ch
ange
*** ***
***
RESULTADOS
46
Para monitorizar la viabilidad de la línea celular HCC1954 después de la
transfección con los microRNAs miméticos de miR-221, miR-30b y miR-21, se determinó la
misma en tres puntos posteriores a la transfección, en el primer, cuarto y séptimo día. En
el primer día se observó una menor viabilidad de las células transfectadas con los
microRNAs miméticos, posiblemente por la presencia de los complejos de transfección. En
el cuarto día se incrementó la viabilidad de las células transfectadas con miR-30b y miR-21
(Fig. 15). En el séptimo día, la viabilidad de las células transfectadas con miR-221 también
aumentó, llegando a ser igual a la de las células control no transfectadas, a la de las células
con reactivos de transfección sin miRNAs y a la de las células transfectadas con miR-30b y
miR-21 (Fig. 15). Por lo tanto, se seleccionó este último punto para medir la viabilidad
celular en el posterior experimento de transfección de la línea celular HCC1954 con los
miRNAs miméticos de miR-221, miR-30b y miR-21 y tratamiento con el inhibidor BKM-120.
Figura 15. Viabilidad de la línea celular HCC1954 en el primer, cuarto y séptimo día posterior a la
transfección con los microRNAs miméticos: miR-221, miR-30b y miR-21. Se midió la viabilidad celular por
MTT. Se observa la viabilidad celular respecto al control sin reactivos de transfección. Las barras de error
representan la desviación estándar de 3 réplicas. Abreviaturas: C: control sin transfección, CTr: control con
reactivos de transfección sin microRNAs miméticos.
Finalmente, se observó el efecto de los microRNAs miR-221, miR-30b y miR-21
sobre la viabilidad de línea celular HCC1954 tratada con Trastuzumab y BKM-120. Se
transfectaron las células con los microRNAs miméticos de miR-221, miR-30b y miR-21. A
continuación, se trataron las células transfectadas, células control (sin transfectar) y
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
C CTr miR-221 miR-30b miR-21
Via
bili
dad
cel
ula
r re
lati
va a
l co
ntr
ol
Día 1
Día 4
Día 7
RESULTADOS
47
células control de transfección (con reactivos de transfección sin microRNAs miméticos),
con medio de cultivo con DMSO como control, con Trastuzumab, BKM-120 y la
combinación de ambos.
En las células transfectadas con el microRNA mimético miR-221 se observó un
menor efecto de BKM-120 sobre la viabilidad celular, comparado con su efecto sobre las
células del control de transfección (con reactivos de transfección pero sin miRNA-221)
(Fig. 16). Adicionalmente, se determinó un incremento significativo (**p=0,002) de la
viabilidad de las células transfectadas con miR-221 tratadas con BKM-120 combinado con
Trastuzumab, respecto a las células del control de transfección tratadas con la misma
combinación de fármacos (Fig. 16). Estos resultados sugieren que miR-221 favorece la
supervivencia celular y por lo tanto reduce la sensibilidad celular a BKM-120, aunque no
de manera tan marcada como para observarse su efecto respecto al control sin reactivos
de transfección.
Figura 16. Viabilidad de la línea celular HCC1954 en el séptimo día posterior a la transfección transitoria con
el microRNA mimético miR-221. Se midió la viabilidad celular por MTT. En el primer día posterior a la
transfección, se trataron las células transfectadas y no transfectadas con medio de cultivo con DMSO como
control, con Trastuzumab, con BKM-120 (1000nM, añadido en el cuarto día) y con la combinación de BKM-
120 con Trastuzumab. Abreviaturas: Control: células sin transfección Control Transf: control con reactivos
de transfección sin miRNA-221, BKM+T: combinación de BKM-120 con Trastuzumab. Se observa la viabilidad
celular respecto al control con medio de cultivo con DMSO. Las barras representan la desviación estándar de
3 réplicas. (Test T: *p<0,05 **p<0,01, *** p<0,001).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Control Control Transf. miR-221
Via
bili
dad
cel
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l co
ntr
ol
Control mediocon DMSO
Trastuzmab
BKM-120
BKM+T
**
RESULTADOS
48
Por otro lado, se incrementó significativamente la viabilidad de las células
transfectadas con miR-30b en presencia BKM-120, comparada con la viabilidad de las
células control (**p=0,004) y de las células del control de transfección (**p=0,007) (Fig.
17). De forma análoga, se observó una mayor viabilidad de las células transfectadas con
miR-30b y tratadas con BKM-120 combinado con Trastuzumab, respecto a las células del
control y del control de transfección tratadas con los mismos fármacos (Fig. 17). Estos
datos sugieren que miR-30b favorece en gran medida la supervivencia celular y por lo
tanto revierte el efecto de BKM-120 sobre la viabilidad de la línea celular HCC1954.
Figura 17. Viabilidad de la línea celular HCC1954 en el séptimo día posterior a la transfección transitoria con
el microRNA mimético miR-30b. Se midió la viabilidad celular por MTT. En el primer día posterior a la
transfección, se trataron las células transfectadas y no transfectadas con medio de cultivo con DMSO como
control, con Trastuzumab, con BKM-120 (1000nM, añadido en el cuarto día) y con la combinación de BKM-
120 con Trastuzumab. Abreviaturas: Control: células sin transfección Control Transf: control con reactivos
de transfección sin miRNA-30b, BKM+T: combinación de BKM-120 con Trastuzumab. Se observa la viabilidad
celular respecto al control con medio de cultivo con DMSO. Las barras representan la desviación estándar de
3 réplicas. (Test T: *p<0,05 **p<0,01, *** p<0,001).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
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Control Control Transf. miR-30b
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Control mediocon DMSO
Trastuzmab
BKM-120
BKM+T
**
**
**
**
RESULTADOS
49
Se observó también un incremento significativo (*p=0,04) en la viabilidad de las
células transfectadas con miR-21 tratadas con BKM-120 respecto a la viabilidad de las
células del control de transfección tratadas con el mismo inhibidor (Fig. 18). Estos
resultados sugieren también un posible papel de miR-21 sobre la supervivencia de la línea
celular HCC1954.
