JORGE PEREIRA DA SILVA

ESTUDO ULTRAESTRUTURAL E IMUNOLÓGICO DA RELAÇÃO PARASITA-HOSPEDEIRO NA CROMOBLASTOMICOSE.

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOFÍSICA “CARLOS CHAGAS FILHO” PROGRAMA NACIONAL DE COOPERAÇÃO ACADÊMICA

PROCAD/CAPES – UFRJ/UENF/UFPA.

TESE DE DOUTORADO

Estudo ultraestutural e imunológico da relação parasita-hospedeiro na

cromoblastomicose.

Aluno: Jorge Pereira da Silva

Orientadora: Sonia Rozental

Co-orientador:

Cláudio Guedes Salgado

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de pós-graduação em Ciências Biológicas – Biofísica, IBCCF, CCS, UFRJ, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).

Rio de Janeiro, RJ. Outubro - 2006

Silva, Jorge Pereira da

Estudo ultraestrutural e imunológico da relação parasita – hospedeiro na

cromoblastomicose. Rio de Janeiro, UFRJ, IBCCF, 2006.

Tese: Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).

1. Células de Langerhans 2. Relação fungo-hospedeiro

3. Cromoblastomicose 4. Fonsecaea pedrosoi

5. TGF-β 6. Modulação Th1-Th2

I - Universidade Federal do Rio de Janeiro

II - Título

iv

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular de Fungos do Instituto de Biofísica “Carlos Chagas Filho” da Universidade Federal do Rio de Janeiro e no Laboratório de Dermato-Imunologia da Universidade Estadual e Universidade Federal do Pará, Secretaria Estadual de Saúde Pública do Pará, sob a orientação da Profª. Drª. Sônia Rozental e Co-orientado pelo Profº. Dr. Cláudio Guedes Salgado.

v

Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida, minha esposa Ruth Léa e ao meu filho Gustavo Lara.

vi

AGRADECIMENTOS À Profª. Drª. Sônia Rozental, pela orientação, por acreditar neste trabalho e pelo acompanhamento de minha trajetória de capacitação desde o Mestrado. Ao Profº. Dr. Cláudio Guedes Salgado, pela co-orientação, pela amizade, respeito profissional nas minhas atividades no LDI e paciência durante este trabalho. Aos Professores Doutores Wanderley de Souza e Cristóvam W. Picanço Diniz por viabilizar esta modalidade de capacitação, pelo sucesso do MINTER e PROCAD. Aos Doutores Jorge Travassos e Edvaldo Loureiro, ex-Diretores do Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, por permitir a realização de parte desta Tese nos laboratórios do IEC. Ao Dr. Manoel do C. P. Soares, Chefe do Setor de Microscopia do IEC, por disponibilizar o setor para as imagens eletrônicas e pelo incentivo constante a realização deste trabalho. Ao Mestre José Antonio P. Diniz Jr., pela amizade, pela cooperação, pela disponibilidade em ajudar, pois este trabalho só foi possível devido sua dedicada colaboração. À Drª Celuta Alviano, pelo incentivo, pela explosão de alegria e carinho, estimulo e apoio por toda esta minha caminhada rumo a capacitação, desde o Mestrado. À Drª Rosângela Soares pela amizade, paciência em ouvir minhas angústias, incentivo durante todo o tempo de minha busca à capacitação, iniciada no Mestrado. Às Professoras Doutoras, Narcisa, Márcia Attias, Técia, Thaís Souto-Padron, pelo carinho com que me receberam no Laboratório Hertha Mayer, desde o meu Mestrado. Ao Mestre Moisés Batista, dinâmico companheiro do LDI, pela amizade, incansável colaboração e por sua valiosa dedicação, pela qual foi possível a realização desta Tese. Aos amigos e amigas do LDI, Patrícia Fagundes, Patrícia Ramos, Simone, Suellen, Maysa, Helio, Vânia, Kátia, Lívia, Elaine, Rachel, Fátima, Sidnei, Silvia, Nilce, Cleide, Aluízio e Antonio. Aos amigos, Jovens Doutores, Márcio, Leonardo, Anderson, pelo incentivo e carinho com que me receberam no grupo, desde o Mestrado, obrigado por tudo.

Aos membros do Laboratório de Estrutura de Superfície de Microorganismos, Daniela, Lucimar e Fátima, grato pela cooperação, desde o inicio desta carreira. Às UFRJ, UENF e UFPA, institucionalmente, por proporcionarem esta modalidade de capacitação profissional.

Meus sinceros agradecimentos, grato por tudo.

viii

RESUMO

Fonsecaea pedrosoi, fungo dematiáceo, é o principal agente etiológico da

chomoblastomycosis, uma crônica, micose granulomatosa normalmente limitada à pele e

tecidos subcutâneos. A infecção pelo F. pedrosoi, inicia-se com a implantação traumática de

conidios ou fragmentos de hifas em tecidos subcutâneos. Os mecanismos de defesa do

hospedeiro, granuloma, e citocinas envolvidas na formação da fibrose, patogênese da

inflamação e reparação tecidual na cromoblastomicose são pouco conhecidos. A resposta

imune celular contra fungo é essencial para controle da infecção. Células de Langerhans

(CsL) são derivadas da medula óssea, específica de monócitos, células dendriticas

apresentadoras de antígenos da epiderme. As CsL estão localizadas na camadade suprabasal

da epiderme e em mucosas onde elas tem papel importante nas respostas imunes da pele. O

propósito do estudo presente foi avaliar a relação de fungo-hospedeiro cromoblastomicose,

através da análise ultrastructural e imunológica, da interação de CsL purificadas de Balb/c

com conídios e células escleróticas induzidas in vitro, de F. pedrosoi, em mio de cultura

RPMI-1640, quantificando a citocina TGF-β por ELISA no subrenadante da interação e no

plasma de pacientes de cromoblastomicose. Nossos resultados mostraram para que CsL

fagocitam conídios, porem não células escleróticas F. pedrosoi, nas 03 primeiras horas de

interação, enquanto que inibe a formação de hifas durante 36 horas de co-cultura de ambas as

formas, interiorizadas ou não. Também, analisou-se a maturação de CsL, pela expressão

inibida de CD40 e B7 através de interação com conídio, porem não com de células

escleróticas. Níveis de TGF-β no soro de pacientes de cromoblastomicose. Destruição de

fungos por Itraconazol correlaciona-se com queda plasmática de TGF-β, porem a

remodelação tecidual provavelmente aumenta seu nível, interferindo com a resposta imune

celular. Nossos dados demonstraram uma importante função das CsL na inata e adaptativa

imunidade contra infecção de F. pedrosoi e que este fungo induz uma resposta de Th1 após a

implantação de fungo em pele até o início das lesões e desenvolvendo uma resposta de Th2

após o aparecimento das lesões clínicas. Também, mostrou que o isolamento e purificação de

CsL, é um modelo experimental importante para o estudo do fungo-hospedeiro na

cromoblastomicose, assim como também para outras patologias nas quais o patógeno

penetram no hospedeiro através da pele. Estes resultados podem subsidiar conhecimento para

outras pesquisas, enquanto busca estratégias para o tratamento ou controle do

cromoblastomicose.

ix

ABSTRACT

Fonsecaea pedrosoi, a dematiaceous fungus, is a major etiological agent of

chomoblastomycosis, a chronic, granulomatous mycosis usually confined to skin and

subcutaneous tissues. The infection by F. pedrosoi begins with the traumatic implantation of

conidia or hyphae fragments in subcutaneous tissues. The host defense mechanisms,

granuloma, and cytokines engaged in fibrosis formation, pathogenesis of the inflammation

and tissue repair in chromoblastomycosis are poorly understood. The cellular immune

response against fungus is essential to control infection. Langerhans cells (LC) are derived

from specific bone-marrow derived monocyte, dendritic antigen-presenting cells of the

epidermis. LC are localized in suprabasal layers of the epidermis and in mucosa, where they

play important roles in skin immune responses. The purpose of the present study was to

evaluate the host-fungus relation in cromblastomycosis, through ultrastructural and

immunological analysis of purified from Balb/c LC interaction with F. pedrosoi conidia or in

vitro produced sclerotic cells, in RPMI-1640 culture medium, to quantify the cytokine TGF-β

by ELISA in the supernatants of the interaction and plasmatic levels of TGF-β in

chromoblastomycosis patients. Ours results showed that LC phagocytose F. pedrosoi conidia

but not sclerotic cells in the first 3hours of interaction, inhibiting hyhae formation during 36

hours co-culture from both forms, internalized or not. Also, LC maturation, analyzed by the

expression of CD40 and B7-2 was inhibited by conidia, but not by sclerotic cells. TGF-β

serum levels are high in chromoblastomycosis patients. Fungal destruction by Itraconazole

correlates with TGF-β downregulation, but tissue remodeling probably raises its levels again,

interfering with cellular immune responses. Ours data demonstrated an important inate and

adaptive immunity function of LC against F. pedrosoi infection and that this fungus induces

an Th1 responses after implantation of fungus in skin until the beginning of the lesions and

developing an Th2 response with the emergence of the clinical lesions. Also show that

isolated and purity LC is an important experimental model for the study of the fungus-host in

the chromoblastomycosis, as well as others pathologies in which the pathogen penetrate in the

host across the skin. These results can subsidze knowledge for others research, seeking

strategies for the treatment or control of the chromoblastomycosis.

x

SUMÁRIO Título Pagina Ficha Catalográfica ivApresentação vDedicatória viAgradecimentos viiResumo viiiAbstract ix1. INTRODUÇÃO 011.1 A Patologia 011.2 O Fungo Fonsecaea Pedrosoi 091.3 Células de Langerhans 121.4 Resposta Imune X Fungos 161.5 Citocinas X Fungos 241.5.1 Citocinas Th1 281.5.2 Citocinas Th2 291.6 Interação de Células do Sistema Imune X Fungos 321.7 Interação de Células de Langerhans X Fungos 372. OBJETIVOS 402.1 Geral 402.2 Específicos 403. MATERIAL E MÉTODOS 423.1 Material Biológico 423.2 Métodos laboratoriais 423.2.1 Isolamento do Fungo Fonsecaea pedrosoi 423.2.2 Produção de micélio 423.2.3 Produção de conídios 423.2.4 Produção de hifas 433.2.5 Produção de células escleróticas in vitro 433.2.6 Obtenção das células de Langerhans 443.2.7 Determinação de índice de purificação das CsL 443.2.8 Cultivo das CsL 453.2.9 Interação das CsL com o fungo Fonsecaea pedrosoi 453.2.10 Processamento de material para microscopia ótica 453.2.10.1 Coloração pelo Giemsa 453.2. 9.2 Imunofluorescência e Citometria de Fluxo 463.2.11 Processamento de material para microscopia eletrônica 463.2.11.1 Microscopia eletrônica de transmissão 463.2.11.2 Microscopia eletrônica de varredura 473.2.12 Identificação e quantificação da citocina TGF-β em sobrenadante 483.2.13 Quantificação de TGF-β no plasma de pacientes com cromoblastomicose 483.2.14 Análise estatística 494. RESULTADOS 504.1Caracterização ultraesturutural das CsL purificadas da epiderme de camundongos Balb/c 50

4.2 Interação das CsL purificadas e conídios de Fonsecaea pedrosoi 504.3 Interação das CsL purificadas e células escleróticas de Fonsecaea pedrosoi induzidas in vitro 51

4.4 Interação das CsL purificadas e hifas de Fonsecaea pedrosoi 51

xi

4.5 Expressão de moléculas co-estimulatórias B7-2 e CD40 em CsL após 36 horas de interação com Fonsecaea pedrosoi 51

4.6 Quantificação da TGF-β no plasma de pacientes portadores de cromoblastomicose. 52

4.7 Quantificação de TGF-β no sobrenadante após 36h de interação entre CsL e o fungo Fonsecaea pedrosoi, em RPMI-1640. 53

5. DISCUSSÃO 686. CONCLUSÕES 747. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76

xii

INTRODUÇÃO

1.1. A PATOLOGIA

A cromoblastomicose, também conhecida como cromomicose, micose de Carrión,

micose de Lane-Pedroso, dermatite verrucosa e blastomicose negra, é um termo utilizado para

designar um grupo de infecções fúngicas subcutâneas, crônicas, causadas por implantação

transcutânea de diversas espécies de fungos demáceos, isto é, fungos melanizados (Maslin et

al., 2001). A infecção geralmente ocorre após traumatismo da pele e inoculação percutânea de

conídios ou hifas destes fungos. Estes agentes crescem em matéria orgânica em

decomposição, farpa de madeira, gravetos, espinhos de plantas vivas ou mortas (Rubin et al.,

1991; Salgado et al., 2004; Zeppenfeld et al., 1994). No sítio de inoculação ocorre uma lesão

limitada ao tecido cutâneo e subcutâneo, sendo caracterizada clinicamente pelo aspecto

verrucoso (Fig.01A e B) com presença de nódulos que podem ulcerar e que se elevam de 01 a

3cm acima da pele, culminando com hiperceratose e hipercantose dos tecidos lesionados

(Kwon-Chung & Bennet, 1992) (Fig.01C). Essas úlceras localizadas podem tornar-se

vegetantes, adquirindo aspecto papilomatoso semelhante à couve-flor (Rippon, 1998)

(Fig.01D), assim como em alguns casos pode ocorrer quadro de disseminação (Salgado et al.,

2005) (Fig.01E). A doença é mais freqüente em regiões tropicais e subtropicais entre

trabalhadores rurais, sendo que a faixa etária mais atingida coincide com a fase mais

produtiva do individuo, tornando os pacientes morbidamente limitados tanto para o trabalho,

quanto para o convívio social (Lacaz et al., 1991). Em relação ao sexo, a infecção predomina

em homens, em menor número em mulheres e sendo rara em crianças, mesmo sendo as

crianças expostas às mesmas condições ambientais que os adultos infectados. Esta raridade de

casos em crianças sugere pensar em um possível longo período de latência do fungo no

hospedeiro e/ou outro fator ainda não esclarecido, até a manifestação clínica da micose

(Vollum, 1997).

1

Figura 01: Diferentes aspectos clínicos das lesões de cromoblastomicose. A) Aspecto clássico das lesões de cromoblastomicose (lesão vegetante com fibrose acentuada), B) Lesão verucosa, C) Lesão tricofitóide. D) Lesão crostosa, E) Caso de cromoblastomicose cutânea disseminada. (Fonte: Laboratório de Dermato-Imunologia UEPA/UFPA/MC)

Os agentes etiológicos da cromoblastomicose têm suas ocorrências saprofíticas bem

documentadas (Rios-Fabra et al., 1994). Os principais agentes são os fungos demáceos

Fonsecaea pedrosoi e Cladophialophora carrionii, com menor frequência outras espécies têm

sido implicadas como agentes desta micose, Phialophora verrucosa, Rhinocladiella

aquaspersa ou Wangiella dermatitidis (Esterre & Queiroz-Telles, 2006), assim como

Exophiala jeanselmei (Queiroz-Telles et al., 2003) e Exophiala spinifera (Tomson et al.,

2006) (Fig.02A-D). Entretanto a maioria dos autores considera o gênero Exophiala como

sendo exclusivo agente de feohifomicose, outro grupo de micoses subcutânea e profunda

caracterizadas pela presença no tecido parasitado de fungos demáceos nas formas

filamentosas (McGinnis & Hilger, 1987).

2

Figura 02: Principais agentes da cromoblastomicose, mostrando os respectivos conidióforos que caracterizam as diferentes espécies de fungos: A) Fonsecaea pedrosoi, B) Phialophora verrucosa, C) Exophiala spinifera e D) Cladophialophora carrionii (Fonte: Laboratório de Dermato-imunologia/UEPA/UFPA/MC). Barra: 10µm.

Os agentes da cromoblastomicose, aparentemente, são de baixo poder patogênico e

apresentam um tipo de dimorfismo dependente da resistência do hospedeiro e/ou do tecido

onde foram implantados. Nos tecidos lesionados apresentam-se sob a forma denominada

células escleróticas ou “células muriformes”, que se reproduzem por septação em mais de um

plano (Matsumoto, 1984). As células escleróticas, formas fúngicas encontradas no

hospedeiro, representam uma forma vegetativa intermediária entre o conídio e a hifa

(McGinnis, 1983). Este dimorfismo é a habilidade que alguns fungos possuem de mudar da

forma de levedura ou filamentosa para outras formas só encontradas na fase parasitária do

fungo, em resposta às alterações do ambiente natural de crescimento para o novo ambiente

parasitário, ou seja, o hospedeiro, a capacidade destes microrganismos agirem como parasitas

nas infecções em mamíferos (Madhani & Fink, 1998). A diferenciação de hifas ou conídios

em células escleróticas ou “células muriformes”, ocorrida no tecido do hospedeiro, é um

aspecto biológico cujo mecanismo ainda não está devidamente esclarecido (Walter et al.,

1982).

