exp physiol 1989 sakmann 1107 18

7/27/2019 Exp Physiol 1989 Sakmann 1107 18

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Q u a r t e r l y J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P h y s i o l o g y ( 1 9 8 9 ) , 7 4 , 1 1 0 7 - 1 1 1 8P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

PATCH CLAMP TECHNIQUES USED FOR STUDYINGSYNAPTIC TRANSMISSION IN SLICES OFMAMMALIAN BRAIN

B . SAKMANN*, F . EDWARDS*, A . KONNERTHt AND T . TAKAHASHI+* M a x - P l a n c k - l n s t i t u t f u r m e d i z i n i s c h e F o r s c h u n g , A b t e i l u n g Z e l l p h y s i o l o g i e , H e i d e l b e r g , F R G , t M a x - P l a n c k -I n s t i t u t f u r b i o p h v s i k a l i s c h e C h e m i e , G o i t t i n g e n , FRG a n d T D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y ,U n i v e r s i t v o f K y o t o , J a p a n

SUMMARYP r o c e d u r e s a r e d e s c r i b e d f o r r e c o r d i n g p o s t s y n a p t i c c u r r e n t s f r o m n e u r o n e s i n s l i c e s o f r a tb r a i n u s i n g p a t c h c l a m p t e c h n i q u e s . T h e m e t h o d i n v o l v e s c u t t i n g b r a i n s l i c e s ( 1 2 0 - 3 0 0 ,mt h i c k ) w i t h a v i b r a t i n g m i c r o t o m e f o l l o w e d b y l o c a l i z a t i o n o f c e l l s o m a t a , w h i c h c a n b e c l e a r l ys e e n w i t h N o m a r s k i d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c e c o n t r a s t o p t i c s i n t h e l i g h t m i c r o s c o p e . T i s s u ec o v e r i n g t h e i d e n t i f i e d c e l l i s t h e n r e m o v e d m e c h a n i c a l l y a n d s t a n d a r d p a t c h c l a m p t e c h n i q u e sa r e a p p l i e d . U s i n g t h e s e m e t h o d s , s p o n t a n e o u s l y o c c u r r i n g a n d s t i m u l u s - e v o k e d i n h i b i t o r yp o s t s y n a p t i c c u r r e n t s ( I P S C s ) w e r e r e c o r d e d f r o m n e u r o n e s i n r a t h i p p o c a m p u s a t g r e a t l yi m p r o v e d r e s o l u t i o n . I n t h e p r e s e n c e o f t e t r o d o t o x i n , t o b l o c k p r e s y n a p t i c a c t i o n p o t e n t i a l s ,s p o n t a n e o u s I P S C s s e l d o m e x c e e d e d 2 5 p A . E v o k e d I P S C s e l i c i t e d b y c o n s t a n t e l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n o f a p r e s y n a p t i c n e u r o n e w e r e l a r g e r a n d f l u c t u a t e d i n t h e i r a m p l i t u d e s . S i n g l e -c h a n n e l c u r r e n t s , a c t i v a t e d b y t h e p u t a t i v e i n h i b i t o r y t r a n s m i t t e r y - a m i n o b u t y r i c a c i d( G A B A ) , h a d a s i z e o f a b o u t 1 p A . T h e n u m b e r o f p o s t s y n a p t i c c h a n n e l s a c t i v a t e d b y a p a c k e to f i n h i b i t o r y t r a n s m i t t e r i s p r o b a b l y n o t m o r e t h a n t h i r t y , n e a r l y t w o o r d e r s o f m a g n i t u d es m a l l e r t h a n p r e v i o u s l y r e p o r t e d e s t i m a t e s f o r CNS s y n a p s e s . T h i s m i g h t r e f l e c t m a t c h i n g o fs y n a p t i c e f f i c a c y t o t h e h i g h i n p u t r e s i s t a n c e o f h i p p o c a m p a l n e u r o n e s a n d c o u l d b e ar e q u i r e m e n t f o r f i n e t u n i n g o f i n h i b i t i o n .

INTRODUCTIONM o s t o f w h a t i s known a b o u t t h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n a n di t s u n d e r l y i n g m o l e c u l a r c o n s t i t u e n t s i s d e r i v e d f r o m s t u d i e s o f p e r i p h e r a l s y n a p s e s , m o s ti m p o r t a n t l y t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n o f s k e l e t a l m u s c l e , t h e s q u i d g i a n t s y n a p s e ( f o rr e v i e w K a t z , 1 9 6 6 ) a n d t h e e l e c t r o m o t o r s y n a p s e o f t h e e l e c t r i c r a y T o r p e d o ( f o r r e v i e w sK a r l i n , C o x , K a l d a n y , L o b e l & H o l t z m a n , 1 9 8 3 ; W h i t t a k e r , 1 9 8 4 ) . A t t h e n e u r o m u s c u l a rs y n a p s e i t w a s d i s c o v e r e d t h a t t h e r e l e a s e o f a c e t y l c h o l i n e f r o m t h e p r e s y n a p t i c t e r m i n a l i s' q u a n t a l ' i n n a t u r e ( f o r r e v i e w K a t z , 1 9 6 9 ) a n d t h a t t h e p o s t s y n a p t i c a c t i o n o f a c e t y l c h o l i n ei s c o m p o s e d o f many ' e l e m e n t a r y ' c u r r e n t e v e n t s ( K a t z & M i l e d i , 1 9 7 2 ) . E s t i m a t e s o f t h es i z e a n d d u r a t i o n o f t h e m o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f t h e a c e t y l c h o l i n e - a c t i v a t e d p o s t s y n a p t i cc u r r e n t ( K a t z & M i l e d i , 1 9 7 2 ; A n d e r s o n & S t e v e n s , 1 9 7 3 ; N e h e r & S a k m a n n , 1 9 7 6 )i n d i c a t e d t h a t a p a c k e t o f a c e t y l c h o l i n e , w h e n r e l e a s e d f r o m t h e n e r v e t e r m i n a l , a c t i v a t e dt h o u s a n d s o f i o n c h a n n e l s i n t h e e n d p l a t e . Much l e s s i s known a b o u t e i t h e r t h e r e l e a s e o ft r a n s m i t t e r o r t h e m o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f p o s t s y n a p t i c t r a n s m i t t e r a c t i o n a t s y n a p s e s i nt h e m a m m a l i a n c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ( C N S ) ( f o r r e v i e w s K a t z , 1 9 6 9 ; J o h n s t o n & B r o w n ,1 9 8 4 ) . P o s t s y n a p t i c c u r r e n t s a t CNS s y n a p s e s a r e much s m a l l e r t h a n a t p e r i p h e r a l s y n a p s e sa n d c o n v e n t i o n a l i n v i v o o r b r a i n s l i c e p r e p a r a t i o n s r e q u i r e d t h e u s a g e o f h i g h - r e s i s t a n c em i c r o e l e c t r o d e s w h i c h l i m i t c u r r e n t r e s o l u t i o n . F u r t h e r m o r e , d u e t o f a c t t h a t n e u r o n e s a r ec o v e r e d b y s u r r o u n d i n g t i s s u e a n d d u e t o t h e c o m p l e x i t y o f s y n a p t i c c o n n e c t i o n s i n t h e