Figura 18 Viabilidad de la línea celular HCC1954 en el séptimo día posterior a la transfección transitoria con
el microRNA mimético miR-21. Se midió la viabilidad celular por MTT. En el primer día posterior a la
transfección, se trataron las células transfectadas y no transfectadas con medio de cultivo con DMSO como
control, con Trastuzumab, con BKM-120 (1000nM, añadido en el cuarto día) y con la combinación de BKM-
120 con Trastuzumab. Abreviaturas: Control: células sin transfección Control Transf: control con reactivos
de transfección sin miRNA-21, BKM+T: combinación de BKM-120 con Trastuzumab. Se observa la viabilidad
celular respecto al control con medio de cultivo con DMSO. Las barras representan la desviación estándar de
3 réplicas. (Test T: *p<0,05 **p<0,01, *** p<0,001).
0
0,2
0,4
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Control Control Transf. miR-21
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Control mediocon DMSO
Trastuzmab
BKM-120
BKM+T
*
DISCUSIÓN
50
5. DISCUSIÓN
Existe una creciente necesidad de estudiar los mecanismos de resistencia a
Trastuzumab del carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2, para mejorar la
respuesta a la terapia anti-HER2. Entre los mecanismos de resistencia, el más frecuente es
la activación constitutiva de la ruta PI3K/AKT/mTOR33. En paralelo, en los últimos años se
han desarrollado moléculas inhibidoras específicas de las proteínas PI3K, AKT y mTOR,
debido a su importancia en un amplio rango de malignidades. En el presente trabajo
hemos evaluado el uso de los inhibidores de la ruta de señalización PI3K/AKT (BKM-120,
MK-2206, GDC-0980 y Everolimus) como estrategia para revertir la resistencia a
Trastuzumab en líneas celulares con sobre-expresión de HER2 y resistencia primaria al
anticuerpo. Se evaluó el efecto de los inhibidores sobre la viabilidad celular, la
fosforilación de AKT y la expresión de micro-RNAs relacionados con la ruta PI3K/AKT.
5.1 Efecto de la Inhibición de PI3K con BKM-120
La inhibición de PI3K podría ser una estrategia válida para revertir la resistencia a
Trastuzumab debido a que la alteración más frecuente en carcinoma de mama HER2
positivo es la activación constitutiva de PI3K por mutaciones en su subunidad catalítica o
como consecuencia de la pérdida de su regulador negativo PTEN33.
En el presente trabajo, la inhibición de PI3K con BKM-120 potenció el efecto de
Trastuzumab en la línea celular HCC1954. La combinación de BKM-120 con Trastuzumab
fue significativamente más efectiva que BKM-120 por sí solo. La combinación de ambos
agentes mostró un mayor efecto sobre la viabilidad celular y menores niveles de
pAKTThr308 y pAKTSer473. Estos resultados coinciden con el estudio de Chakrabarty y
colaboradores, en donde se observó un efecto sinérgico de los inhibidores de PI3K: XL-147
y BKM-120 combinados con Trastuzumab en la misma línea celular10. La línea celular
HCC1954 tiene una mutación activadora en el dominio catalítico de PI3K4,10 como
mecanismo de resistencia a Trastuzumab. Por lo tanto, la inhibición de PI3K revierte la
resistencia al anticuerpo en esta línea celular.
DISCUSIÓN
51
Por otro lado, en las células HCC1569 con PTEN nulo4,10, la inhibición de PI3K con
BKM-120 redujo la viabilidad celular aunque el efecto no fue potenciado con
Trastuzumab. Otro estudio en líneas celulares de carcinoma de mama corrobora la
sensibilidad de la línea celular HCC1569 a la inhibición de PI3K con otro inhibidor: GDC-
094134, aunque no se evaluó el efecto combinado con Trastuzumab. Es relevante señalar
que en un trabajo en un panel de líneas celulares de carcinoma de mama, se determinó
que la sensibilidad celular a la inhibición de PI3K con GDC-0941, se correlaciona con
mutaciones en PI3K y amplificación de HER2 pero no con la pérdida de PTEN35. Estos
trabajos, junto con el nuestro, sugieren que aunque la línea celular HCC1569 es sensible a
la inhibición de PI3K, las células con mutaciones en PI3K como HCC1954, tienen mayor
sensibilidad a la inhibición de PI3K que las células con pérdida de PTEN.
Por otra parte, en nuestro estudio la inhibición de PI3K con BKM-120 potenció el
efecto de Trastuzumab en la línea celular HCC1954 con mutación en PI3K, pero no
potenció la actividad de Trastuzumab en la línea celular HCC1569, con pérdida de PTEN.
Posiblemente, esto se debe a que la actividad de PTEN es necesaria para la respuesta a
Trastuzumab17.
La actividad anti-proliferativa de Trastuzumab se da mediante varios mecanismos
independientes que contribuyen al bloqueo de PI3K14. Uno de ellos es la internalización y
degradación de HER29 que disminuye la activación de PI3K. Otro mecanismo es el
incremento en la actividad fosfatasa de PTEN que elimina un fosfato del mensajero PIP3, y
así evita que éste active a PI3K. Estos dos mecanismos de acción de Trastuzumab para
inactivar PI3K tienen lugar de forma independiente, siendo la activación de PTEN un
mecanismo inmediato y la degradación de HER2 un mecanismo que requiere varias
horas14. Por lo tanto, es posible que en la línea celular HCC1569, con PTEN nulo, no se
adicione el efecto de Trastuzumab sobre PTEN, a la inhibición de PI3K con BKM-120, y no
se observe un sinergismo de ambos agentes.
Otro hecho que podría influir en la menor sensibilidad de las células con PTEN nulo
a la inhibición de PI3K es el descrito por Jia y colaboradores en carcinoma de próstata.
DISCUSIÓN
52
Ellos han descrito que los tumores PTEN deficientes dependen preferencialmente de la
isoforma p110β de PI3K para su supervivencia13,36,37. En un modelo animal de carcinoma
de próstata y en líneas celulares del mismo, se observó que la tumorogénesis depende de
p110β y no de p110α37. Por lo tanto, es posible que el inhibidor BKM-120, por ser un
inhibidor de amplio espectro para varias isoformas de PI3K, tenga un menor efecto
específico sobre la isoforma p110β en carcinoma de mama y esto contribuya a una menor
actividad sobre las células HCC1569. Este posible hecho sobre BKM-120 mercería un
estudio más profundo.