3

Quanto ao tratamento da cromoblastomicose, até o presente momento, nenhuma droga

ou procedimento conhecido pode ser considerado de eficácia absoluta. As terapias podem ser

divididas em simples ou combinação de drogas que inclui o uso sistêmico ou intralesional de

Anfotericina-B com 5-Fluorcitosina e Itraconazol oral, droga mais largamente utilizada

atualmente (Fig.03). Outras terapias incluem métodos físicos, cirurgias convencionais,

cirurgia a laser, termoterapia e crioterapia. O sucesso terapêutico nos casos de

cromoblastomicose é determinado por vários fatores, inclusive, pelo agente etiológico, em

virtude de sua sensibilidade às drogas. Infelizmente, o F. pedrosoi, que é o fungo mais

comumente isolado, é o menos sensível às drogas antifúngicas utilizadas atualmente. Alguns

resultados favoráveis, com o uso de Itraconazol (Fig.03), foram obtidos no tratamento desta

micose causada por F. pedrosoi (Borelli, 1987; Queiroz-Telles et al., 1992; Smith et al.,

1993). O tamanho da lesão é algo relevante, porque lesões pequenas podem ser tratadas com

meios físicos, cirurgias convencionais, a laser ou através do calor (Bonifaz et al., 1997). Uma

das terapias combinadas que têm apresentado bons resultados consiste na combinação de

Anfotericina-B com 5-Fluorcitosina (Fig.03), raspagem e crioterapia, apesar dos efeitos

colaterais da Anfotericina-B e da ocorrência de cepas de F. pedrosoi resistentes a 5-

Fluorcitosina (Poirrez et al, 2000). Também foram obtidos excelentes efeitos terapêuticos

com Itraconazol em casos cujo agente era C. carrionii (Crowe & Martin, 2000). Outras

combinações foram tentadas com algum sucesso, como o uso alternado de Itraconazol e

Terbinafina (Gupta et al., 2002), combinação de vitamina D3 por via parenteral com

Terbinafina oral em casos refratários a outros tipos de terapia (Hussain et al., 2002) e uso de

laser de dióxido de carbono associado a termoterapia, isto é, com aplicações de calor sobre as

lesões (Hira et al., 2002). Bonifaz et al.,(2004), sugerem o tratamento de lesões pequenas por

criocirurgia e por “spray” com nitrogênio liquido em pacientes com grandes lesões. A

quimioterapia com as drogas 5-Fluorcitosina e Itraconazol deve ser utilizada para a redução

do tamanho das lesões seguido de termoterapia (calor local ou criocirurgia), assim como

determinar in vitro a sensibilidade do fungo a diversos fármacos, para estimar a concentração

inibitória mínima do antifúngico. Ungpakorn & Reangchaínam (2006), obtiveram bons

resultados, com 66,7% de cura dos casos tratados, utilizando pulsoterapia com 400mg/dia de

Itraconazol durante uma semana por mês em um período de doze (12) meses, sem observar

efeitos colaterais durante o tratamento.

4

Figura 03: Drogas utilizadas no tratamento da cromoblastomicose - Itraconazol, Anfotericina B e 5-nannmn domlaqtoma( d)Tj10.01601 0 0 10.03 112491308 5.0i06366 TmDrolnlangcoas u tratamen

asromFonte: Lad sromaregiõommosomcomHowles3: Texas (Gardner3:mLavelle, 198omos, sendo o principal agente o 3:Emmons 3:os fomcocoBansal & PommDiaz Alromos o 3:mcomcomYegres, 198om são siromR i os-Faommm os o agente é o 3:Velasquez3:Cucè 3:os, sendo a (m)Tj1.995601 0 0.04895573909750988203 Tmaom

pacientes oriundos de áreas rurais de Salta e Jujuy, isolando F. pedrosoi através de culturas

em amostras de 36 pacientes.

Figura 04: Mapa mostrando a distribuição geográfica mundial de casos de cromoblastomicose. Amarelo (países com menos de 10 casos registrados), marrom (entre 10 e 50 casos registrados), laranja (entre 50 e 100 casos catalogados) e vermelho (acima de 100 casos)-Fonte: Silva, 2006.

No Brasil, a cromoblastomicose ocorre em vários estados do país, com casos

distribuídos por todas as regiões geográficas (Fig.05). Vários casos foram relatados no Rio

Grande do Sul (Minotto et al., 2001), no estado do Espírito Santo (Mattê et al., 1990); no

estado de São Paulo onde inclusive foram relatados os primeiros casos na história da doença

(Lacaz et al., 1991); no estado do Maranhão (Silva et al, 1992); no estado da Bahia, inclusive

com casos com lesão de localização não usual, como a região auricular (Bittencourt et al.,

1994). A maioria dos casos do país é de pacientes oriundos da região Amazônica, com

destaque para os casos do estado do Pará, provavelmente a segunda região mundial em

número de casos registrados (Silva et al., 1999), sendo o F. pedrosoi, quando isolado, o

agente etiológico de todos os casos relatados no país (Fig. 05).

6

Figura 05: Mapa do Brasil com distribuição de casos de cromoblastomicose no País: Branco (sem registro de caso), amarelo-claro (até 50 casos registrados), amarelo vivo (entre 50 e 300 casos registrados) e vermelho (mais de 300 casos). Fonte: Silva, 2006.

Na Europa, alguns casos foram relatados em diversos países, como na França (Le Gall

et al., 1993), na Rússia (Malkina & Darchenkova, 1977) e na Finlândia (Souck, 1988). Na

Ásia, foram relatados casos na China e Filipinas (Al Doory, 1947), na Malásia (Jayalakshmi

et al., 1990); na Índia, onde até 1954, eram conhecidos 30 casos (Rajendran et al, 1997); no

Sri Lanka relatos de 71 casos (Attapattu, 1997). No Japão, o número de casos a partir de 1955

tem aumentado drasticamente. Sendo que até 1983 foram observados 290 casos com

isolamento de 275 amostras, e o agente etiológico isolado e identificado em 215 casos (86%)

foi o F. pedrosoi, e ao contrário de outras regiões mundiais, em mais de 50% dos casos as

lesões eram localizadas nas extremidades superiores do corpo e áreas da face e pescoço

(Fukushiro, 1983). Uma revisão de casos deste país destaca um adicional de 212 casos até o

ano de 2001 (Kondo et al, 2005). Na Austrália, na maioria dos casos relatados, o agente

etiológico principal é o C. carrionii (Leslie & Beardmore, 1979). A predominância deste

7

agente etiológico está relacionada com o clima continental, quente e seco deste país, onde a

precipitação pluvial é escassa, apenas 11% do território recebe mais que 1000 mm3de chuvas,

enquanto 2/3 recebe menos de 500 mm3de chuvas.

No Continente Africano, a cromoblastomicose foi relatada no Quênia, Tanzânia (Al

Doory, 1974), no Zaire (Banks, 1985), na Líbia (Bhaktaviziam et al., 1983) e Moçambique

(Magalhães & Meyer, 1970). Em Madagascar, o principal foco de cromoblastomicose do

mundo, atualmente foram registrados 1343 casos no período de 1955 a 1994, a maioria dos

pacientes eram trabalhadores rurais e lenhadores, atividades que podem justificar a

localização das lesões, 75% nas pernas e pés, sendo que 87% dos pacientes são do sexo

masculino e 98% com idade acima de 16 anos. Dos casos isolados e identificados por cultivo,

o agente etiológico foi F. pedrosoi em 61,8%, de lesões de pacientes oriundos de regiões de

floresta, em 38,2% foi o C. carrionii o fungo isolado de pacientes oriundos das regiões

semidesérticas do País (Esterre et al., 1996).

A cromoblastomicose, na maioria dos casos atinge trabalhadores rurais do sexo

masculino, sem predisposição racial, sendo a faixa de 30-50 anos de idade a mais atingida.

Crianças expostas às mesmas condições raramente desenvolvem a doença (Vijaya & Kumar,

2005). A relação homem/mulher entre os pacientes é mais ou menos 10:1 na maioria dos

países onde ocorre a doença, talvez porque os homens ficam mais expostos a traumatismos

em função da atividade no campo, a qual é exercida predominantemente pelo sexo masculino

(Lacaz et al., 1991). Porém, essa mesma relação no Japão é quase igual entre os dois sexos

(Fukushiro, 1983). Entre os pacientes Zulus da província de Natal (África do Sul), onde as

mulheres trabalham no campo, 11 de 18 casos, são mulheres (Bayles, 1971). No Brasil, em

algumas séries de casos observados, os aspectos epidemiológicos apresentam semelhanças.

Estudos de Londero & Ramos (1976), no Rio Grande do Sul, demonstraram que a maioria dos

pacientes é do sexo masculino e 90% apresentam as lesões nos membros inferiores. Silva et

al., (1992), estudando casos no estado do Maranhão, relatam que 84,6% dos pacientes eram

do sexo masculino, 92,3% eram lavradores e 84,6% as lesões localizavam-se nos membros

inferiores. Relato de 12 casos de cromoblastomicose no Rio Grande do Sul realizado por

Matte et al., (1997), refere-se que 11 pacientes eram do sexo masculino e 01 feminino, 10

pacientes eram agricultores, e que os membros inferiores estavam acometidos em 09

8

pacientes. E quanto a casos, onde as lesões foram encontradas em regiões do corpo não

usuais, Bittencourt et al., (1994), relatam um caso de Cromoblastomicose auricular. Belfort et

al., (1960), descrevem casos na face e pescoço. Zaror et al., (1986), descrevem um caso de

localização nasal e Hofling-Lima et al., (2005), publicaram relato de um caso ocular com

lesão da córnea após traumatismo.

Estudos epidemiológicos de 325 casos de cromoblastomicose no estado do Pará,

Brasil, demonstraram que pacientes masculinos (93%), maioria lavradores (86%) com idade

entre 41-70 anos foram os mais atingidos pela micose, tendo como principal agente etiológico

identificado em exames micológicos foi o F. pedrosoi e que este número de casos destaca esta

região da Amazônia como o principal foco da doença no país e provavelmente a segunda

região mundial em número de casos descritos (Silva et al., 1999).

1.2. O FUNGO Fonsecaea pedrosoi

O agente da cromoblastomicose (Fig 06A), F. pedrosoi, é um fungo demáceo, cujas

características destes incluem: parede celular melanizada, crescimento lento, colônias com

aspecto aveludado e coloração variando do verde oliva ao negro (Fig 06C), reproduzindo no

tecido como formas escleróticas (Fig 06B), por subdivisão celular planária, e no meio

ambiente por produção e liberação de propágulos (conídios) (Fig 06D), por desarticulação

(Sterflinger et al., 1999). Sua localização taxonômica pode ser definida, por aspectos

ultraestruturais, como sendo um Ascomiceto (Rozental et al., 1994b) e por biologia

molecular, situada na ordem Chaetothryriales e na família Herpotrichiellaceae (De Hoog, et

al., 2000). A micromorfologia apresenta hifas septadas, ramificadas e de coloração marron-

claro, com produção de conídios de forma simpodial sobre células conidiogênicas (De Hoog

& Guarro, 1995) (Fig.06D).

9

Figura 06: Características do principal agente da cromoblastomicose: A) Lesão verrucosa clássica, B) Células escleróticas em exame micológico direto, clarificado com KOH à 20%, C) Cultura em agar-Sabouraud, D) Microcultivo em lâmina mostrando conidióforo característico de F. pedrosoi (Riddel, 1950). Fonte: Laboratório de Dermato-Imunologia/UEPA/UFPA/MC. Barra escura =1cm, Barra clara =10µm.

A forma parasítica ou tecidual consiste em células escleróticas, que são células

leveduriformes de parede espessa, septadas em mais de um plano, com aproximadamente 12

µm de diâmetro (Fig. 07). Estas células aparentemente representam uma forma vegetativa

intermediaria que está fenotípicamente entre as morfologias de levedura e hifa (McGinnis,

1983). Estas formas podem ser obtidas in vitro em meio quimicamente definido adicionado de

propranolol (Alviano et al., 1992) e em meio com pH baixo contendo quelantes de cálcio ou

suplementado de cálcio, indicando que este pode ser um fator envolvido na indução de células

escleróticas in vitro (Mendoza et al., 1993). Células escleróticas obtidas in vitro induzidas

com propranolol ou por meio quimicamente definido (Fig. 07B e D) possuem similaridade

ultraestrutural e antigênica com as células encontradas em lesões de pacientes (Fig. 07A e C)

(Silva et al., 2002). Estudos revelam que a diferenciação celular de F. pedrosoi em células

escleróticas in vivo, pode ser obtida com a interação deste fungo com fator de agregação

plaquetária (PAF) liberado por células do sistema imune (Alviano et al, 2003). Estudos

10

recentes, objeto de estudo de tese de mestrado (Dissertação defendida e artigo submetido por

Silva et al., 2006) mostram que conídios de F. pedrosoi sofrem diferenciação em meio natural

com biomasa de Teobroma grandiflorum, Bactris gasipae entre outras (Fig.07B), assim como

em meio quimicamente definido (Fig.07) composto por nitrato de potássio, sulfato de

magnésio, fosfato de potássio monobásico e dextrose.

Figura 07: Prancha mostrando características morfológicas de células escleróticas obtidas in vivo e in vitro. A e C) Exame micológico direto das lesões, B) Célula esclerótica induzida in vitro em meio natural e D) Célula esclerótica induzida in vitro em meio quimicamente definido. (Fonte: Laboratório de Dermato-Imunologia-UEPA/UFPA/MC). Barra 5µm.

A coloração marrom é devida à presença de melanina na parede do fungo, pigmento

marrom ou negro, que são polímeros multifuncionais de alto peso molecular, formados a

partir de polimerização oxidativa de compostos fenólicos (Hamilton & Gomes, 2002). O F.

pedrosoi produz melanina em grânulos citoplasmáticos, chamados de melanossoma e os envia

à parede celular. A melanogênese em F. pedrosoi é ativada com solução salina contendo soro

fetal bovino demonstrando que o mesmo pode acontecer no contato com soro humano após a

inoculação fúngica (Franzen et a.l, 1999). Estudos demonstram que melanina sintética possue

ação imunomoduladora, com implicação na supressão da produção de citocinas pró-

inflamatórias, dados que sugerem que a melanina produzida pelos fungos pode ter um papel

similar na immunossupressão localizada durante a infecção fúngica (Mohagheghpour et al.,

11

2000). Estudos demonstraram que no soro de pacientes com cromoblastomicose, contém

anticorpos antimelanina, dados que indicam que a melanina existente no agente F. pedrosoi é

uma estrutura imunologicamente ativa, capaz de induzir respostas humoral e celular que

podem ajudar o sistema de defesa do hospedeiro no controle desta micose (Alviano et al.,

2004). A relação entre melanina fúngica e a resposta imune foi observada na sobrevivência de

camundongos infectados experimentalmente com Cryptococcus neoformans, quando foram

tratados com anticorpos monoclonais antimelanina (Rosas et al., 2001).

A ultraestrutura das células escleróticas ou muriformes de F. pedrosoi, não revelou até

agora, de forma bem definida, a presença de núcleo, mitocôndrias ou retículo endoplasmático,

porém alguns autores confirmam a presença destas organelas, além dos ribossomos e vacúolos

(Walter et al., 1982). A análise por técnicas de congelamento seguido por fratura demonstra

diferenças significativas na quantidade de proteínas integrais de membrana entre as faces

externa (E) e protoplasmática (P) da membrana celular de conídios, o mesmo não sendo

verificado em micélio. Além disso, a face P dos conídios apresenta invaginações numerosas e

irregulares que podem estar relacionadas à idade da cultura (Rozental et al., 1994a).

1.3. CÉLULAS DE LANGERHANS

A pele é o maior órgão do corpo, com diversas funções, sendo histologicamente

dividida em epiderme, derme e hipoderme. A epiderme tem um envolvimento crítico na

resposta imune, sendo a camada mais superficial da pele funciona como uma barreira

protetora contra invasões de substancias estranhas. A derme tem uma importante função

termoreguladora e suporte de uma rede vascular que supre a avascular epiderme com

nutrientes. A hipoderme, também conhecida como tecido conectivo subcutâneo armazena

tecido adiposo (Valladeau, & Saeland, 2005). As células imunitárias da pele participam na

defesa contra patógenos, em particular através de uma rede de células dendríticas (CsD). Na

epiderme, encontram-se residindo em um estado uniforme e imaturo as células de Langerhans

(CsL) (Fig.08). As CsL são derivadas de um precursor de monócitos da medula óssea, que

migra para a pele e diferencia-se nesta importante célula de vigilância do sistema imune

(Banchereau & Palucka, 2006). Estas células estão localizadas na camada basal e suprabasal

da epiderme, fazendo parte de uma população de CsD destas áreas da epiderme juntamente

12

com as células dendriticas dermais (CsDD) e as células dendriticas plasmocitóides (CsDP),

que ocorrem sob condições patológicas. Estas células imunitárias possuem um espectro de

diferentes funções com implicações que estendem para fora da pele. Elas possuem a

capacidade de internalizar agentes particulados, macromoléculas e apresentam a propriedade

de migrar da pele para os linfonodos onde encontram os linfócitos T antígenos-específicos. As

CsL representam uma sub-população de CsD caracterizadas pela presença de uma organela

citoplasmática conhecida como grânulo de Birbeck e de uma lectina tipo-C que é

especificamente expressa em sua superfície (Valladeau & Saeland, 2005).

