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KARIDIA DIALLO
ETUDE DU PHAGE KSYl DE U C T O C ' C U S U C T I ; S , s o u s ~ s ~ ~ c ~ CWYMOR~;~
Mémoire prhnté
à la Facuité des énides supaieures de l'université Laval
pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M Sc.)
SEPTEMBRE 1998
Q Karidia DIALLO, 1998
National Library 1+1 ,,"da Bibliothèque nationale du Canada
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Le phage KSYl a été i d 4 ar Fuilande i partir d'un produit laitier visquaix, filant a acide du nom de "Vütiw. C'ut un phage de It hwlk d a P e n ' du morphotype C3, avec
une tête allongée de 230 x M mi et une queue ton- &environ 35 nm portant une structure
annelée complexe. Sa souche-hôte est L souche HER 1248. qui est sr Unkriar>ans bcas sow
espèce cremmis. mrU ü se répîique sur une autre sou& de t4crdca:cus sous-espèce
cremoris appelée QE, qui prCscnte le m&K profii piasmidipue que la souche HER 1248.
Son profil protéique montre une seule protéiae majeure de 43 kD et ne présente aucune
homologie avec des prothes dans les banquer de données* -
La taille du génome est d'environ 130 f 10 Itpb. Le génome montre une homologie
partielle avec le phage uI36 (P335). mais aucune hybridation avec les ADN des phages de
lactocoques les plus répandus d u u l'industrie laitière. Son ADN résiste a toutes les entymes de
restriction ayant les bues G et C dans leur site de reconn'ssance, suggérant Ia présence d'une
modification,
Avant-propos
Mes sincères remerciements vont au Conseil de Recherches en Sciences Natureiles et en
Génie du Canada (Subventions Stratégiques) qui est L'organisme subventionnaire du projet.
Je tiens à exprimer ma plus sincère reconnaissance au Docteur K-W. Ackemiann et au
Docteur S. Moineau qui m'ont accueillie dans leurs laboratoires et qui ont accepté de diiger ce
travail. Je les remercie de leur encouragements, de leur conseils judicieux et de l'intérêt qu'b
m'ont prodigué tout au long de ce projet.
Je tiens à remercier le Docteur R Lévesque, Cgalement du Département de biologie
médicale, pour avoir mis un appareil pour électrophorèse inversée (FIGE pour Field Inverse
Gel Electrophoresis) à ma disposition, ainsi que F. Sanschagrin qui m'a aidée à tnivailier avec
cet appareil.
Je suis également très reconnaissante au Docteur E. Emond pour son assistance et son
soutien pendant tout le projet.
Padresse un grand merci à tous mes collègues du laboratoire du Dr Moineau, pour leur
assistance durant mes travaux. Ce bref séjour passé panni eux, restera a j d s grav6 dons ma
mémoire.
Pour terminer, j'adresse mes remerciements imprégnés d'amour à mes deux enfants qui ont eu à
supporter une maman stressée et tendue pendant deux ans et qui par leur présence m'ont aidk
à m'en sortir,
iii
TABLE DES MA'I'K~REs
.. ....................................................................................................................... AVANT-PROPOS u
... TABLE DES MATDÈRES ........................................................................................................... ut
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................ v
.................................................................................. ..................... LISTE DES FIGURES ,., vi
.. ABBREVIATIONS COURANTES ...................~.~~~.~~~..~....~.~.~~~~.~.~.~~~.~~..~.. ,.,, ............................ .vu CKAPITRE 1 . INTRODUCTION ................................................................................................ 1
1.1. Rappels historiques .................................................................................................... 1
1.2. Propriétés générales et classification des phages ................... .... ............................. 2
1.2.1. Propriétés .................................................................................................... 2
1.2.2. CIassification ............................................................................................... 2 1.3. Types de bactériophages ......................................................................................... 6
1.3.1. Les phages lytiques ...................................................................................... 6
1.3.2. Les phages tempérés ................................................................................ 10
1.4. Propriétés et classification d u bactéries lactiques .......................................... 1 1 . . ......... 1.4.1. Propnetés ,. ....................................................................................... 1 1
1.4.2. Classification ........................ .................................................................... 12
............................................................................................... 1.5. Le genreIuctococcus 13
1.6. Les phages des lactocoques ...................................................................................... 15
1.7. Description du phage KSY 1 .................... ...... ................................................... 19
.............. 1.8. But du travail proposé .... .................................................................... 19
CHAPITRE IL MATÉIUEL ET &=ODES .......................................................................... 20
2.1. Souches bactériennes et milieux de culture ............................................................... 20
2.2. Ampüfication et concentration du phage ................................................................... 21
2.3. Microscopie électronique .... .. ..............................~.~.................................................. 22 . . 2.4. Profil proteique ........................................................................................................ 22
2.5. Spectre lytique ............. ,. ..................~....................................................................... 23
2.6. Profil plaunidique d u souches sensibles .............................................................. 24
2.7. Profd de restriction et taüle du génome .................................................................... 24
2.8. Hybridations d'ADN .......... .,. ................................................................................. 2 6
2.9. Composition de l'ADN du phage KSYl .................................................................... 27
CHAPITRE m . RÉSULTATS
3.1. Morphologie du phage ............. .. ....................................................................... 2 8 0 . 3.2. Profil proteique ..................... ..... ..................................................... 2 9
...................... .................................................*............. 3.3. Spectre lytique ..... 2 9
3 .4 . Profil plasmidique des souches sensibles ................................................................... 33 . . 3.5. Profil de restnctron ................................................................................................... 33
3.6. Tailfe du génome .... ,. ................................................................................................ 33
3 .7 . Hybridations d'ADN .......... .. ... ... ............ ... .................................................. 38
...........-..... .. 3.8. Nature et pourcentage des bases qui composent l'ADN du phage ...... 41
CHAPITRE IV . DISCUSSION. ............................................................................................... 4 6
CHAPITRE V . CONCLUSION ................... .. ......................................................................... 50
RÉFÉRENCES .......................................................................................................................... 52
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 . Familles a genres de phages avec leun principales caractéristiques .......................... 5
Tableau II . Caractéristiques dinérenciant les espèces et sous-espbs du genre k t o c ~ ~ ~ ~ s ..... 14
.............................. Tableau IIL Les phages des lactoco~ues et leurs principales caradristiques 16
.................................................... Tableau N . Phages et bactéries utilisés dans les expériences .. 21
LISTE DES FIGURES
Figure 1 .
Figure 2 .
Figure 3 .
Figure 4 .
Figure 5 .
Figure 6 .
Figure 7 .
Figure 8 .
Figure 9 .
Morphotypes observés chez les phages ........................................................................ 4
Microphotographies des trois espèces de phages les plus fréquentes dans les
.. industries laitieres .................. .... ............................................................................. 18
Microphotographie de phages concentrés ................................................................... 30
........................................................................... Microphotographie du phage KSY 1 31
Profil protéique du phage KSY 1 ................................................................................ 32
Profil plasmidique des souches sensibles HER 1248 et QE ......................... .. ........... 34
Profil de restriction du génome de KSY 1 ................................................................. 35
............................................. Électrophorèse de I'ADN non digéré de KSYl en FIGE 36
Électrophorèse de l'ADN digéré de KSYl en FIGE ............................................ 37
Figure 10 . Vérification de la similarité entre l'ADN de KSY 1. du phage T4 et de quatre phages
............................................................................................................ de lactocoques 39
Figure 1 1 . Hybridation des ADN de KSYl et u136 ...................................................................... 40
Figure 12 . Courbes d'absorption des bases étalons ATGC sur HPLC ....................... .. .............. 43
Figure 13 . Courbes d'absorption des bases de FADN de KSY 1 ...................... .. .................... 45
vii
ADN
ARN
ARNr
ARN16S
A
T
G
C
Ml7
LM17
SDS
NaOH
U.V.
EDTA
DNase
RNase
c m kPb kD
SSC
Acide desoxyribonucléique
Acide ribonucléique
Acide ribonucléique ribosomique
Acide ribonucléique de 16 S (unités Svedberg)
Adénine
Thymine
Guanine
Cytosine
Milieu 17
Milieu 17 + lactose 0.5%
Sodium dodécyl sulfate
Hydroxyde de sodium
Ultra Violet
~th~lènediaminetétra-acétique
Enzyme hydrolysant l'ADN
Enzyme hydrolysant 1'ARN
Centre Hospitalier de l'Université Lavai
kilopaire de bases
HoDalton
Sodium Chlorure - Sodium Citrate
Sous-espèce
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1. Rappel historique
Les bactériophages ont Cté découverts indépendamment par le Britannique Freâerick
Wdiiam Twort et le Canadien Félix Hubert d'Hérelle. En 1915, Twort rapporte avoir observé
que des colonies de "microcoques" isolés de vaccin devenaient vitraises et transparentes. Ce
phénomène pouvait être transmis mécaniquement. Les agents responsables passaient à travers
des filtres de porcelaine et étaient inactivés après incubation à 60°C. 11 donna plusieurs
explications a ses observations. L'agent taud pourrait être une bactérie, une amibe, une entité
encore primitive, un protoplasme vivant incapable de former des cellules individuelles définies
ou une enzyme capable de croissance. Les obsewations de Twort, publiées en 1915, passèrent
d'abord inaperçues (Ackermann et DuBow, 1987a).