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B . SAKMANN AND OTHERSC N S , t h e p r e c i s e n e u r o n a l t y p e a n d t h e l o c a t i o n o f t h e s y n a p s e ( s ) s t u d i e d a r e o f t e n n o tk n o w n . M o s t l y t h e s e t e c h n i c a l l i m i t a t i o n s h a v e p r e v e n t e d b o t h t h e d i r e c t m e a s u r e m e n t o fq u a n t a l c o m p o n e n t s o f p o s t s y n a p t i c c u r r e n t s i n m a m m a l i a n n e u r o n e s a n d a l s o t h em e a s u r e m e n t o f e l e m e n t a r y e v e n t s a c t i v a t e d b y t h e p u t a t i v e t r a n s m i t t e r o n a p a r t i c u l a rn e u r o n e .A n o t h e r , m o r e q u a n t i t a t i v e w a y , t o s t u d y s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i n t h e m a m m a l i a n CNSw o u l d b e t o r e c o r d f r o m v i s u a l l y i d e n t i f i e d n e u r o n e s i n a p a r t i c u l a r b r a i n a r e a a n d s t i m u l a t ea s i n g l e p r e s y n a p t i c n e u r o n e . P a t c h c l a m p t e c h n i q u e c o u l d t h e n b e u s e d t o a c h i e v e a h i g h e rr e s o l u t i o n o f t h e p o s t s y n a p t i c c u r r e n t s a n d t o r e s o l v e e l e m e n t a r y c u r r e n t e v e n t s . R e c e n t l yw e h a v e d e v e l o p e d a p r e p a r a t i o n w h i c h a l l o w s t h e m e a s u r e m e n t o f s t i m u l u s - e v o k e d a n ds p o n t a n e o u s s y n a p t i c c u r r e n t s i n i d e n t i f i e d n e u r o n e s i n t h e m a m m a l i a n C N S , u s i n g t h ep a t c h c l a m p t e c h n i q u e ( E d w a r d s , K o n n e r t h , S a k m a n n & T a k a h a s h i , 1 9 8 9 ) . T h i s m e t h o di n v o l v e s t h e p r e p a r a t i o n o f r e l a t i v e l y t h i n s l i c e s ( T a k a h a s h i , 1 9 7 8 ) o f b r a i n t i s s u e ( 1 2 0 -3 0 0 , a m i n t h i c k n e s s ) , f o l l o w e d b y l o c a l i z e d , v i s u a l l y c o n t r o l l e d r e m o v a l o f n e u r o p i l ec o v e r i n g t h e n e u r o n a l s o m a t a . S t a n d a r d p a t c h c l a m p t e c h n i q u e s ( H a m i l l , M a r t y , N e h e r ,S a k m a n n & S i g w o r t h , 1 9 8 1 ) c a n t h e n b e a p p l i e d t o r e c o r d e v o k e d p o s t s y n a p t i c c u r r e n t s i na l m o s t a n y p a r t o f t h e b r a i n , w i t h a g r e a t l y i m p r o v e d c u r r e n t r e s o l u t i o n . S i n g l e - c h a n n e lc u r r e n t s c a n a l s o b e r e c o r d e d f r o m t h e s a m e n e u r o n e . H e r e we i l l u s t r a t e t h e m e t h o d s a sa p p l i e d t o s t u d y i n h i b i t o r y s y n a p s e s i n r a t h i p p o c a m p a l n e u r o n e s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a tt h e n u m b e r o f p o s t s y n a p t i c c h a n n e l s o p e n e d b y a s i n g l e p a c k e t o f t r a n s m i t t e r i nh i p p o c a m p a l c e l l s i s s u r p r i s i n g l y s m a l l , a b o u t t w o o r d e r s o f m a g n i t u d e s m a l l e r t h a n a t t h en e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n o r a t o t h e r i n h i b i t o r y CNS s y n a p s e s .

RESULTSP r e p a r a t i o n o f t h i n s l i c e s o f m a m m a l i a n CNS

T h e b r a i n i s r e m o v e d q u i c k l y f r o m r a t s o f 1 8 - 2 3 d a y s o f a g e a n d i s k e p t a t l o wt e m p e r a t u r e ( 0 - 4 C ) i n r a t R i n g e r s o l u t i o n . B l o c k s o f t i s s u e 1 - 5 mm i n t h i c k n e s s a r em o u n t e d o n t h e s t a g e o f a v i b r a t i n g t i s s u e s l i c e r u s i n g a f a s t - d r y i n g g l u e ( C y a n o a c r y l a t e ,e . g . Uhu S e k u n d e n k l e b e r ) . S l i c e s 1 2 0 - 3 0 0 , u m i n t h i c k n e s s ( F i g . 1 A ) a r e c u t a t h i g hv i b r a t i n g f r e q u e n c y ( 8 - 8 0 H z ) . We u s e d a D o s a k a m i c r o s l i c e r D . T . K . - 1 0 0 0 ( D o s a k a C o .L t d , K y o t o , J a p a n ) o r a n FTB V i b r a c u t m i c r o t o m e ( F T B , W e i n h e i m , F R G ) .T i s s u e s l i c e s a r e p l a c e d a t r o o m t e m p e r a t u r e i n t h e e x p e r i m e n t a l c h a m b e r , p e r f u s e d w i t hr a t R i n g e r s o l u t i o n a n d h e l d i n p l a c e w i t h a g r i d made f r o m n y l o n t h r e a d s o n a m e t a l f r a m e( F i g . I B ) . S l i c e s o f 1 2 0 - 1 5 0 i t m t h i c k n e s s a l l o w e d i d e n t i f i c a t i o n o f i n d i v i d u a l n e u r o n e su s i n g a 4 0 x w a t e r i m m e r s i o n l e n s a n d N o m a r s k i d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c e c o n t r a s t o p t i c s( T a k a h a s h i , 1 9 7 8 ) . T h e o u t l i n e s o f many i n d i v i d u a l n e u r o n e s c a n b e s e e n e a s i l y b y f o c u s i n gt h r o u g h t h e t h i c k n e s s o f t h e s l i c e .F o r e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g s a n u p r i g h t m i c r o s c o p e ( Z e i s s ' S t a n d a r d ' ) w a sm o d i f i e d s u c h t h a t t h e a s s e m b l y o f o b j e c t i v e a n d o c u l a r s w a s moved d u r i n g f o c u s i n g w h i l et h e s l i c e a n d t h e p i p e t t e s r e m a i n e d s t a b l e ( F i g . 2 A ) . T h e t a b l e c a r r y i n g t h e e x p e r i m e n t a lc h a m b e r w h i c h c o n t a i n s t h e t i s s u e s l i c e ( F i g . 2 B ) a n d t h e m i c r o m a n i p u l a t o r s c a r r y i n g t h ep a t c h p i p e t t e a n d t h e c l e a n i n g o r s t i m u l a t i n g p i p e t t e s , w e r e m o u n t e d t o g e t h e r o n a s i n g l eb l o c k . T h e y h a d n o d i r e c t c o n n e c t i o n t o t h e m i c r o s c o p e , s o t h a t m o v e m e n t s o f t h er e c o r d i n g a n d s t i m u l a t i n g p i p e t t e s r e l a t i v e t o t h e s l i c e w e r e m i n i m i z e d d u r i n g f o c u s i n g .A s h o r t c o m i n g o f a w a t e r i m m e r s i o n l e n s i s t h e d i f f i c u l t y o f p l a c i n g o n e o r m o r e p i p e t t e s

c o r r e c t l y i n t h e b a t h u n d e r t h e w a t e r i m m e r s i o n o b j e c t i v e . To make t h i s e a s i e r , a h i n g e w a sa d d e d t o t h e b a c k b o n e o f t h e m i c r o s c o p e ( F i g . 2 A ) . T h i s m o d i f i c a t i o n a l l o w s a q u i c k c h a n g e

1 1 0 8



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SYNAPTIC TRANSMISSION IN THE CNS

F i g . 1 . T h i n s l i c e s o f r a t b r a i n . A , p h o t o m i c r o g r a p h o f t h i n s l i c e o f h i p p o c a m p u s a s v i e w e d w i t h a d i s s e c t i n gm i c r o s c o p e . T h e t h i c k n e s s o f t h e s l i c e i s a b o u t 1 5 0 , u m . C A l , CA2 a n d g r a n u l a r c e l l r e g i o n s ( s t a r ) a r e e a s i l yi d e n t i f i e d b y t h e i r l i g h t e r a p p e a r a n c e . B , s t a b i l i z a t i o n o f a s l i c e f o r r e c o r d i n g . S a m e s l i c e a s i n A . N y l o n t h r e a d sg l u e d t o a m e t a l f r a m e h o l d t h l e h i p p o c a m p a l s l i c e o n t h e b o t t o m o f t h e r e c o r d i n g c h a m b e r . T h e d i m e n s i o n so f t h e g r i d a r e a p p r o x i m a t e l y 7 x 9 m m .o f t h e r e c o r d i n g o r s t i m u l a t i n g p i p e t t e s o r o f t h e s l i c e , a n d t h e s u b s e q u e n t f o c u s i n g o n t ot h e p i p e t t e t i p s u n d e r t h e w a t e r i m m e r s i o n l e n s i s g r e a t l y s i m p l i f i e d .R e m o v a l o f n e u r o p i l e f r o m n e u r o n a l s o m a t a

