farber disease
TRANSCRIPT
Laura Isabel Jaramillo Jaramillo Kelly Marisancén Carrasquilla
Medicine studentsIII Semester
Molecular biology
Introduction
Farber disease or Farber´s lipogranulomatosis
It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the ASAH1 gene or by the deficiency of prosaposin.
Ceramide
Sphingosine + Fatty acid
ASAH1 Acid ceramidase
Introduction
Deletion of ASAH1 gene, g.8728_18197del
(c.126-3941_382 + 1358del)
Introduction
Typical symptoms:
• Subcutaneous nodules
• Deformed joints
• Hoarseness by laryngeal involvement
Gen ASAH1 and Farber disease
Mutations in the ASAH1 gene is the main cause of the disease.
There are seven subtypes:
•Subtypes 1-6: Are related with the deficiency of AC caused by mutations in the ASAH1 gene
•Subtype 7: Is caused by the deficiency of prosapin (sphingolipid activator protein precursor)
Introduction
Learn more about Farber´s disease, its genetic explanation
and molecular bases using laboratory techniques.
Objective
Materiales y métodos
Paciente Femenina.
Único caso reportado de FD con hidropesía no inmune fetal.
Proliferación de macrófagos y monocitos en hígado, bazo, médula ósea, ganglios linfáticos, timo, glándula parótida y médula adrenal.
Falleció a los tres días de iniciar la diseminación de la coagulación intravascular.
Subtipo 4 de FD
Líneas celulares y cultivo celular
Fibroblastos de la piel de:
Individuos control
Individuos con Niemann Pick tipo B
Pacientes FD con infección simulada
• 10% de suero fetal bovino
• Antibióticos
• Tripsinización
• Lavado con un tampón fosfato-solución salina
• Congelación
Materiales y métodos
Materiales y métodos
Anticuerpos
MCA Anticuerpo monoclonal de ratón anti-AC generado contra el segmento de péptido 88-182 de la proteína humana
PCA Anticuerpo policlonal de cabra anti –AC producido contra un segmento interno de la proteína humana
SHA Anticuerpo policlonal de conejo anti-AC
Anticuerpos secundarios de cada uno de los ya mencionados
Materiales y métodos
Extracción de DNA
Se extrajo ADN genómico a partir de fibroblastos de la piel
Cada exón fue amplificado utilizando 12 conjuntos de primers
PCR
Electroforesis en gel de agarosa
Materiales y métodos
Purificación de los productos
Secuenciación directa e inversa
Análisis de los datos obtenidos
Confirmación de cada mutación
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Es una forma simple y rápida de multiplicar el DNA presenteen diferentes muestras biológicas, para posibilitar suidentificación.
Materiales y métodos
PCR
El conjunto específico de primers utilizados para amplificar la
región del gen ASAH1 eran:
• 5‘-CAGACTTGATGTTGTCTTCACA-3'
• 5'-CTGAAATTTGGGCTTGCTATG-3'
Materiales y métodos
Materiales y métodos
Precalentamiento
Desnaturalización
Hibridación
Extensión de los primers
Confirmación de la mutación por repetición de PCR y secuenciación.
PCR y secuenciación
Materiales y métodos
Transcripción1. El ARN total se aisló a partir de fibroblastos de la piel.
2. Un fragmento que abarca los exones 8-14 se amplificó.
3. Se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa usandogliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como gen de referenciaendógena
Análisis de proteínas por Western Blot
1. Los sedimentos celulares de cultivos de fibroblastos se suspendieron en:un tampón de lisis y un inhibidor proteico.
2. Lisis por sonicación en hielo.
3. Centrifugación.
4. Las muestras se prepararon en un buffer.
5. Desnaturalización por calor.
Materiales y métodos
Análisis de proteínas por Western Blot
6. Electroforesis en gel de acrilamida y transferencia a una membrana.
7. Incubación de la membrana en tampón de bloqueo.
8. Incubación con anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo).
9. Visualizar inmunorreactividad con anticuerpo secundario.
10. Detección de quimioluminiscencia.
Materiales y métodos
Ensayos lipídicos1. Los lípidos se extrajeron y la ceramida fue medida.
2. Se usaron membranas de E-Coli como fuente de diacilglicerol quinasa.
3. Se aisló la ceramida 1 fosfato radioactiva mediante cromatografía de capa fina.
Cloroformo
Acetona
Metanol
Ácido acético
Agua
Materiales y métodos
4. Las placas de TLC (Thin layer chromatography) fueron expuestas a rayos X.
5. Se realizó un raspado de las manchas de lipidos de ceramida fosforilada y diacilglicerol.
6. Se realizó un conteo de éstos por medio de centelleo líquido.
7. Posterior a una metanólisis alcalina, se analizó la esfingomielina por análisis de fósforo lipídico.
Materiales y métodos
Resultados
Secuencia de variación intrónica c.917 + 4A> G.• La mutación c.917 + 4A> G no se detectó en 100 cromosomas normales de
control.