En conjunto, estos resultados señalan que la inhibición de PI3K con BKM-120 no
fue efectiva para revertir la resistencia a Trastuzumab, en las células HCC1569, cuyo
mecanismo de resistencia al anticuerpo es la pérdida de PTEN.
En cuanto a la línea celular JIMT-1, la inhibición de PI3K con BKM-120 no redujo la
viabilidad celular, ni la fosforilación de AKT. Se ha señalado que en las células con sobre-
expresión de HER2 se encuentra activa preferencialmente la ruta PI3K/AKT, pero pueden
co-existir mutaciones en la ruta Raf/MEK/ERK13. Estas rutas interaccionan en varios niveles
y en respuesta a la inhibición de una de ellas13. Posiblemente, en esta línea celular existen
varias vías de señalización activas involucradas en la resistencia a Trastuzumab. En el
presente trabajo, al comparar los niveles basales de pAKTThr308 y pAKTSer473 de las líneas
celulares HCC1954 y JIMT-1, se observó que ambas tienen similares niveles de pAKTThr308,
pero HCC1954 tiene mayores niveles basales de pAKTSer473. Esto sugiere que la línea
celular HCC1954 mantiene activa AKT porque posiblemente depende de esta ruta para su
supervivencia, pero la línea celular JIMT-1 sólo activa AKT en función de las condiciones
celulares.
Adicionalmente, se observó que la fosforilación de pAKTSer473 aumentó en
presencia de BKM-120 y Trastuzumab en la línea celular JIMT-1. Se ha descrito que la
fosforilación de pAKTThr308 mediada por PDK1 depende de PI3K30, mientras que la
fosforilación de pAKTSer473 podría depender también de otras proteínas o de la auto-
fosforilación de AKT30. En consecuencia, la inhibición de PI3K en las células JIMT-1 reduce
DISCUSIÓN
53
pAKTThr308, dependiente de PI3K, pero a su vez esta inhibición podría activar rutas
compensatorias para mantener la actividad de AKT, incrementando la fosforilación de
pAKTSer473.
5.2 Efecto de la inhibición de AKT con MK-2206
La inhibición de AKT podría ser también una estrategia efectiva para revertir la
resistencia a Trastuzumab en un punto inferior a PI3K en la ruta PI3K/AKT. AKT se activa
en las células por acción de PI3K o por alteraciones propias de la proteína AKT, que
aunque con menor frecuencia, se han descrito en la resistencia a Trastuzumab17.
En este trabajo, la inhibición de AKT con MK-2206 afectó significativamente la
viabilidad de las tres líneas celulares, independientemente de las alteraciones presentes
en cada una de estas. Se confirmó la inactivación de AKT mediante Western Blot
observándose niveles reducidos de pAKTThr308 y pAKTSer473. Estos resultados coinciden con
un estudio en líneas celulares de carcinoma de mama con PTEN nulo o mutaciones en
PI3K, que detectó sensibilidad de estas células a la inhibición de AKT con MK-2206,
comparadas con líneas celulares con alteraciones en la ruta Raf/MEK/ERK que fueron
resistentes a MK-220638.
Se observó en el presente trabajo que MK-2206 fue más efectivo que el inhibidor
de PI3K, BKM-120 sobre la viabilidad de las tres líneas celulares. Por lo tanto, se podría
inferir que la inhibición de AKT tiene un mayor efecto anti-proliferativo que la inhibición
de PI3K. Esto posiblemente se debe a que la activación de AKT depende también de otras
rutas de supervivencia celular. Por lo tanto, la inhibición de PI3K no es suficiente para
inactivar AKT que puede reactivarse por interacción con otras proteínas. En consecuencia,
la inhibición de AKT con MK-2206, bloquea la posible activación de AKT por otras rutas de
señalización celular y reduce la viabilidad celular.
Adicionalmente, en este trabajo se determinó que la inhibición de AKT con MK-
2206 no potenció la actividad de Trastuzumab en las tres líneas celulares. Probablemente,
DISCUSIÓN
54
esto sucede porque el efecto de Trastuzumab en última instancia es la inactivación de AKT
y MK-2206 directamente realiza esta función en las células.
En este sentido, en un estudio clínico en fase I, en tumores sólidos HER2 positivos
que progresaron inicialmente con Trastuzumab, se observó una mejor respuesta y
tolerabilidad de los pacientes frente al tratamiento con MK-2206 combinado con
Trastuzumab, aunque no se concluyó si su efectividad es mayor, comparada con la del
inhibidor sólo 39.
5.3 Efecto de la inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980
El inhibidor dual de PI3K y mTOR, GDC-0980 redujo significativamente la viabilidad
celular de las tres líneas celulares. Esto sugiere que independientemente del mecanismo
de resistencia presente en las líneas celulares resistentes a Trastuzumab, la inhibición de
la ruta PI3K/AKT en varios niveles es más efectiva debido a que suprime los bucles de
reactivación y la intercomunicación con otras vías de señalización celular.
GDC-0980 potenció la actividad de Trastuzumab e inhibió la fosforilación de AKT en
la línea celular HCC1954, subrayando que la inhibición de PI3K revierte la resistencia al
anticuerpo en las células con mutaciones activadoras en PI3K. Adicionalmente, en un
estudio se determinó que el boqueo de mTORC1 fue también efectivo en líneas celulares
de carcinoma de mama con mutaciones en PI3K13. Por lo tanto, la inhibición dual de PI3K y
mTOR tiene un efecto sustancial sobre la línea celular HCC1954.
Por otro lado, un estudio determinó que las células de carcinoma de mama con
mutaciones activadoras en PI3K estimulan la producción de ligandos de los receptores de
la familia HER para asegurar su activación y la de AKT33. Uno de esos ligandos es la
heregulina, que induce la formación de hetero-dímeros HER2/HER3. En el mismo estudió
se observó que al tratar las células con otro inhibidor dual de PI3K y mTOR: BEZ235, se
eliminó la expresión de heregulina, la formación de hetero-dímeros HER2/HER3 y en
consecuencia disminuyó la supervivencia celular33. A pesar de que no se ha estudiado aún
este posible efecto del inhibidor usado en nuestro estudio: GDC-0980, análogo a BEZ235,
DISCUSIÓN
55
este podría ser un efecto sinérgico adicional del inhibidor GDC-0980 sobre la línea celular
HCC1954.