To a l l o w a c c e s s o f t h e t i p o f t h e p a t c h p i p e t t e t o t h e n e u r o n a l m e m b r a n e , t h e n e u r o p i l e( g l i a l a n d v a s c u l a r t i s s u e ) o v e r l y i n g t h e n e r v e c e l l m u s t b e r e m o v e d . F i g u r e 3 s h o w ss c h e m a t i c a l l y h o w t h i s i s a c h i e v e d . R i n g e r s o l u t i o n i s b l o w n a n d s u c k e d t h r o u g h a

1 1 0 9



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B . SAKMANN AND OTHERSA

O b j e c t i v e

C o n d e n s e r

F o c u s i n gt r a c k

B

F i g . 2 . S c h e m a t i c d r a w i n g o f e x p e r i m e n t a l s e t - u p . A , s i d e v i e w o f m o d i f i e d Z e i s s ( C a r l Z e i s s , O b e r k o c h e n , F R G )' S t a n d a r d ' m i c r o s c o p e . T h e n o r m a l t a b l e o f t h e m i c r o s c o p e h a s b e e n r e m o v e d a n d i s r e p l a c e d b y a m o d i f i e dt a b l e c a r r y i n g t h e e x p e r i m e n t a l c h a m b e r ( n o t s h o w n ) . T h i s t a b l e i s n o t a t t a c h e d t o t h e m i c r o s c o p e ( n o t s h o w n ) .t h e f o c u s i n g t r a c k i s a t t a c h e d t o t h e b a s e - p l a t e . I t m o v e s t h e p a r t c a r r y i n g t h e o c u l a r s a n d t h e o b j e c t i v e r e l a t i v et o t h e c o n d e n s o r a n d t h e t a b l e . A h i n g e a l l o w s r e m o v a l o f t h e o b j e c t i v e d u r i n g c h a n g e o f t h e p i p e t t e s a n d i t sr e t u r n t o t h e s a m e p o s i t i o n . B , d e t a i l e d v i e w o f t h e a r r a n g e m e n t o f t h e w a t e r i m m e r s i o n o b j e c t i v e , t h e r e c o r d i n gc h a m b e r w i t h s l i c e ( s t i p p l e d ) r e s t i n g o n t h e t a b l e a s w e l l a s r e c o r d i n g , c l e a n i n g o r s t i m u l a t i n g p i p e t t e s . T h e yf i t u n d e r n e a t h t h e x 4 0 w a t e r i m m e r s i o n o b j e c t i v e w i t h a l o n g ( 1 6 m m) w o r k i n g d i s t a n c e ( o b j e c t i v e4 0 / 0 7 5 W , C a r l Z e i s s ) .

' c l e a n i n g ' p i p e t t e w h i c h i s p l a c e d w i t h i t s t i p d i r e c t e d a t t h e i m m e d i a t e s u r r o u n d i n g s o ft h e c e l l b o d y o f t h e n e u r o n e t o b e c l e a n e d ( F i g . 3 A ) . T h e c l e a n i n g p i p e t t e h a s a t i p o p e n i n go f 1 0 - 1 5 , u m a n d p r e s s u r e a n d s u c t i o n a r e d e l i v e r e d v i a t h e m o u t h p i e c e o f a c o n v e n t i o n a lp a t c h p i p e t t e h o l d e r ( H a m i l l e t a l . 1 9 8 1 ) . T h e j e t s o f R i n g e r s o l u t i o n g r a d u a l l y b r e a k u p t h en e u r o p i l e a n d e v e n t u a l l y p i e c e s o f d e b r i s c a n b e s u c k e d a w a y ( F i g . 3 B ) .F i g u r e 4 s h o w s p h o t o m i c r o g r a p h s o f l i v i n g c e l l s a f t e r c l e a n i n g n e u r o n e s i n b r a i n s l i c e s .I n o r d e r t o r e c o r d f r o m n e u r o n e s w i t h t h e i r d e n d r i t i c t r e e s a s i n t a c t a s p o s s i b l e , o n e c h o o s e sn e u r o n e s l y i n g a b o u t h a l f - w a y i n t o t h e d e p t h o f t h e s l i c e . A f t e r r e m o v a l o f t h e o v e r l y i n gt i s s u e t h e r e g i o n u n d e r t h e p i p e t t e t i p h a s a c r a t e r - l i k e a p p e a r a n c e w h e n o n e f o c u s e s o n t h e

1 1 1 0



5/12

SYNAPTIC TRANSMISSION IN THE CNSA

C l e a n i n gp i p e t t e ,

B A

F i g . 3 . S c h e m a t i c d r a w i n g o f l o c a l i z e d c l e a n i n g o f n e u r o n a l c e l l b o d i e s . A , t i p o f c l e a n i n g p i p e t t e f i l l e d w i t hR i n g e r s o l u t i o n i s d i r e c t e d t o w a r d s n e u r o n a l c e l l s o m a t a ( i n b l a c k ) a n d j e t s o f s o l u t i o n b r e a k u p t h e o v e r l y i n gt i s s u e ( s h a d e d ) . B , d e b r i s i s s u c k e d a w a y i n t o t h e t i p o f t h e p i p e t t e .s u r f a c e p l a n e o f t h e s l i c e ( F i g . 4 A ) . T h e c l e a n e d c e l l b o d i e s o f i n d i v i d u a l n e u r o n e s l i e a t t h eb o t t o m o f t h e c r a t e r a n d a r e r e a d i l y a c c e s s i b l e t o p a t c h p i p e t t e s . T h i s i s s h o w n i n F i g . 4Bf o r a g r o u p o f p y r a m i d a l n e u r o n e s i n t h e C A l l a y e r o f r a t h i p p o c a m p u s .I n c o n v e n t i o n a l s l i c e s ( a b o u t 3 0 0 - 3 5 0 , s m i n t h i c k n e s s ; A l g e r , D h a n j a l , D i n g l e d i n e ,G a r t h w a i t e , H e n d e r s o n , K i n g , L i p t o n , N o r t h , S c h w a r t z k r o i n , S e a r s , S e g a l , W h i t t i n g h a m &W i l l i a m s , 1 9 8 4 ) , n e u r o n a l s o m a t a c a n a l s o b e r e c o g n i z e d a n d f r e e d f r o m o v e r l y i n g t i s s u e i nt h e s a m e w a y a s t h e n e u r o n e s i n t h i n s l i c e s ( F i g . 4 C ) . I d e n t i f i c a t i o n o f s o m a t a a n d c l e a n i n gi s m a d e m u c h e a s i e r b y t h e u s e o f a s t a n d a r d v i d e o s c r e e n t o o b s e r v e t h e o u t l i n e s o fn e u r o n e s t o b e c l e a n e d a n d t o m o n i t o r t h e r e m o v a l o f t i s s u e . T h e u s e o f t h e s e s o m e w h a tt h i c k e r b r a i n s l i c e s i m p r o v e s t h e c h a n c e o f r e c o r d i n g f r o m n e u r o n e s w i t h i n t a c t d e n d r i t i ct r e e s a n d t h i s p r e p a r a t i o n i s now u s e d r o u t i n e l y i n s t u d i e s o n h i p p o c a m p a l n e u r o n e s .I n h i b i t o r y p o s t s y n a p t i c c u r r e n t sA f t e r f o r m i n g a h i g h - r e s i s t a n c e s e a l o n a h i p p o c a m p a l g r a n u l e c e l l a n d b r e a k i n g t h em e m b r a n e u n d e r t h e t i p t o e s t a b l i s h t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g c o n f i g u r a t i o n ( F i g . 5 A ) ,s p o n t a n e o u s l y o c c u r r i n g c u r r e n t s o f v a r y i n g a m p l i t u d e ( < 1 0 - 2 0 0 p A , a t -50 mV) a r ea l w a y s o b s e r v e d . T h e s e c u r r e n t s a r e r e v e r s i b l y b l o c k e d b y b i c u c u l l i n e ( 2 u M ) a n d r e v e r s e a tt h e C l - r e v e r s a l p o t e n t i a l . T h e y h a v e t h u s b e e n i d e n t i f i e d a s y - a m i n o b u t y r i c a c i d ( G A B A A ) -r e c e p t o r - m e d i a t e d i n h i b i t o r y p o s t s y n a p t i c c u r r e n t s ( I P S C s ) . I n t h e p r e s e n c e o f t h e N a +c h a n n e l b l o c k e r t e t r o d o t o x i n ( T T X , 1 / , M ) , t h e l a r g e r c u r r e n t s d i s a p p e a r a n d t h e r e m a i n i n gc u r r e n t s r a n g e i n a m p l i t u d e u p t o a b o u t 4 0 pA ( F i g . 5 B ) , w i t h t h e v a s t m a j o r i t y o f c u r r e n t s