Estas células constituem 2% a 4% da população total da epiderme, sendo o segundo

tipo mais freqüente de célula dendrítica e encontrada em concentração semelhante à dos

melanócitos, entre 460-1000 células/mm3 (Foster et al., 1986) (Fig.8). As CsL expressam

antígenos Ia e HLA-DR associados com resposta imune (Shimada et al., 1987), receptores Fc

e C3, antígeno T6, proteína S-100 e filamentos de vimentina e uma ATPase fixada à

membrana (Chu et al., 1982). As CsL em microscopia eletrônica mostram um núcleo

acentuadamente pregueado, ausência de tonofilamentos ou desmossomos, os grânulos de

Birbeck estão presentes no citoplasma de todas estas células, com tamanhos que variam

consideravelmente, de 1nm a 3nm, em forma de disco ou de uma tigela achatada, às vezes

mostrando uma vesícula em uma ou em ambas extremidades, formando uma estrutura

semelhante a uma raquete de tênis, sendo que estes grânulos são invaginações da membrana

plasmática e apresenta-se de forma mais abundante na zona do Golgi, mas podem ser

encontrados distribuídos por todo o citoplasma. O complexo de Golgi aparece bem

desenvolvido, apresentando pilhas de lamelas membranosas e grande número de pequenas

vesículas (Bell, 1999). O retículo endoplasmático rugoso é representado por cisternas curtas e

espalhadas de formas isoladas, os ribossomos livres são comuns no citoplasma, possuem

bastante retículo endoplasmático liso, mitocôndrias de perfil redondo ou alongado, alguns

lisossomos e melanossomos também são observados (Lentz, 1971).

13

Figura 08: Aspecto microscópico das células de Langerhans purificadas, coradas pelo Giemsa, mostrando prolongamentos citoplasmáticos (dendritos–setas).Fonte: Laboratório de Dermato-imunologia UEPA/UFPA/ MC. Barra 10 µm

As CsL têm como principal função captar antígenos na epiderme e apresentar para

linfócitos T na derme ou nos linfonodos. O estímulo pode gerar a proliferação clonal de

linfócitos T citotóxicos (CD-8+), auxiliares (CD-4+) ou linfócitos T memória, regulando,

portanto a resposta a alérgenos e microorganismos invasores (Tamaki et al., 1980). O

mecanismo neste processo baseia-se na produção de citocinas e na presença de moléculas co-

estimuladoras que definem a tolerância e ativação do linfócito T (Katayama et al., 1997). Em

CsL purificadas, demonstrou-se que as moléculas co-estimuladoras B7-1, B7-2 e CD-40 são

reguladas pela presença de citocinas produzidas pelas próprias células de Langerhans ou por

queratinócitos. Entre as citocinas envolvidas na regulação de moléculas co-estimuladoras

estão citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e Interleucina-1β (IL-1β) (Salgado et al.,

1999b), e citocinas inibidoras, como IL-10 e IFN-γ (Beissert et al., 1995).

14

Em comum com outras subpopulações de CsD, as CsL regulam para cima sua

expressão de MHC classe II e moléculas co-estimulatórias após estimulo antigênico, e

migram para áreas de células T nos linfonodos regionais, onde iniciam uma resposta imune T-

dependente (Bancherau et al., 2000). Quanto as caracteristicas diferentes apresentadas pelas

CsL em relação as outras CsD, inclui a existência de Grânulos de Birbeck, fraca função do

receptor de manose, expressão de E-caderina e dependência de TGF-β para sua diferenciação

(Wu et al, 2001). As CsL não expressam o marcador CD14 que é um dos receptores de LPS,

enquanto outras CsD expressam (Salgado et al, 1999a). Foi demonstrado que CsL purificadas

da epiderme de camundongo Balb/c expressam receptores Toll-like 2, 4, e 9, porém não

expressam Toll-like 7, encontrado em outras CsD (Mitsui et al., 2004). As CsL expressam

CD45 e os marcadores mieloide CD33 e CD13, assim como CD1a, uma molécula também

encontrada sobre timócitos corticais. Também expressam CD11c, moléculas de adesão, como

as integrinas β1, CD44, CD54, CD15s, CLA-proteína associada a linfócitos cutâneos e E-

caderina que também são encontradas sobre queratinócitos e mediam a homotípica adesão

entre estes dois tipos de células (Larregina & Falo, 2005). Para internalizar antígenos CsL

apresentam lectinas tipo-C que são capazes de ligar-se a açucares presentes na superfície de

microorganismos. A lectina tipo-II Langerina/CD207, molécula de reconhecimento específica

para manose é que identifica as CsL na epiderme de camundongos e humanos (Valladeau et

al., 2003). As CsL também expressam dectin-1, uma lectina tipo-C capaz de reconhecer

glucanas e zymozam (Taylor et al., 2002; Valladeau & Saeland, 2005). As CsL são

proeminentes CsD da epiderme, porem seu papel na imunidade e tolerância ainda não está

totalmente esclarecido (Kissenpfenning & Malissen, 2006).

15

1.4. RESPOSTA IMUNE X FUNGOS.

Estima-se que existem entre 100.000 e 1.000.000 de espécies fúngicas habitando

nosso planeta. A convivência com os fungos tem levado a evolução em animais multicelulares

de mecanismos inatos e adaptativos de defesa antifúngica. Poucas espécies causam

regularmente doenças invasivas na população, sendo que a maioria age como agentes

oportunistas em indivíduos com algum defeito imune específico (Levitz, 2004).

Os fungos são seres eucarióticos, e como tais apresentam muitos dos aspectos

celulares básicos encontrados nas células dos mamíferos, como uma membrana nuclear, 80S

ribossoma, retículo endoplasmático e aparelho de Golgi. A presença de parede celular é o

principal aspecto que distingue a célula fúngica das células dos mamíferos, a qual confere aos

fungos proteção física e suporte estrutural, assim como contém distintas moléculas,

particularmente polissacarídeos. Na superfície dos fungos existe as moléculas do padrão

molecular associado à patógenos (PAMPs), que são reconhecidas pelas células do sistema

imune, entre as quais β-glucanas, quitina e manoproteinas (Klis et al., 2002).

A estrutura básica da parede celular consiste em uma cadeia linear de β-glucanas, na

qual existem ramificações ligadas por ligações covalentes de outras β-glucanas, quitina e

manoproteinas (Fig. 09). As manoproteinas tendem a ser altamente glicosiladas, geralmente

contendo centenas de resíduos de manose N-ligado, podendo ser extensivamente ramificadas

(Cutler, 2001). Os resíduos O-ligados tendem a ser curtos, porém consistindo

predominantemente de manose (Mansour & Levitz, 2003). A manose exposta na parede

celular e as manoproteinas circulantes são reconhecidas como estranhas pelos receptores do

hospedeiro. A maioria dos antígenos fúngicos imunodominantes são manosilados, sendo que

o grau de dominância dependente da manosilação (Mansour et al., 2002). Apesar da parede

celular de alguns fungos, serem definida com grandes detalhes, estudos mostram que pode

haver variação antigênica entre as espécies ou mesmo dentro das mesmas. Por exemplo, em

alguns fungos, os resíduos de manose estão expostos na superfície, enquanto em outros estes

estão confinados no interior da parede celular e não podem ser reconhecidos pelos receptores

de manose do hospedeiro (Bernard & Latge, 2001).

16

Figura 09: Microfotografia por microscopia eletrônica de transmissão (corte ultrafino e criofratura) e modelo esquemático da parede celular de fungo, mostrando a ligação entre os diversos constituintes da parede celular (Jabra-Risk et al, 1999).

O sistema imune evoluiu para proteger indivíduos de antígenos potencialmente

perigosos, como os patógenos invasivos. A geração de uma apropriada resposta é essencial, e

animais superiores desenvolveram complexo sistema de reconhecimento para garantir que

relevante resposta imune seja induzida (Abbas et al., 1996). A imunidade é o resultado da co-

evolução de microorganismos com o sistema imune e os microorganismos tem “aprendido”

como manipular o sistema imune em proveito próprio. Estudos de interações entre parasita-

hospedeiro revelam mecanismos moleculares que controlam a iniciação, persistência e a

polarização da resposta imune (Ricciardi-Castagnoli & Granucci, 2002).

Uma efetiva resposta imune contra fungos requer a contribuição coordenada da

imunidade inata e imunidade adquirida. A imunidade inata consiste de mecanismos protetores

que foram desenvolvidos no início e mantidos durante a evolução dos organismos

multicelulares. Esta exerce uma atividade antifúngica direta, cujos mecanismos incluem as

funções de barreira da pele e mucosas, antagonismo microbiano da flora destas superfícies e

recentemente foram reconhecidos peptídeos como as defensinas e colectinas, que estão

envolvidas no reconhecimento e fagocitose de microrganismos pelas células efetoras. Exerce

também um papel instrutivo sobre as do sistema imune adaptativo, através do processamento

e apresentação do antígeno, assim como a produção de moléculas mediadoras, como as

citocinas e quimocinas (McCormack et al., 2003; Romani, 2004).

Assim, o conjunto de defesas imunes inata ou adaptativa dos mamíferos, no combate

as infecções fúngicas, é constituído principalmente pela população de fagócitos profissionais,

consistindo de monócitos/macrófagos, leucócitos polimorfonucleares (PMNs, também

17

conhecidos como neutrófilos) e células dendríticas (CsD). Sendo que o sucesso do sistema

imune inato em controlar uma infecção fúngica depende de vários fatores, como a rota da

infecção, tamanho do inóculo e das condições gerais do sistema imune do hospedeiro

(Mansour & Levitz, 2002). A entrada do fungo na célula do hospedeiro é iniciada pela

aderência deste a um receptor na superfície da célula, onde gera um sinal que pode induzir sua

internalização citoplasmática. Além disso, o fungo utiliza uma variedade de moléculas de sua

superfície para ligar-se a componentes da matriz extracelular do hospedeiro para estabelecer

uma efetiva infecção (Mendes-Giannini, 2005). Micoses invasivas estão associadas com alta

morbidade e mortalidade, principalmente entre hospedeiros imunocomprometidos, infectados

por fungos oportunistas como a Candida albicans e Aspergillus fumigatus. Em relação à

principal conseqüência clínica das infecções fúngicas, os conhecimentos atuais, de como

células do sistema imune reconhecem e respondem a invasão de fungos patogênicos são muito

limitados (Overland et al., 2005).

Todos agentes de micoses sistêmicas e subcutâneas produzem uma reação inflamatória

granulomatosa, com recrutamento para o sítio da infecção de células envolvidas na resposta

inata, como as do sistema mononuclear fagocitário, com presença freqüente de neutrófilos

polimorfornucleares (PMNs) nestas infecções (Hirsch & Jonhson, 1984). Entre as células que

migram para o local do processo inflamatório, os PMNs, monócitos e macrófagos são os

principais fagócitos que englobam e digerem fungos, outros patógenos ou partículas estranhas

e são recrutadas para o sítio de infecção por ação de sinais de processo inflamatório. Sinais

estes representados por citocinas, componentes do complemento e células com ação sôbre os

fungos, os quais são mortos ou danificados por produção e/ou aumento de produtos reativos

intermediários do oxigênio e peptídeos microbianos (Diamond et al., 1980).

Os PMNs migram para o sítio infeccioso onde reconhecem, fagocitam e degradam os

microorganismos via produção de reativos intermediários do oxigênio (superóxido, peróxido

de hidrogênio e ácido hipocloroso), dependendo da disponibilidade da mieloperoxidase e

enzimas proteolíticas que são direcionadas para os fagossomos e para o ambiente extracelular.

Os PMNs ativados sintetizam quimiocinas e citocinas que recrutam e regulam a resposta

inflamatória de outras células como os macrófagos, células T e outros neutrófilos inativos

(Theilgaard-Mönch et al., 2006).

18

O sistema mononuclear fagocítico tem sido definido como uma família de células

composta de progenitores da linhagem hematopoiética, monócitos da corrente sanguinea e

macrófagos teciduais, sendo que os macrófagos constituiem a principal população celular em

muitos tecidos do organismo e seu número aumenta nos processos inflamatórios (Hume,

2006). Monócitos são fagócitos circulantes, que diferenciam em linhagem macrófagica

quando migram da circulação, dentro dos tecidos desenvolvem a macrófagos. Os mecanismos

envolvidos na fagocitose e destruição de microorganismos por monócito são, em geral,

similares os que ocorrem nos neutrófilos, porém são diferentes em relação aos dos

macrófagos (Fukazawa & Kagaya, 1988).

Os macrófagos teciduais são reconhecidos por alguns aspectos: morfologia estrelada e

evidência ultraestrutural de atividade endocítica por microscopia ótica e eletrônica, expressão

de certas enzimas como esterases, hidrolases lisossomais e ecto-enzimas detectáveis

histoquimicamente e por possuir receptores para porção Fc de imunoglobulinas e

complemento (Hume, 2006). Células fagocíticas apresentam receptores que são capazes de

reconhecer um padrão molecular específico de microorganismos patogênicos (PAMPs),

encontrados por exemplo em fungos, chamados de receptores padrão de reconhecimento

(PRRs). As principais classes de PRRs são os receptores Toll-like (TLRs) e os receptores

lectinas-like (LLRs). O reconhecimento de PAMPs pelos TRLs e LLRs induzem sinais

responsáveis pela ativação de genes importantes para uma efetiva defesa do hospedeiro,

especialmente os genes das citocinas pró- inflamatórias (Akira & Hemmi, 2003).

Nos macrófagos existem quatro fases principais nas quais a sinalização pelos TLRs

podem afetar a fagocitose: primeiro os TLRs podem funcionar diretamente como receptores

fagocíticos; segundo a TLRs sinalização pode modular a eficiente formação do fagossomo;

terceiro a mesma pode afetar a maturação e novamente formar fagossomos e quarto os TLRs

podem mediar respostas transcricionais afetando genes envolvidos em todas as etapas da

fagocitose (Underhill & Gantner, 2004).

As células dendriticas (CsD) são importantes células com envolvimento nas respostas

imune inata e adaptativa e encontra-se em locais de interação entre o indivíduo e o ambiente,

19

como a pele e mucosas, e aparecem, também, circulando na corrente sanguinea. A contínua

circulação entre tecidos e órgãos de linfoides

2) e CD54 na superfície das células também é elevada (Moll, 2003). Estas moléculas têm um

papel crucial na excitação antígeno-específica do effetor de células T (CD4+ e CD8+), assim

como no desenvolvimento de tolerância destas mesmas células (Belz et al., 2002),

caracterizada pela regulagem para baixo do poder de captura e da capacidade fagocitica

(Sundguist et al., 2004). As CsD “maduras”apresentam ainda diferentes padrões de expressão

de receptores e produção de quimocinas, possibilitando sua migração e o recrutamento de

outros tipos células, assim como o aumento de secreção de citocinas (Geijtenbeek et al.,

2004).

Na epiderme são encontradas as células de Langerhans (CsL), que são células

dendriticas (CsD) com caracteristicas bem definidas, enquanto na derme contem células

dendriticas interticiais ou dermais (intCsD). Estas subpopulações de CsD expressam

receptores diferentes para os diversos produtos microbianos, isto as permitem iniciar resposta

imune para uma variedade de microorganismos e gerar diferentes respostas para um simples

microorganismo, aumentando assim as chances de sucesso no controle da invasão microbiana

(Palucka & Banchereau, 2002).

Foram caracterizadas duas populações distintas de CsD em sangue periférico humano,

células mieloide e plasmocitoide. Os dois subconjuntos estão definidos de acordo com o

fenótipo imune e morfologia. CsD mieloide são células apresentadoras de antígenos clássicas,

que apresenta produtos antigênicos degredados para células CD4+ e CD8+, enquanto

segrega ao mesmo tempo citocinas pró-inflamatórias, por exemplo Interleucina-12, que

também são essenciais para o desenvolvimento de uma resposta imune efetiva. As CsD

plasmocitoide são uma subpopulação de células dendriticas que produzem quantidades

significativas de Interferons tipo I, e são consideradas como o “células produtoras naturais de

Interferon”, podem agir como células apresentadoras de antígeno, em parte por causa da

aquisição de morfologia dendritica e expressão elevada de moléculas de MHC na superfície e

de precursores de maturação. Entretanto a eficiência delas como estimulantes de células T

comparadas com as CsD mieloide é controversa. Células mieloide e plasmacitoide podem

segregar Interleucina-10 e Interleucina-12, e a relação entre ambas citocinas define a

polarização da resposta Th, sendo que esta polarização de respostas Th1 ou Th2 em estudos

em camundongos, pode estar na dependência da dose de antígeno e existência de receptores

21

ligantes TLRs na superfície dos patógenos (Pachiadakis et al., 2005). Células dendriticas de

murinos são classificadas dentro de seis populações: (1) no baço ( CD11c+ 11b+ 8α- 4- ) e

expressando TLR2, TLR4 e TLR9, (2) nos linfonodos periféricos (CD11c+ 11b+8α- 4+) e

expressandoTLR7 e TRL9, (3) nas placas de Peyer (CD11c+ 11b+8α- ) e expressando TLR3 e

TRL9, (4) nos linfonodos mesentéricos (CD11c+ 11b+ 8α- 4- e CD11c+ e langerina+), (5) nos

tecidos linfóides e corrente sanguinea – precursores de CsD plasmocitoides – (CD11cintGr-

I+B220+) e expressando TRL7 e TRL9 (6) e um subtipo somente encontrado nos linfonodos e

na pele (CD11c+ langerina+), acredita-se que este subtipo seja a forma “madura” da célula de

Langerhans (Henri et al., 2001.; Kelsal et al., 2002).