En 19 15, d'Hérelle qui travaillait a l'Institut Pasteur à Paris, observa que des filtrats de
selles de patients pouvaient lyser des cultures sur gélose et des bouiilons de culture de bades
de la dysenterie.
Il observa également que l'apparition de la lyse correspondait au début de la
convalescence. D'HereUe publia ses observations en 1917, afnnnant que l'agent causal était un
microbe invisible et un parasite obligatoire des bactaies. Il inventa le mot "bactériophagen pour
le désigner. Ce tenne bactériophage ou 'phagen resta associé aux virus des proclryotes
( A c k e m et DuBow, 1987a). Les lecteurs intéressés a l'historique des phages trouveront
dans le livre de Ackermann et DuBow une revue très bien documentée. Depuis 1960, plus de
4500 phages ont été découverts dans plus de 100 genres bactériens (Ackermann, 1996).
1.2. Propnit& et classification des phages
L'avènement du microscope électronique et de la génétique ont permi de préciser la
nature de ces virus bactériens. En général, les bactériophages sont caudés, cubiques,
filamenteux ou pléomorphiques et contiennent un ADN simple ou double brin ou de L'ARN. Les
phages caudés, de loin les plus nombreux (environ 96%), sont Cnormément diversifiés a sont probablement très anciens en termes géologiques. Ils ont un ADN bicaténaire a une queue
entièrement protéique utilisée pour infecter l'hôte. Les phages sont géographiquement très
répandus et ont souvent le même habitat que leurs hôtes, mais leur plus important habitat est la
souche-hôte lysogène parce qu'elle protège les prophages de l'environnement et les libère de la
nécessité de trouver une nouvelle bactérie pour se propager. Certains phages sont extrêmement
sélectifs dans leur spectre d'hôte tandis que d'autres sont actifs sur plusieurs genres bactériens
(Ackermann, 1996).
1.2.2. Ciassification des phages
La taxonomie virale moderne a commencé en 1962, quand un système de classification
basé sur les propriétés du virion et de son acide nucléique fit introduit par Lwoe Home et
Tournier (Ackermann et DuBow, 1987a; Ackennann, 1992). Les critères retenus par l?CTV
(Comité International de Taxonomie des V i s ) pour la classification des phages comprement
notamment :
L'ADN : Nature, conformation, poids moléculaire, composition en bases,
homologie d'ADN a profil des @menits de restriction.
Le virion : Forme, structure fine, &nemion, poids de la particule, coeficient
de sédimentation, densité de flottaison en gradient de chlonue de césium.
Le profd protéique et la présence ou l'absence de Lipides.
La sérologie : Des anticorps poly- et monoclonua ont été développCs contre les
protéines de structure des phages. Les membres d'une même e s p h ont du
propriétés sérologiques similaires.
Le spectre lytique : Il comprend les souches bactéric~es sensibles aux phages d'me
même espèce.
Les propriCt& physico-chimiques : Résistance au chloroforme, a l'éther et a la
chaleur.
L'ICW reconnaît actuellement 13 familles et environ 30 genres de phages (Pringle,
1996). Les morphotypes des phages sont illustrés dans la Figure 1 et leurs principales
caractéristiques sont résumées dans le Tableau 1. Notons que les critères l u plus importants
pour le regroupement des phages en familles portent avant tout sur la nature de l'acide
nucléique, la fome de la panicule et la présence ou L'absence d'une enveloppe. Comme c h u les
autres virus, les nom des f d e s se terminent en -viRdae et les noms des genres en -vim. Les
espèces sont désignées par les noms vernaculaires des membres les plus COMUS (Ackerma~,
1992).
Figure 1. Morphotypes observés c h a les phages. Les types A a F ont été définis en 1967 par
la morphologie et la nature de l'acide nucléique. D'autres types ont été ajoutés au fil
des ans et les phages caudés, déjà classés selon la nature de la queue, ont été
subdivisés en fonction de la forme de la tête (selon Ackerrnann, 1996).
Tableau L Familles et genres de phages avec leun principales urrict6rutiques.
Modifié d'après Ackennann, 1996.
- -
Fonne Familles Morphotypes Genres
Cubiques Microviridae
Filamenteux hoviridae
Pléomorphes Plasmaviridae Fuselloviridae
Queue- Longuequeue non antractiie Queue courte
Microvirus Capsomem visibles Spiromicmvinis Bdeliomicrovinrs Chlamydiamicm~
Co~ticovirus Capside complexe, lipides
Tectivinis Double capside, pseudoqueue, lipides
LeviMnis AlloleviMNS
Cystovirus Enveloppe, lipides
Taovinis Lxnig-t Plectrovirus court- Lipothnxvinis Enveloppe, lipides Rudivirus Filament B ADN bicaténaire
Plasmavinis Enveloppe, lipides, pas de capside Fuseiiovinis Forme en citron
1.3.1. Les phages lytiques ou virulents
Les phages lytiques ou Wulents sont caract6risb par un cycle de multiplication qui est
le cycle lytique, appelé encore cycle végétatif ou productif Ii comprend cinq principales étapes
et aboutit à la formation de nouvelles particules virales
a) Adsorption
Le principal site d'adsorption est la paroi, mais il y a des phages caudés qui se fixent
d'abord aux flagelles, aux pili ou sur la capsule pour rejoindre la paroi plus tard.
Lorsqu'un phage infecte une cellule bactérienne, il s'attache de manière réversible par
l'extrémité de sa queue à des sites hydrocarbonés ou protéiques, distribués à la nirfPce de la
cellule (Valyasevi et ai., 199 1; Ackerrnann 1992). L'interaction du phage avec une proteme
membranaire spéciique, rend alors l'adsorption irréversible (Valyasevi et d, 1991).
L'attachement implique des structures phagiques et des récepteurs bactdriens
spécifiques. Ii exige parfois la présence de cofacteurs particuliers comme les cations didents
~ a 2 + et ~~2~ (Letellier et al.. 1985). Les ions caZC requis pour l'adsorption du phage peuvent
être également requis pour la pénétration de l'ADN, la lyse et la stabilisation de la structure du
phage (Watanabe et al., 1972). Un domaine de liaison au calcium a iti identifié dans la
séquence des protéines structuraIes de i'extrémité caudale chez certains phages (Scbouler et
al., 1992 et 1994).
Une fois le phage adsorbé, il éjecte son ADN i l'intérieur de Ia cellule bactérienne selon
un mécanisme mal COMU. Chez les hovirus et le Cystovints 46, la capside pénètre la paroi
cellulaire maïs non la membrane cytoplasmique (Ackermann, 1992). Chez les phages i queue
contractile, la paroi cellulaire est dégradée par des enzymes situées à l'extr6mit6 de la queue. La
gaine se contracte ensuite et le tube central de la queue entre en contact avec la membrane
plasmique. La structure protéique du phage demeure à i'extérieur de la cellule (Ackermann,
1992).
c) Multiplication
Une fois l'iïection établie, commence la période de latence qui est l'intervalle de temps
entre la pénétration de l'ADN du phage et la production de nouvelles pariides virales
infectieuses. Ce temps de latence dépend largement de l'état physiologique de l'hôte, de la
composition du milieu de culture ainsi que de la température d'incubation. Il varie de 20
minutes à 30-40 heures (Ackermann et DuBow. 1987a; Ackermann, 1992).
Après pénétration de son ADN, le phage prend contrôle du métabolisme de la bactérie,
l'entraînant à produire de nouvelles particules virales en grand nombre. Si les phages au gros
génome sont peu dépendants de leurs hôtes, ceux au petit génome en dependent presque
totalement (Ackermann et DuBow, 1987a). Dès la pénétration de son ADN, le phage qui
n'avait aucune activité métabolique, devient actif et modifie ou m ê t e les synthèses normales
des bactéries. Chez les phages en général (phages caudés surtout) I'expression des gènes est
largement séquentielle et ordonnée. Les gènes précoces sont exprimés avant la réplication de
l'ADN du phage, entraînant l'arrêt de la synthèse bactérienne (Powell et d, 1992; Ackcnnann,
1992). Ces gènes, qui sont transcrits par I'ARN polymérase de l'hôte, codent pour des proteks
nécessaires à la synthèse de l'ADN de phage. Des facteurs de spécificité sont codés par le
phage, modifiant la polymérase qui ne reconnaît plus les promoteurs de l'hôte (Ackerrnann et
DuBow, 1987a). L'expression des gènes précoces fournit les aicteurs nécessaires à la
réplication du génome du phage. Chez les phages caudés, cette réplication commence i des
sites précis sur la molécule d'ADN et de façon gaiede, est bidirect io~ek et aboutit A la
formation de longues chahes d'ADN appelées 'concatémèresn ( A c k e n ~ ~ , 1992). Chez
certaines espèces de phages, l'ADN est réplique mus sa forme ünéaüe et chez d'autres, il
devient circulaire dès sa pénétration dans la cellule bactérienne. Chez les phages ayant un
génome à bouts cohésifs, les bases de ces emdmités monocat4naires s'appuient, donnant un
ADN circulaire (Mitra, 1980 ).