1 1 1 1



6/12

B . SAKMANN AND OTHERS

F i g . 4 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f l i v i n g s l i c e s w i t h e x p o s e d n e u r o n a l c e l l b o d i e s . A , CAI l a y e r o f r a t h i p p o c a m p u s i na t h i n s l i c e ( a b o u t 1 2 0 , i m i n t h i c k n e s s ) . T h e p l a n e o f f o c u s i s t h e s u r f a c e o f t h e s l i c e . R e m o v a l o f t i s s u e c r e a t e da c r a t e r - l i k e a p p e a r a n c e i n t h e s l i c e . T h e t i p o f t h e c l e a n i n g p i p e t t e i s s e e n o n t h e r i g h t . B , s a m e a r e a o f t h es l i c e b u t t h e p l a n e o f f o c u s w a s c h a n g e d t o t h e n e u r o n a l c e l l b o d i e s w h i c h a r e l y i n g i n t h e d e p t h o f a c r a t e r . S c a l eb a r i n t h e l o w e r r i g h t c o r n e r i s 2 0 , u m f o r b o t h A a n d B . C , p h o t o m i c r o g r a p h o f a c l e a n e d a r e a i n r a t C A lh i p p o c a m p a l r e g i o n i n a c o n v e n t i o n a l s l i c e . T h e s l i c e w a s c u t t o a t h i c k n e s s o f a b o u t 3 0 0 , u m . T h e n e u r o n a ls o m a t a w e r e l o c a l i z e d u s i n g a Kappa CF6 v i d e o c a m e r a ( K a p p a M e s s t e c h n i k , G l e i c h e n , FRG) a t t a c h e d t o t h em i c r o s c o p e . T h e s o m a t a o f p y r a m i d a l n e u r o n e s a r e i n t h e p l a n e o f f o c u s . S c a l e b a r i s 1 4 / i m .

F

1 1 1 2



7/12

SYNAPTIC TRANSMISSION IN THE CNSA I s

B

2 0 0 msC oF i g . 5 . S p o n t a n e o u s a n d e v o k e d I P S C s i n g r a n u l e c e l l s o f r a t h i p p o c a m p u s . A , s c h e m a t i c d r a w i n g i l l u s t r a t i n gr e c o r d i n g a n d s t i m u l a t i o n v i a p a t c h p i p e t t e s . I P S C s a r e r e c o r d e d i n t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g c o n f i g u r a t i o n v i aa r e c o r d i n g p a t c h p i p e t t e ( I p ) . E v o k e d I P S C s a r e e l i c i t e d b y s t i m u l a t i n g a n e i g h b o u r i n g n e u r o n e v i a a ne x t r a c e l l u l a r p a t c h p i p e t t e ( I s ) w i t h i t s t i p p l a c e d o n t o t h e c e l l b o d y o f a n e i g h b o u r i n g n e u r o n e . D i r e c td e p o l a r i z a t i o n o f t h e n e u r o n e a s w e l l a s d e p o l a r i z a t i o n o f t h e n e r v e e n d i n g o f a n o t h e r n e u r o n e c l o s e t o t h es t i m u l a t i n g p i p e t t e m i g h t l e a d t o s t i m u l a t i o n o f s e v e r a l s y n a p t i c i n p u t s i n t h e c e l l b e i n g r e c o r d e d . B , r e c o r d s o fs p o n t a n e o u s I P S C s i n a g r a n u l e c e l l . W h o l e - c e l l r e c o r d i n g c o n f i g u r a t i o n . M e m b r a n e p o t e n t i a l -50 mV. I / I M -TTX w a s a d d e d t o t h e b a t h s o l u t i o n t o b l o c k a c t i o n p o t e n t i a l s i n v a d i n g p r e s y n a p t i c t e r m i n a l s . C , s u p e r i m p o s e dr e c o r d s o f e v o k e d u n i t a r y I P S C s e l i c i t e d b y e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f a n e i g h b o u r i n g n e u r o n e i n a g r a n u l e c e l la t -50 mV. E v o k e d I P S C s a r e p r e c e d e d b y a s t i m u l u s a r t i f a c t . T h e p e a k a m p l i t u d e o f I P S C s e v o k e d b yi d e n t i c a l s t i m u l i f l u c t u a t e s b e t w e e n d i f f e r e n t l e v e l s w h i c h a r e a p p r o x i m a t e l y 2 0 pA a p a r t . R e c o r d s s h o w n i n Ba n d C w e r e f i l t e r e d a t 2 kHz l o w p a s s a n d d i g i t i z e d a t 5 k H z . C o m p o s i t i o n o f t h e b a t h s o l u t i o n ( i n m M ) : N a C l ,1 2 5 ; K C I , 2 5 ; NaHCO3, 2 6 ; N a H 2 P O 4 , 1 - 2 5 ; M g C I 2 , 1 ; C a C 1 2 , 2 ; g l u c o s e , 2 5 ( p H 7 - 4 ) , b u b b l e d w i t h 9 5 % 0 2a n d 5 % C O 2 . T h e p i p e t t e s o l u t i o n c o n t a i n e d ( i n m M ) : N - m e t h y l g l u c a m i n e , 1 4 0 ; H C I , 1 2 5 ; C a C l 2 , 2 ; M g C l 2 , I ;EGTA, 1 0 ; A T P , 2 ; H E P E S , 1 0 ( p H 7 - 3 ) .h a v i n g a m p l i t u d e s o f l e s s t h a n 2 5 p A . T h e y c a n n o t b e b l o c k e d b y r e p l a c i n g C a 2 + b y M g 2 +i n t h e e x t r a c e l l u l a r s o l u t i o n . T h e s e c u r r e n t s p r e s u m a b l y r e s u l t f r o m s p o n t a n e o u s r e l e a s e( i . e . i n t h e a b s e n c e o f p r e s y n a p t i c a c t i o n p o t e n t i a l s ) o f p a c k e t s o f t r a n s m i t t e r f r o m t h ei n h i b i t o r y p r e s y n a p t i c t e r m i n a l a n d a r e r e f e r r e d t o a s ' s p o n t a n e o u s ' I P S C s .To e v o k e a p o s t s y n a p t i c c u r r e n t b y s t i m u l a t i n g a p r e s y n a p t i c n e u r o n e , t h e t i p o f a p a t c hp i p e t t e f i l l e d w i t h r a t R i n g e r s o l u t i o n i s p l a c e d o n t o t h e s o m a o f a p a r t i a l l y c l e a n e d n e u r o n ei n t h e n e i g h b o u r h o o d o f t h e r e c o r d e d n e u r o n e a n d s h o r t ( 2 0 0 , u s ) v o l t a g e p u l s e s ( 2 - 1 0 V )a r e a p p l i e d t o t h e p i p e t t e ( F i g . 5 A ) . C u r r e n t s e v o k e d i n t h i s w a y a r e c h a r a c t e r i z e d b y s h o r t