En conjunto estos resultados sugieren que la inhibición simultánea de PI3K y mTOR
afecta considerablemente la viabilidad celular de células resistentes a Trastuzumab y
potencia la actividad del anticuerpo en la línea celular HCC1954 con mutación en PI3K.
Un efecto diferente se observó en línea celular JIMT-1, en donde la viabilidad
celular disminuyó pero pAKTSer473 se incrementó en presencia de GDC-0980 y
Trastuzumab. Este hecho podría resultar de la activación de rutas compensatorias que
mantienen la fosforilación de AKT15, como se ha mencionado anteriormente. Se conoce
que mTORC2 induce la fosforilación de pAKTSer473 40, considerando que GDC-0980 actúa
sobre mTORC1 pero no sobre mTORC2, podría ser que mTORC2 aumente la fosforilación
de pAKTSer473 en esta línea celular. Adicionalmente, en pacientes con tumores sólidos y en
líneas celulares se ha observado que la inhibición de mTOR reactiva la vía Raf/MEK/ERK13 y
esto a su vez podría reactivar AKT por inter-señalización. Sin embargo, aunque se
mantenga la fosforilación de pAKTSer473, como se ha mencionado, GDC-0980 inhibe
también mTOR proteína en donde convergen ambas rutas de señalización13 y esto afecta
finalmente la supervivencia de la línea celular JIMT-1.
5.4 Efecto de la inhibición de mTOR con Everolimus
Por otro lado, la inhibición de mTOR con Everolimus afectó la viabilidad celular de
las tres líneas en estudio y redujo la fosforilación de AKT. Sin embargo, Everolimus fue
menos efectivo que los demás inhibidores, en reducir la viabilidad celular. El menor efecto
de Everolimus podría explicarse porque éste inhibe mTORC1 pero no mTORC2, cómo se ha
mencionado antes, mTORC2 reactiva la ruta PI3K/AKT, fosforilando AKT17,33. A su vez la
inhibición de mTORC1 ejerce un bucle de reactivación de la ruta mediante PI3K. Al inhibir
mTORC1 se inhibe también el sustrato de éste S6K1. Este último regula negativamente a
PI3K. S6K1 fosforila el sustrato del receptor de insulina: IRS-1, y así impide la activación de
PI3K por acción del receptor de insulina17,19. En consecuencia, la inhibición de mTORC1
con Everolimus puede bloquear la regulación negativa de PI3K, induciendo su re-
DISCUSIÓN
56
activación17. Este hecho podría explicar a su vez el mejor efecto del inhibidor dual de PI3K
y mTOR, GDC-0980 sobre la viabilidad de las líneas celulares.
Everolimus no presentó una actividad sinérgica con Trastuzumab en ninguna de las
líneas celulares estudiadas. Estos resultados contrastan con otros trabajos que
determinaron un efecto sinérgico de Everolimus con Trastuzumab en pacientes de
carcinoma de mama con resistencia al anticuerpo33,41. El efecto sinérgico Everolimus con
Trastuzumab se debe a que mTOR puede ser modulado también por la proteína quinasa C,
de forma independiente de AKT. Por lo tanto, Trastuzumab, que inactiva AKT, por sí solo
no puede inhibir totalmente mTOR y requiere de Everolimus para mejorar la respuesta al
tratamiento41.
5.5 Efecto de la inhibición de MEK 1/2 con GSK en la línea celular JIMT-1
El inhibidor de MEK1/2, GSK sólo o combinado con Trastuzumab, no mostró un
efecto mayor que los inhibidores de la ruta PI3K/AKT, sobre la viabilidad de la línea celular
JIMT-1. Por lo tanto, es posible que la resistencia a Trastuzumab tampoco dependa
directamente de la ruta Raf/MEK/ERK en la línea celular JIMT-1. Posiblemente, esta línea
celular no depende de una sola ruta para su supervivencia. Al combinar el inhibidor de
AKT, MK-2206 con GSK se observó una menor viabilidad celular que con cada uno de los
inhibidores por separado; sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente
significativas.
Es posible también que la resistencia a Trastuzumab en la línea celular JIMT-1 se
deba a la activación de una proteína que anteceda a las rutas PI3K/AKT y Raf/MEK/ERK y
active a ambas o una de las dos, dependiendo de las condiciones celulares. Un estudio en
líneas celulares de carcinoma de mama, resistentes a Trastuzumab, señala que los
inhibidores de PI3K no tienen efecto sobre las células con activación aberrante de Src15. En
nuestro estudio el inhibidor de PI3K, BKM-120 no mostró efecto sobre la viabilidad de la
línea celular JIMT-1. Por esta razón, especulamos que es posible que la proteína quinasa
Src se encuentre activa en esta línea celular y sea posiblemente responsable de la
DISCUSIÓN
57
resistencia al anticuerpo. Como se ha mencionado antes, Src se activa por interacción
directa con HER2 y se ha identificado como una proteína nodal, que puede activar las
rutas PI3K/AKT y MEK/ERK15 y causar resistencia a Trastuzumab.
Adicionalmente, en la bibliografía se ha descrito la sobre-expresión de la mucina
MUC4 en la línea celular JIMT-112. Se cree que MUC4 impide la unión de Trastuzumab al
receptor HER212, y se ha señalado también que MUC4 es una unidad oncogénica que
activa HER2, estabiliza el hetero-dímero HER2/HER3 y activa las rutas PI3K/AKT y
Raf/MEK/ERK42. Por lo tanto, en esta línea celular es necesario profundizar el estudio del
mecanismo de resistencia a Trastuzumab para identificar una diana terapéutica clave.