As CsD são o centro de balanço entre a imunopatologia e a geração de proteção

imunológica na interação parasita hospedeiro. Durante ambas as respostas, celular e humoral,

para agentes infecciosos, as CsD as regulam, enquanto elas próprias são elementos

destruidores de sua função, e por isso necessitam de distintos mecanismos “ligar e desligar”,

visando a eliminação de patógenos com o mínimo de dano para o hospedeiro (Andersson &

Ahmed, 2002).

Dados recentes indicam que CsD contribuem para uma parte essencial para o inicio e

regulação da imunidade adaptativa, localizando-se nos possíveis sítios de entrada de

patógenos no hospedeiro, exercendo excepcional capacidade de detectar e capturar

microorganismos invasores. Por outro lado patógenos podem desenvolver numerosas

estratégias para evadir e subverter funções destas células (Moll, 2003). O estudo da biologia

celular do processamento e apresentação de antígeno pelas CsD, tem muito contribuído para o

entendimento da resposta imune. Na presença de patógenos as CsD regulam sua via

endocitica, mecanismos proteolíticos, transporte e dinâmica de membrana dentro e fora do

lisossoma, para se tornar a mais potente célula apresentadora de antígeno (APC) conhecida

(Gatti & Pierre, 2003).

Certamente células que participam das respostas imunes adaptativas são conhecidas

por polarizar sua produção de citocinas, sendo que o conceito de polarização da resposta Th1

(celular) / Th2 (humoral) surge por observação de citocinas específicas produzidas por um

22

tipo de célula T (CD4+) inibindo a proliferação e/ou função de outro tipo de célula local ou

sistêmica (Kourilsky & Truffa-Bachi, 2001).

Células T CD4+ participam de ambas as respostas, celular e humoral, sendo que

clones de células T, (T helper-Th1) produzem preferencialmente Interleucina-6 (IL-6),

Interleucina-12 (IL-12), Interferon-γ (IFN-γ), Fator de necrose tumoral (TNF), enquanto as

células Th2 são propensas a sintetizar Interlucina-4 (IL-4), Interlucina-5 (IL-5), Interlucina-6

(IL-6), Interlucina-10 (IL-10), Interlucina-13 (IL-13) entre outras, e uma subpopulação Th3

que produzem altos níveis de Fator de crescimento e transformação β (TGF-β) e quantidades

variáveis de Interlucina-4 (IL-4), Interlucina-10 (IL-10) (Chen, 1994). A predominância de

resposta Th1 sôbre a resposta Th2 está correlacionada com a proteção contra várias micoses

(Roilides et al., 2003). Funcionalmente, células Th1 participam das reações inflamatórias e

proporcionam moderada ajuda para as células B, sendo que as células Th2 regulam a

produção de imunoglobulinas e estimula a eosinofilia. As células Th3 possuem um fenótipo

imunossupressivo de tolerância e autoimunidade em modelos experimentais (Coffman, 1999).

O envolvimento de células T e os mecanismos de ativação destes linfócitos nas

infecções fúngicas ainda nescessita ser bem definido, principalmente com o fungo F.

pedrosoi. Alguns estudos mostraram que antígenos de parede de F. pedrosoi são capazes de

induzir resposta mediada por células, resposta Th1, quando utilizados em testes intradermicos

em pacientes com cromoblastomicose (Iwatsu, et al., 1979), assim como aspecto da resposta

imune Th1, foi observado em diversos órgãos de animais de laboratório inoculados com o

fungo F. pedrosoi (Kurita, 1979).

O sistema imune inato em mamíferos percebe a invasão de microorganismos, entre

estes os fungos, utilizando receptores para β-glucanas, para manose e Toll-like receptores.

Estes receptores são de uma família de proteínas evolucionalmente conservadas que

funcionam como sensores de infecção e induz a ativação do sistema imune, estimulação que

inicia uma variedade de mecanismos de defesa do hospedeiro (Takeda et al., 2003). Vários

PRRs reconhecem fungos patogênicos, através de estruturas da parede celular como as

mananas e glucanas. Por exemplo, os macrófagos, possuem receptores para manose pelos

quais reconhecem e fagocitam Candida albicans, sendo que CsD possuem receptor lectina-

23

like (DC-SIGN) que partipam da fagocitose de Cândida albicans e Aspergillus fumigatus

(Cambi et al., 2003). Os TLRs são expressados primariamente sobre macrófagos e CsD e

controlam a ativação destas células apresentadoras de antígeno (Kopp & Medzhitov, 2003).

Estes receptores na superfície das células do sistema imune possuem um domínio extracelular

que distingue produtos microbianos e um domínio citoplasmático que transmite sinais para

proteínas adaptadoras intracelulares. Uma destas proteínas adaptadoras, a codificada pelo

gene88 da diferenciação mieloíde (MYD88), inicia uma sinalização em cascata levando à

expressão de moléculas microbicidas e citocinas (Levitz, 2004). Nos mamíferos existem pelo

menos 10 membros da família de TLRs receptores, que fazem parte da familia de PRRs e que

reconhecem especificamente componentes conservados na superfície dos microorganismos,

que são as PAMPs. A ativação das TLRs não só conduz a indução da resposta inflamatória,

assim como o desenvolvimento da imunidade adaptativa antígeno-específica (Akira, 2003).

Estudos experimentais demonstram que TLR2, por exemplo, desempenham um significante

papel na defesa do hospedeiro contra a infeccção pulmonar por A. fumigatus (Balloy et al.,

2005), enquanto TLR4 está envolvido no reconhecimento de manoproteinas de C. albicans e

glucoronoxylomanana de C. neoformans (Roeder et al., 2004). Desta forma a imunidade inata

é crucial mesmo em infecções fungicas que requerem resposta imune adaptativa para

resolução do processo. Citocinas como: Fator de necrose tumoral (TNF-α), Interleucina-12

(IL-12), Interleucina-18 (IL-18) e Interferon-γ (IFN-γ) podem aumentar a resposta inata,

enquanto que: Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-10 (IL-10) e Fator de transformação e

Citocinas são pequenas proteínas ou glicoproteinas que transmitem informações de

uma célula a outra, sendo que muitas células do organismo secretam e respondem para as

mesmas citocinas e seus efeitos foram descritos sobre uma infinidade de funções celulares.

Assim, cada modelo de doença pode ser específico, com mecanismo próprio de autoregulação

controlado por uma retroalimentação positiva ou negativa, envolvendo citocinas e moléculas

co-estimulatórias (Vecchiarelli, 2000).

As citocinas agem principalmente de forma parácrina e autócrina, são liberadas e

consumidas no local onde a reação imune está ocorrendo, assim a maioria das citocinas é

detectada em níveis baixos no sangue periférico. Alterações na síntese de citocinas podem ser

bem estudadas in vitro, estimulando células e analisando o padrão de produção (Cavaillon et

al., 1990).

A resposta imune humana é regulada por complexa rede de elementos controladores.

Entre estes componentes reguladores estão as citocinas pró e antiinflamatórias e inibidores

específicos de citocinas. Sob condições fisiológicas, estas citocinas inibidoras servem de

elementos imunomoduladores que limitam a área nos tecidos lesionados ou excesso de

reações inflamatórias. Existe um equilíbrio entre estes tipos de citocinas, que pode ser

alterado por influência genética, ambiental e principalmente por microorganismos (Opal &

DePalo, 2000) (Fig.10).

Dois padrões de citocinas produzidas por linfócitos TCD4+ (T-helper), foram

indentificados por análise clonal de células T de camundongos, os linfócitos Th1 e Th2

(Mosmann & Coffman, 1989), e posteriormente foram caracterizados tambem estas mesmas

subpopulaçãoes de TCD4+ em humanos, sendo que a definição foi extendida para inclusão de

outra subpopulação de Th CD4+, a Th0 (Firestein et al., 1989). A resposta Th1 é definida

como uma forte resposta imune celular com uma normal ou aumentada produção de citocinas

predominantemente Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-15 (IL-15), Interferon-γ (IFN-γ) e

Fator de necrose tumoral-α (TNFα). Enquanto a resposta tipo Th2 é definida como uma

redução ou não detectável resposta celular, acompanhada por um aumento na ativação de

linfócitos B e um aumento nos níveis de Interleucina - 4 (IL-4), Interleucina-5 (IL-5),

Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-10 (IL-10) (Lucey et al., 1996).

25

Figura 10: Esquema do balanço da proteção e imunopatologia na infecção fúngica: cooperação entre resposta imune inata e adaptativa. Muitos fungos são detectados e destruídos dentro de horas por mecanismos de defesa inatos mediados por fagócitos e opsoninas através de envolvimentos de distintos receptores padrão de reconhecimento (PPRs). Estes mecanismos agem imediatamento e são seguidas algumas horas depois por um inicio de indução de resposta inflamatória, a qual pode ser ativada pela infecção, porem pode gerar imunidade protetora duradora. Estas fases iniciais ajudam manter a infecção sobre controle. Em vertebrados, entretanto, se o fungo romper estas linhas de defesa iniciais, segue-se uma resposta imune adaptativa com geração de células efetoras antígeno específicas T helper (Th), células T regulatórias (T reg) e células B que especificamente atingem o patógeno e induzem células memórias que previne subsequentemente infecções com alguns microorganismos. Células dendriticas capturam o fungo no local de colonização ou infecção, transporta-os para os linfonodos e ativam células Th e Treg. As diferentes subpopulações Th (Th1, Th2, Treg) liberam um distinto painel de citocinas capazes de ativar e inibir sinais efetores da fagocitose. A ativaçãp de apropriada subpopulação de células Th é instrumental na geração de uma resposta imune de sucesso contra fungos. Controle de células Treg serve para evitar uma excessiva resposta inflamatória e contribui para o desenvolvimento de uma memória imune anti-fúngica (Romani, L., 2004).

Fatores de virulência produzidos pelos fungos podem modular a resposta imune do

hospedeiro, sendo que o tipo de resposta imune adaptativa, Th1 ou Th2 geralmente determina

26

1.5.1 CITOCINAS Th1

A resposta imune mediada por células (Th1), envolve a ativação de macrófagos e

indução de linfócitos T CD4+, linfócito T citóxico CD8+ a produzirem citocinas, as quais

regulam a resposta imune. As células Th1 produzem entre outras citocinas:IFN-γ, TNF-α, IL-

2, IL-12 e IL-18. As células Th1 mediam a ativação de macrófagos e de outras células via

IFN-γ e TNF, caracterizando assim como uma típica resposta imune celular (Powrie &

Coffman, 1993).

A IL-12, produzida por linfócitos B e macrófagos, estimula a produção de IFN-γ por

linfócitos T e células NK, induz a diferenciação de linfócito T. Existe evidencias que a IL-12

exerce um papel importante na resistência mediada pela imunidade celular a bactérias e

parasitas intracelulares (Trinchieri, 2004).

A IL-18 é produzida por várias células, entre as quais macrófagos, células epiteliais e

células dendriticas. Também conhecida como fator indutor de IFN-γ pelas células T e

estimuladora da atividade citóxica de células NK, é uma citocina pleiotropica envolvida na

polarização Th1 da resposta imune durante a inflamação (Swain, 2001).

Estas citocinas, conhecidas por terem grande importância no controle da produção de

Interferon-γ (IFN-γ), sinergicamente induzem a produção de IFN-γ por células NK e óxido

nítrico por células do exudato peritoneal de camundongos, estimulando a atividade inbitória

destas células no crescimento de C. neoformans (Zhang et al., 1997). Em infecção in vitro de

DCs com Clamydia trachomatis foi demonstrado que as células dendriticas produzem IL-12 e

18 e agindo sinergicamente, ambas citocinas simultaneamente estimulam células matadoras

naturais (NK) a produzirem IFN-γ (Hook et al., 2005).

O IFN-γ é um potente imunomodulador, aumentando varias atividades microbicidas

em fagócitos normais, como a fagocitose, apresentação de antígenos, explosão oxidativa,

produção de óxido nítrico e aumento da produção de Fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e

IL-12 pelos macrófagos. O IFN-γ é produzido pelas células T CD4+, CD8+, células NK, e

quando produzida por estas últimas pode funcionar como mediador da imunidade inata e

28

contribuir para o choque séptico (Kullberg & Anaissie, 1998). IFN-γ aumenta a explosão

oxidativa e atividade antifúngica em macrófagos e polimorfonucleares neutrófilos (PMNs)

humanos contra um largo espectro de fungos patogênicos de relevância médica, como: C.

albicans, A. fumigatus, C. neoformans, P. brasiliensis e Blastommyces dermatitidis (Roilides

et al, 2003). Demonstrou-se em estudos com camundongos que a Interleucina-18 (IL-18),

citocina pró-inflamatória proteje contra disseminação de C. albicans e que os dados sugerem

que este efeito protetor é mediado através IFN-γ endógeno (Stuyt et al., 2002).

O TNF-α é um mediador tanto da imunidade inata como da adaptativa, sendo um

importante elo entre as respostas imunes e a inflamação aguda. A principal fonte de TNF-α é

o fagócito mononuclear, embora as células T e NK ativadas por antígenos podem produzir e

secretar esta citocina. A principal função do TNF-α é ativar e diferenciar monócitos e

macrófagos, assim como age sinergicamente com IFN-γ para ativação de macrófagos

citotóxicos para parasitas (Vassalli, 1992).

O TNF-α aumenta a atividade antifúngica dos PMNs sobre blastoconídios de C.

albicans e C. glabrata (Ferrante, 1989), assim como aumenta a capacidade de destruição de

hifas por PMNs de A. fumigatus e atividade fagocítica de conídios de macrófagos residentes

(Roilides et al., 2003). O mecanismo pelo qual o TNF-α aumenta a atividade antifúngica dos

PMNs, pode estar parcialmente relacionada a um aumento na expressão de receptor de

complemento 3 (CR3) e aumento dos mecanismos oxidativos (Klebanoff et al., 1986).

1.5.2 CITOCINAS Th2

As células tipo Th2 produzem uma variedade de citocinas antinflamatórias, incluindo

IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 e TGF-β, promovendo resposta imune humoral contra

patógenos extracelulares (Kelso, 1995).

As citocinas antinflamatórias são uma série de moléculas imunoreguladoras que

controlam a resposta e síntese de citocinas pró-inflamatórias, como as Interleucina-1 (IL-1),

fator de necrose tumoral (TNF) e de outras citocinas pró-inflamatórias, agindo em acordo com

inibidores e receptores de citocinas para regular a resposta imune (Opal & DePalo, 2000).

29

O TGF-β é uma potente citocina reguladora com diversos efeitos sobre linfócitos,

células NK, macrófagos, granulócitos e células dendriticas. Esta citocina controla o início e

resolução da resposta inflamatória, atividade modulada pelo estágio de diferenciação celular,

presença de citocinas inflamatórias e moléculas co-estimulatórias. As atividades desta citocina

ainda é objeto de pesquisa, porém sabe-se que está envolvida na morfogênese de vários

tecidos e órgãos, na patogênese da inflamação, reparação tecidual e doenças fibróticas

humanas (Werner & Alzheimer, 2006). Todos os leucócitos produzem e respondem para

TGF-β, exerce efeito estimulatório e inibitório sobre células do sistema imune, tais como:

sobre macrófagos estimula a quimiotaxia, inibe fagocitose e apresentação de antígeno; sôbre

células T estimula a sobrevivência, inibe a proliferação, diferenciação e função efetora; sôbre

as células dendríticas e células de Langerhans estimulam o desenvolvimento, inibem a

maturação e apresentação de antígenos de ambas (Li et al., 2006). Estudos demonstram que

TGF-β apresenta em papel benéfico na resistência adquirida contra C. albicans em

camundongo, pois administração de TGF-β recombinante em camundongos succetiveis para

C. albicans provoca um efeito protetor e demorado a progressão da doença (Spaccapelo et al.,

1995). Em contraste, localmente TGF-β suprime a defesa do hospedeiro imunocomprometido

em candidíase invasiva (Letterio et al., 2001). Em candidíase vaginal experimental em

camundongos, foi detectado alto nível de TGF-β no tecido infectado, comparados com níveis

de outras áreas do trato genital, dados que sugerem a importância desta citocina na resposta

imune da mucosa vaginal contra C. albicans (Taylor et al., 2000).