1 1 1 3



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B . SAKMANN AND OTHERSd e l a y s ( < 1 m s ) a n d b r i e f ( < 1 m s ) r i s e t i m e s . T h e y a l w a y s f l u c t u a t e i n t h e i r a m p l i t u d e s( F i g . 5 C ) . T h e i r d e c a y t i m e c o u r s e h a s s e v e r a l c o m p o n e n t s a n d h a s s i m i l a r c h a r a c t e r i s t i c st o t h e s p o n t a n e o u s I P S C s . T h e s e e v o k e d c u r r e n t s a r e a l s o b l o c k e d b y b i c u c u l l i n e ( 2 f M )a n d r e v e r s e a t t h e C l - r e v e r s a l p o t e n t i a l . T h e y h a v e t h u s b e e n i d e n t i f i e d a s e v o k e d I P S C s .I n t h e p r e s e n c e o f TTX ( 0 I j t M ) , n o c u r r e n t s a r e s e e n i n r e s p o n s e t o s t i m u l a t i o n . T h u s t h e ya r e s h o w n t o b e d u e t o s t i m u l a t i o n o f p r o p a g a t e d a c t i o n p o t e n t i a l s i n a p r e s y n a p t i cn e u r o n e a n d n o t d u e t o l o c a l d e p o l a r i z a t i o n o f p r e s y n a p t i c n e r v e t e r m i n a l s .E x t r a c e l l u l a r s t i m u l a t i o n s o m e t i m e s r e s u l t s i n a c t i v a t i o n o f s e v e r a l s y n a p t i c i n p u t s , a sj u d g e d b y d i f f e r e n c e s i n l a t e n c i e s o f e v o k e d I P S C s a n d b y d i f f e r e n t s t i m u l a t i o n t h r e s h o l d so f I P S C s . T h i s may b e d u e t o d e p o l a r i z a t i o n o f n o t o n l y t h e soma o f t h e c e l l on w h i c h t h ee l e c t r o d e i s p l a c e d , b u t a l s o o f t e r m i n a l s o f o t h e r n e u r o n e s w h i c h i n n e r v a t e t h i s c e l l b o d y .T h u s a c t i o n p o t e n t i a l s c o u l d b e p r o p a g a t e d i n more t h a n o n e c e l l r e s u l t i n g i n r e l e a s e f r o mt w o o r more s y n a p s e s ( F i g . 5 A ) . I n i t i a l a t t e m p t s t o r e c o r d i n t h e w h o l e - c e l l c o n f i g u r a t i o nf r o m t w o n e i g h b o u r i n g n e u r o n e s a n d e l i c i t a c t i o n p o t e n t i a l s i n o n l y a s i n g l e p r e s y n a p t i cn e u r o n e w e r e s u c c e s s f u l , b u t t h e n u m b e r o f c o u p l e d c e l l s w a s t o o l o w t o u s e d o u b l e w h o l e -c e l l r e c o r d i n g a s a s t a n d a r d p r o c e d u r e . H o w e v e r , b y a d j u s t i n g t h e p o s i t i o n o f t h es t i m u l a t i n g p i p e t t e s u c h t h a t a l l e v o k e d I P S C s a r e o f s i m i l a r l a t e n c y a n d r i s e t i m e , i t s e e m sl i k e l y t h a t w i t h e x t r a c e l l u l a r s t i m u l a t i o n a c t i o n p o t e n t i a l s c a n b e e l i c i t e d i n a s i n g l ep r e s y n a p t i c n e u r o n e a n d t h a t t h e e v o k e d c u r r e n t s ( F i g . 5 C ) a r e ' u n i t a r y ' e v o k e d I P S C s( F a b e r & K o r n , 1 9 8 2 ) w h i c h r e p r e s e n t t h e c o m b i n e d i n p u t f r o m t h e a c t i v e s y n a p t i c b o u t o n so f a s i n g l e p r e s y n a p t i c n e u r o n e .S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s

I n o r d e r t o e s t i m a t e t h e n u m b e r o f c h a n n e l s a c t i v a t e d d u r i n g t h e p e a k o f s p o n t a n e o u sI P S C s , w h i c h p r e s u m a b l y r e f l e c t s t h e r e l e a s e o f a p a c k e t o f t r a n s m i t t e r , we m e a s u r e d s i n g l e -c h a n n e l c u r r e n t s i n o u t s i d e - o u t p a t c h e s i s o l a t e d f r o m n e u r o n a l c e l l b o d i e s . T h em e a s u r e m e n t s w e r e m a d e u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s t o t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s o f I P S C se v o k e d b y r e l e a s e o f t r a n s m i t t e r f r o m t h e t e r m i n a l . F i g u r e 6A s h o w s r e c o r d i n g s o f c u r r e n t sa c t i v a t e d b y GABA, t h e p u t a t i v e t r a n s m i t t e r a t t h e s e i n h i b i t o r y s y n a p s e s ( C u r t i s , F e l i x &M c L e n n a n , 1 9 7 0 ) . T h e p a t c h w a s i s o l a t e d f r o m t h e s o m a m e m b r a n e o f a g r a n u l e c e l l o f r a th i p p o c a m p u s . A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o f s u c h r e c o r d i n g s i n d i c a t e t h a t a t l e a s t t w o c l a s s e so f e l e m e n t a r y c u r r e n t s a r e a c t i v a t e d , p r e s u m a b l y r e f l e c t i n g d i f f e r e n t s u b t y p e s o f GABAAr e c e p t o r c h a n n e l s w i t h c o n d u c t a n c e s o f 1 4 a n d 2 3 p S . T h e n u m b e r o f c h a n n e l s a c t i v a t e dd u r i n g s p o n t a n e o u s I P S C s r e c o r d e d f r o m t h e s a m e c e l l ( F i g . 6 B ) t h u s i s i n t h e o r d e r o f1 5 - 2 5 c h a n n e l s a s s u m i n g t h a t t h e t r a n s m i t t e r a n d GABA a c t i v a t e t h e s a m e c l a s s o fc h a n n e l s . T h e a v e r a g e d e c a y t i m e c o n s t a n t o f s p o n t a n e o u s a n d u n i t a r y e v o k e d I P S C s i sc o m p a r a b l e t o t h e a v e r a g e d u r a t i o n o f t h e G A B A - a c t i v a t e d e l e m e n t a r y c u r r e n t s w h i c hw o u l d s u p p o r t t h e a b o v e a s s u m p t i o n .I d e n t i f i c a t i o n o f n e u r o n a l c e l l t y p e s

C o n f o c a l l a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p y ( A s l u n d , L i l j e b o r g , F o r s g r e n & W a h l s t e n , 1 9 8 7 ) i nc o n j u n c t i o n w i t h l o a d i n g c e l l s w i t h f l u o r e s c e n t d y e s ( e . g . L u c i f e r Y e l l o w o r T e x a s R e d ) i sa c o n v e n i e n t m e t h o d t o c h a r a c t e r i z e i n m o r e d e t a i l t h e t y p e o f n e u r o n e f r o m w h i c h ar e c o r d i n g i s made a n d t o e n s u r e t h e i n t e g r i t y o f i t s d e n d r i t i c t r e e ( W a l l e n , C a r l s s o n ,L i l j e b o r g & G r i l l n e r , 1 9 8 8 ) . F i g u r e 7A s h o w s t h e s u p e r p o s i t i o n o f s e v e r a l s c a n s t a k e n a td i f f e r e n t l e v e l s o f f o c u s i n t h e r a t h i p p o c a m p a l g r a n u l e c e l l f r o m w h i c h I P S C s w e r er e c o r d e d . A p a r t i a l t h r e e - d i m e n s i o n a l r e c o n s t r u c t i o n o f t h e d e n d r i t i c t r e e o f t h e s a m e c e l li s s h o w n i n F i g . 7 B . T h e c e l l w a s f i l l e d , v i a t h e p a t c h p i p e t t e , w i t h L u c i f e r Y e l l o w , f i x e d

1 1 1 4



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SYNAPTIC TRANSMISSION IN THE CNSA

T =q-.X 4 -* - - - . - - - - - - - - J - - -..