5.6 Efecto de Trastuzumab sobre la fosforilación de AKT y ERK1/2
En cuanto a Trastuzumab, como era de esperarse, éste no afectó la viabilidad de
las tres líneas celulares HCC1954, HCC1569 y JIMT-1 identificadas como resistentes. Por
otro lado, se observó una disminución de la fosforilación de AKT en las líneas celulares,
especialmente de pAKTThr308. Esto sugiere que Trastuzumab puede reducir un poco la
fosforilación de pAKTThr308, dependiente de PI3K, en las células resistentes, pero requiere
de un mecanismo de respuesta de las células para reducir también la fosforilación de
AKTSer473 y así inactivar completamente a AKT. Por lo tanto, es necesaria la inactivación
completa de AKT, es decir tanto de pAKTThr308 como de AKTSer473, para afectar la viabilidad
celular.
Existen estudios que señalan que Trastuzumab impide la formación de hetero-
dímeros HER2/HER3, independiente de ligando, y bloquea principalmente la formación de
homo-dímeros HER2. Los homo-dímeros HER2 activan selectivamente la ruta de
señalización Ras/MEK/ERK18, mientras que los hetero-dímeros HER2/HER3 activan a Src y
en mayor medida a la ruta PI3K/AKT. En la línea celular JIMT-1, Trastuzumab disminuyó los
niveles de pERK1/2. Probablemente en esta línea celular se encuentren presentes tanto
hetero-dímeros HER2/HER3 como homo-dímeros HER2 que activan la ruta Ras/MEK/ERK.
En consecuencia, Trastuzumab reduciría la fosforilación de pERK1/2, al inhibir los homo-
DISCUSIÓN
58
dímeros HER2, pero la presencia de hetero-dímeros HER2/HER3 activaría la ruta PI3K y Src
para asegurar la supervivencia celular.
En conjunto estos resultados podrían sugerir que el uso de inhibidores de la ruta
PI3K/AKT es efectivo en líneas celulares con diferentes mecanismos de resistencia a
Trastuzumab y que por lo tanto podría ser efectiva la monoterapia con los inhibidores. Sin
embargo, varios estudios destacan la necesidad de combinar un inhibidor de la ruta
PI3K/AKT con un inhibidor de HER2 para mejorar la terapia anti-tumoral. En células con
carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2, la inhibición de PI3K/AKT induce la
activación de otros receptores tirosina quinasa, principalmente HER3, que pueden
interactuar con HER2 y reactivar la ruta o activar rutas paralelas como Raf/MEK/ERK. Por
esta razón es necesario combinar los inhibidores de la ruta PI3K/AKT con inhibidores de
los receptores tirosina quinasa20,36. Se ha observado en un estudio que la combinación de
los inhibidores de PI3K: XL147 o BKM-120, con Trastuzumab en células resistentes al
anticuerpo, disminuye la reactivación de HER3 como respuesta a la inhibición de PI3K20. En
particular, en las líneas celulares con sobre-expresión de HER2 y PTEN nulo es necesario el
uso de Trastuzumab, ya que estas dependen fuertemente de la activación de HER236.
5.7 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
microRNAs oncogénicos y supresores tumorales
Un elemento a estudiar es el hecho de que la activación de la ruta PI3K/AKT en
células resistentes a Trastuzumab no sólo se debe a mutaciones de las proteínas, sino
también a alteraciones epigenéticas de la ruta10. En este sentido los microRNAs han
demostrado tener un papel importante en las mencionadas alteraciones y en la
carcinogénesis24.
Considerando le heterogeneidad tumoral, la presencia de múltiples mutaciones y
las posibles interacciones entre las rutas de señalización celular, la inhibición de una sola
diana no es la mejor estrategia para eliminarlos. Es por esta razón que es de gran interés
DISCUSIÓN
59
el estudio de los microRNAs asociados a la ruta PI3K/AKT y a la resistencia a Trastuzumab,
ya que estos regulan la expresión de varios genes simultáneamente, y en ocasiones
relacionados con la misma ruta22. En el presente trabajo hemos determinado los cambios
de expresión de microRNAs asociados a la ruta PI3K/AKT y a la resistencia a Trastuzumab,
en respuesta al tratamiento con los inhibidores de la ruta.
Además de reducir la viabilidad celular y la fosforilación de AKT, los inhibidores de
PI3K, AKT y mTOR indujeron cambios de expresión de microRNAs relacionados con la
resistencia a Trastuzumab por modulación de la ruta de señalización HER2/PI3K.
5.7.1 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
miR-21 y miR-221
En general, los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR: BKM-120, MK-2206, GDC-
0980 y Everolimus solos y en combinación con Trastuzumab redujeron la expresión miR-
21, en las líneas celulares HCC1954 y HCC1569.
En la línea celular JIMT-1, la expresión de miR-21 no se alteró en presencia de los
inhibidores, disminuyendo únicamente en presencia de GDC-0980 combinado con
Trastuzumab. Esta disminución coincide en cierta medida con los resultados de viabilidad
celular de estas células, en donde GDC-0980 tuvo un mayor efecto que los demás
inhibidores, sobre la viabilidad celular.
De igual forma la disminución de la expresión de miR-21 en las líneas celulares
HCC1954 y HCC1569 coinciden con una reducción de la viabilidad celular. Por el contrario
al incrementar la expresión de miR-21 en la línea celular HCC1954, con un miRNA
mimético, se observó un incremento significativo de la viabilidad celular respecto a las
células sin transfectar, en presencia del inhibidor BKM-120. Estos resultados sugieren que
miR-21 favorece la supervivencia celular aún en presencia de inhibidores de la ruta PI3K,
recalcando su posible papel oncogénico y su relación con la resistencia a Trastuzumab. En
este sentido, Han y colaboradores determinaron, en líneas celulares de carcinoma de
mama, que miR-21 reduce la expresión de PTEN, activa las vías PI3K/AKT, MEK/ERK e
DISCUSIÓN
60
incrementa la proliferación, migración e invasión celular dependiente de estas vías43.
Varios estudios confirman a PTEN como diana de miR-2132,44-47. Adicionalmente, un
estudio en células de carcinoma de mama, señaló que la expresión de miR-21 se
incrementó a medida que se inducía resistencia a Trastuzumab y que el bloqueo de miR-
21 sensibilizó a las células al anticuerpo23.
