fermentative production of thymidine by a metabolically engineered escherichia coli strain

Metabolic Engineering & Systems Biology Laboratory

Fermentative Production of Thymidine by a Metabolically

Engineered Escherichia coli Strain

11 硕：李思梦导师：陈涛


主要内容

研究的目的与意义1

实验方法2


1. 研究的目的与意义

• 胸苷，即 2- 脱氧胸苷，由一分子 2- 脱氧核糖和一分子胸腺嘧啶组成，是多种抗病毒药物的前体，也是治疗 AIDS 的重要组成成分

胸苷 C10H14N2O5 242.23


发酵法优点：1.生产成本具有竞争力；如果从无水葡萄糖开始合成胸苷，需要 14 步反应。因此，多步化学

合成的方法使得胸苷的成本非常昂贵。（ Japanese Patent Publication No. 39-16345 ， 1964 ）

2. 减少了化学合成工艺对环境的污染 ;3. 存在立体专一性 .

作为抗病毒药物的前体，胸苷的生产通常有化学合成法和微生物发酵法。


胸苷生产菌株

• 黄色短杆菌 Brevibacterium helvolum

类似物抗性 226ug/ml 7 天补料发酵 6.5g/l

• 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis

• 大肠杆菌 Escherichia coli （在专利 EP1190064B1中，产量达到 6.8g/l 左右）

Satwinder K. Kalirai, Bernard Scanlon, Steve C. Taylor, 1 and Shamim I. Ahmad* J. Gen. Appl. Microbiol., 46, 217–224 (2000)

EP0344937B1

EP0504279B1

EP1190064B1


为什么选择大肠杆菌

• 在 E.coli中，完全是用的代谢工程的方法进行的菌种的改造，而黄色短杆菌是用诱变的方法进行的改造。

• 生长快、在工业应用方面有广泛的应用

• E.coli的基因序列完全清楚，基因操作技术在大肠杆菌中成熟，基因元件库多，可以做到对基因的精细调控，合成生物学的方法技术在大肠杆菌中也比较全面


2. 实验方法• 由于胸苷涉及到 DNA 的合成，因此胞内的胸苷浓度很低，而且受到严密调控。

• 策略：加强胸苷合成的从头合成途径，敲除补救途径。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　


2. 实验方法

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途径介绍• 途径从碳酸根与谷氨酰胺经氨甲酰磷酸合成酶（ pyrA）合成氨甲酰

磷酸，又经过天冬氨酸转氨甲酰酶（ pyrBI）生成氨甲酰天冬氨酸，

经二氢乳清酸酶（ pyrC）生成二氢乳清酸，经二氢乳清酸脱氢酶（

pyrD）生成乳清酸，与由 pp途径生成的 PRPP经乳清酸磷酸核糖转

移酶（ pyrE）生成乳清核苷酸 OMP，经 OMP脱羧酶（ pryF）生

成尿嘧啶核苷酸 UMP，经 UMP激酶（ pyrH）生成 UDP，经核苷

二磷酸还原酶（ nrd）生成 dUDP，经核苷二磷酸激酶（ ndk）生成

dUTP，经脱氧尿苷三磷酸酶（ dut）生成 dUMP，经胸苷酸合成酶

（ thyA）生成 dTMP，经 TMP水解酶生成胸苷。


E.coli产胸苷的研究现状 Strains and plasmids Description yield （ mg/l ）BL21 Star(DE3) F-ompT hsdSB (rB

- mB-) gal dcm rne1

31 (DE3)

BLd BL21 ΔdeoA

BLdt BL21 ΔdeoA Δtdk

BLdtu BL21 ΔdeoA Δtdk Δudp

BLdtu1 BLdtu harboring pETD::Td

BLdtu2 BLdtu harboring pETD::TdNr

BLdtu23 BLdtu2 harboring pACD::DU

BLdtu24 BLdtu2 harboring pACD::DUTm 459.0± 10.8 　（ 649.3 ）

BLdtu24 (dut) BLdtu2 harboring pACD::DUTmUt 376.2 ± 9.2

BLdtug24 BLdtu24 Δung 550.7 ± 6.2（ 740.3 ）

flask cultures for 24 h


• 阻断补救途径，首先敲除 deoA （合成胸苷磷酸化酶），发现不能全完阻断胸苷的去路，接着敲除了 tdk （胸苷激酶）与 udp （尿苷磷酸化酶），发现有胸苷的合成了。

• 胸苷酸合成酶（ thyA ）是合成胸苷的非常重要的酶，过表达之后，胸苷的积累量增加了。同时 T4 nrdAB （核苷二磷酸还原酶）是被高度调控的酶，过表达之后，胸苷的产量增加了两倍。 T4 nrdC 是编码硫氧还蛋白的基因。

• 由代谢图看出， dUMP 是胸苷的前体， dUMP 的水平直接影响胸苷的产量，为增加 dUMP 的通量，表达了 udk-dcd （尿苷激酶， dCTP 脱氨酶）操纵子，但产量仅增加了 30mg/l ，可以看出应该还有另外的限速步骤。

• 提高 TMP 水解酶酶的酶活，发现 dTMP 水解为胸苷的效率才 1.3pmol/mg.min ，表达 PBS2 的 TMPase ，效率达到了 16.6pmol/mg.min ，胸苷积累量增加了 1.5 倍。


T4 核糖核苷酸二磷酸还原酶（ nrdAB ）操纵子， T4 硫氧还蛋白（ nrdC ）， T4 胸苷酸合酶（ td ）， PBS2 TMP 磷酸水解酶（ TMPase ），大肠的dCTP 脱氨酶（ dcd ），脱氧尿苷三磷酸酶（ dut ）和尿苷激酶（ udk ）


• Lee HC, Ahn JM, Lee SN, Kim JH (2004) Overproduction of thymidine by recombinant Brevibacterium helvolum amplified with thymidine monophosphate phosphohydrolase gene from bacteriophage PBS2. Biotechnol Lett 26:265–268

• Lee HC, Kim JH, Kim JS, Jang W, Kim SY (2009a) Fermentative production of thymidine by a metabolically engineered Escherichia coli strain. Appl Environ Microbiol 75:2423–2432

• Lee HC, Kim JS, Jang W, Kim SY (2009b) Thymidine production by overexpression NAD+kinase in an Escherichia coli recombinant strain. Biotechnol Lett 31:1929–1936

• Lee HC, Kim JS, Jang W, Kim SY (2010) High NADPH/NADP +ratio improves thymidine production by a metabolically engineered Escherichia coli strain. J Biotechnol 149:24–32

• Lee HC, Kim JS, Jang W, Kim SY (2011)Enhancement of thymidine production in E. coli by eliminating repressors regulating the carbamoyl phosphate synthetase operon.Biotechnol Lett (2011) 33:71–78

fermentative production of thymidine by a metabolically engineered escherichia coli strain

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