2 pA5 0 msB

1 0 pA5 0 ms

F i g . 6 . E l e m e n t a r y c u r r e n t s a c t i v a t e d b y t h e p u t a t i v e t r a n s m i t t e r GABA i n g r a n u l e c e l l s . A . r e c o r d s o f s i n g l e -c h a n n e l c u r r e n t s e v o k e d b y GABA a p p l i c a t i o n t o a n o u t s i d e - o u t p a t c h i s o l a t e d f r o m a h i p p o c a m p a l g r a n u l ec e l l . Membrane p o t e n t i a l -50 mV. S o l u t i o n s a s d e s c r i b e d i n F i g . 5 . B a s e l i n e i s i n d i c a t e d b y c o n t i n u o u s l i n e .T h e d a s h e d l i n e i n d i c a t e s o n e o p e n s t a t e o f t h e GABAA r e c e p t o r c h a n n e l . B , f o r c o m p a r i s o n , a s p o n t a n e o u sI P S C r e c o r d e d f r o m g r a n u l e c e l l u n d e r s i m i l a r i o n i c c o n d i t i o n s a n d a t -50 mV membrane p o t e n t i a l .C o n t i n u o u s l i n e i n d i c a t e s b a s e l i n e .b r i e f l y , t h e n s c a n n e d a n d r e c o n s t r u c t e d . S u c h r e c o n s t r u c t i o n s s h o w e d t h a t t h e c e l l b o d i e so f g r a n u l e c e l l s a r e s m a l l ( 1 0 - 1 5 / , m i n d i a m e t e r ) a n d t h a t t h e d e n d r i t i c p r o c e s s e s o fg r a n u l a r c e l l s a r e e x t r e m e l y t h i n ( < 3 , u m i n d i a m e t e r a t t h e w i d e s t p o i n t s ) . T h e s m a l l s i z eo f t h e i r s o m a t a a n d t h e i r t h i n p r o c e s s e s c o u l d a c c o u n t f o r t h e h i g h i n p u t r e s i s t a n c e ( s e v e r a lg i g a o h m s ) a n d l o w c a p a c i t a n c e o f t h e s e c e l l s . To map t h e a n a t o m i c a l s t r u c t u r e o f t h es y n a p t i c c o n n e c t i o n s b e t w e e n c e l l s f r o m w h i c h a s y n a p t i c c o n n e c t i o n h a s b e e n r e c o r d e d o n ec a n f i l l t h e t w o n e u r o n e s w i t h d i f f e r e n t d y e s ( E d w a r d s e t a l . 1 9 8 9 ) t h e n s c a n b o t h n e u r o n e sa t d i f f e r e n t w a v e l e n g t h s , a n d d e t e r m i n e t h e l o c a t i o n o f t h e c o n t a c t z o n e s b e t w e e n t h e p r e -a n d p o s t s y n a p t i c n e u r o n e s .

DISCUSSIONP a t c h c l a m p t e c h n i q u e s u s e d t o r e c o r d s y n a p t i c c u r r e n t s f r o m v i s u a l l y i d e n t i f i e d n e u r o n e si n b r a i n s l i c e s a l l o w t h e r e s o l u t i o n o f w h o l e - c e l l c u r r e n t a m p l i t u d e s a s s m a l l a s 8 pAw h e r e a s c o n v e n t i o n a l s i n g l e - e l e c t r o d e v o l t a g e c l a m p m e t h o d s a l l o w e d r e s o l u t i o n o f a b o u t1 0 0 pA ( E d w a r d s & G a g e , 1 9 8 8 ) . T h i s h i g h e r r e s o l u t i o n m a d e i t p o s s i b l e t o m e a s u r e t h ea m p l i t u d e s o f s p o n t a n e o u s I P S C s a n d t o d e m o n s t r a t e f l u c t u a t i o n s i n t h e a m p l i t u d e o fe v o k e d u n i t a r y I P S C s e l i c i t e d b y c o n s t a n t e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f a p r e s y n a p t i c n e u r o n e .T h e f l u c t u a t i o n s o f u n i t a r y I P S C s a r e r o u g h l y o f t h e s a m e s i z e a s t h e p e a k i n t h ed i s t r i b u t i o n o f s p o n t a n e o u s I P S C s . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t e v o k e d r e l e a s e i s q u a n t a l i nn a t u r e w i t h a q u a n t a l c o n d u c t a n c e i n c r e a s e o f 0 2 - 0 4 n S , c o n s i d e r a b l y s m a l l e r t h a ne s t i m a t e s ( 5 - 8 n S ) d e r i v e d f r o m t h e q u a n t a l a n a l y s i s o f i n h i b i t o r y s y n a p t i c p o t e n t i a l s i nm o t o n e u r o n e s ( K u n o & W e a k l y , 1 9 7 2 ) . I n g o l d f i s h CNS q u a n t a l c o n d u c t a n c e c h a n g e s o ft e n s o f n S w e r e d e r i v e d ( F a b e r & K o r n , 1 9 8 2 ; K o r n , M a l l e t , T r i l l e r & F a b e r , 1 9 8 2 ) . T h e s ee s t i m a t e s w e r e b a s e d s o l e l y o n t h e a n a l y s i s o f f l u c t u a t i o n s o f e v o k e d u n i t a r y I P S C s . I nl a m p r e y i n h i b i t o r y s y n a p s e s t h e s i z e o f s p o n t a n e o u s I P S C s a l s o i n d i c a t e d q u a n t a lc o n d u c t a n c e c h a n g e s i n t h e r a n g e o f t e n s o f n S ( G o l d & M a r t i n , 1 9 8 3 ) , b u t e v o k e d u n i t a r y

1 1 1 5



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B . SAKMANN AND OTHERS

F i g . 7 . P h o t o m i c r o g r a p h o f c o m p u t e r - b a s e d r e c o n s t r u c t i o n s o f r a t h i p p o c a m p a l g r a n u l e c e l l I P S C s w e r e r e c o r d e di n t h i s c e l l i n t h e g r a n u l a r c e l l l a y e r o f r a t h i p p o c a m p u s u s i n g a p a t c h p i p e t t e f i l l e d w i t h t h e n o r m a l i n t r a c e l l u l a rs o l u t i o n p l u s 1 5 m g / m l L u c i f e r Y e l l o w ( S i g m a ) . A f t e r r e m o v i n g t h e p a t c h p i p e t t e t h e s l i c e was f i x e d f o r h a l fa n h o u r i n p a r a f o r m a l d e h y d e , w a s h e d w i t h p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 - 6 ) a n d t h e n m o u n t e d i n c l e a r i n g s o l u t i o no f M o v i o l ( H o e c h s t , F r a n k f u r t , FRG) a c c o r d i n g t o t h e r e c i p e p r o v i d e d b y Dr M. O s b o r n , M . P . I . f u r b i p h y s .C h e m i e , G 6 t t i n g e n , FRG ( O s b o r n , 1 9 8 1 ) . T h e c e l l w a s s c a n n e d t h r o u g h a Z e i s s A x i o s k o p b u i l t i n t o t h ePHOIBOS c o n f o c a l s c a n n i n g s y s t e m ( S a r a s t r o , S t o c k h o l m , S w e d e n ) . A , t h e c e l l w a s s c a n n e d u s i n g a x 6 3 o i li m m e r s i o n o b j e c t i v e g i v i n g a r e s o l u t i o n ( p i x e l s i z e ) o f 0 - 2 , u m . S c a n s w e r e m a d e i n e i g h t p l a n e s w i t h v e r t i c a li n t e r v a l s o f 0 - 2 , u m a n d a d d e d . T h i s p r o c e d u r e a l l o w s t w o - d i m e n s i o n a l v i s u a l i z a t i o n o f t h e l e n g t h o f t h e c e l l u l a rp r o c e s s a l t h o u g h t h e c e l l d o e s n o t l i e e x a c t l y i n t h e p l a n e o f t h e s c a n n i n g . T h e s c a l e b a r r e p r e s e n t s 1 5 / s m . B ,t h r e e - d i m e n s i o n a l r e c o n s t r u c t i o n o f t h e t h i c k e r s e c t i o n o f t h e p r o c e s s o f t h e c e l l s h o w n i n t h e u p p e r p a n e l ,s c a n n e d a t h i g h e r r e s o l u t i o n . I n t h e r i g h t h a l f o f t h e r e c o n s t r u c t i o n t h e i n i t i a l p o r t i o n s o f t w o s e c o n d a r yd e n d r i t e s c a n b e s e e n . N o t e t h a t t h e t h i n n e s t p a r t s o f t h e p r o c e s s e s a r e l o s t b y t h e ( d i g i t a l ) f i l t e r i n g . T h e s c a n sw e r e m a d e w i t h x 1 0 0 o i l i m m e r s i o n o b j e c t i v e w i t h a r e s o l u t i o n ( a n d p i x e l s i z e ) o f 0 - 1 3 , u m . O n l y o n e - s i x t e e n t ho f t h e f i e l d s h o w n i n A w a s s c a n n e d . A f t e r t a k i n g r e p e t i t i v e s c a n s ( t h r e e p e r p l a n e ) i n t w e n t y p l a n e s a t 0 - 2 , u mi n t e r v a l s t h e s e c t i o n s w e r e f i l t e r e d , v e c t o r i z e d a n d t h e n r e c o n s t r u c t e d . T h e s c a l e b a r r e p r e s e n t s 5 , u m .