Considerando que la pérdida de PTEN en carcinoma de mama con sobre-expresión
de HER2 se debe a mutaciones, sólo en el 3% de los casos24, es posible que en la línea
celular HCC1569, la sobre-expresión de microRNAs que modulan PTEN como miR-21, sean
la causa de la pérdida de PTEN. En el presente trabajo se observó que BKM-120, MK-2206
solos o combinados con Trastuzumab, y GDC-0980 y Everolimus combinados con
Trastuzumab, disminuyeron en gran medida la expresión de miR-21, en esta línea celular.
En conjunto, estos resultados sugieren que los inhibidores de la ruta
PI3K/AKT/mTOR reducen la expresión de miR-21, en las líneas celulares en estudio y que a
su vez miR-21 podría estar relacionado con una mayor viabilidad celular y resistencia a
Trastuzumab.
En cuanto a miR-221, en las líneas celulares JIMT-1 y HCC1954 se redujo su
expresión en presencia de BKM-120, MK-2206, GDC-0980 y Everolimus combinados con
Trastuzumab, en mayor medida que con los inhibidores solos. Esto sugiere un papel clave
de miR-221 en la resistencia a Trastuzumab. En este sentido, Ye y colaboradores
identificaron altos niveles de miR-221 en líneas celulares de carcinoma de mama
resistentes a Trastuzumab24. Otro estudio detectó sobre-expresión de miR-221 en tejidos
de pacientes con carcinoma de mama. En el mismo estudio, se observó una mayor
proliferación celular y capacidad de invasión de líneas celulares transfectadas con miR-
22148. En el presente trabajo se observó un incremento de la viabilidad en las células
HCC1954 transfectadas con miR-221 respecto de las células no transfectadas,
especialmente en presencia de BKM-120 combinado con Trastuzumab. En conjunto, estos
estudios y nuestro trabajo recalcan la idea de que miR-221 es clave en la supervivencia y
resistencia a Trastuzumab en las líneas celulares estudiadas.
DISCUSIÓN
61
Adicionalmente, varios estudios han confirmado a PTEN como diana de miR-
22124,31. Otra diana validada de miR-221 es el regulador del ciclo celular p27kip, sugiriendo
un efecto anti-apoptótico de miR-221, independiente de la regulación de PTEN49. Se ha
descrito que la infra-expresión de p27kip y su secuestro en el citoplasma por AKT, están
relacionados con la resistencia a Trastuzumab4,9,49. Por lo tanto, miR-221 tiene un papel
importante en la modulación de la resistencia al anticuerpo no sólo por regulación de
PTEN, sino también de otras dianas como p27kip.
Como se ha mencionado anteriormente, estos estudios en conjunto con nuestros
resultados subrayan la importancia de la modulación de miR-221 para revertir la
resistencia a Trastuzumab.
5.7.2 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
miR-26a y miR-30b
La expresión de miR-26a y miR-30b disminuyó en presencia de los inhibidores de la
ruta PI3K/AKT/mTOR en las tres líneas celulares en estudio, coincidiendo con una menor
viabilidad celular. En la línea celular JIMT-1 se observaron menores niveles de expresión
de miR-30b en presencia de Trastuzumab combinado con MK-2206 y GDC-0980 que con
los inhibidores solos. Estos resultados sugieren que miR-26a y miR-30b podrían tener un
papel oncogénico en estas células resistentes a Trastuzumab, antagónico al que tienen en
células sensibles al anticuerpo, en las que miR-26a y miR-30b incrementaron su expresión
en respuesta al tratamiento con Trastuzumab según Ichikawa y colaboradores25.
Se considera que la desregulación de miR-26a depende del tipo celular ya que
actúa como microRNA oncogénico o supresor de tumores en diferentes tipos de cáncer.
En carcinoma pancreático y de mama, miR-26a tiene un papel supresor de tumores ya que
reduce la expresión de ciclinas como CDK2 y por lo tanto impide la proliferación
celular50,51. Al contrario, en un estudio en carcinoma de ovario, altos niveles de miR-26a
en tejidos y líneas celulares, se correlacionaron con una mayor proliferación celular52. En
carcinoma de pulmón, miR-26a se detectó sobre-expresado en tumores metastásicos e
infra-expresado en tumores primarios. En el mismo estudio se determinó que miR-26a no
DISCUSIÓN
62
afecta la proliferación celular, pero incrementa la migración e invasión celular, mediante
regulación de PTEN y la vía PI3K/AKT53. Estos estudios sugieren un papel oncogénico de
miR-26a en algunos tipos de cáncer y coinciden con nuestros resultados en las tres líneas
celulares de carcinoma de mama, en donde se observó que la disminución de la expresión
de miR-26a, por acción de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT, concuerda con una menor
viabilidad celular. Es posible que el papel oncogénico de miR-26a en las líneas celulares de
nuestro trabajo esté relacionado con la modulación de PTEN.
En cuanto a miR-30b, éste disminuyó en presencia de los inhibidores de la ruta
PI3K/AKT/mTOR en las tres líneas celulares de nuestro estudio, coincidiendo con una
menor viabilidad celular. En este sentido, un estudio en líneas celulares de carcinoma de
pulmón, determinó que la expresión tanto de miR-30b como de miR-221, depende de la
activación de EGFR y MET54. Considerando que EGFR y MET activan, entre otras rutas de
señalización, la ruta PI3K/AKT/mTOR54, es lógico que los inhibidores de esta ruta reduzcan
los niveles de expresión de miR-30b y miR-221, tal y como se observó en nuestro estudio.
Adicionalmente, el mismo estudio en carcinoma de pulmón determinó que miR-30b y
miR-221 reducen la expresión de las proteínas pro-apoptóticas BIM y APAF-154, señalando
su papel oncogénico. Otro estudio relacionó a miR-30b con la resistencia a inhibidores de
receptores tirosina quinasa, en muestras de pacientes con carcinoma de pulmón55.
Aunque las funciones de los microRNAs dependen del tipo celular, en conjunto estos
datos sugieren que miR-30b, podría tener un papel oncogénico también en las líneas
celulares de carcinoma de mama de nuestro estudio, resistentes a Trastuzumab. En el
presente trabajo se observó que al sobre-expresar miR-30b en la línea celular HCC1954, se
aumentó significativamente la viabilidad celular de las células transfectadas con miR-30b,
respecto a las células no transfectadas, en presencia del inhibidor BKM-120 y de su
combinación con Trastuzumab. Esto sugiere que efectivamente miR-30b favorece la
supervivencia celular. Por lo tanto, la reducción de la expresión de miR-30b en presencia
de los inhibidores PI3K, podría contribuir a revertir la resistencia a Trastuzumab en estas
líneas celulares.