A IL-4 é uma glicoproteina produzida por células Th2 maduras, mastócitos, células B

e células do estroma, desempenha um papel crítico nas reações inflamatórias mediadas por

IgE e esosinófilos. Esta citocina estimula o desenvolvimento dos linfócitos Th2 e inibição da

síntese de citocinas pro-inflamatórias, entre elas IL-1, TNF-α, IL-6 e IL-8. A IL-4 suprime a

resposta Th1 através da regulação para baixo da produção de IL-12, oxido nítrico e ação

microbicida dos macrófagos, assim como a inibição de diferenciação de células típicas Th1

(Paul, 1991).

A Interleucina-10 (IL-10) é uma citocina produzida pelos macrófagos ativados, alguns

linfócitos e queratinócitos. As duas principais atividades desta citocina são inibir a produção

30

de outras citocinas pelos macrófagos e funções acessórias deste fagócito na ativação de

células T. Este último efeito é devido à inbição da produção de IFN- α e redução da expressão

de moléculas co-estimuladoras MHC classe II, B7-1 e B7-2, como efeito a inibição do

processo inflamatório (Moore et al., 2001). C. albicans induz imunossupressão através de IL-

10, mecanismo de escape similar também é observado em infecções por A. fumigatus, hifas e

conídios induz a liberação desta citocina, a qual prejudica a resposta imune celular nescessaria

para resolução da infecção (Akira et al., 2006).

A interleucina-13 (IL-13) é produzida por linfócito T ativado, e tem a capacidade de

inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias, inibindo a resposta Th1 através da supressão

da produção de IL-12, TNF e regulando para baixo a expressão de moléculas co-

estimuladoras em células apresentadoras de antígeno, favorecendo assim o desenvovimento

de uma resposta Th2 (De Wall Malefyt et al., 1993).

As citocinas IL-4, IL-10 e IL-13 são críticas para direcionar a defesa do organismo

para uma resposta humoral e são especializadas em regular e diminuir a extensão da

inflamação induzida pelas citocinas Th1. Particularmente a IL-10 tem um potente efeito

inibidor sobre células Th1 e age em macrófagos regulando para baixo a expressão das

moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC-classe II) e atenuando a

produção de citocinas pro-inflamatórias, como as TNF-α, IFN-γ e IL-12 (Mehad &

Standiford, 1999).

Dessa maneira IL-4 e IL-10 diminuem a resposta oxidadativa e atividade antifúngica

de PMNs e MNCs contra C. albicans (Roilides et al., 1997b), assim como para A. fumigatus

(Roilides et al., 1997a). Produção de IL-4 parece ter um significante papel na progressão da

Paracoccidiodomicose pulmonar disseminada, pois o fungo P. brasiliensis é fagocitado e

cresce intracelularmente em monócitos e macrófagos humanos (Brummer et al., 1992).

A resposta imune humoral controlada pelas citocinas Th2, em cromoblastomicose

pouco se conhece. Foi observado que no soro pacientes, altos níveis de anticorpos totais são

dectáveis por sorologia (Villalba, 1988), mais específicamente imunoglobulina M (IgM) e A

(IgA) (Esterre et al., 2000) e que o método imunoenzimático (ELISA), é um bom método

31

sorológico para avaliar a resposta imune de pacientes portadores desta micose, causada pelo

F. pedrosoi (Vidal et al., 2003).

1.6 INTERAÇÃO DE CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE X FUNGOS

Os fungos possuem uma variedade de moléculas de padrão associado a patógenos

(PAMPs), que são capazes de iniciar fagocitoses e ativar vias pró-inflamatórias após

reconhecimento pelos receptores-manose (MR) e receptores β-glucana, lectinas ligadas a

manose (MBL), receptores para complemento (CR) e receptor Toll-like (TLR) 2 e 4 (Romani,

2004) (Fig.11)

Figura 11: Esquema do reconhecimento e ativação de função antifúngica em fagócitos (Romani, L., 2004).

Macrófagos, expressam entre outros, receptores Toll-like, que reconhecem moléculas

de padrão molecular associado a patógeno (PAMPs) na superfície de fungos. Estas células

fagocíticas tornam eficientes células efetoras após estimulação por citocinas pró-

inflamatórias. Destrõem fungos por mecanismos que incluem fusão lisossomal, acidificação

32

de fagossomos, seqüestro de ferro e degradação enzimática de proteínas fúngicas, e

mecanismos extracelulares mediados pela liberação de peptídeos antifúngicos, óxido nítrico e

possivelmente radicais intermediários do oxigênio (Lovchik et al., 1995). Os macrófagos

possuem um mecanismo antimicrobiano adicional, pelo qual podem utilizar a produção de

óxido nítrico, para inibir o crescimento de fungos patogênicos endocitados, como o C.

neoformans (Aspaugh & Granger, 1991). Estudos demonstram que produtos fúngicos, como o

principal polissacarídeo componente da cápsula do C. neoformans, a glucuronoxylomanana

(GXM), interagem com o Toll-like-4 destes fagócitos (Shoham et al., 2001). A GXM também

pode ser reconhecida pelo Toll-like-2, receptor para manose, receptor FcγRII, CD14 e CD18,

sendo que esta interação as vêzes immunestimula outras vêzes imunessuprime, sendo capaz

de induzir apoptose de células T, direcionando para uma resposta imune Th2 (Monari, et al.,

2006).

Em pacientes imunocompetentes, as maiores células fagocíticas do pulmão,

macrófagos alveolares, destroem conídios de A. fumigatus, assim como outros

microorganismos inalados. Os mecanismos celulares da internalização e destruição ainda são

pouco conhecidos. A polimerização da actina e a atividade da phosphatidylinositol-3-kinase,

assim como a maturação do fagossomo do conídio de A. fumigatus produz um fagolisossomo,

com destruição conidial dependente da acidificação deste compartimento, são mecanismos

requeridos para o início da fagocitose (Ibrahim-Granet et al., 2003). Macrófagos quando

estimulados por conídios de Aspergillus produzem citocina pró-inflamatórias incluindo TNF-

α, IL-1α, IL-1β, através de macanismos dependentes de TLR-4, enquanto que por outro lado

hifas deste mesmo fungo estimulam a produção de citocina antinflamatória IL-10, através de

mecanismos dependentes de TLR-2. Assim, a ativação de receptores de superfície específicos,

durante a germinção pode facilitar o Aspergillus a neutralizar as defesas do hopedeiro (Netea

et al., 2004). Formas germinativas de A. fumigatus, conídios maduros e tubos germinativos

são reconhecidos por receptor Dectin-1 que estimula a produção de TNF-α na ausência de

sinal TLR2, demonstrando que a resposta inflamatória pulmonar é realizada por células

metabolicamente ativas, independentemente de lesão tecidual causada pela freqüente inalação

de esporos (Gersuk, et al. 2006).

33

Estas células atacam e fagocitam esporos de Zigomicetos e inibem a germinação,

enquanto que as hifas são danificadas por mecanismos extracelulares, porem não fagocitadas

completamente (Waldorf et al., 1984.). Macrófagos podem servir como proteção para certos

fungos dimorficos que se multiplicam e disseminam do pulmão para outros órgãos, como é

caso de Histoplasma capsulatum, típico patógeno intracelular de macrófagos humanos

(Woods, 2003). A ação fungicida do macrófago ativado não foi demonstrada nos conídios de

F. pedrosoi, devido à transição para hifa, mas ação fungistática ocorre durante as 24 horas de

interação, onde somente 20% dos conídios mudaram de forma, sendo que nos resultados da

interação com macrófagos residentes, todos os conídios passaram à forma de hifa. A produção

de radicais superóxidos produzidos na explosão respiratória por macrófagos ativados é

revelada no contato destes com conídios do fungo pela redução do agente azul de

nitrotetrazolina (Rozental et al., 1994). O fungo F. pedrosoi não melanizado quando

interagido com macrófagos sofre maior índice de endocitose do que o fungo melanizado,

entretanto este último quando é endocitado é capaz de liberar melanina dentro do vacúolo nos

macrófagos. A liberação de melanina pode representar um mecanismo de escape dos fungos

melaninzados aos sistemas microbicidas dos macrófagos (Farbiarz et al., 1992).

Os PMNs expressam em sua superfície receptores para quimiocinas que uma vez

estimulados, os recrutam rapidamente para o foco inflamatório, sendo que estudos

demonstram que a glucuronoxylomannan (GXM) de C. neoformans e frações de

mananoproteinas, MP-4 de outros fungos inibem a migração deste leucócitos (Lipovsky et al.,

1998). Neutrófilos reconhecem e internalizam células leveduriformes opsonizadas ou não de

Candida, via PAMPs, incluindo TLRs, receptores para manose e receptores para β-glucanas,

destruindo-as por mecanismos oxidativos, incluindo geração de radicais intermediários de

oxigênio e nitrogênio, e por mecanismos não oxidativos. A fagocitose e a destruição são

aumentadas pela opsonização e ação de citocinas (Bellocchio et al., 2004). Efeito fungicida é

observado na interação do fungo F. pedrosoi com neutrófilos, por um mecanismo

independente de anticorpo, através da produção e liberação de produtos derivados de O2.

Estes efeitos resultados da explosão respiratória são demonstrados por mi951 0copi î3pico,

peroxidase, a enzima responsável pela produção de hipoclorito a partir do H2O2 no fungo já

internalizado (Rozental et al., 1996).

As DCs são capazes de fagocitar células fúngicas e apresentar antígenos às células T,

iniciando resposta imune adaptativa mediada por células, assim como podem destruir

blastoconídios e danificar as hifas de C. albicans, apesar de serem menos potentes que

monócitos e macrófagos (Newman & Holly, 2001; Netea et al., 2004). Vários receptores

sobre DCs participam de eventos de reconhecimento, incluindo receptores para vários

componentes do sistema complemento (CR), receptor para Fc (FcγR) e receptores de

reconhecimento padrão (PRRs), como o receptor de manose (MR)(Reis e Souza, 2001). O

reconhecimento de moléculas do padrão molecular associado a patógeno (PAMPs), são

considerados um pré-requisito para o sistema imune ser capaz de discriminar entre diferentes

patógenos e instruir a resposta imune adaptativa (Medzhitov & Janeway, 2002).

As DCs expressam em sua superfície antígeno VLA-5 (very late antigen-5), que

reconhecem conídios de A. fumigatus e células leveduriformes de H. capsulatum e direciona a

internalização e eventual processamento de antígenos destes fungos, sendo que as DCs

mostraram que são superiores aos macrófagos no controle do crescimento intracelular de H.

capsulatum (Gildea et al., 2001). DCs podem internalizar conídios de A. fumigatus através de

receptor de manose (MR) e hifas através de receptor para C3 e FcγR, assim como pode

discriminar a produção de citocinas por estímulos das duas formas do fungo. Sendo que a IL-

12 é produzida quando estimulada com conídios e IL-4 e IL-10 quando as DCs são

estimuladas com hifas, entretanto ambas as formas induzem a produção de TNF-α (Bozza et

al., 2002). Estudo de interação de DCs de medula óssea de camundongo com artroconídios de

Coccdiodes posadasii, mostra aumento na expressão de moléculas co-estimulatórias CD40,

CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) e significante aumento na secreção de IL-12 pelas DCs, assim

como possibilidade do reconhecimento do fungo ser realizado através dos TLRs 2 e 4

(Awasthi & Magee, 2004). Estudo comparativo sobre mecanismo de estimulação de produção

de citocinas por blastoconídios e hifas de C. albicans, sobre células mononucleares de sangue

periférico (PBMC), macrófagos residentes peritoneais e linfócitos de baço de camundongo

C57BL, mostrou que blastoconídios estimula TLR-2 e TLR-4, sendo que o TLR-4 é o

responsável pela produção de IFN-γ. Em contraste as hifas não foram reconhecidas pelo TLR-

35

4. Ambas as formas de C. albicans induziram grande quantidade de IL-10 através de TLR-2,

porém, não foram capazes de estimular IFN-γ através deste receptor (Van der Graaf et al.,

2005). Também interação de DCs originadas de PBMC com mananoproteinas de parede

celular de C. albicans (MP65), demonstrou que MP65: facilita a maturação de DCs, aumenta

a expressão de moléculas co-estimulatórias CD40, MHC classe II, CD80 e CD86 e promove

estimulação de secreção de citocinas proinflamatórias como as IL-6, TNF-α e ativação gênica

de IL-12 a qual é considerada citocina chave para indução da resposta Th1 (Pietrella et al.,

2006). DCs purificadas de baço de camundongo quando estimuladas com mananoproteinas,

demonstra resposta imune inata a este glicoantígeno encontrado na parede de fungos, neste

caso de C. neoformans, sugerindo que múltiplos receptores de manose sobre a superfície de

DCs reconhecem mananoproteinas.Estes dados sugerem que DCs estabelece a ligação crucial

entre a resposta imune inata e adaptativa para C. neoformans através de um processo

dependente de eficiente afinidade entre mananoproteinas e receptores de manose (Mansour et

al., 2006).

Diferentes tipos de células de mamíferos foram utiliadas para estudar a interação de

fungo F. pedrosoi com o hospedeiro, o processo de adesão foi estudado com a interação entre

o fungo e células mutantes de ovários de hamster chinês (CHO) que apresenta determinados

resíduos de açúcares, com os resultados demonstrando a importância dos resíduos de manose

para a adesão do fungo. Este resultado foi comprovado com a ação da concanavalina-A, uma

lectina que se liga especificamente à resíduo de manose, diminuindo o índice de adesão do

fungo as células CHO. O passo seguinte à adesão é a penetração das células fagocíticas pelo

fungo, ou seja, a invasão, e nesta etapa os resíduos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) se

mostraram fundamentais, pois na presença da aglutinina de germe de trigo (WGA), que se

liga aos resíduos de GlcNAc, o número de fungos aderidos aumentou, indicando a diminuição

da endocitose (Limongi et al., 1997). Um processo ativo pode ser a via de penetração do

fungo F. pedrosoi em células não fagocíticas, sendo que carbohidratos como a manose e N-

acetilglucosamina encontrados na superfície de células CHO, liga-se a uma com 50kDa,

semelhante a lectina, constituinte da parede do conídio do fungo (Limongi et al., 2001). Além

disso, a fosforilação de proteínas pela ação de uma serina quinase do fungo parece ser

necessária para a invasão nas células não fagocíticas, dado demonstrado com a inibição da

serina quinase de conídios do F. pedrosoi que leva a diminuição do índice de invasão nas

36

células epiteliais e nenhum efeito nos macrófagos (Limongi et al., 2003). Um outro açúcar da

superfície do fungo que parece ser importante no processo de adesão é o ácido siálico

(Alviano et al., 1999). O tratamento de conídios de F. pedrosoi com sialidase demonstra:

diminuição na mobilidade eletroforética das células, diminuição na ligação das células com

ferritina cationizada e com ferro coloidal, além de alterações morfológicas e diferenças no

derivado do ácido N-acetilneuramínico, que é o açúcar formador do ácido siálico de conídios

e micélio de F. pedrosoi (Souza et al., 1986). Entretanto, ácido siálico ou glicoproteínas

sializadas não foram detectados em células escleróticas, o que sugere uma proteção de

conídios e micélios contra a fagocitose pelas células de defesa do hospedeiro e que depois de

instalada a doença, o fungo se diferencia para as células escleróticas que são altamente

resistentes (Alviano et al., 2004b). Conídios de F. pedrosoi apresentam ectofosfatase ácida na

parede celular e estudos mostram relação desta enzima com a adesão do fungo com células de

mamífero. Considerando que conídios são formas infectantes para o hospedeiro, a expressão e

a atividade de fosfatase na superfície do fungo, pode contribuir com os mecanismos primários

requeridos para o estabelecimento da cromoblastomicose (Kneipp et al., 2004). Assim como

podem os conídios ao produzir enzimas proteolíticas que influenciam em seu

desenvolvimento celular, também degrada estruturas teciduais importantes do hospedeiro,

com conseqüências importantes para o entendimento da relação fungo-hospedeiro (Palmeira

et al., 2006).