Après la réplication de I'ADN du phage, les gènes tard& entrent en activité et codent
pour les protéines de structure, d'assemblage et de lyse. Cette séquence ordonnée pennet
l'accumulation de plusieurs génomes du phage avant la lyse bactérieme (McCorquodaie, 1975).
Ces génomes de phages ainsi synthétisés peuvent servir de gabarit pour la trPnsaiption des
gènes du phage qui codent surtout pour les protéines de structure nécessaires à la formation des
nouvelles particules virales. La traduction et les mécanismes de régulation qui y sont d é s ,
sont mal connus chez les phages (Ackermann, 1992).
d) Assem blagt
L'assemblage des particules de phages ou maturation est la dernière étape qui précède la
lyse bactérienne. Les phages s'assemblent spontanément ou à l'aide d'enzymes spécifiques. Chez
les phages caudés, l'assemblage est un processus hautement réglé au cours duquel les produits
des gènes entrent en action de façon séquentielle. II peut impliquer le clivage de précurseurs
ainsi que des voies distinctes pour l'assemblage des differents constituants wrnme la tête te la
queue (Ackermam, 1992; Girard et Hirth, 1980).
Les têtes et les queues sont assemblées séparément et jointes seulement aprh
l'encapsidation de l'ADN. L'assemblage de la capside nécessite une protëie qui sert de noyeu et
autour de laquelle les protéines de la capside vont s'assembler en une structure de tête
immature. La maturation de la tête se fait selon un processus incluant pulois le c l i ~ g e et le
réarrangement des protemes de la capside, ainsi que sa stabiiisation par des prothes mincwts.
La protéine qui sert de noyau pour la synthhe de la capside peut être & l'int6rieur ou à
l'extérieur de la capside (Ackermann et DuBow, 1987a)-
C h u plusieurs fades de phages, l'ADN entre dans la capside préfonnéq chez d'autres,
comme les Inovirus et les Levivims, la capside est construite autour de l'acide nucléique
(Ackemann, 1992). Dans le premier cas, les concatéméres d'ADN phegiques sont coupCs a
l'entrée de la capside par une teminase (Black, 1989). Chez certahs phages, des extrémités
cohésives sont générées par la coupure et une unité de longueur de génome est encapsidée.
Chez les phages dont les extrémités du génome sont redondantes, l'ADN est coupé a fonction
de la capacité de la capside du phage, selon un mecMisrne appelé "de tête pleinew. L'assemblage
final de la particule survient après encapsidation du génome (Ackermann, 1992).
e) Lyse
Le cycle lytique prend fin avec la lyse de la cellule-hôte et la libération des nouvelles
particules phagiques qui s'étaient accuumlées dans la cellule (Ackermann et DuBow, 19870).
Cette lyse est due à la synthèse par le phage d'enzymes qui attaquent la paroi ceildaire a savoir
la lysine et la hoüne. La holine fait une perforation pour permettre à la lysine de sortir a d'agir
sur la paroi de l'intérieur, permettant ainsi aux nouveaux phages de sortir (Naylor et Cailaiq
1956). La durée du cycle lytique et le nombre de phages libérés par une ceiiule infectée sont
très variables et dépendent du système phage-hôte. Le rendement moyen se situe entre 50 et
100 phages par cellule infectée (Ackermann, 1992).
Chez ces phages, l'infection résulte en un équilibre spécial entre le phage et son hôte
(Ackermann, 1992). Dans ce cas, le phage ne se multiplie pas, mais son ADN est intégré dans
le chromosome de l'hôte et devient prophage, se répliquant une fois a chaque multiplication de
la cellule bacterieme. La situation d'équilibre se perpétue presque indéfiniment jusqu'a ce que le
phage tempéré subisse une induction lors d'un dommage du chromosome de l'hôte ou p u des
agents inducteurs comme la mitomycine C, les rayons U.V. ou la chaleur. Après induction, le
phage tempéré devient lytique et produit des phages qui peuvent lysogaiiscr d'autres cellules.
Une bactérie hébergeant un prophage est appel6 Iysoghe parce qu'elle a acquis la capacit6 de
produire des phages. Les bactéries polylysogènes pc-~ent porter jusqu'a cinq prophages
différents. Une lysogénie défectueuse est la perpétuation de phages tempérés qui sont
incapables de se répliquer, soit souvent des têtes ou des queues isolées (Ackermann, 1992). La
lysogénie est ubiquitaire et apparaît chez les eubactéries, incluant les cyanobactéries, a les archébactéries.
Chez les bactéries pseudolysogènes, seulement une partie de la culture est Ulfectée par
les phages et un équilibre existe entre les phages libres et les cellules sensibles non infectées.
Les souches sans phage peuvent être obtenues par simple clonage ou par culture de h bactérie
dans un sérum anti-phage (Ackermann, 1992).
1.4. Propriétés et classification des bactéries lactiques
1.4.1. Propriétés
Les bactéries lactiques sont des cocci non sporulants, des coccobaciiIes ou des
bâtonnets à Gram positif dont l'ADN est composé de moins de 50 mol% W C (Pot et al.,
1994). Elles sont généralement catalase-négatives même si une pseudo-catalase a été détectée
chez les cultures sur des milieux pauvres en sucre. Elles ont besoin d'hydrates de carbone
fermentescibles pour leur croissance. Le glucose est p~cipalement converti en acide lactique
(homofermentation) ou en acide lactique, dioxyde de carbone (gaz carbonique), éthanol edou
acide acétique (hétérofermentation). Les bactéries lactiques sont ubiquitaires et se rencontrent
chez les animaux, les plantes et dans le sol. Plusieurs bactéries lactiques isolées du lait sont
auxotrophes à différents acides amhés. dont la présence est indispensable à leur croissance.
Selon la bactérie, le besoin en acides aminés varie de 4 à 14 acides aminés. Les caséines qui
représentent 80% des protéines du lait contiennent tous les acides aminés nécessaires à la
croissance des bactéries lactiques. Les bactéries lactiques produisent des substances et une
quantité importante d'acide lactique qui inhibent la croissance des bactéries qui altèrent les
aliments et le fourrage (Pot et al., 1994). D'autres propriétés dont la réduction du potentiel
redox et la fermentation du citrate permettant la production d'arômes, sont attribuées aux
bactéries lactiques.
Après que Pasteur eut formulé sa théorie microbiologique des changements fermentaires
vers 1857 (Vallecy-Radot, 1922). Joseph Lister entreprit de prouver la nature des fermentations
lactiques en 1873. Depuis, une grande variété de bactéries lactiques a été isolée et étudiée de
plusieurs façons par un bon nombre de spécialistes.
1.4.2. Classification
Quinze principaux critères sont utilisés pour la classification des bactéries lactiques (Pot
et al., 1994). Ces critères portent sur:
+ La morphologie,
+ Le type de fermentation,
+ La physiologie,
La composition de la paroi bactérienne,
+ La mobilité élect rophorétique der lactate déshydrogénases (LDH),
+ Le profil des protéines totales en SDS-PAGE,
+ La sérologie,
+ Les marqueurs chimiotactiques,
+ La structure et les relations immunologiques entre les LDH et les autres enzymes,
La composition en bases de l'ADN et l'homologie d'ADN,
+ Le profil plasmidique,
L'hybridation d'ADN: ARNr,
+ Le catalogage selon PARNr 16S,
+ La comparaison des analyses des séquences d'ARNr 16S/23S,
+ D'autres critères dont:
L'analyse des fiagrnents de restriction,
Les anticorps monoclonaux,
L'activité bactériolytique.
Ces critères ont permis de classer les bactéries lactiques en quatorze principaux genres
qui sont: Aerococars, AAoi~~occus, Camobacterium, Enterocuc~us, Lactobacillus,
Lactococars, Letrconostoc, Gemellea, Pedimoccus, Peptococcus, Pepfostreptroocccs~
Strepfococnrs. Tetragenacoçcus et Vagococcus. Les cocci Gram-positifs et catalase-négatifs
(Aerococcus, Aifoiococcus, Enterococus, GemeIlea, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Peptococcus, Peptostreptococcu~~ Strepococcus, Tetragenococcus et Vagococcus) peuvent
être divisés en deux groupes: le groupe des anaérobies facultatifk ou microaérophiles et celui
des anaérobies stricts (Pot et al., 1994). Panni les quatorze genres de bactéries lactiques, les
plus utilisés dans la fermentation d u produits laitiers en Amérique du Nord sont les genres
Lactococms, Luciobacillus, Leuconostoc et Strep fococcus (Holt et al., 1994).