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SYNAPTIC TRANSMISSION IN THE CNSI P S C s c o u l d n o t b e e l i c i t e d . T h e s m a l l s i z e o f a q u a n t a l c o n d u c t a n c e c h a n g e i nh i p p o c a m p a l n e u r o n e s r e f l e c t s a much s m a l l e r n u m b e r o f p o s t s y n a p t i c c h a n n e l s a c t i v a t e dd u r i n g a q u a n t a l c o n d u c t a n c e c h a n g e . E i t h e r a c o n s i d e r a b l y s m a l l e r n u m b e r o f t r a n s m i t t e rm o l e c u l e s i s m a k i n g u p a n a x o n a l l y r e l e a s e d p a c k e t o r t h e n u m b e r o f p o s t s y n a p t i c r e c e p t o rc h a n n e l s o p p o s i t e a r e l e a s e s i t e i s r a t h e r s m a l l e r i n h i p p o c a m p a l s y n a p s e s . I t h a s b e e ns u g g e s t e d t h a t i n t h e CNS s i n g l e s y n a p t i c b o u t o n s a c t a s i n d e p e n d e n t r e l e a s e u n i t s ( K o r ne t a l . 1 9 8 2 ; F i n k e l & R e d m a n , 1 9 8 3 ; G o l d & M a r t i n , 1 9 8 3 ) . I f t h e s i z e o f t h e q u a n t a lc o m p o n e n t s o f u n i t a r y I P S C s w e r e l i m i t e d b y t h e n u m b e r o f a v a i l a b l e GABA r e c e p t o r so p p o s i t e a b o u t o n t h e n t h e w e i g h t o f a p a r t i c u l a r s y n a p t i c k n o b c o u l d b e d r a s t i c a l l ym o d i f i e d b y i n s e r t i n g o n l y a f e w a d d i t i o n a l r e c e p t o r s .T h u s f a r t h e m o r p h o l o g i c a l d e s c r i p t i o n o f t h e CNS s y n a p s e s s t u d i e d f u n c t i o n a l l y h a s n o tb e e n p o s s i b l e . H o w e v e r , i n c o n j u n c t i o n w i t h s c a n n i n g c o n f o c a l m i c r o s c o p y a n d i m a g er e c o n s t r u c t i o n , a r a p i d a n a t o m i c a l t y p i n g o f t h e r e c o r d e d n e u r o n e b y i t s d e n d r i t i cb r a n c h i n g p a t t e r n a n d e s t i m a t e s o f t h e n u m b e r a n d l o c a t i o n a n d t h e m o l e c u l a r c o n s t i t u e n t so f p h y s i o l o g i c a l l y i d e n t i f i e d s y n a p s e s c o u l d b e a c h i e v e d . F u t u r e d e v e l o p m e n t s a i m e d a tt h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i n t h e CNS u s i n g t h e t e c h n i q u e sd e s c r i b e d h e r e w i l l b e d i r e c t e d t o w a r d s s t i m u l a t i o n o f a s i n g l e p r e s y n a p t i c n e u r o n e v i a a ni n t r a c e l l u l a r m i c r o e l e c t r o d e ( M i l e s & W o n g , 1 9 8 4 ) a n d p o s s i b l y c h a n g i n g i t s i n t r a c e l l u l a rc o n s t i t u e n t s . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s we c a n h o p e t o a c h i e v e a s i m i l a r d e g r e e o fr e p r o d u c i b i l i t y a s a t t h e n e u r o m u s c u l a r s y n a p s e a n d f i n d o u t w h e t h e r a n d how t h e r u l e sg o v e r n i n g s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n e s t a b l i s h e d a t t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n b y B e r n a r dK a t z a n d h i s s c h o o l a r e t o b e m o d i f i e d a t t h e r a p i d l y t r a n s m i t t i n g s y n a p s e s i n t h e C N S .G i v e n t h e o b s e r v a t i o n t h a t l o n g - t e r m c h a n g e s i n i n h i b i t o r y s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i n t h eh i p p o c a m p u s o c c u r d u r i n g p o s t n a t a l d e v e l o p m e n t ( M u e l l e r , T a u b e & S c h w a r t z k r o i n ,1 9 8 4 ) a n d i n a d u l t a n i m a l s i n r e s p o n s e t o e n v i r o n m e n t a l s t i m u l i ( E d w a r d s & G a g e , 1 9 8 8 ) ,t h e i n v e s t i g a t i o n o f s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n b y t h e t e c h n i q u e s d e s c r i b e d h e r e , i n c o n j u n c t i o nw i t h t h e m o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f GABAA r e c e p t o r c h a n n e l s u b t y p e s b y cDNAt e c h n i q u e s ( S c h o f i e l d , D a r l i s o n , F u j i t a , B u r t , S t e p h e n s o n , R o d r i g u e z , R h e e , Rama-c h a n d r a n , R e a l e , G l e n c o r s e , S e e b u r g & B a r n a r d , 1 9 8 7 ; P r i t c h e t t , S o n t h e i m e r , S h i v e r s ,Y m e r , K e t t e n m a n n , S c h o f i e l d & S e e b u r g , 1 9 8 9 ) , m i g h t p r o v i d e s o m e i n s i g h t i n t o t h e p r e -a n d p o s t s y n a p t i c m e c h a n i s m s w h i c h g o v e r n l o n g - t e r m c h a n g e s i n t h e e f f i c a c y o f i n h i b i t o r yCNS s y n a p s e s .

REFERENCESA L G E R , B . E . , D H A N J A L , S . S . , D I N G L E D I N E , R . , G A R T H W A I T E , J . , H E N D E R S O N , G . , K I N G , G . L . ,L I P T O N , P . , N O R T H , A . , S C H W A R T Z K R O I N , P . A . , S E A R S , T . A . , S E G A L , M . , W H I T T I N G H A M , T . S . &W I L L I A M S , J . ( 1 9 8 4 ) . B r a i n s l i c e m e t h o d s . I n B r a i n S l i c e s , e d . D I N G L E D I N E , R . , p p . 3 8 1 - 4 3 7 . Ne wY o r k : P l e n u m P r e s s .A N D E R S O N , C . R . & S T E V E N S , C . F . ( 1 9 7 3 ) . V o l t a g e c l a m p a n a l y s i s o f a c e t y l c h o l i n e p r o d u c e d e n d -p l a t e c u r r e n t f l u c t u a t i o n s a t f r o g n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 3 5 , 6 5 5 - 6 9 1 .A S L U N D , N . , L I L J E B O R G , A . , F O R S G R E N , P . - O . & W A H L S T E N , S . ( 1 9 8 7 ) . T h r e e - d i m e n s i o n a l d i g i t a lm i c r o s c o p y u s i n g t h e PHOIBOS s c a n n e r . S c a n n i n g 9 , 2 2 7 - 2 3 5 .C U R T I S , D . R . , F E L I X , D . & M C L E N N A N , H . ( 1 9 7 0 ) . GABA a n d h i p p o c a m p a l i n h i b i t i o n . B r i t i s hJ o u r n a l o f P h a r m a c o l o g y 4 0 , 8 8 1 - 8 8 3 .E D W A R D S , F . A . & G A G E , P . W. ( 1 9 8 8 ) . S e a s o n a l c h a n g e s i n i n h i b i t o r y c u r r e n t s i n r a t h i p p o c a m p u s .N e u r o s c i e n c e L e t t e r s 8 4 , 2 6 6 - 2 7 0 .E D W A R D S , F . A . , K O N N E R T H , A . , S A K M A N N , B . & T A K A H A S H I , T . ( 1 9 8 9 ) . A t h i n s l i c e p r e p a r a t i o n f o rp a t c h c l a m p r e c o r d i n g s f r o m n e u r o n e s o f t h e m a m m a l i a n c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m . P f l u g e r s A r c h i v4 1 4 , 6 0 0 - 6 1 2 .