DISCUSIÓN
63
Considerando el estudio antes mencionado de Ichikawa y colaboradores, que
identifica a miR-30b como un micro-RNA de respuesta a Trastuzumab en líneas celulares
sensibles al anticuerpo25, es relevante lo encontrado en el presente estudio. Nuestros
resultados sugieren a miR-30b como un posible responsable de la resistencia a
Trastuzumab, por lo tanto podrían existir funciones antagónicas de miR-30b entre líneas
celulares resistentes y sensibles a Trastuzumab. Adicionalmente, estos resultados
subrayan que el papel de los microRNAs depende del contexto celular y proponen a miR-
30b como un microRNA importante en la supervivencia celular y la resistencia a
Trastuzumab.
5.7.3 Efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR sobre la expresión de
miR-491-5p y miR-342-5p
En un estudio con líneas celulares de carcinoma de mama resistentes a
Trastuzumab se determinó que miR-491-5p y miR-342-5p reducen los niveles de HER2, la
fosforilación de AKT y ERK, la proliferación celular e inducen apoptosis22. Ambos
microRNAs se detectaron infra-expresados tanto en las líneas celulares, como en tumores
de mama de pacientes con sobre-expresión de HER2 y resistencia a Trastuzumab22. En el
presente trabajo, en la línea celular HCC1954, miR-491-5p mostró un patrón de expresión
que coincide con el estudio mencionado. Los niveles de expresión de miR-491-5p
aumentaron en presencia de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT y el incremento de la
expresión de miR-491-5p concuerda con una menor viabilidad celular en presencia de los
mismos inhibidores.
Por otro lado, en las líneas celulares HCC1569 y JIMT-1 el patrón de expresión de
miR-491-5p en presencia de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT fue muy variable. En la
línea celular HCC1569, la expresión de miR-491-5p aumentó únicamente en presencia de
GDC-0980 y disminuyó en presencia de MK-2206, aunque ambos inhibidores reducen la
viabilidad de estas células. De igual forma en la línea celular JIMT-1, se observó una
disminución de la expresión de miR-491-5p en presencia GDC-0980 y BKM-120
DISCUSIÓN
64
combinados con Trastuzumab, pese a que BKM-120 no redujo la viabilidad celular y GDC-
0980 si lo hizo. Por lo tanto, no se encontró un patrón de cambios en la expresión de miR-
491-5p concluyente en estas líneas celulares.
miR-491-5p ha sido poco estudiado, trabajos previos lo relacionan con EGFR y
recalcan su papel como supresor de tumores en células de glioblastoma56. Otro estudio
determinó que miR-491-5p induce apoptosis e inhibe la ruta PI3K/AKT, pero no la ruta
Raf/MEK/ERK en células de carcinoma pancreático57. Los estudios realizados junto con los
resultados de nuestro trabajo en la línea celular HCC1954 sugieren que miR-491-5p
tendría un papel supresor de tumores en esta línea celular y su modulación podría
favorecer la actividad terapéutica de Trastuzumab.
Por otro lado, miR-342-5p no fue detectable en las líneas celulares HCC1954 y
JIMT-1, sugiriendo que posiblemente este microRNA se encuentre infra-expresado en
estas líneas celulares. En la línea celular HCC1569, la expresión de miR-342-5p disminuyó
en presencia de BKM y GDC-0980. Pérez-Rivas y colaboradores identificaron a miR-342-5p
como un biomarcador de recurrencia en carcinoma de mama cuando se encuentra infra-
expresado y sugirieron a AKT como una posible diana de este microRNA58. En conjunto,
estos resultados sugieren que miR-342-5p podría tener un papel supresor de tumores,
aunque en el presente trabajo no se hayan encontrado datos concluyentes que soporten
esa hipótesis.
En cuanto a Trastuzumab, éste no afectó los niveles de expresión de los microRNAs
en la línea celular HCC1569. En la línea celular HCC1954, Trastuzumab incrementó la
expresión de miR-491-5p. En la línea celular JIMT-1, el anticuerpo incrementó la expresión
de miR-21 y miR-491-5p y disminuyó la expresión de miR-221 y miR-26a.
En conjunto estos resultados sugieren que la inhibición de la ruta PI3K/AKT/mTOR
puede regular la expresión de microRNAs asociados a procesos de supervivencia,
apoptosis y resistencia a Trastuzumab en las células estudiadas. En general, los inhibidores
DISCUSIÓN
65
de la ruta PI3K/AKT/mTOR reducen la expresión de miR-21, miR-221, miR-26a y miR-30b.
Asimismmo la sobre-expresión de miR-221, miR-30b y miR-21 incrementa la viabilidadde
la línea celular HCC1954. Por lo tanto, estos microRNAs podrían tener un papel
oncogénico y estar relacionados con la resistencia Trastuzumab. Por el contrario miR-491-
5p tendría un papel supresor de tumores en las líneas celulares resistentes a Trastuzumab.
En este contexto, la modulación, tanto de la ruta, como de los microRNAs resultaría
interesante para mejorar la respuesta a la terapia anti-HER2.
Considerando, que la inhibición de la ruta PI3K/AKT/mTOR altera la expresión de
microRNAs, podría plantearse que estos microRNAs regulan la ruta, pero a su vez son
regulados por la misma. En un estudio se ha comprobado un bucle de expresión de miR-22
el cuál activa AKT pero a su vez depende de este para mantener su expresión59. En este
sentido, el uso de inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR para revertir la resistencia a
Trastuzumab en líneas celulares de carcinoma de mama con sobre-expresión de HER2, no
sólo inhibe la ruta de señalización, sino que induce cambios a nivel epigenético con una
importante actividad anti-proliferativa. A su vez, estos inhibidores han destacado la
importancia de profundizar en el estudio de los microRNAs asociados a la resistencia a
Trastuzumab para mejorar la terapia.