Notons que la classification des bactéries lactiques est encore sous investigation et
restera pendant longtemps un important sujet pour les taxonomistes. Le grand nombre
d'espèces déjà décrites et l'isolement continu de nouvelles bactéries lactiques a travers le
monde, requièrent l'utilisation d'approches taxonomiques polyphasiques. L'utilisation combinée
de techniques révélant des relations à des niveaux taxonomiques différents faciiitera
i'identification et la classification de nouveaux isolats (Pot et al., 1994).
1.5. Le genre L ~ ~ ~ O C O C C ~ S
Le "Bergey's Manual of Detenninative Bacteriology" (Holt et al., 1994). reconnaît cinq
espèces de lactocoques. Parmi eues, l'espèce Lactococczis laclis comprend trois sous-espèces,
soit L. luctis sous-espèce lactis, L. lacfis sous-espèce cremoris et L. Zuctis sous-espèce
hordniae. Les caractéristiques des espèces et sous-espèces de Loctococnrs laclis sont résumées
dans le Tableau II.
II-
Des souches de L. locls peuvent être isolées de matfiel végétal, incluant des l@xnes
frais ou congelés (Sandie et aL, 1972). Le lait au contient une quantité remarquable de
lactocoques, mais la vache m porte peu, tant dans sa salive que sur son corps. Les lactoco~ues
entreraient dans le lait à partir de l'environnement exttneur, Ion de la traite ou P p& des
fourrages qui pourraient être la source première d'inoculation (Teuber et d, 1981). Ils sont
utilisés pour la fabrication de nombreux fromages, surtout L. Iactis qui est couramment
employé pour la fabrication du Cheddar. Les lactocoques sont des bactéries a Gram psi*
sphériques, immobiles, formant des chainettes de deux à plusieurs cellules. Ils sont anaérobies
facultatifs et ne possèdent pas de catalasc. Ils poussent ai prisencc de suaes a sont dits
"ferments mérophiles" car leur température optimale de croissance est sihiCe entre 25 et 30°C.
1.6. Les phages des Iactocoques
Les lactocoques utilisés pour les fermentations sont sensibles aux bactériophages,
entraînant parfois une inhibition totale de la production d'acide lactique (Whitehead et
a1.,1935). L'utilisation de lait pasteurisé non stérile provenant du lait cru qui est une niche
écologique pour les phages, la nature fluide du lait favorisant la dispersion des phages et
l'emploi continu de cultures pures de lactocoques expliquent la prolifération des phages dans les
usines laitières.
Les phages des lactocoques sont tous caudés (possédant une queue) et constitués d'un
.ADN double brin entouré d'une coque protéique. Ils ont une morphologie et des dimensions
variables, avec une queue entièrement protéique, non contractile et dont k taille est égaiement
variable (J&s et al-, 1991). Cette queue protéique est utiliste pour infecter l'hôte (Acke-
et DuBow, 1987a). Certains phages de L. lactis sont tempérés, mais la majorité est virulente.
Les phages de lactocoques sont classés selon leur morphologie et l'homologie de leun
ADN. Ces critères ont permis de les classer en 12 espèces regroupées dans deux famille
(Jarvis et al., 1991). Ces espèces et familles sont présentées dans le Tableau III-
Dix de ces espèces appartie~ent à la fpmille des S i p h 0 v i . i ' et ont une tête
isométrique ou allongée et une longue queue non contractiie. Les deux es- restantes
appartie~ent à la famille des Poriovin'dze avec une tête ailongée, mais une queue trb courte.
Tableau III. La phages des Iactocoques et leurs principilcr caractCrîstiqucr
(selon la classification de Jarvis et al., 1991).
Famille Morphotype Espèce C~~a~tesistiques
Sip hovindae B1 936 P335 BK5-T Tl87 Pl07 1483 1358 949
Podoviridae C2 PO34
Podoviridae C3 KSYl
Petite ou large tête ioométrique inférieure à 60 nm
Queue non contractile, inférieure a 200 m de long
Tête peu allongée, 60 x 40 nm Queue non contractile inférieure à 100 nm de long
Tête peu allongée, 65 x 44 nm Queue très courte
Tête allongée, 230 x 50 nm Queue longue de 35 nm
Dans l'industrie laitière mondiale, trois des 12 espèces sont très fréquentes mais en
proportion variable selon le pays et le système de ferments utilisé (Moineau et d., 1992). Ce
sont les espèces 936 et P335 avec une petite tête ioométrique et l'espèce c2 avec une tête
allongée @ipn 2). Toutes les trois espèces ont une queue non-contrade. Environ 80.h des
phages isolés dans les fermentations industrieiles nord-am6ricaines appartiennent I l'espèce
936 (Moineau et al., 1996 ; Labne et Moineau 1997).
Figure 2. Microphotographies des trois espèces de phages I t s plus fréquentes dans les
industries Iaitiires (Moineau et al., 1992)
1.7. Description du phage KSYl
Le phage KSY l a été isolé en 1979 en F i a n d e par le Dr M:L. Saxelin et son équipc a
partir d'un produit laitier visqueux, filant et acide du nom de "vüli". Le phage a été partiellement
caractérisé. Il appartient à la f d e des PodoMn'the et au morphotype C3. Sa tête mesure 230
x 50 nm et sa queue est longue d'environ 35 nm et non contractile @igm3). Sa souche-hôte
(KER 1248) est un Lactocuccus Ioclis de la sous-espèce cremoris qui produit des capsules. Il
se réplique e g h e n t sur une autre souche de cremoris (souche 249) qui est non-capsulée .
Son "burst sizen (rendement moyen) est de 80 phages par cellule et le temps de latence est de
1 50 minutes à 20°C. Sa densité en CsCl est de 1.436 &rn3 (Saxelin et ai., 1979).
KSYl a une seule proteme majeure d'environ 43 kD (Saxelin, communication
personnelle; JaMs et d, 1991). Son ADN a une densité de 1.679 g/crn3 en gradient de
chlorure de cisium et la valeur de G+C est d'environ 16% (Saxelin, communication
personnelle).
1.8. But du travail propos6
Le but de ce projet est d'approfondir les connaissances sur le phage KSYl. En e f b ,
paxmi environ 4500 virus bactériens, KSYl est le seul phage à avoir une telie morphologie. II se
réplique sur des souches de Lacfococcils ïactis productrices de polysaccharides et est peu
connu sur le plan génomique.
Les objectifs sont donc de réexaminer la morphologie du phage au microscope
électronique, déterminer son spectre lytique a confirmer son profil protéique. Nous d o n s
ensuite établir son profil de restriction, déterminer la taille de son gtnome ainsi que la nature et
le pourcentage des bases qui le composent. La similarité de son ADN avec ceux des phages
d'autres espèces, notamment les trois espèces phagiques les plus fiéquentes dans i'industrie
laitière, sera également déterminée. Finalement, le profil plasmidique des souches bacteriemes
sensibles sera établi.
2.1. Souches bactirknnts, phages et müieux de culture
Les souches bactériennes utilisées sont Lact0coccu.s Iac- sous-espèce cremon's,
souche E R 1248, provenant du Centre Félix d'Hérelie (Département de biologie médicale,
Faculté de médecine, Université Laval), et d'autres souches de ladocoques dont la souche QE
de Luctococcus hctis sous-espèce cremovàs, provenant du laboratoue du Dr S. Moineau
(Département de biochimie, Faculté des sciences d de génie, Université Lavai). Toutes les
souches ont été propagées à 30°C dans du milieu Ml7 ( D i i Moratonts, Detroit, MI) selon
la méthode de Temghi et Sandine (1975) avec addition de 0.5% de lactose comme source de
carbone. Les phages utilisés, leurs souches hôtes et leun provenances sont résumés dans le
Tableau IV.
Tableau IV : Les phigm et bact6rics utiiirés dans kr up€riciiccr
Phages Souchcs hôtcs Provcaince Espke
KSY l HER 1248 (L W s sous-espèce wemon's) Centre F. d'Hérelle KSYl
T4 HER 1024 (E. coli B 1 1303) Centre F. d'HéreIle T4
47 SMQ 189 (L lactis) Dr S. Moineau c2
uf36 SMQ 86 (L. hctis) Dr S. Moineau P335
4 3 8 SMQ 196 (L. hctis) Dr S. Moineau 936
Qss QE (IL Iactis sous-espèce cremoris) Dr S- Moineau 936
2.2. Amplification et concentration du phage KSY1
Le phage KSYl (section 1.6), a été amplifie sur la souche HER 1248 selon la méthode
de Moineau et al. (1994) légèrement modifiée. Ainsi, après croissance de la souche HER 1248
à 30°C dans du milieu Ml7 additionne de lactose (LM17), 100 pl de lysai de KSYl et 100 pl
de culture bacténeme ont été inoculés dans 10 ml de LM17 en présence de CaCl2
(concentration h a l e de 10 mM). Le phage et sa souche-hôte ont été ajoutés en même temps au
milieu de culture et l'incubation s'est poursuivie pendant toute la nuit à 20°C. Le lysat obtenu a
été fihé et titré. Cette étape a été suivie par une deuxième amplification identique dans le but
d'élever le titre du lysat avant de préparer un grand volume (1 litre de LM17) pour h
concentration du phage.