• Ninguna otra alteración perjudicial se encontró en los exones e intronesde la muestra del paciente.
• Se estudio el empalme del exón 11 /entrón 11.
• Cuanto mayor sea la puntuación, mayor es la probabilidad de que lasecuencia sea un sitio de empalme.
Secuencia de variación intrónica c.917 + 4A> G.• La secuencia con mayor puntaje fue TGAgtaagt, por tanto es el sitio de
empalme verdadero y allí se da la mutación c.917 + 4A> G cuatronucleótidos después de la primera posición del intrón 11.
• Para este sitio de empalme la puntuación media es 8,83. Sin embargo,por la mutación c.917 + 4A> G hay una reducción a 3,27.
• Esta mutación interrumpe el proceso de empalme normal.
Resultados
Fig. 1.
Resultados
Resultados
Electroforesis del fragmento de DNAc amplificado de la paciente y el fragmento control
Otras bandas de rápida migración representan splicingsalternativos
Mayor migración del fragmento de la paciente
Se identificó la omisión de secuencias entre los exones 3 a 5
Secuenciación de transcripciones ASAH1
ResultadosFig. 2.
Resultados
Fig.3.
Tres polimorfismos fueron encontrados:
• Inserción de 29 pb en el intrón 5
• 2 Polimorfismos de nucleótido simple:
Intrón 6
Exón 10
Resultados
Variantes genéticas polimórficas
Análisis semi-cuantitativo de la transcripción ASAH1
Resultados
• Se empleo GAPDH como gen endógeno para la normalización de la expresión
• En los análisis de los productos de la PCR se encontró un nivel reducido de 50%del DNAC en las células de FD cuando se compara con la muestra de control .
• La transcripción se alteró por un acortado polipéptido resultado de la deleción deaminoácidos codificados por los exones del 3-5 y la aparición de un codón deparada prematuro.
Fig 4.
Resultados
Análisis de la proteína endógena de CA
Resultados
BANDA (kDa) ANTICUERPOS SIGNIFICADO
14 MCA y SHA Subunidad α
40 PCA Subunidad β
50-55 PCA Forma precursora de la enzima
Resultados
Fig. 5.
Análisis de esfingolípidosLa ceramida celular total (Cer) y los niveles de esfingomielina (SM) se evaluaron en lisados de fibroblastos humanos.
• Niemann Pick: deficiencia de esfingomielinasa ácida.
SM: Aumenta Cer: Aumenta
• Enfermedad de Farber neonatal:
SM: Disminuye Cer: Aumenta
Resultados
o en comparación a las células de control
DiscussionAuthors Approach
M. Muranjan, S. Agarwal, K. Lahiri, M. Bashyam,
The transition in the 5′ss consensussequence of intron 11 represents thethird report of a splicing mutation inthe ASAH1 gene c.457 + 4A > G
T. Levade, K. Sandhoff, H.Schulze, J.A. Medin.
The transition in the 5′ss consensussequence of intron 11 represents thethird report of a splicing mutation inthe ASAH1 gene c.1098 + 1G > T
X
DiscussionY.F. Chang, J.S. Imam, M.F.Wilkinson.
No detectable molecular formscorresponding to precursor orproteolytically processed mature proteinwere observed. Thus, if this aberranttranscript escapes to degradation by thenonsense-mediated mRNA decaymechanism and is translated, then themutant polypeptidemust be prematurelydegraded.
X
E. Kattner, A. Schäfer, K. Harzer.
In compliance with these findings, the invitro residual enzymatic activity observedin patient's cells represents one of thelowest values reported for FD patients .
T. Levade, K. Sandhoff, H. Schulze, J.A. Medin.
In compliance with these findings, the invitro residual enzymatic activity observedin patient's cells represents one of thelowest values reported for FD patients .
Conclusions
• Laboratory techniques like electrophoresis or protein analysisby Western Blot, are very useful for identifying andunderstanding the molecular basis of some diseases.
• The sequencing of the nitrogenous bases allow to know thelocations of different polymorphims or mutations that mayoccur in a genetic structure and this is a relevant diagnostictool.
• Molecular processes are very specific and important, becauseany slight alteration of these can lead to serious diseases.
• Farber disease is a clear example of the importance ofenzymatic processes in life. Different alterations at this level,can trigger events such as death
Conclusions
Kelly Marisancén Carrasquilla
Bibliography
• MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología molecular. 7. ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina, 2012. 292 p
• Mariana Q. Alves, Emmanuelle Le Trionnaire, Isaura Ribeiro, Stéphane Carpentier, Klaus Harzer, Thierry Levade, M. Gil Ribeiro. Molecular basis of acid ceramidasedeficiency in a neonatal form of Farber disease: Identification of the first large deletion in ASAH1 gene. Molecular Genetics and Metabolism 109 (2013) 276–281.