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B . SAKMANN AND OTHERSF A B E R , D . S . & K O R N , H . ( 1 9 8 2 ) . T r a n s m i s s i o n a t a c e n t r a l i n h i b i t o r y s y n a p s e . I . M a g n i t u d e o fu n i t a r y p o s t s y n a p t i c c o n d u c t a n c e c h a n g e a n d k i n e t i c s o f c h a n n e l a c t i v a t i o n . J o u r n a l o fN e u r o p h y s i o l o g y 4 8 , 6 5 4 - 6 7 8 .F I N K E L , A . S . & R E D M A N , S . J . ( 1 9 8 3 ) . T h e s y n a p t i c c u r r e n t e v o k e d i n c a t s p i n a l m o t o n e u r o n e s b yi m p u l s e s i n s i n g l e g r o u p l a a x o n s . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 3 4 2 , 6 1 5 - 6 3 2 .G O L D , M . R . & M A R T I N , A . R . ( 1 9 8 3 ) . C h a r a c t e r i s t i c s o f i n h i b i t o r y p o s t - s y n a p t i c c u r r e n t s i n b r a i n -s t e m n e u r o n e s o f t h e l a m p r e y . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 3 4 2 , 8 5 - 9 8 .H A M I L L , 0 . P . , M A R T Y , A . , N E H E R , E . , S A K M A N N , B . & S I G W O R T H , F . J . ( 1 9 8 1 ) . I m p r o v e d p a t c h -c l a m p t e c h n i q u e s f o r h i g h - r e s o l u t i o n c u r r e n t r e c o r d i n g f r o m c e l l s a n d c e l l - f r e e membrane p a t c h e s .P f l u g e r s A r c h i v 3 9 1 , 8 5 - 1 0 0 .J O H N S T O N , D . & B R O W N , T . H . ( 1 9 8 4 ) . B i o p h y s i c s a n d m i c r o p h y s i o l o g y o f s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i nh i p p o c a m p u s . I n B r a i n S l i c e s , e d . D I N G L E D I N E , R . , p p . 5 1 - 8 6 . Ne w Y o r k : P l e n u m P r e s s .K A R L I N , A . , C o x , R . , K A L D A N Y , R . - R . , L O E B E L , P . & H O L T Z M A N , E . ( 1 9 8 3 ) . T h e a r r a n g m e n t a n df u n c t i o n s o f t h e c h a i n s o f t h e a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r o f T o r p e d o e l e c t r i c t i s s u e . C o l d S p r i n g H a r b o rS y m p o s i a o n Q u a n t i t a t i v e B i o l o g y X L V I I I , 1 - 8 .K A T Z , B . ( 1 9 6 6 ) . N e r v e , M u s c l e a n d S y n a p s e . Ne w Y o r k : M cG ra w H i l l B o o k C o m p a n y .K A T Z , B . ( 1 9 6 9 ) . T h e R e l e a s e o f N e u r a l T r a n s m i t t e r S u b s t a n c e s . T h e S h e r r i n g t o n L e c t u r e s X .L i v e r p o o l : L i v e r p o o l U n i v e r s i t y P r e s s .K A T Z , B . & M I L E D I , R . ( 1 9 7 2 ) . T h e s t a t i s t i c a l n a t u r e o f t h e a c e t y l c h o l i n e p o t e n t i a l a n d i t s m o l e c u l a r

c o m p o n e n t s . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 2 4 , 6 6 5 - 6 9 9 .K O R N , H . , M A L L E T , A . , T R I L L E R , A . & F A B E R , D . H . ( 1 9 8 2 ) . T r a n s m i s s i o n a t a c e n t r a l i n h i b i t o r ys y n a p s e . I I . Q u a n t a l d e s c r i p t i o n o f r e l e a s e , w i t h a p h y s i c a l c o r r e l a t e f o r b i n o m i a l n . J o u r n a l o fN e u r o p h y s i o l o g y 4 8 , 6 7 9 - 7 0 7 .K U N O , M. & W E A K L Y , J . N . ( 1 9 7 2 ) . Q u a n t a l c o m p o n e n t s o f t h e i n h i b i t o r y s y n a p t i c p o t e n t i a l i n s p i n a lm o t o n e u r o n e s o f t h e c a t . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 2 2 4 , 2 8 7 - 3 0 3 .M I L E S , R . & WONG, R . K . S . ( 1 9 8 4 ) . U n i t a r y i n h i b i t o r y s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n t h e g u i n e a - p i gh i p p o c a m p u s i n v i t r o . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 3 5 6 , 9 7 - 1 1 3 .M U E L L E R , A . L . , T A U B E , J . S . & S C H W A R T Z K R O I N , P . A . ( 1 9 8 4 ) . D e v e l o p m e n t o f h y p e r p o l a r i z i n gi n h i b i t o r y p o s t s y n a p t i c p o t e n t i a l s a n d h y p e r p o l a r i z i n g r e s p o n s e t o y - a m i n o b u t y r i c a c i d i n r a b b i th i p p o c a m p u s s t u d i e d i n v i t r o . J o u r n a l o f N e u r o s c i e n c e 4 , 8 6 0 - 8 6 7 .N E H E R , E . & S A K M A N N , B . ( 1 9 7 6 ) . S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m membrane o f d e n e r v a t e df r o g m u s c l e f i b r e s . N a t u r e 2 6 0 , 7 9 9 - 8 0 2 .O S B O R N , M . ( 1 9 8 1 ) . T e c h n i q u e s i n c e l l u l a r p h y s i o l o g y - P a r t I . L o c a l i z a t i o n o f p r o t e i n s b yi m m u n o f l u o r e s c e n c e t e c h n i q u e s . T e c h n i q u e s i n t h e L i f e S c i e n c e s P 1 0 7 , 1 - 2 8 .P R I T C H E T T , D . B . , S O N T H E I M E R , H . , S H I V E R S , B . D . , Y M E R , S . , K E T T E N M A N N , H . , S C H O F I E L D , P . R . &S E E B U R G , P . H . ( 1 9 8 9 ) . I m p o r t a n c e o f a n o v e l GABAA r e c e p t o r s u b u n i t f o r b e n z o d i a z e p i n ep h a r m a c o l o g y . N a t u r e 3 3 8 , 5 8 2 - 5 8 5 .S C H O F I E L D , P . R . , D A R L I S O N , M. G . , F U J I T A , N . , B U R T , D . R . , S T E P H E N S O N , F . A . , R O D R I G U E Z , H . ,R H E E , L . M . , R A M A C H A N D R A N , J . , R E A L E , V . , G L E N C O R S E , T . A . , S E E B U R G , P . H . & B A R N A R D ,E . A . ( 1 9 8 7 ) . S e q u e n c e a n d f u n c t i o n a l e x p r e s s i o n o f t h e GABAA r e c e p t o r s h o w s a l i g a n d - g a t e dr e c e p t o r s u p e r - f a m i l y . N a t u r e 3 2 8 , 2 2 1 - 2 2 7 .T A K A H A S H I , T . ( 1 9 7 8 ) . I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g f r o m v i s u a l l y i d e n t i f i e d m o t o n e u r o n s i n r a t s p i n a lc o r d s l i c e s . P r o c e e d i n g s o f t h e R o y a l S o c i e t y B 2 0 2 , 4 1 7 - 4 2 1 .

W A L L E N , P . , C A R L S S O N , K . , L I L J E B O R G , A . & G R I L L N E R , S . ( 1 9 8 8 ) . T h r e e - d i m e n s i o n a l r e c o n s t r u c t i o no f n e u r o n s i n t h e l a m p r e y s p i n a l c o r d i n w h o l e - m o u n t , u s i n g a c o n f o c a l l a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p e .J o u r n a l o f N e u r o s c i e n c e M e t h o d s 2 4 , 9 1 - 1 0 0 .W H I T T A K E R , V . P . ( 1 9 8 4 ) . T h e S y n a p t o s o m e . I n H a n d b o o k o f N e u r o c h e m i s t r y , v o l . 7 , 2 n d e d n , e d .L A J T H A , A . , p p . 1 - 3 9 . Ne w Y o r k : P l e n u m P r e s s .

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exp physiol 1989 sakmann 1107 18

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