Après amplification et ajout du NaCl à 0.5 M, on a procédé à une centrinigation a 10
000 rpdmin (centrifugeuse Bechan modèle JZ-21, rotor JA-14, Paio Alto, CA) pendant 15
minutes pour éliminer les débris bactériens. Les particules phagiques ont été précipitées par du
polyéthylène glycol (PEG) 8000 a 4*C pendant toute la nuit (Yamamoto et d., 1970). Ensuite,
les partides ont été récoltées par centrifugation a 10 000 rpmlmin pendant 15 minutes
(Beckman modèle J2-21, rotor JA-14) et reprises dans du tampon de phage (20 mM Tris-HCf,
pH 7.4, 100 mM NaCI, 100 m M MgC12- Maniatis et al., 1992). Finalement, Les phages ont W
concentrés par ultracentrifiigation (60 000 rpdmin, rotor NVT65, ultracentriftge Beckman
Optima TM LE-80 K) pendant 18h sur gradient continu de chlorure de césium (Émond et of.,
1997) et dialysé trois fois contre du tampon de phage à la tempéraîun de la pi&
2.3. Microscopie üectronique
A l'aide d'une pipette Pasteur, une microgoutte de phages concentrés a été dm& sur
une grills en cuivre (type Athène, 200 ou 400 trous, 3 mm de diamètre) portant un nIm de
Fomvar renforcé au carbone. Elle a ensuite été colorée négativement par le phosphotungstate
de potassium (ZN, pH 7.2 ; Brenner et Home, 1959). L'excès de colorant a été enlevé avec une
languette de papier filtre.
Les @es ont été examinées avec un microscope électronique Philips EM 300 (60 kV,
diaphragme d'objectif30 pm). Les microphotographies ont été prises au grossissement nnal de
297 000 x et enregistrées sur nIm (Kodak Fine Grain Positive Film, 35 mm; Kodak, Rochester,
NY). Eues ont ensuite été agrandies 10 fois avec un appareil Durst S 4 5 (lampe POINT) et
tirées sur papier Ektamatic SC (Kodak).
2.4. Profd protéique et sCguence des acides amin&
Un échantillon de phages concentrés est bouilli pendant 10 minutes dans un volume égal
de tampon d'échantillon (120 mM Tris-HCl pH 6.8, 20% giydrol, 4% SDS (BDH C h d d s ,
Toronto, ON), 10% Bmercaptoéthanol) (Braun et al., 1989). Les prottines phrgiques ainsi
libérées ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacryiamide à 15% en présence de
SDS (LaemmIi, 1970). La cellule utilisée est du type Mini-Protean 2 (Bio-Rad hboratonm,
Mississauga, ON) avec une tension de 50V pour le gel de rattrapage et lûûV pour le gel de
séparation. La référence est un marqueur de poids moléculaire à large spectre (New Engluid
Biolabs, Mississauga, ON). Les protéines phagiques ont été visualisées après coloration au bleu
de Coomassie (Bio-Rad).
Les protéines siparées comme décrit plus haut ont Cti ensuite trarwf&&s sur une
membrane de type ProBlott (Applied Biosystems) P l'aide d'un tampon de transfert contenant
10 mM CAPS (10mM 3-cydohexylamUi01-propane sulfonic acid, pH 11.0, SIGMA. St-Louis,
MI) et 10% de mdthanol. Après coloration au bleu de Coomassie, la bande correspondant i. la
protéine majeure a été prélevée en la coupant et son extrdmité N-termînale soumise au
séquençage par dégradation selon Edman sur un séquenceur automatique (Puise Liquid Protein
Sequencer, modèle 473 A, App lied Biosystems, Foster City, CA).
2.5. Le spectre lytique
Trente-quatre souches de Iactocoques de la coliection du Dr Moineau ont Yi
ensemencées dans du bouillon MI7 additionne de lactose ou de glucose comme source de
carbone. Ensuite, la surface d'une gélose a été inondée avec 3 ml d'une ailturc en phase
exponentielle de croissance. Après avoir enlevé le surplus de culture et lais& la boîte
légèrement sécher, une goutte de lysat de KSYl a été déposée sur chacune et les boîtes ont ét6
incubées à 20°C pendant toute la nuit. Le lendemain, chaque boîte a été examinée pour détecter
la présence de plages de lyse.
2.6. ProfiI plasmidique des souches sensibles
L'ADN plasmidique a été iwlC selon la méthode de O'Sullivm et Klatnhammer (1993).
Un millilitre d'une culture d'environ 18 heures a Ct6 centrifiige et le culot de cclluics traité par
200 pl de sucrose 25% contenant du lysozyme (30 mglml, Biozyme, Universitt Laval, QuCbec,
QC). Les cellules ont ensuite été traitées avec 400 pl d'une solution alcaline (0.2 N NaOH et 3
% SDS) et les protemes précipitées avec 300 pl d'une solution d'acétate de potassium (3M, pH
4.8) glacée et éliminées par centrifugation à 14000 rpmlmn pendant 15 minutes (centfigeuse
Eppendog 5415 C, Brinlanann Instnunents, Missisoauga, ON). LXDN contenu drns le
surnageant a été précipité avec 650 pl d'isopropanol et centrihg6 pendant 15 minutes i 14 000
rpdmn dans la même centrifugeuse. Ii a ensuite été repris dans 320 pl d'eau distillée stéde
additionnée de 200 pl d'acétate d'ammonium (7.5 M) et traité avec 350 pl de phénol-
chloroforme. L'ADN plasmidique ainsi isolé a été précipite avec de l'éthanol a 95%, nettoyé
deux fois avec de I'éthanol à 70%, repris dans 40 pl Tris-EDTA et traité avec 1 @ de RNase H
(Boehringer Mannheim, Montréal, QC).
L'ADN plasmidique ainsi obtenu a étC soumis à la séparation par électrophortse sur gel
dagarose à 0.8 ./o dans du tampon TAE (40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA) avez une ceilde a
électrophorèse Minigel, modèle B 1A (OWL, Montréal, QC). Après coloration au bromure
d'éthidium, le gel a été exposé sur un transiliuminateur à rayons U.V. (FBTI-816, Fisher
Scientific, Nepean, ON) permettant la visualisation des bandes plasmidiques, qui ont été
photographiées par digitalkation Poiaroid.
2.7. Profil de restriction et taille du génome
L'ADN du phage a eté isolé selon la méthode de Moineau et al. (1994) légèrement
modifiée. Une quantité de 200 pl d'une suspension de phages purifiés a été traitée avec 1 pl de
DNase 1 (6 mglml; Boehringer Mannheim) et 1 pl de RNue H (20 mghi; Boehringer
Mannheim) à 37 OC pendant 30 minutes. Ensuite, les phages ont été traités avec 80 pl de SDS
10% à 70°C pendant 30 rnn et 10 pl de protéinaoe K (1 mg/mî) (LiTe Technologies, GIBCO
BRL, Burlington, ON) à 37OC pendant 1 heure. Cent-trente-cïnq (135 pl) microlitres d'acétate
d'ammonium (100 miM, pH 7.5) ont étC ajoutés, suivis d'un volume égal de phkiol-chloroforme
(355 pl). Après centrifugation a 14 000 rpm pendant 10 niinutes, le surnageant a été récupéré
et le traitement au phénolchlorofonne a Ctt répété jusqu'à l'absence d'une intedacc protéique.
L'ADN a été précipité ensuite avec un volume egal(650 pl) d'isopropanoi, centrifuge a 14 000
rpm pendant 15 minutes et lavé deux fois avec de l'éthanol à 700/.. Le culot ainsi obtenu a été
repris dans 50 pl de Tris-HC1 @H 8) a traité à la RN- H (1 mghi).
Pour établir le profil de restriction, I'ADN extrait a étt digéré avec l a entymes de
restriction S',pl., DmI, et Am1 dans les conditions spéciiées par le manufacturier (Boehringer
Mannheim). Les hgments obtenus ont été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose a 0.8 %
dans du tampon TAE (40 m . Tris-acétate, 1 m . EDTA). Le gel a été coloré au bromure
d'éthidium et les Eragments visualisés par exposition du gel sur le même transluminateur a
rayons U.V. décrit précédement, puis photographié.