1.7 INTERAÇÃO DE CÉLULAS DE LANGERHANS X FUNGOS

A interação de CsL com microorganismos tem sido raramente investigada, parasitismo

de CsL com bactérias tem sido reportado somente por biópsia de paciente com hanseníase

(Poulter et al., 1984), e com sífilis granulomatosa (Mittag & Klingmüller, 1983). As CsL

desempenham um papel decisivo na interação entre os parasitas da leishmaniose e o sistema

imune do hospedeiro. Atuando como células hospedeiras, células acessórias que apresentam

antígenos dos parasitos liberando sinais co-estimuladores, secretando citocinas que modulam

atividades de células T e atuando como células efetoras na eliminação dos organismos

parasitários. A caracterização do papel dessas células na leishmaniose cutânea e dos fatores

que regulam suas atividades ficou demonstrada que as CsL são requeridas para o transporte da

Leishmania major do tecido parasitado para o nódulo linfático satélite, iniciando aí a resposta

37

imune mediada por células T específica. Sendo que no início da infecção, CsL que contém de

forma persistente os parasitas nos nódolos linfáticos podem estar envolvidas na manutenção

da resposta imune específica (Moll, 1997). Estudos sobre relação entre C. albicans e células

de Langerhans por métodos de histoquímica e imunohistoquimica, em tecidos de pacientes

com candidiase oral, demonstraram que CsL expressam moléculas de superfície T6 ao

interagirem com hifas, não ocorrendo o mesmo com células leveduriformes (Daniels et al.,

1985). Caracterização imunohistologica do infiltrado celular em infecções da pele por

dermatóficos, Trichophyton rubrum e Microsporum canis, mostra aumento de CsL na

epiderme e derme na área micótica, demonstrando a participação destas na resposta imune a

estes fungos (Szepes et al., 1993). Na Paracoccidiodomicose, ocorre uma diminuição da

densidade e alterações morfológicas das células de Langerhans na pele de pacientes com a

forma disseminada, refletindo a depressão da imunidade celular provocada pela infecção com

o P. brasiliensis (Gimenez et al., 1987). Análise por microscopia ótica e eletrônica, de

transmissão em biopsias de lesões de cromoblastomicose causadas por C. carrionii, mostrou

entre outros componentes do processo infeccioso grande número de CsL, porém ainda não foi

determinado o papel destas células frente a este agente (Sanchez-Mirt et al, 1995). Recentes

estudos demonstraram por imunohistoquimica em cortes histológicos de biopsias de pacientes

de cromoblastomicose, depósitos de antígenos de F. pedrosoi no citoplasma de CsL,

concluindo que estas células podem ter função de células apresentadoras de antígeno e estar

envolvida no processo inflamatório granuloso, característico desta micose (Sotto et al., 2004).

Em virtude do isolamento de células de Langerhans da pele e membranas mucosas ser

um processo complexo, durante o qual, somente poucas células são obtidas, tem-se utilizado

células progenitoras CD34+ induzidas com fatores estimulantes a partir de sangue periférico

ou cordão umbilical, as quais possuem características de CsL (Caux et al., 1996). Estudos

com células de Langerhans induzidas a partir cultivo de células CD34+ de cordão umbilical

(iCL), interagindo com conídios de A. fumigatus, demonstraram a adesão de conídios, rara

fagocitose e ativação de iCL, capacitando-as para migrarem e ativarem linfócitos T para uma

resposta imune específica (Persat et al., 2003). CsL isoladas e purificadas de epiderme de

BALB/c estimuladas com baixas e altas (1ηg/ml e 1µg/ml respectivamente) quantidade de

lipopolissacarideos (LPS) secretam IL-6 e IL-12 e não alteram a expressão de moléculas

coestimulatórias CD40, CD80 e CD86 (Tada et al., 2004). Em relação a interação de células

38

de Langerhans de epiderme isoladas ou não, assim como células CD34+ de cordão umbilical

(iCL) com o F. pedrosoi, principal agente da cromoblastomicose, não existem dados na

literatura.

39

2 OBJETIVOS.

2.1 Geral

Analisar a relação fungo-hospedeiro na cromoblastomicose, caracterizando o perfil da

citocina TGF-β presente no plasma de pacientes, antes e após o tratamento clínico, e as

alterações ultraestruturais e imunológicas decorrentes da interação de CsL isoladas e

purificadas da epiderme de camundongos Balb/c com o fungo F. pedrosoi.

2.2 Específicos:

2.2.1 Validar metodologia de isolamento de células de Langerhans da epiderme de

camundongos Balb/c fêmeas descrita na literatura.

2.2.2 Comparar, através de microscopia ótica, eletrônica de varredura e transmissão, a

morfologia das células de Langerhans isoladas a partir de epiderme de camundongos

Balb/c fêmeas, com as descritas na literatura.

2.2.3 Observar através da microscopia ótica, eletrônica de transmissão e varredura

aspectos ultraestruturais da interação de células de Langerhans e conídios do fungo F.

pedrosoi ocorrida nos períodos de 01, 03, 12 e 36h horas.

2.2.4 Observar através da microscopia ótica, eletrônica de transmissão e varredura

aspectos ultraestruturais da interação de células de Langerhans e células escleróticas

induzidas in vitro do fungo F. pedrosoi ocorrida nos períodos de 01, 03, 12 e 36h horas.

2.2.5 Identificar o perfil das moléculas co-estimulatórias expressas na membrana das

células de Langerhans, após 36h de interação com o fungo F. pedrosoi, com ênfase para B7-2

e CD40.

40

2.2.6 Quantificar a citocina TGF-β presente no plasma de pacientes com

cromoblastomicose, correlacionar com o tratamento e aspecto clínico das lesões.

2.2.7 Quantificar a citocina TGF-β no sobrenadante da interação entre conídios e

células escleróticas induzidas in vitro de F. pedrosoi e células de Langerhans, após 36h.

41

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Biológico.

A colheita de tecido de lesões cutâneas e subcutâneas por curetagem e biópsias, assim

como sangue para obtenção de plasma, foi realizada em pacientes portadores de

Cromoblastomicose atendidos no Centro de Referência e Treinamento em Dermatologia

Sanitária “Dr Marcelo Cândia” - URE/SESPA, na cidade de Marituba-PA, após

consentimento informado. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética Envolvendo Seres

Humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará.

As CsL foram obtidas de camundongos Balb/c fêmeas, fornecidos pelo biotério do

Instituto Evandro Chagas-SVS/MS.

3.2 Métodos Laboratoriais.

3.2.1 Isolamento do fungo F. pedrosoi: O fungo foi isolado, a partir de tecidos

curetados de lesões e inoculados em ágar-Mycosel (Bencton-Dickinson, USA),

após crescimento do fungo neste meio o fungo foi mantido por repiques sucessivos

em ágar-Sabouraud à temperatura ambiente (25ºC). A identificação da espécie

fúngica foi realizada por microcultivo em lâmina pela técnica de Riddell (Riddell,

1950) em ágar-dextrose Batata (Merck Company, Germany).

3.2.2 Produção de Micélio: As cepas isoladas de F. pedrosoi foram mantidas em meio

ágar-Sabouraud e a partir do estoque foi realizado um inoculo em meio ágar-

dextrose-Batata para produção de micélio.

3.2.3 Produção de Conídios: A partir da cultura do micélio foi realizado um inóculo em

meio ágar-dextrose-Batata, após crescimento da colônia, a massa fúngica foram

coletada e suspensa em soro fisiológico. A suspensão foi passada em vortex e os

conídios foram filtrados em rede de nylon estéril e lavados 03 vezes por

centrifugação de 4000rpm/5 minutos com solução salina tamponada por fosfato

42

(PBS), pH 7.2, 0,1M e quantificados em câmara de Neubauer. Conforme Bozza et

al., 2002, verificou-se a viabilidade dos conídios de >95% por diluição seriada

apartir de 107 conídios (CFU)/ml e inoculada em RPMI 1640 distribuido em placas

de 24 poços, observado por microscopia o desenvolvimento de hifas e

contabilizado a porcentagem de diferenciação.

3.2.4 Produção de Hifas: As hifas de F. pedrosoi utilizadas em nossos experimentos

foram obtidas segundo Van der Graaf et al., 2005. Uma concentração definida de

107CFU/ml (conídios) de F. pedrosoi foi utilizada para produção de hifas. Os

conídios foram cultivados em RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis-USA), com

pH ajustado para 6.4, por 36h à temperatura ambiente. Após 36h os conídios

deram origem a hifas, com uma média de 95% de diferenciação de conídios para

hifas, observada e quantificada por microscopia. As hifas foram resuspensas em

RPMI 1640 e o volume foi ajustado para obtenção de um inóculo do tamanho

original, ou seja, 107/ml de hifas.

3.2.5 Produção de Células escleróticas in vitro: A metodologia de produção de células

escleróticas apartir de conídios, foi procedida de acordo com Silva, 2006

(Dissertação de Mestrado), e pode ser descrita da seguinte forma: De um meio

quimicamente definido, composto por 4,0g de Dextrose, 1,9g de Nitrato de

Potássio, 4,0g de Fosfato de Sódio Monobásico e 0,9g de Sulfato de Magnésio em

100ml de água destilada, com o pH sido ajustado para 2.7. A partir desta solução

faz se uma diluição 1:1000, ou seja, deste meio concentrado retira-se 0,1ml e dilui

em 100ml de água destilada, obtendo o meio desejado para diferenciação. O

cultivo ocorreu em 400µl de meio e conídios em uma concentração de 107/ml, em

placas de poliestireno de 24 poços, em um tempo de 10 dias à temperatura

ambiente, obtendo-se células escleróticas com características morfológicas

idênticas as células escleróticas observadas in vivo. A viabilidade das células

escleróticas de >95% foi observada por diluição seriada para se obter 20 células

por campo microscópico (40X) e inoculada em RPMI 1640 distribuido em placas

de 24 poços, observado por microscopia o desenvolvimento de hifas e

contabilizado a porcentagem de diferenciação.

43

3.2.6 Obtenção das células de Langerhans: As células de Langerhans foram isoladas,

purificadas e cultivadas conforme metodologia padronizada (Salgado et al., 1999):

Os camundongos Balb/c fêmeas foram sacrificados e removidos os pêlos, retirada

a pele da parte dorsal e ventral, esta foi cortada e incubada a 37oC em ambiente de

5% de CO2 com Dispase-3000UI/ml (Roche Company-Germany) por 03 horas. A

epiderme foi separada da derme e incubada com DNAase 0.025% (Sigma, St.

Louis, USA) por 20 minutos em temperatura ambiente. As células foram

separadas através de pipetagens vigorosas e incubadas com anticorpo monoclonal

anti-Iad (MHC classe II), de camundongo. (BD PharMingen, San Diego, CA)

diluido 1:600 por 45 minutos à 4ºC. A suspensão de células epidérmicas já

marcadas (anti-Iad) foi incubadas em placas de Petri plásticas previamente

revestidas com anticorpo anti-IgG fração Fc (Cappel, Durham, NC), diluído 1:100

por 01h à 4ºC. As placas foram lavadas para retirar o sobrenadante e as CsL

aderidas às placas foram removidas e cultivadas em meio RPMI-1640,

suplementado com soro fetal bovino à 10% (Gibco-USA).

3.2.7 Determinação do índice de purificação das CsL: Após o isolamento as células

foram aderidas em lamínulas previamente revestidas em poli-L-lisina à 1% e

fixadas com paraformaldeído a 4% em tampão PHEM pH 7,2, 0,1M por 1h. Em

seguida as células foram lavadas, usando tampão de bloqueio (PBS com albumina

a 3%) por 30 minutos 02 vezes e incubadas com anticorpo monoclonal MHC

Classe II (1:50) diluído em tampão de bloqueio, por 90 minutos em temperatura

ambiente. As células foram lavadas 03 vezes com tampão de bloqueio e incubadas

com o segundo anticorpo conjugado a FITC (hamster anti-camundongo- 1:100)

por 90 minutos em temperatura ambiente. A seguir as células foram lavadas, 02

vezes com tampão de bloqueio, e 01 vez com PBS pH 7,2. As lamínulas foram

montadas em lâminas de vidro com Permount (Fisher Scientific, USA) e

observadas em microscópio de fluorescência Nikon-Eclipse-E400.

3.2.8 Cultivo das células de Langerhans: As CsL isoladas e purificadas foram

cultivadas isoladamente ou em interação com as células fúngicas (conídios, hifas e

44

células escleróticas induzidas in vitro), em meio de cultura liquido, RPMI-1640,

suplementado com soro fetal bovino a 10% e incubação a 37oC, em ambiente de

5% de CO2.

3.2.9 Interação das CsL com o fungo F. pedrosoi: A interação foi realizada por

períodos de 01, 03, 12 e 36 horas, na proporção de 10 células fúngicas (conídios,

hifas e células escleróticas induzidas in vitro) para cada CsL, em meio de cultura

liquido, RPMI-1640, suplementado com soro fetal bovino a 10% e incubação a

37oC, em ambiente de 5% de CO2. Após o período de interação o sobrenadante foi

recolhido para pesquisa da citocina TGF-β e as células processadas para

observação por microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura e

transmissão.

3.2.10 Processamento de material para microscopia ótica:

3.2.10.1 Observação a fresco e após coloração pelo Giemsa: As CsL cultivadas sem a

presença do fungo F. pedrosoi (conídios e células escleróticas in vitro) foram

observadas a fresco entre lâmina e lamínula, assim como após coloração. As

quais após serem em aderidas em lamínulas redondas previamente recobertas

com poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis-USA), fixadas em solução de Bouin

(375ml de ácido pícrico saturado, 125ml de formaldeído e 25ml de ácido acético

glacial), por 1h e lavadas em etanol a 70% por 03 vezes, lavadas em H2O

destilada por mais 03 vezes e corado em solução de Giemsa (Merck Company,

Germany) 10% em H2O, durante 01h hora, a temperatura ambiente. Após este

período de incubação, o material foi descorado e desidratado em acetona/xilol, a

partir de acetona 100%, acetona 90%/xilol 10%, acetona 70%/xilol 30%, acetona

30%/xilol 70% e por fim xilol 100%. Em seguida a lamínula com o material foi

montada com Permount (Fisher Scientific, USA) sobre uma lâmina de vidro e

observadas em microscópico.

3.2.10.2 Imunofluorescência e Citometria de Fluxo: As CLs cultivadas com o fungo F.

pedrosoi (conídios e células escleróticas in vitro) por 36h, foram aderidas em

45

lamínulas redondas previamente recobertas com poli-L-lisina, fixadas com

paraformaldeído a 4% em tampão PHEM pH 7.2, 0,1M por 1h. Em seguida

lavadas, usando PBS com albumina a 3% por 30 minutos 02 vezes e incubadas

com anticorpo monoclonal coelho anti-camundongo para B7-2 e CD40 (1:50)

(BD PharMingen - USA) diluído em tampão de bloqueio (PBS + Albumina a

3%) por uma noite. Lavadas 03 vezes com tampão de bloqueio e incubadas com

o segundo anticorpo conjugado a FITC-coelho anti-camundongo (1:100) (BD

PharMingen - USA) por 90 minutos em temperatura ambiente. Lavadas 02 vezes

com tampão de bloqueio e 01vez com PBS pH 7.2. As lamínulas foram

montadas em lâminas de vidro com Permount (Fisher Scientific) e observadas

em microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse - E400). Para a Citometria de

Fluxo (FACS). As CLs cultivadas com o fungo F. pedrosoi (conídios e células

escleróticas induzidas in vitro) por 36h, foram colhidas, centrifugadas em tubos

de ensaio plástico (12mmX75mm), para remover o sobrenadante e fixadas com

paraformaldeído a 4% em tampão PHEM pH 7.2, 0,1M por 1h. Em seguida

lavadas, usando PBS com albumina a 3% por 30 minutos 02 vezes e incubadas

com anticorpo monoclonal coelho anti-camundongo para B7-2 e CD40 (1:50)

(BD PharMingen - USA) diluído em tampão de bloqueio (PBS + Albumina a

3%) por uma noite. Lavadas 03 vezes com tampão de bloqueio e incubadas com

o segundo anticorpo conjugado a FITC-coelho anti-camundongo (1:100) (BD

PharMingen - USA) por 90 minutos em temperatura ambiente. Lavadas 02 vezes

com tampão de bloqueio e 01vez com PBS pH 7.2. Em seguida analizada a

fluorescência média, obtida pelo citômetro de fluxo – FACS (Couter Epics XL,

Beckman Couter, USA).

3.2.11 Processamento de material para microscopia eletrônica.

3.2.11.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão: Para a realização da microscopia

eletrônica de transmissão (MET), as CsL obtidas de cultivo (CsL e CsL em

interação com conídios e células escleróticas indizidas in vitro) foram colhidas,

lavadas 02 vezes com tampão PBS em pH 7,2 e fixadas a temperatura ambiente

46

por 02 horas com 2,5% de glutaraldeído, 4% de paraformaldeído, cloreto de

cálcio 2,5mM em tampão cacodilato 0,1M e pH 7,2. Após 2 horas de fixação, as

células foram lavadas 3 vezes com tampão cacodilato 0,1M pH 7,2 e pós-fixadas

em solução contendo 1% de tetróxido de ósmio (OsO4), 0,8% de ferricianeto de

potássio, CaCl2 5mM, em tampão cacodilato 0,1M pH 7,2 à temperatura

ambiente por uma hora. Após esse tempo, as células foram novamente lavadas

03 vezes no mesmo tampão e desidratadas com passagem em uma série de

acetona em água a 20, 30, 50, 70, 90% e 100%, com tempo de 15 minutos para

cada etapa e duas vezes 20 minutos em acetona 100%. Após desidratação, as

células foram infiltradas conforme o seguinte esquema: antes da interação -

mistura epon/acetona na proporção 1:2, 1:1, 2:1 (06h cada etapa) e após

interação – mistura epon/acetona na proporção 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 e epon puro,

em 06, 12, 12, 24, 24 e 24h respectivamente. Após polimerização em epon por

48 horas, cortes ultrafinos foram obtidos e, em seguida, contrastados com acetato

de uranila e citrato de chumbo e observados em microscópio eletrônico de

transmissão. ZEISS 900.