CONCLUSIONES
66
6. CONCLUSIONES
6.1 Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR: BKM-120, MK-2206, GDC-0980 y
Everolimus afectaron la viabilidad celular de las líneas celulares de carcinoma de
mama con sobre-expresión de HER2, resistentes a Trastuzumab: HCC1954, HCC1569 y
JIMT-1. El efecto de los inhibidores de la ruta PI3K/AKT fue mayor sobre la línea celular
HCC1954 con mutación PI3K, que sobre la línea celular HCC1569 con pérdida de PTEN
y sobre la línea celular JIMT-1, que posiblemente tiene alteraciones en otras rutas de
señalización como mecanismo de resistencia a Trastuzumab.
6.2 La inhibición de PI3K con BKM-120 no resultó ser efectiva en la línea celular JIMT-1, y
fue menos efectiva en la línea celular HCC1569, sugiriendo que la estrategia de
inhibición de PI3K en células resistentes a Trastuzumab funciona mejor cuando el
mecanismo celular de resistencia al anticuerpo es la presencia de mutaciones en PI3K,
como en la línea celular HCC1954.
6.3 Tanto el inhibidor de PI3K, BKM-120, como el inhibidor dual de PI3K y mTOR, GDC-
0980 demostraron un efecto sinérgico con Trastuzumab en la línea celular HCC1954.
La combinación de estos inhibidores con Trastuzumab fue más efectiva que cada
fármaco por separado, sobre la viabilidad de esta línea celular. Por lo tanto, BKM-120 y
GDC-0980 pueden revertir la resistencia a Trastuzumab en las células HCC1954.
6.4 La inhibición de AKT con MK-2206 fue más efectiva que la inhibición de PI3K en las tres
líneas celulares resistentes a Trastuzumab, aunque este inhibidor no mostró
sinergismo con Trastuzumab.
6.5 La inhibición dual de PI3K y mTOR con GDC-0980 demostró ser la estrategia más
efectiva para reducir la viabilidad de las tres líneas celulares resistentes a
Trastuzumab, independientemente de sus mecanismos de resistencia al anticuerpo.
Esto subraya que la inhibición de mTOR es efectiva por ser un punto de convergencia
CONCLUSIONES
67
de varias rutas de señalización. Adicionalmente, la inhibición dual de PI3K y mTOR
evita la reactivación de la ruta, que se observó con el inhibidor de mTOR, Everolimus.
6.6 La línea celular JIMT-1 demostró menor sensibilidad a los inhibidores de la ruta
PI3K/AKT estudiados, y tampoco fue sensible al inhibidor de MEK1/2, GSK. La
combinación de MK-2206 y GSK redujo en mayor medida la viabilidad celular de las
células JIMT-1. Por lo tanto, esta línea celular tiene posiblemente alteraciones en
varias rutas de señalización o en una proteína upstream de las rutas PI3K/AKT y
MEK/ERK que aseguran su supervivencia.
6.7 La menor efectividad de los inhibidores BKM-120, MK-2206, GDC-0980 y Everolimus
para revertir la resistencia a Trastuzumab en la línea celular HCC1569, con ausencia de
PTEN, subraya la importancia de la actividad fosfatasa de PTEN en la respuesta a
Trastuzumab.
6.8 La fosforilación de pAKTSer473 y pAKTThr308 disminuyó en presencia de los inhibidores de
la ruta PI3K/AKT/mTOR: BKM-120, MK-2206, GDC-0980 y Everolimus en la línea celular
HCC1954, en concordancia con una menor viabilidad celular. En la línea celular JIMT-1
la inhibición directa de AKT con MK-2206 y la inhibición de mTOR con Everolimus
redujo la fosforilación de AKT y la viabilidad celular.
6.9 Trastuzumab redujo los niveles de pAKTThr308, pero no redujo los niveles de pAKTSer473
en la línea celular HCC1954. Por lo tanto, es necesaria la inactivación completa de AKT
(pAKTSer473 y pAKTThr308) para reducir la viabilidad celular en la línea celular HCC1954
que depende de la ruta PI3K. En el caso de la línea celular JIMT-1 Trastuzumab redujo
los niveles de ambos, pAKTSer473 y pAKTThr308, pero esto no se reflejó en la viabilidad
celular, subrayando que posiblemente esta línea celular tiene otros mecanismos de
supervivencia paralelos.
CONCLUSIONES
68
6.10 Los inhibidores de la ruta PI3K/AKT: BKM-120, MK-2206, GDC-0980 y Everolimus
combinados con Trastuzumab influyeron en la expresión de microRNAs relacionados
con la ruta en las líneas celulares estudiadas. Los inhibidores incrementaron la
expresión de miR-491-5p que podría tener un efecto supresor de tumores en la línea
celular HCC1954. Por otro lado, se redujo la expresión de miR-21, miR-221, miR-26a y
miR-30b en presencia de los fármacos. Adicionalmente, la sobre-expresión de miR-
221, miR-30b y miR-21 en la línea celular HCC1954 incrementó la viabilidad celular,
subrayando su posible papel oncogénico e implicación en la resistencia a Trastuzumab,
en especial de miR-30b. En consecuencia, es fundamental profundizar el estudio de
estos microRNAs en las células de carcinoma de mama resistentes a Trastuzumab, que
permitan en el futuro plantear estrategias terapéuticas que contemplen su
modulación.
6.11 Finalmente, la terapia anti-HER2 tiene una ventaja sobre las moléculas que actúan
directamente sobre vías de señalización celular, ya que afectará en mayor medida a las
células que sobre-expresen HER2. Esto permite, en cierta medida, direccionar el
tratamiento hacia las células tumorales con sobre-expresión de HER2 y disminuir los
efectos secundarios. Por lo tanto, es importante el estudio de moléculas que puedan
ser administradas en conjunto con Trastuzumab, como los inhibidores de la ruta
PI3K/AKT/mTOR evaluados en este trabajo. Adicionalmente, el estudio de los
microRNAs relacionados con la resistencia a Trastuzumab, abre una posibilidad
terapéutica de combinar sintéticamente al anticuerpo anti-HER2 con antagonistas de
los micro-RNAs oncogénicos o miméticos de los micro-RNAs supresores de tumores
para direccionar estas moléculas a las células con sobre-expresión de HER2 y mejorar
la efectividad del tratamiento.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
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