Pour déterminer la taille du &nome, l'ADN digéré a été soumis à une électrophorèse sur
gel d'agarose à 1% dans du tampon TBE (Tris-acide borique, O.SM EDTA) dans une cellule de
15 cm x 15 cm selon la technique du FIGE (Field Inverse Gel Electrophoresis; Bio-Rad
Laboratones), qui utilise un courant de 180V en avant et de 120V a l'oppod. De même, l'ADN
non-digéré a été soumis à une électrophorèse identique pour comparaison avec les fragments de
l'ADN digéré. Les marqueurs utilisés sont 1 kb, 5 kb et I concatémerique tous de GIBCO
BRL.
2.8 Hybridations d'ADN
L'hybridation de l'ADN du phage KSYl avec ccux d'autres espèces phagiques a été
étudiée selon la technique Southem Dans un premier temps, une sonde a été préparée en
digérant l'ADN de KSYl avec l'enzyme de restriction Am1 et en marquant de fhçon aléaîoire
les fragments obtenus @nsemble "DIG DNA Labeling" de Boehringer Mannheim). L'ADN de
KSY l a été digéré dans un second temps avec la même enzyme a après électrophorèse (section
II.7.), il a été transféré sur une membrane de nylon (Hybond-N+, Amersham. Arlington
Heights, E) par capillarité selon le protocole de Moineau et d. (1994).
Après fixation de l'ADN par les rayons U.V., on a proddC P la pré-hybridation (pendant
4 heures à 42OC) dans la solution DIG Easy-Hyb (Boehringer Mannheim) suivie de l'hybridation
(12 heures a 42OC) dans la même solution à laquelie on a ajout6 la sonde. Après deux lavages
de 5 minutes chacun à la température de la pièce [tampon 2x SSC (Sodium Sulfate Citrate) +
0.1% SDS], suivis de deux autres de 15 minutes chacun à SS°C, (tampon 0.5 x SSC + 0.1%
SDS) un blocage des sites de fixation non spécifiques a été fait (réactif de blocage dilué au 1/10
avec du tampon acide maléique (100 mM acide maléique, 150 mM NaCI, pH 7.5). Ensuite,
deux autres lavages de 15 minutes chacun ont été faits à la température de h pièce, suivis de la
détection de la sonde marquée à la digoxigénine en utdisant l'anticorps anti-digoxigénine et le
substrat chemiiuminescent (Boehringer Mannheim) coupé à la phosphatase dcaiine. La
membrane a ensuite été exposée à un film sensible (Xomat Kodak) et l'hybridation a été révélée
après développement dans les solutions de Kodak (Révélateur et Fixateur KodaJc GBX).
2.9. Compositioa de l'ADN du phage KSYl
Après extraction de L'ADN du phage comme décrit dans la section IL7, il a &é lyophüisé
dans l'appareil Speed-Vac, modèle SC1 10A (Speed-Vac Concentrator, Savant Instrument Inc.,
Farmingdale, NY). Ensuite, 400 pg ont été soumis 4 une hydrolyse par un millilitre d'acide
formique 85% dans l'appareil ~ i c o - ~ a ~ m Work Station de Waters (Miifîord, MA). Après
hydrolyse, l'ADN est séché dans le Speed-Vac et repris dans 200 pl de tampon (bis-Tris 50
mM, 2 mM MgC12, 1 rnM ZnCl2 pH 4.5). Des standards de comparaison comprenant les
quatre bases normales (A, T, Gy C) et des bases modifiées (5-méthylcytosine, 5-
hydroxyméthylcytosine, uracile, 5-hydroxyméthyluracile) (Sigma, St-Louis, MI) ont été traités
de la même façon.
Les standards et I'échantiilon ont été soumis a une chromatographie a haute pression en
phase inverse (HPLC ou "High Pressure Liquid Chromatographyn). Cet appareii HPLC de
Waters (Milford, MA) comprend des contrôleurs d e pression (Waters 600), un détecteur de
rayons U.V. visibles (Waters 486)' une pompe (Waters 600). un échantiiiomeur automatique
"717 plus" et un logiciel de gestion des données (Millenium, TXT Québec, QC). Les différentes
bases contenues dans l'échantillon ont été identifiées par comparaison de leurs pics avec ceux
des bases-étalon et leur quantité a été déterminée selon l'aire du pic.
3.1. Morphologie du phage KSYl
La concentration du phage KSYl en m e n t continu de chl0IUte de césium (&on
II.2) a été très efficace, de sorte que les phages se présentent au microscope Clcctronique en
paquets de particules parailèles Vigure 4). Cette disposition insolite a tout-&-nit inhabituelle
des phages est due à leur morphologie particulière.
La microscopie électronique a confirmé la morphologie de KSYl telie que décrite dans
la littérature. Après coloration négative au phosphotungstate de potassium et au grossissaient
de 297 000 x. les dimensions du phage sont les mêmes que celles rapport&s par Saxelin et d,
(1979), soit 230 x 50 nm pour la tête et 35 nm pour la queue. La queue porte des structures
annelées qui pourraient effectvement se& de structures de fixation du phage k son hôte.
Malgré l'isolement de centaines de nouveaux phages, KSYl demeure unique. Aucun autre
phage ayant une morphologie semblable n'a encore étC dCcnt dans la littérature.
3.2. Profil protéique du phage KSYl
Le profil protéique du phage KSYl avait déjà été détermine par Saxeün
(comrnunication personnelle) et rapportée par Jarvis et al., 1991. Ce profil présente environ 15
bandes de polypeptides dont la plus grosse, qui est celle de la protéine majeure, a une masse
d'environ 43 kD. Ces données déjà publiées ont été c o ~ r m é e s par nos résultats. La séquence
peptidique de l'extrémité N-terminale de cette protéine a été établie par le Dr S. Bourassa du
Service de Séquence de peptides de l'Est du Québec situé au Centre de recherche du CHUL.
Elle est de PSISVGAGSQA pour les douze premiers acides aminés. Selon le programme
BLAST (Altschul et al., 1997), aucune protéine semblable n'a été trouvée dans les banques de
données,
3.3. Spectre lytique
Sur trente-quatre souches de lactocoques testées (section II.S.), une seule souche s'est
avérée être sensible au phage KSYI. Cette souche, appelée QE, produit des exopolysaccharides
(la présence de capsule et la nature des exopolysaccharides ne sont pas connues) et pr&nnte le
même profil plasmidique que la souche HER 1248, qui est la souche-hôte de KSYl et qui
produit des capsules exopolysaccharidiques. Les deux souches sont aussi sensibles au phage
Q55 de l'espèce 936. Le phage KSYl est également propagé par la souche 249 provenant du
laboratoire du Dr Saxelin (Saxelin et al., 1979) qui ne produit pas de capsule. Rappelons que
toutes sont des souches de L. lactis sous-espèce cremork
FIGURE 3. Phages concentrés formant des paquets parallèles (coloration négative au
phosphotungstate de potassium; grossissement 297 000 x). - La barre est égale à 100 nm.
FIGURE 4. Microphotographie du phage KSYl après coloration négative au
phosphotungstate de potassium (grossissement 297 000 x) - La barre est égaie Q 100 nm.
FIGURE 5. Profil protéique du phage KSY1. Électrophorèse d u protéines en gel de
polyacrylamide (PAGE) à 15% après coloration au bleu de Coomassie.
Puits 1. Standard de poids moléculaire i large spectre (New Englind Biolab).
Puits 2. Protéines du phage KSY1; la plus grosse bande correspond 1
environ 43 kD.
3.4. Profd plumidique des souches sensibles au phage Km1
L'etabiissement du prof3 plasmidique des souches HER 1248 et QE sensibles P KSYI
(section II.6.) a dom6 un résultat semblable pour les deux souches. Ces pronls identiques
laissent supposer que les deux souches sont apparentées. Cette ressemblance des deux profils
plasmidiques a éte confinnée en les digérant avec les enzymes de restriction EcoRI a EcoRV,
renforçant l'hypothèse de la parenté.
3.5. Profd de restriction du phage KSYl
Sur vingt-cinq enzymes testées (section 11.7.). seules trois coupent l'ADN de KSY1. La
séquence de reconnaissance pour chacune de ces trois enzymes est:
Ami: A ~ A A T
D ~ = I : ~ A A A
SJPI : AA+ ATT
Ces enzymes coupent l'ADN de KSYI, plusieurs fois, donnant de nombreux fhgments
qui sont ditncilement séparables et quantifiables. La résistance de l'ADN de KSYl à plusieurs
enzymes de restriction, notamment celles ayant les sites de coupure contenant G et C, laisse
supposer que cet ADN porte des modifications.
3.6. Taille du génome du phage KSYl
La taille du génome du phage KSYI, déterminée par électrophorèse de l'ADN non
digéré par inversion du champ (ou FIGE pour Field Inverse Gel Electrophoresis), est de 130 * 10 kpb. La marge de 10 kpb, correspond a l'erreur inhérente a la technique du FIGE. Ainsi.
avec environ 130 kpb, le phage KSYl possède le plus grand génome parmi tous les phages de
lactocoques rapportés dans la littérature.
FIGURE 6. Profil plasmidique des souches HER 1248 et QE sensibles au phage KSY1.