3.2.11.2 Microscopia Eletrônica de Varredura: Para a realização da microscopia

eletrônica de varredura (MEV), células cultivadas em meio RPMI 1640 (CsL e

CsL em interação com conídios hifas e células escleróticas) foram coletadas e

lavadas 02 vezes em tampão PBS, pH 7,2 e fixadas a temperatura ambiente por

02 horas em uma solução contendo 2,5% de glutaraldeído, 4% de

paraformaldeído em tampão cacodilato 0,1M e pH 7,2. Após esse tempo, as

células foram aderidas em lamínulas previamente recobertas com poli-L-lisina e

novamente lavadas 03 vezes no mesmo tampão e pós-fixadas em solução

contendo 1% de tetróxido de ósmio (OsO4), 0,8% de ferricianeto de potássio,

5mM CaCl2 5mM em tampão cacodilato 0,1M pH 7,2 a temperatura ambiente

por uma hora, lavadas 03 vezes no mesmo tampão e desidratadas com passagem

em uma série de etanol em água a 20, 30, 50, 70, 90% e 100%, com tempo de 15

minutos para cada etapa e 02 vezes 20 minutos em etanol 100% e passadas por

um processo de secagem por ponto crítico de CO2. A seguir as lamínulas foram

fixadas em suporte para amostra (“stub”) e recobertas com ouro

47

(aproximadamente 2nm de espessura), e após a metalização utilizando aparelho

Emitech K550-England foram observadas em microscópio eletrônico de

varredura Leo 1450VP.

3.2.12 Quantificação da citocina TGF-β no sobrenadante. Foi utilizado teste

imunoenzimático ELISA (Kit / BD PharMingen - USA), baseado no princípio de

“sanduíche”, em sobrenadante de interação após 36h. Em cavidades de microplaca

de 96 poços previamente sensibilizadas individualmente com anticorpo

monoclonal de coelho anti-TGF-β de camundongo, foi adicionado 100µL do

sobrenadante da interação, agitado em um microagitador, velocidade aproximada

de 900rpm durante 15 segundos e incubada a placa por 90 minutos a 37ºC. Lavada

a placa 03 vêzes com PBS, pH 6.8. Adicionado em cada cavidade 100µl de

anticorpo de coelho biotinilado anti-TGF-β e incubada a placa por 60 minutos a

37ºC. Lavadas 03 vêzes com PBS, pH 6.8. Adicionado em cada cavidade 100µL

de Streptoavidina Peroxidase e incubada a placa por 60 minutos a 37ºC. Lavada a

placa 03 vêzes com PBS, pH 6.8. Adicionadas em cada cavidade 100µl de

substrato (peróxido de hidrogênio) e do cromógeno (TMB-Tetramethilbenzidina) e

incubada a placa por 15 minutos a 37ºC, e parada a reação adicionando 100µL de

ácido sulfúrico 1N e lida a absorvância da solução de cada cavidade a 450nm em

uma leitora de ELISA MRX Revelation-DINEX MB/USA.

3.2.13 Quantificação de TGF-β no plasma de pacientes com cromoblastomicose. Para

a quantificação de TGF-β no plasma de 12 pacientes com cromoblastomicose, foi

utilizado teste imunoenzimático ELISA (Kit / BD PharMingen - USA), baseado no

princípio de “sanduíche”, em plasma de pacientes. Em cavidades de microplaca

de 96 poços sensibilizadas individualmente com anticorpo monoclonal de coelho

anti-TGF-β humano e estocada a 4o C por uma noite. Após este tempo, 100µL de

plasma de cada um dos pacientes, foi adicionado em cada poço sensibilizado,

agitando-se a placa em um microagitador, velocidade aproximada de 900rpm

durante 15 segundos e incubada a placa por 90 minutos a 37ºC. Lavada a placa 03

vêzes com PBS, pH 6,8. Adicionado em cada cavidade 100µl de anticorpo de

coelho biotinilado anti-TGF-β e incubada a placa por 60 minutos a 37ºC. Lavadas

48

03 vêzes com PBS, pH 6,8. Adicionado em cada cavidade 100µL de

Streptoavidina Peroxidase e incubada a placa por 60 minutos a 37ºC. Lavada a

placa 03 vêzes com PBS, pH 6,8. Adicionadas em cada cavidade 100µl de

substrato (peróxido de hidrogênio) e do cromógeno (TMB-Tetramethilbenzidina) e

incubada a placa por 15 minutos a 37ºC, e parada a reação adicionando 100µL de

ácido sulfúrico 1N e lida a absorvância da solução de cada cavidade a 450nm em

uma leitora de ELISA MRX Revelation-DINEX MB/USA.

3.2.14 Analise Estatística. Os resultados das dosagens de TGF-β por ELISA no plasma

de pacientes com cromoblastomicose, foram co-relacionados com o tempo de

tratamento. O teste t-student pareado foi usado para comparar os resultados em 0,

3, 6, 12 meses de tratamento e foi encontrado um valor de p<0,005.

49

4 RESULTADOS.

4.1 Caracterização ultraestrutural das células de Langerhans purificadas da epiderme

de camundongos Balb/c. As CsL da epiderme de camundongos Balb/c, que são

encontradas neste tecido juntamente com outras células como queratinócitos, constituem

1 a 3% do total de células (Fig.12), foram isoladas e purificadas da epiderme (Fig.12A),

pelo método de panning (Salgado et al., 1999) e observadas por microscopia ótica a

fresco entre lâmina e lamínula (Fig.12C). Obtivemos um índice de purificação acima de

95% visualizado por imunofluorescência com marcadores para MHC-Classe II

(Fig.12B). Após a adesão das CsL e lâminas de vidro recobertas previamente com poli-

L-lisina e coloração pelo Giemsa, pode-se observar por microscopia ótica a presença de

dendritos, prolongamentos citoplasmáticos que caracterizam as células dendriticas

(Fig.12D). O material foi, também, visualizado por microscopia eletrônica de varredura:

após 1h (Fig.13A), 03h (Fig 13B) e 12h de cultivo, onde se observa a formação de

dendritos (Fig.13C). Em 36h (Fig.13D) de cultivo, em meio RPMI 1640 suplementado

com 10% de soro fetal bovino, observa-se a expressão de grande quantidade de

dendritos. As células recém-isoladas foram também observadas por microscopia

eletrônica de transmissão, onde podem ser observados prolongamentos citoplasmáticos

(dendritos)(Fig.14A-seta escura), assim como, reticulo endoplasmático rugoso (Fig.14B-

seta amarela) e grânulos de Birbeck, organela formada pela invaginação da membrana

que caracteriza ultraestruturalmente esta célula dentrítica (Fig 14B-seta clara).

4.2 Interação de células de Langerhans purificadas e conídios de F. pedrosoi. As CsL

isoladas e purificadas da epiderme de camundongos Balb/c foram co-cultivadas com

conídios de F. pedrosoi e observou-se, por microscopia ótica, que o fungo é fagocitado

pelas CsL após 03h de interação (Fig.15B-seta escura). Até o tempo de 36h de interação

ocorre internalização do conídio e a inibição da formação de hifas a partir dos conídios

livres em co-cultivo com CsL (Fig.15C-seta escura), quando comparado com cultivo

controle, onde observa-se a formação de tubo germinativo (hifas)(Fig.15A-seta clara).

Por microscopia eletrônica de varredura pode-se observar o conídio de F. pedrosoi

(Fig.16A), inicio da internalização do conídio com 01h de interação (Fig.16B-seta

50

Observou-se que conídios do fungo inibem a expressão de CD-40 (Fig.21B) e também a

expressão de B7-2 (Fig.22B). Enquanto que as células escleróticas induzidas in vitro não alteraram a expressão de CD-40 (Fig.21C) e aumenta a expressão de B7-2

(Fig.22C), após 36H de interação com CsL. Células CsL controles cultivadas pelo

mesmo período expressam CD-40 e B7-2 (Fig.21A e 22A). Obervou-se também, através

de citometria de fluxo a média de intensidade de flourescência da expressão de CD40 e

B7-2 (Fig.23), que comparada com os controles negativos, mostram uma fraca

expressão de CD40 na superfície das CsL, após co-cultura com conídios e não houve

diferença quando observa-se CsL que interagiram com células escleróticas induzidas in

vitro (Fig.23A). Quanto a expressão de B7-2, observa-se que após interação com

conídios, as CsL não expressam significantemente esta molécula co-estimulatória,

enquanto que após interação com células escleróticas induzidas in vitro, as CsL

expressam fortemente a molécula B7-2 em sua superfície (Fig.23B).

4.6 Quantificação de TGF-β no plasma de pacientes portadores de

cromoblastomicose: Após confirmação do diagnóstico pelo exame direto

(Fig.24A), cultura em ágar-Mycosel (Fig.24B) e microcultivo em lâmina (Fig.24C),

foi avaliado o nível de TGF-β no plasma de 12 pacientes com cromoblastomicose,

sendo 11 homens e 01 mulher, pelo método de ELISA, durante o período de 12

meses. Foi observado que os pacientes demonstraram uma grande melhora clínica

nos primeiros 03 meses de tratamento com Itraconazol (200mg/dia) (Fig. 24D-E,

G-H), entretanto nos meses seguintes a resposta ao medicamento ocorreu de

maneira mais lenta (Fig.24F e I). A dosagem dos níveis plasmáticos de TGF-β

(Fig.25), dos mesmos pacientes, revelou altos níveis desta citocina, antes do

tratamento (média: 7.016 ± DP: 1988 pg/ml), em comparação com os níveis dos

controles, indivíduos sem nenhum tipo de doença granulomatosa, (média: 3.791 ±

209 pg/ml; p < 0.005). Os pacientes apresentaram uma queda significativa nos

níveis de TGF-β no plasma após 03 meses (4.625 ± 645 pg/ml; p < 0.005) de

tratamento com Itraconazol, queda acompanhada com uma rápida melhora clínica,

especialmente relacionada ao aspecto seco e ao tamanho das lesões. Entretanto após

06 meses (6.566 ± 777 pg/ml; p < 0.001) e 12 meses (6.908 ± 776; p < 0.001) de

tratamento, o nível de TGF-β aumenta, retornando quase aos mesmos níveis

52

observados antes do tratamento (Fig. 25). Aumento este relacionado com uma lenta

melhora clínica (Fig.24D e G), persistência do fungo na lesão e acentuada fibrose

cicatricial (Fig.24E-I). Os ensaios para quantificação de TGF-β foram realizados

em triplicata.

4.7 Quantificação de TGF-β no sobrenadante, após 36h de interação entre CsL e o

fungo F. pedrosoi, em RPMI 1640. Após 36h de interação entre as CsL e as

diversas formas do fungo, foi realizado a quantificação de TGF-β, por ELISA, no

sobrenadante da interação. Observou-se um aumento do nível desta citocina na

interação com os conídios e com células escleróticas induzidas in vitro, sendo que

houve uma maior detecção da citocina após a interação com estas últimas (Fig.26).

Os ensaios foram realizados em triplicata.

53

Figura 12: Aspectos microscopicos das células de Langerhans. Em (A), Micrografia

ótica da epiderme de pele recém retirada de camundongos Balb/c. Em (B), expressão de

MHC-classe II, por microscopia ótica de fluorescência, mostrando a célula de Langerhans

in situ. Em (C) observa-se as CsL recém isoladas e purificadas por microscopia ótica, em

exame a fresco e em (D) observa-se as CsL recém isoladas e purificadas por microscopia

ótica coradas pelo Giemsa. Barra 10µm.

54

Figura 13: Micrografia por microscopia eletrônica de varredura das células de

Langerhans isoladas da epiderme de Balb/c: (A) após 01h, (B) após 03h, (C) após 12h e

(D) após 36h de cultivo, em RPMI-1640. Barra 1µm.

55

Figura 14: Micrografia por microscopia eletrônica de transmissão de CsL recém

isoladas e purificadas da epiderme de Balb/c: mostrando prolongamentos citoplasmáticos-

dendritos (seta escura), reticulo endoplasmático (seta amarela) e a presença de grânulos de

Birbeck (seta clara). Barra 5µm.

56

Figura 15: Micrografia por microscopia ótica da interação de CsL e conídios de F.

pedrosoi. A (Fig. A), mostra a formação de hifas (seta branca) a partir dos conídios, após

cultivo de 36h (controle sem a presença de CsL). Em (B) observa-se a internalização dos

conídios (seta escura) e inibição da formação de hifas, após 03h de interação. Em (C) observa-

se a internalização dos conídios (seta escura) e inibição da formação de hifas, após 36h de

interação com CsL, em RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino.

57

Figura 16: Micrografia por microscopia eletrônica de varredura da interação de CsL e

conídios de F. pedrosoi. Em (A) observa-se o conídio de F. pedrosoi. Em (B) conídio sendo

internalizado pela CsL após 01h de interação, mostrando pseudopodes (seta amarela). Barra

5µm

58

Figura 17: Micrografia por microscopia eletrônica de varredura da

interação de CsL e conídios de F. pedrosoi. Mostrando em (A) conídio

aderido (seta branca), conídio internalizado (seta vermelha) e em (B)

conídios internalizados após 12h de interação (setas vermelhas). Barra 10

µm.

59

Figura 18: Microscopia eletrônica de transmissão da interação conídios de F pedrosoi e

CsL isoladas e purificadas de epiderme de Balb/c em RPMI-1640: Em (A), inicio da

fagocitose após 01h de interação. Em (B), após 03h de interação, observa-se o conídio dentro

do fagossomo (seta). Em (C), após 12h de interação, mostrando a internalização do conídio e

presença de citoesqueleto (asterístico) circundando o fagossomo. Em (D), após 36h de

interação com o conídio internalizado, mostrando possível destruição do citoplasma e

manutenção da parede do fungo (seta) e presença de citoesqueleto (asterístico) circundando o

fagossomo. Barra 10 µm.

60

Figura 19: Micrografias por microscopias ótica, eletrônica de varredura e transmissão

da interação de células escleróticas induzidas em meio quimicamente definido e CsL

isoladas e purificadas de epiderme de Balb/c após 36h em RPMI-1640. Em (A)

microscopia ótica, mostrando a inibição da formação de hifas apartir de células escleróticas.

Em (B), microscopia ótica, onde se observa a formação de hifas (seta amarela) a partir das

células escleróticas, em cultivo sem CsL. Em (C) microscopia eletrônica de varredura

mostrando importante adesão entre CsL e células escleróticas induzidas in vitro (seta clara).

Em (D) microscopia eletrônica de transmissão mostrando CsL rica em mitocôndrias (seta

escura) e discreta adesão da CsL com as célula esclerótica (seta vermelha).

61

A B

Figura 20: Micrografia eletrônica de varredura da interação de CsL e hifas de F

pedrosoi. Mostrando adesão, entre ambas as células (A). Pode-se observar a formação de

prolongamentos dendríticos direcionados ao filamento fúngico (B).

62

Fig.21. Micrografia de microscopia ótica de fluorescência da expressão de CD40

pelas CsL, após 36h de interação com conídios e células escleróticas. Mostrando a

inibição (B) da expressão de moléculas co-estimulatórias CD-40 pelas CsL quando co-

cultivadas com conídios de F. pedrosoi. Em (C) a expressão desta molécula pelas CsL,

permanece inalterada quando co-cultivadas após 36h com células escleróticas induzidas

in vitro, comparadas com o controle (A).

Fig.22. Micrografia de microscopia ótica de fluorescência da expressão de B7-2

pela CsL, após 36h de interação com conídios e células escleróticas. Mostrando em

(B) a inibição da expressão de B7-2 pelas CsL após interação com células escleróticas

induzidas in vitro, após 36h de interação.Em (C) observa-se aumento da expressão de

B7-2 pelas CsL, quando comparadas com os controles (A). Barra 1µm.

63

Fig.23. Citometria de fluxo da expressão de CD40 e B7-2 em CsL após 36 horas de

co-cultura com conídios e células escleróticas. Em (A) observa-se uma importante

expressão de CD40 em CsL após 36h de co-cultura com conídios de F. pedrosoi, porem

sem alteração significativas na expressão desta molécula co-estimulatória nas CsL

quando cultivadas com células escleróticas induzidas in vitro. Em (B) observa-se que

não ocorre alteração significativa na expressão de B7-2 nas CsL após 36h de co-cultura

com conídios de F. pedrosoi, quando comparada com o controle, enquanto que pode ser

observado um aumento significativo da expressão pelas CsL de B7-2, após 36h de co-

cultivo com células escleróticas induzidas in vitro, em comparação com o controle.

Dados representam um em treis experimentos independentes, realizados em triplicata.

64

Fig.24 Aspectos laboratoriais e clínica da cromoblastomicose. Micrografia de exame direto

de pacientes com cromoblastomicose em KOH a 20% mostrando células escleróticas (A),

colônia de F. pedrosoi em ágar-Mycosel (B) e microcutivo em lâmina (C). Aspectos clínicos

de lesões de 02 pacientes com cromoblastomicose antes do tratamento (D, G), após 03 meses

de tratamenteo com ITZ (E, H) e após 12 meses de tratamento com ITZ (F, I).

65

Fig.25. Níveis plasmáticos de TGF-β de 12 pacientes com diferentes formas

clínicas de cromoblastomicose, em tratamento com ITZ. Plasma de indivíduos

sadios foi usado como controle negativo. Cada ponto representa o nível plasmático de

TGF-β em cada paciente. A média é representada pela linha horizontal.

