MPG NSG workshop I: Pooled Sequencing Analysis 

Jason Flannick 

Postdoctoral Fellow Altshuler Lab 02/04/10 

What is pooled sequencing? 

•  Sequence mulIple individuals in a single lane 

•  No barcoding •  Usually phenotype driven 

2 

When should you perform pooled sequencing? 

•  You have a (small) target region to sequence 

•  You want to sequence as many individuals as possible 

•  You can’t use indexing 

•  It’s too late to redesign your experiment 

3 

How is pooled sequencing unique? 

•  SNP calling more challenging –  Allele frequencies close to error rates –  Lose idenIty of samples 

•  Phenotype driven –  Different (but sIll general) analyses 

•  Different analysis pipeline –  Different SNP caller –  AnnotaIon / associaIon scripts 

4 

Pooled sequencing analysis workflow 

5 

Call Ready BAM files 

Coverage & Power Metrics 

Syzygy 

SNP calls 

AnnotaIons Frequency EsImaIon 

AssociaIons Burden TesIng 

Syzygy ReSeq 

Polyphen PDB UCSC C‐alpha 

Variants for  Followup Genotyping PED/MAP files 

ValidaIon Metrics VbV AssociaIons Burden TesIng 

PLINK C‐alpha 

GATK 

Picard BAM files 

GATK 

Produced by Pipeline 

Pipeline Automates These Tasks 

6 

Call Ready BAM files 

Coverage & Power Metrics 

SNP calls 

AnnotaIons Frequency EsImaIon 

AssociaIons Burden TesIng 

Syzygy ReSeq 

Polyphen PDB UCSC C‐alpha 

Variants for  Followup Genotyping PED/MAP files 

ValidaIon Metrics VbV AssociaIons Burden TesIng 

PLINK C‐alpha 

GATK 

1 day  2 hrs 

2 hrs 

Instant 

Syzygy 

Picard BAM files 

GATK RunIme for FHS 

3 hrs 

Tools provided to help 

How to run your data 

•  OpIon 1: Your own custom analysis –  Install and run Syzygy –  Write own scripts to analyze annotaIons and associaIons 

•  OpIon 2 (recommended): Run data through pipeline –  Work with designated analyst  

–  Required input files •  Picard BAM files 

•  Target file •  Sample to lane mapping informaIon 

–  Use web interface to monitor progress and access files 

–  Can get data out of pipeline at any point •  Direct access to all intermediate and final files through Unix File System 

7 

Sample Output Files: ApplicaIon to T2D 

8 

Sample Output Files: Coverage & Power Metrics 

12 

15 

16 

Sample Output Files: SNP Calls 

17 

Sample Output Files: AnnotaIons & AssociaIons 

21 

22 

24 

Summary 

•  Pipeline recommended for calling and analyzing pooled data 

•  Many tools to help analyze data, but also allows easy access to every intermediate file for custom analysis 

•  Designated analysts can advise on how to filter SNP calls and analyze variants for associaIon 

25 

Power calculator 

•  Available at hhp://www.broadinsItute.org/~flannick/power/ 

26 

Overview of Syzygy 

•  Call SNPS –  Compute error model for each locus (different from GATK) 

–  Perform likelihood raIo test of SNP vs. error –  Filter SNPs 

•  Strand bias, clustered SNPs, second best base •  Annotate SNPS 

–  ReSeq annotaIon server •  Frequency esImaIon and associaIon tesIng 

–  Use EM to esImate case and control frequencies 

–  Perform chi‐squared test of associaIon for each SNP 

–  Perform C‐alpha test on each gene for variants with MAF < .05 

27