Gel d'agarose à 0.8%.
Puits 1. Marqueur d'ADN surenroulé (GIBC0fBR.L)
Puits 2. Contrôle positif [SMQ 291 (L lmtis)].
Puitr 3. HER 1248 (souchchôte de KSYl).
Puits 4. QE (deuxième souche sensible à KSYl).
Puits S. Contrôle négatif [LM 0230 ( L lizctis)].
FIGURE 7. Profd de restriction du phage KSYl en gel dd'agarose i 0.8% ip* coloration
au bromure dd'6thidium.
Puits 1. Marqueur 1 kb (GIBCO/BRL).
Puits 2. ADN du phage KSYl digW par AsnL
Puits 3. ADN du phage KSYl digM par DraL
Puits 4. ADN du phage KSYl digCrC par Ss;pl
FIGURE 8. Électrophorèse en gel d'agarose par inversion du champ (FIGE) de I'ADN non
digéd du phage -1.
Puits 1. Maqueur conutémérique de 5 (GIBCO/BRL)
Puits 2. ADN non digér6 du phage KSY1.
Figure 9. Électrophorèse en gel d'agarose par inversion du champ (FIGE) de l'ADN
du phage KSYl après digution par AsnI et DraL
Puits 1. Marqueur 1 kb (GWCO/BRL).
Puits 2. Marqueur 5 kb (GIBC0lBR.L).
Puits 3. ADN de KSYl digéré par DraI.
Puits 2. ADN de KSYl digéré par AsnI.
Puits 3. ADN de KSYl digCré par DraI.
3.7. Hybridations d'ADN
La technique Southem a démontré que I'ADN du phage KSYl n'hybride pas avec
l'ADN des phages Q7 et QSS de i'espke 936, ni avec celui du phage 4 3 8 de l'espéa c2, ce qui
se traduit par l'absence de bandes sur le film après révélation (Fig. 9 B). L'ADN de KSYl
n'hybride pas non plus avec l'ADN du phage T4, dont i'ADN est modifié p u remplacement de
la cytosine par la 5-hydroxyméthylcytosine a addition de glucose (Wyatt a Cohen, 1953;
Jesaitis, I956).
Une faible hybridation est observée avec l'ADN du phage ul36 de l'espèce P335. Cette
hybridation visible dans la figure 9 B. a été confimi& en rdpdtant l'expérience avec la ronde
u136 (Fig. 10 B). Elie est situ& sur un fiagrnent d'environ 6 kpb du phage KSYl et un îragment
d'environ 9 kpb du phage un6 (Figs. 9 B et 10 B).
FIGURE 10. Vérification de la similarit& entre l'ADN du phage KSYl, du phage T4 et des
quatre phages de Iactocoques 4 7 et QSS (espèce 936), 438 (espèce c2) et
u136 (espèce P335).
A. Profil de restriction des phages (gel d'agarose i 0.8%; coloration au
bromure deéthidiurn).
Puits 1. Marqueur 1 kpb (GIBCO/BRL).
Puits 2. ADN de KSYl digéré par AsnL
Puits 3. ADN de T4 digéré par AsnL
Puits 4. ADN de Q7 digéré par Eco=
Puits 5. ADN de Q38 digéré par EcoRI.
Puits 6. ADN de QSS digéré par Eco=
Puits 7. ADN de 11136 digér6 par Eco=
B. Hybridation des ADN de différents phages avec la sonde faite à partir de
l'ADN du phage KSYI.
Puits 2. KSYl ayant hybridé avec lui-même.
Puits 7. Fragment uD6 ayant hybridé avec la sonde KSY1.
Les puits sans réaction 1,3,4,5,6 correspondent au marqueur et aux ADN
des phages T4, Q7.438 et Q55 n'ayant pas hybridé avec la sonde KSY1.
Figure 11. A. Séparation de l'ADN des phages KSYl et u136 par électrophorése sur gel
d'agarose à 0.8%.
Puits 1. Marqueur 1 kpb (kpb, Gibco/BRL).
Puits 2. KSYlIAsnL
Puits 3. u136/EcoRI,
B. Hybridation Southern avec la sonde faite à partir de l'ADN du phage ul36.
Puits 1. Vide correspondant au marqueur 1 kpb n'ayant pas hybridé.
Puits 2. Fragment d'ADN de KSYl ayant hybridé avec Ia sonde ul36.
Puits 3. ADN du phage uI36 ayant hybridé avec lui-même.
3.8 Nature et pourcentage des basa qui composent l'ADN du phage KSYl
Après hydrolyse acide, la chromatographie en phase inverse en HPLC montre cinq pics
de hauteur variable, constamment présents, et une série de pics mineurs inconstants situés entre
les cinq pics majeurs.
Quatre pics majeurs et- constants sont identifiés par leur ressemblance aux profils
chromatographiques des quatres bases normales (ATGC) purifiées et testées dans les mêmes
conditions. Le cinquième pic n'a pu être identifié, car il ne correspond à aucun pic des bases
normales ou modifiées (5-méthylcytosine, 5-hydroxyméthylcytosine, uracile, et 5-
hydroxyméthyluracile), utilisées comme bases-étaions pendant l'expérience. Les quantités
relatives de ces bases correspondent à 16% de guanine, 10% de cytosine, 5% de base inconnue,
34% de thymine et 35% d'adénine. La valeur de W C est alors d'environ 26% et est légèrement
supérieure à celle trouvée par le Dr Saxelin (communication personnelle), soit environ 19.h par
la méthode de Kropinski (1974). En se basant sur les pourcentages des différentes bases
normales trouvées dans I'ADN de KYS 1, on peut supposer qu'une partie de la cytosine est
modifiée,
Des pics mineurs et inconstants apparaissant parfois sous forme de bruit de fond tant
avec les standards que les échantillons, sont probablement dus à la présence des sels dans le
tampon (50 mM bis Tris-HCl, 2 m M MgCl% 1 rnM ZnCl2 pH 7.4; Crozatier et al., 1988)
ayant seM à resuspendre les échantillons et les standards. Leur quantité est demeurée plus ou
moins importante selon les concentrations d'échantillon ou de standard utilisé, mais ils n'ont pas
été pris en considération à cause de leur inconstance. Le pic de la guanine sur le
chromatographe des standards (Fig. 13) est pratiquement invisible, la guanine n'étant pas
soluble au pH recommandé (4.5) pour un tampon compatible avec la colonne du HPLC.
FIGURE 12. Profil chromatographique des quatre bases normales (ATGC) sur HPLC en
phase inverse. Les quatre bases ont été miiangées avant Pupirience et
traitées dans les mêmes conditions que l'ADN de KSYl.
Nom
cytosine
Guanine
Thymine
Le pic h tcmps de retention 6.25 minutes est I'im der pics inconstants appYWIlnt awc les
standards et l'&hantillon.
Figure 13. Profil chromatographique des bases de l'ADN du pbage KSYl
Noms Temps de retention Surface Hautew Proportion
(min) (UV/ sec) (UV) relative
Cytosine 5 .O50 789458 63905 1%
Guanine 7.800 1601096 103595 16%
Base modifiée 8.617 425979 29557 5%
Thymine 11 -300 3223278 220630 34%
Adénine 13.017 4458279 229213 35%
Les pics avant et après celui de la cytosine sont les pics que nous considtrons comme liés au
tampon, car apparaissant avec les standards et l'échantillon.
CHAPITRE N
DISCUSSION
Les phages des lactocoquer sont de nos jours l'objet de plusieurs études à cause des
pertes causées par les infections phagiques des fermentations dans les usines fiornageres.
Le phage KSYl, isolé pour la première fois en 1979, s'est révélé être un phage
particulier sur plusieurs plans. Avec sa morphologie unique (longue tète d'environ 230 x 50 nrn
et petite queue non contractile de 35 nm ponant des structures annelées), il est le premier
phage du morphotype C3 à infecter des bactéries à Gram positif (Saxelin et al., 1979). En effet,
de tous les phages isolés jusqu'à nos jours et rapportés dans la littérature, aucun phage n'a une
morphologie similaire a celle de KSYl. Parmi les phages des lactocoques, seulement deux
phages sont membres la famille des Podoviridze, mais les deux n'ont pas la même morphologie
et n'appartiennent pas a la même espèce. Le deuxième phage de lactocoque de la f d l e des
Podoviridbe est du morphotype C2 et appartient à l'espèce P034. Un phage nommé KSY2 a été
trouvé par Saxelin et al., (1986), mais il ne semble pas y avoir de différence entre KSYl et
KSYZ. En effet, il a été constaté que KSYl se répliquait Meux sur la souche 248, l'hôte de
KSY2, que sur la souche 249. Cette dernière a donc été remplacée par la souche 248 (HER
1248), qui est actuellement la souche propagatrice de KSY 1.
de latence varie chez les autres phages entre 16 et 55 minutes en fonction de la température
d'incubation a du milieu de culture utilisé (Keogh 1973). Les plages de lyse sont di- aprà
24 heures et ne deviement claires qu'après 48 heures, pdois même après 72 haires. Cette
faible virulence de KSYl pourrait s'expliquer par une faible adsorption des phages i leun
ceUules-hôtes. Le: halo obscwi autour des plages de lyse est dQ & la difltiision de la lysine
produite par le phage KSYl et s'étend dans le milieu au îÙr et P mesure que le temps passe
pour atteindre une largeur d'environ 5 mm. Malgré sa fable virulence, le phage KSYl
provoque l'échec de la fexmentation du viili (jogourt traditionnel Mandais), fermentation qui
était faitt par des souches sensibles et résistantes au phage.