66

Fig.26: Níveis de TGF-β no sobrenadante da interação após 36h de interação de CsL

com as diversas formas do fungo F. pedrosoi. Os resultados representam a média de 03

experimentos individuais. p<0.005.

67

5 DISCUSSÃO

Propusemos estudar a relação entre formas vegetativas: conídios e células escleróticas

induzidas in vitro do fungo F. pedrosoi e células de Langerhans (CsL) purificadas da

epiderme de camundongo Balb/c, em virtude destas células dendríticas (CsD) da pele

protegerem o sítio de entrada de patógenos, capturando e apresentando antígenos para as

células T nos órgãos linfóides satélites, estimulando a resposta primária mediada por células.

A cromoblastomicose é causada pela penetração de formas vegetativas: conídios e fragmentos

de hifas do fungo F. pedrosoi na pele através de traumatismo, e a evolução da doença é

mantida pela presença de células escleróticas no tecido.

Este estudo foi facilitado pela metodologia de isolamento e purificação de CsL de

epiderme, que apesar de ainda ser pouco desenvolvida, poderá contribuir para o entendimento

da relação parasita-hospedeiro, principalmente nas patologias onde o sitio de entrada do

patógeno é a pele ou em outros tecidos onde as CsL são consideradas importantes sentinelas.

A localização na epiderme das CsL as tornam um alvo para intervenções para

suprimir, estimular ou desviar respostas imunes cutâneas ou sistêmicas (Jakob et al., 2001).

Na presença do patógeno CsD regulam fortemente sua via endocitica, interferindo na

proteólise, dinâmica da membrana e transporte dentro e fora dos lisossomas, para tornarem-se

as mais potentes células apresentadoras de antígeno até hoje conhecidas (Gatti & Pierre,

2003). Acredita-se que seja este o mesmo comportamento das CsL, importantes CsD da pele,

em relação aos agentes da cromoblastomicose, assim como de outras micoses subcutâneas.

Na interação de CsL e formas vegetativas de F. pedrosoi in vitro, nossos resultados

mostram que após 01h de interação de conídios de F. pedrosoi e CsL (na razão de 10:1)

ocorre adesão e formação de pseudópodes em torno do conídio, indicando um processo ativo

de fagocitose das CsL. Após 03 e 12h de interação observa-se o conídio dentro de um

fagossoma, ainda com citoplasma visível assim como na primeira hora. Sendo que após 36h

de interação não é possível observar o citoplasma do fungo, indicando uma possível

destruição do mesmo. Na interação entre CsL e células escleróticas induzidas in vitro,

observou-se somente adesão nos diversos tempos de interação. Outro fenômeno observado foi

68

a inibição da formação de hifas a partir conídios e de células escleróticas, quando estas células

foram co-cultivadas com CsL, com observação até 36h de interação, comparadas com

controle.

Estes resultados são semelhantes aos observados em interações entre CsD isoladas de

pulmão e CsD de linhagem estabelecida derivadas de pele fetal (FSDCs) com conídios e hifas

de A. fumigatus, onde estas CsD internalizam e são capazes de destruir todas as formas deste

fungo (Bozza et al, 2002), e outro que mostra que CsD derivadas de monócitos de sangue

periféricos de humanos e de baço de camundongos, também internalizam e destrõem células

leveduriformes e hifas de C. albicans, sendo que estes efeitos estão relacionados com alta

produção de óxido nítrico e expressão do gene iNOS pelas CsD (d’Ostiani et al., 2000).

Quanto a inibição de formação de hifas, o mesmo fenômeno foi observado por Awasthi &

Magee, 2004, quando fizeram interação de artroconídios de Coccidioides posadasii com

células dendriticas derivadas de medula óssea (BMDC), observando até 48h de interação.

Considerando ser um modelo em murinos, nossos dados podem subsidiar novas

pesquisas em manipulação da resposta imune, com vista a imunoterapia de infecções fúngicas

subcutâneas, entre as quais a cromoblastomicose, micose esta ainda sem uma terapêutica

eficaz. O conhecimento da biologia das CsD, mais especificamente das CsL, na regulação da

resposta imune contra fungos agentes de micoses subcutâneas, principalmente o F. pedrosoi,

será um passo importante na direção de uma definição crítica dos mediadores da mesma.

Assim como as CsL podem ser consideradas como uma peça fundamental para o

desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para ajustar o balanço entre saúde e

doença, principalmente no caso desta importante micose objeto deste estudo.

Estudos sobre vacinação com CsD sensibilizadas ou carregadas de antígenos ex vivo,

com finalidade profilática, terapêutica ou adjuvante de outros tipos de tratamento, foram

desenvolvidos com CsD circulantes ou linhagens estabelecidas, principalmente contra o fungo

A. fumigatus e alguns tipos de câncer, com resultados promissores (Bozza et al, 2003;

Cerundolo et al, 2004). A possibilidade de utilizar CsD geradas ex vivo como ferramenta

terapêutica para restaurar a imunidade anti-fúngica é uma pespectiva para o futuro próximo

(Buentke & Scheynius, 2003), enquanto o desenvolvimento de vacinas contra fungos encontra

69

desafios, como os diferentes fatores de risco do hospedeiro e diferentes etiopatogenias, o que

leva pensar em vacinas altamente específicas para cada espécie fúngica (Deep Jr, 2004).

Assim nossos resultados podem subsidiar estudos com esta metodologia, ou seja, utilizando

CsL para produção de vacinas contra agentes infecciosos que penetram pele, entre estes, mais

especificamente o F. pedrosoi importante agente da cromoblastomicose.

Quanto ao aspecto da expressão de moléculas co-estimulatórias das CsL após

interação com as formas do F. pedrosoi, pouco se conhece sobre a influência destas moléculas

na regulação da resposta imune contra fungos, principalmente em relação ao F. pedrosoi.

Nossos resultados observados após 36h de interação de CsL com conídios de F. pedrosoi,

mostram a inibição nas CsL da expressão de B7-2 e CD-40. Resultados semelhantes foram

observados por (Awasthi & Magee, 2004) mostrando inibição da expressão de B7-1, B7-2 e

CD-40 em CsD derivadas de medula óssea (BMDC) de Balb/c, por artroconídios do fungo

dimórfico Coccidioides posadasii em interação por 24h. Estudo desenvolvido com interação

de conídios de Trichophyton rubrum, fungo dermatófito, agente de micose da pele de caráter

crônico, com macrófagos peritoneais residentes, mostra que conídios são fagocitados e inibem

a expressão de moléculas co-estimulatórias (Campos et al. 2006). Assim nossos resultados

podem sugerir que esta capacidade do fungo de inibir a expressão destas moléculas co-

estimulatórias, seja um mecanismo de escape do fungo, para que seja implantado seu

propágulo, no caso conídio, no tecido do hospedeiro. Mecanismo este capaz de subverter

assim as células do sistema imune, neste caso as CsL, células fagocíticas e apresentadoras de

antígenos encontradas na epiderme, local de entrada deste agente etiológico, compromentendo

a resposta imune celular ou Th1.

A interação de células escleróticas induzidas in vitro com CsL após 36h, mostra que

expressão de B7-2 e CD-40 não sofre alteração. Estudos in vitro indicam que a expressão de

moléculas co-estimulatórias sobre as células apresentadoras de antígeno, parece ser regulada

por C. neoformans, e o aumento da expressão de B7-2 e CD40 pode promover uma resposta

protetora, ou seja, resposta Th1(Vecchiarelli, 2000). A expressão de B7-2 parece ser a favor

de uma resposta a ativação de células T em infecção por C. neoformans (Monari et al., 1999).

O mecanismo pelo qual fungos, em suas diversas fases, inibem ou estimulam a expressão de

moléculas co-estimuladoras é ainda desconhecido, porém evidências recentes sugerem que

70

receptores da resposta imune inata, como a família de receptores Toll-like, podem induzir ou

inibir a maturação de CsD em resposta a produtos microbianos (Blander & Medzhitov, 2006).

Nossos resultados em relação à fagocitose e expressão de moléculas co-estimuladoras podem

ser comparados com os estudos de Gersuk et al., (2006), que mostram que conídios de A.

fumigatus são fagocitados por macrófagos com pouca resposta inflamatória, só causando

infecção com importante resposta inflamatória após iniciar o crescimento de hifas. Resposta

esta que é, em parte mediada por Dectin-1, receptor de β-glucanas existente no macrófago e

em outras CsD, reconhecendo componente não existente em conídios e sim em tubos

germinativos, estruturas iniciais do crescimento da hifa. Processo idêntico pode ocorrer na

interação de CsL e conídios de F. pedrosoi que são internalizados e inibem a expressão de

moléculas co-estimulatórias tipo B7-2 e CD40. Sendo que na interação entre CsL e células

escleróticas induzidas in vitro, células consideradas fase intermediaria entre conídios e hifas,

estas não são fagocitadas e podem estimular a expressão de moléculas co-estimulatórias B7-2

e CD40 nas CsL. Assim estes mecanismos, também, podem estar relacionados com a

capacidade de distinção pelos recptores de membrana das CsL, dos possíveis diferentes

componentes existentes na parede celular das diferentes fases do fungo F. pedrosoi. Este

fenômeno pode ter relação com a clínica da cromoblastomicose, pois quando da inoculação

do fungo na pele, ocorre cicatrização do traumatismo e após longo tempo, “de dormência do

conídio” sem aparente estimulo tecidual, inicia-se a lesão da micose com importante processo

inflamatório. Nestas lesões, mesmo iniciais, não se observam conídios por qualquer exame

laboratorial, e sim células escleróticas. Nossos resultados, comparados a outros com CsD,

demonstram que as CsL podem ter um importante papel na conexão entre a resposta imune

inata e adptativa, assim como pode subsidiar estudos para o desenvolvimento de uma vacina

especifica com células escleróticas ou utilização de CsL pulsadas com antígenos, para

prevenção ou como adjuvante no tratamento de cromoblastomicose.

Sobre o envolvimento da citocina antinflamatória TGF-β na etiopatogenia da

cromoblastomicose, ainda não está amplamente investigada, principalmente a causada pelo

fungo F. pedrosoi. Infecções persitentes ou crônicas mantém alta a produção de TGF-β, e

podem levar a uma progressiva deposição de matrix extracelular e tecido fibroso.

Schistosomiase hepática é um bom exemplo deste processo. O TGF-β produzido quando da

formação de granuloma induzido pelos ovos deste helminto, parece ser o principal indutor da

71

fibrose, através de estimulos para produção de colágeno e outros componentes da matrix

extracelular e proliferação de fibroblastos (Wahl et al., 1997). Ação semelhante pode ocorrer

na cromoblastomicose, infecção fúngica crônica, onde células escleróticas são persistentes na

lesão. A regulação da secreção de TGF-β está implicada na formação de cicatrizes

hipertróficas, mas ainda é obscuro se é causa ou um efeito deste processo (Werner &

Alzheimer, 2006). Em cromoblastomicose, um trabalho exclusivo demonstrou o perfil da

matriz de extracellular com fibrose irreversível na lesão e a presença in situ de TGF-β (Esterre

et al., 1993). Mas a presença ou não, e a correlação entre níveis plasmáticos de TGF-β e

evolução de cromoblastomicose ainda é desconhecida.

Nossos resultados sobre a quantificação de TGF-β no plasma de pacientes com

cromoblastomicose, antes e após tratamento com itraconazol (ITZ), sugestionam um papel

ativo desta citocina no padrão de resposta tecidual, interferindo com o tipo e tamanho da

lesão. No inicio, os níveis de TGF-β são altos, indicando um possível papel para o fungo

como estimulador da produção desta citocina pelas células inflamatórias, e que TGF-β pode

ser importante na evolução crônica da cromoblastomicose, como é em outros processos

infecciosos diferentes, como na leishmaniose, onde tem sido detectado TGF-β no tecido

(Gumy et al., 2004), e na paracoccidioidomicose onde foram detectados altos níveis de TGF-

β no soro de pacientes (Mamoni et al., 2002), o que indica que esta citocina é importante na

manutenção de doenças granulomatosas, e confirma nossos resultados.

Na terapia com ITZ destruindo o fungo, ocorre uma diminuição do nível de TGF-β

combinada com uma melhoria importante no quadro clínico, seguido por um incremento no

nível plasmático de TGF-β, o que também pode ser relacionado à lenta melhoria clínica

observada. Sabe-se que tratamento com ribavirin pode reduzir níveis plasmáticos de TGF-β,

reduzindo também a fibrose hepática em pacientes com hepatite C crônica (Janczewska-

Kazek et al., 2006). Resultados semelhantes aos que observamos com o tratamento com ITZ e

lesões de cromoblastomicose na pele, também foram observados por observado por Tomioka

et al., (1997), mostrando que progressivo crescimento bacteriano, depois do uso de agentes de

antimicrobianos contra Mycobacterium avium, está associado a persitência de TGF-β no

tecido. O que também pode estar ocorrendo em nosso estudo, demonstrado pelo alto nível de

TGF- β depois do terceiro mês de tratamento com ITZ, associado a uma melhoria clínica lenta

72

e a persistência de células escleróticas na lesão. A secreção de TGF- β também pode ser

estimulada durante a entrada, replicação e persistência do patógeno no hospedeiro (Fitzpatrick

et al., 1999). Estes dados podem ser co-relacionados à importante fibrose observada na

recuperação clínica de cromoblastomicose e com os níveis altos desta citocina no

sobrenadante da interação de CsL com conídios e em maior nível com células escleróticas

induzidas in vitro, após 36h de interação, considerando que as células escleróticas são as

formas fúngicas em permanente contato com o tecido e com as diversas células do sistema

imune do tecido cutâneo e subcutâneo.

Estudos adicionais são necessários para elucidar quais são as células inflamatórias

responsáveis pela produção de TGF- β na cromoblastomicose, como a presença do fungo

estimula sua secreção e seu papel na patogênese desta micose, pois foi demonstrado que

anticorpos anti-TGF-β podem aumentar o processo curativo em outras infecções (Li et al.,

1999). Um importante objetivo de futuras pesquisas será obter terapias que explorem aspectos

benéficos da combinação de antifúngicos e antifibróticos, que poderá apresentar melhores

resultados no tratamento de patologias que apresentam envolvimento de fibrose, como

acontece com a cromoblastomicose.

As CsL poderão ser uma das principais ferramentas para induzir imunidade protetora

por vacinação ou adjuvante em combinação terapêutica contra a cromoblastomicose. Sua

capacidade de internalizar conídios, como ficou demonstrada; e a de apresentar antígenos,

pode representar a ativação de diferentes vias imunológicas, necessitando identificar a melhor

via para melhor planejamento de vacinas fúngicas. Uma melhor compreensão do papel das

CsL na interação patógeno-hospedeiro provavelmente direcionará, futuramente, o

desenvolvimento novas terapias antifúngicas, voltadas contra o F. pedrosoi, principal agente

da cromoblastomicose.

Esperamos que novos estudos venham corroborar nossos resultados.

73

6 CONCLUSÕES

6.1 A metodologia aplicada para o isolamento de células de Langerhans, foi considerada

valída para obtenção dos objetivos propostos.

6.2 As carateristicas ultraestruturais das células de Langerhans isoladas e purificadas, são

idênticas as descritas na literatura.

6.3 Conídios de F. pedrosoi são internalizados por células de Langerhans de epiderme de

Balb/c, após 03 horas de interação.

6.4 Conídios de F. pedrosoi inibem a expressão de moléculas co-estimulatórias B7-2 e

CD40 pelas células de Langerhans, até 36 horas de interação, caracterizando

influência na resposta imune inata.

6.5 Conídios de F. pedrosoi estimulam a produção de TGF-β pelas células Langerhans in

vitro.

6.6 Células escleróticas induzidas in vitro, aderem às células de Langerhans in vitro,

porém não são internalizadas.

6.7 Células escleróticas induzidas in vitro, não inibem a expressão de moléculas co-

estimulatórias B7-2 e CD40 pelas células de Langerhans, até 36 horas de interação.

6.8 Células escleróticas induzidas in vitro estimulam a produção de TGF-β pelas células

de Langerhans in vitro.

6.9 Hifas de F. pedrosoi aderem às células de Langerhans in vitro, porem não são

internalizadas.

6.10 Células de Langerhans inibem a formação de hifas a partir de conídios e de células

escleróticas induzidas in vitro, até 36 horas de interação.

6.11 O nível plasmático de TGF-β decresce após 3 meses tratamento com itraconazol,

voltando a nível semelhante ao do tempo zero após 12 meses de tratamento.

6.12 Os altos níveis da citocina anti-inflamatoria TGF-β, após o aparecimento das lesões,

em pacientes com cromoblastomicose, caracteriza uma predominância de uma

resposta Th2.

6.13 A citocina TGF-β pode estar envolvida na progressão da cromoblastomicose.

74

6.14 As células de Langerhans da epiderme de Balb/c mostram ser um excelente modelo

experimental, para o estudo da relação parasita-hospedeiro, principalmente com

microorganismos que penetram no hospedeiro através da pele.

75

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