KSYl est le premier phage de lactocoque à hydrolyser des polysaccharides de la
capsule de certaines souches de lactocoques (Saxelin et al., 1979). La technique utilisée pour
vérifier cette caractéristique de KSYl s'est avérée être inefficace car non reproductible. En
effet, une étudiante d'été travaillant dans le laboratoire du Dr Moineau faisait pousser des
souches productrices d'exopolysaccharides dans le lait et les infectait par la suite avec le phage
KSYl pur en différentes dilutions (le lysat non-diut n'était pas utüid pour évita les fbc
positifs dus à l'action de fa lysine). Eue mesurait ensuite la viscosité du lait fermenté au
viscosirnètre. Si le lait n'était plus visqueux dors que le contrôle nCgatif contenant la souche
bacténeme sans le phage l'était, elle concluait que KSYl avait hydrolysé les
exopolysaccharides. Cependant la non-reproductiblité de ces expériences ne nous a pas permis
d'infirmer ou de confirmer la capacité de KSY 1 à hydrolyser des polysaccharides. Ainsi, cette
caractéristique du phage qui consisterait en l'hydrolyse des exopolysawharides ou des capsules
bactériemes reste a vérifier.
La détermination du spectre lytique du phage KSYl a mis en évidence une nouvelle
souche-hôte productrice d'exopolysaccharkles. Cette souche industrielle, appelée QE, et qui est
aussi un ~ctococcus Iactis de la sous-epèce cremoris utilisée pour la production de babewre,
semble être apparentée a la souche-hôte de KSYl qui ne produit pas d'exopolysaccharides,
mais plutôt des capsules dans certaines conditions C iba t ion B 18OC selon Forsen, 1966). En
effet, les deux souches présentent le m h e profii plasmidique.
Le prof3 protéique de KSYl montre une seule protëme majeure d'environ 43 kD,
correspondant & environ 72% des protéines totales de KSYl (Saxeh, commuiadon
personnelie). Compte tenue de la morphologie du phage, il doit s'agir de la protéine capsidique
majeure. Cela confirme des résultats non-publiés de Saxelin rapportés par JPMs et d., 1991.
Cette protéine, selon la séquence de son extrémité N-tetminale, ne prisnite aucune homologie
avec des protëies dans les banques de données, démontrant une fois de plus que les protéines
capsidiques des bactiaériophages a queue sont extrêmement diversifiées (Ackermann et al.,
1996).
D'autre part, il n'a aucune hybridation de l'ADN de KSYl avec deux des espèces de
phages lactococciques les plus fréquentes dans 1' industrie laitière. à savoir les espèces 936 et
c2. Cela corrobore les données de la littérature, voulant que l'homologie d'ADN soit la
principale caractéristique pour classer les phages des lactocoques en e s p h et que des phages
de morphologie dïf£'érente n'ont généralement aucune homologie d'ADN (Janiis et al., 1991).
Quant à la faible hybridation observée avec le phage ui36 de l'esptcc P335, une espèce
d i r e n t e de KSY1, elle pourrait être attribuée à une transmission horizontaie de gtnes. En
effet, on peut conjecturer qu'à un moment donné, les ancêtres des phages ul36 et KSYl se sont
répliqués dans une même souche-hôte, où ils ont pu échanger les gènes par recombinaison.
En plus d'avoir une morphologie unique, KSYl est le seul phage lactococcique i avoir
un génome d'environ 130 kpb, excédant de beaucoup la taille des génomes des autres phagefi de
lactocoques. Le pourcentage de G+C (environ 26%). quoique légèrement supérieur au
pourcentage trouve par Saxelin (communication personnelie), soit environ lm, est fhible p u
rapport au pourcentage de G+C des autres phages de lactocoques et des lactocoques eux-
mêmes, qui varie de 36 à 38% ( J h s et ai., 1991). Le pourcentage en A+T est Clevé et se situe
aux environs de 69%.
Le phage KSYl est également le premier phage de lactocoque à montrer un ADN
modifié. La base modifiée, qui correspond à environ 5% des bases de l'ADN de KSYl, pourrait
être de la 5-hydroxycytosine, qui est la seule cytosine modinée que nous n'avons pas utilisa
dans notre expérimentation et que nous n'avons pu obtenir dans le commace. La
5-hydroxycytosine a CtC déjh m>wC chez le phage N-17 de SolinomeJGct -le
(Kchromov et al., 1980). Cependant, la faible quantite de cette base modifiée duplique pas la
forte résistana de l'ADN du phage KSYl aux c~~tymes de restriction attaquant un site GC a suggère que l'ADN du phage KSYl porte d'autres éléments pouvant u i h i l'action de ces
enzymes. En e&t, on connaît dans la littérahire des phages dont PADN est giywsyld, en plus
d'avoir des bases modifib, comme c'est le cas chez le coliphage T4 (Wyatt et Cohen, 1953;
Jesaitis, 1956) et le phage 16-19 de 5bfmonella newprt (Moazamie et d., 1979). Chez KSYl
comme chez le phage 16-19, la substitution est partielle. L'hypothèse de la glywsylation, qui
doit être vérifiée, pourrait effectivemm expliquer fa résistance de I'ADN du phage KSYl t h
plupart des endowcléases de restriction Le faible nombre d'obsewations sugg&e que les ADN
glycosylés sont rares chez les phages.
CONCLUSION
Le but de ce projet était d'approfondir les connaissances sur le phage KSYl avec
comme objectif connexe la confirmation des caractéristiques déji déaites dans la littérature.
Ce travail a confirmé la morphologie unique du phage KSYl précédemment d&rite par
Saxeiin et son équipe. Nous avons aussi établi que le phage se replique sur une autre souche de
Lacfococcus lacrs appelée QE, utilisée pour la production de babewre. Celle-ci semble être
apparentée à la souche-h6te de KSYl car les deux présentent le même profil plasmidique. Cela
reste cependant une hypothèse à approfondir.
Nous avons également prouvé que le phage KSYl avait une Seule p r o t h e majeure
d'environ 43 kD, confinnant ainsi les résultats préliminaires de Saxelin (communication
persornelie; Jarvis et ai., 1991). Le séquençage de I'extrérnitb N-tenninale de cette proteme
nous a aussi permi de démontrer par alignement BLAST qu'elle n'est identique i aucune
protéine répertoriée dans les banques de données.
La taille de son génome a Cgalement CtC établie et s'dtve i 130 * 10 kpb. Le phage KSYl ne possède aucune simila& d'ADN avec les phages des espèces 936 et c2 de
Loctococ~(c~ Mis, ni avec le coiiphage T4 qui a lui aussi un ADN modifid. D'autre part, son
ADN hybride partiellement avec l'ADN du phage lactococcique ul36 de I'espècc P335.
L'existence de cette h i l e homologie a été démontrée par des arpériences répétées et eue est
due à une séquence située P la fois sur un fiagrnent d'environ 9 kpb de l'ADN du phage d36
digéré avec l'enzyme EcoRI et un autre d'environ 6 kpb de l'ADN de KSYl digéré avec
L'enzyme AsnL
LtADN du phage KSYl est un ADN riche en adénine-thymine, aves un pourcentage
d'environ 69O/0, et pauvre en guanine-cytosine, soit environ 26%. Nous avons établi qu'il
contient environ 5% d'une base modifiée. Par exclusion, il pourrait s'agir de 5-hydroxycytosine
ou d'une autre base modifiée encore inconnue. La faible quantité de cette base modifiée
n'explique pas à eile seule la forte résistance de I'ADN de KSYl aux enzymes de restriction
attaquant des sites GC. Ceci suggère que cet ADN contient d'autres substances (comme par
exemple des sucres) qui peuvent inhiber l'action de ces enzymes.
Cette recherche ouvre la voie à plusieurs autres projets. Ainsi, il fâut imestigua si le
phage KSYl hydrolyse des polysaccharides; si cela s'avère être vrai, il faut purifier et
caractériser l'enzyme responsable. On peut également pousser plus Loin la caractérisation
génomique du phage KYSl en localisant le gène de la proteme majeure de même que ceux
responsables de la modification de l'ADN et de l'hybridation entre KSYl et ul36 de l'espèce
P335, et en vérifiant si l'ADN du phage KSYl est glycosylé.
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