fragmentos circulantes de propéptido natriurético tipo b n-terminal en el plasma de pacientes con...
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Fragmentos circulantes depropéptido natriurético tipo B N-terminal en el plasma de pacientes con insuficiencia cardiaca
J. Y. Y. Foo, Y. Wan, B. L. Schulz, K. Kostner, J. Atherton, J. Cooper-White, G. Dimeski, y C. Punyadeera
Octubre de 2013
www.clinchem.org/content/59/10/1523.full
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Introducción: problema clínico actual Introducción: problema clínico actual
Insuficiencia cardiaca (IC): un problema sanitario mundial asociado con resultados clínicos deficientes carga económica considerable
El péptido natriurético tipo B (BNP) en plasma o el fragmento N-terminal del propéptido natriurético cerebral (NTproBNP) mejoran la exactitud del diagnóstico en pacientes con sospecha de IC
Sin embargo, su utilidad en la detección en poblaciones asintomáticas y en la supervisión está limitada por la variación entre pacientes y en cada paciente, así como la presencia de varias formas del péptido NTproBNP en la sangre
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Finalidad del estudio: Finalidad del estudio:
Identificar y cuantificar la principal forma del NT-proBNP circulante en plasma obtenido de pacientes con IC
Informar el desarrollo de los análisis de diagnóstico de última generación
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Preguntas de la investigaciPreguntas de la investigaciónón
¿Cuáles son los fragmentos circulantes comunes de NT-proBNP en sangre de los pacientes con IC?
¿Está fragmentado el NT-proBNP en la circulación (es decir, en la sangre)?
¿Qué fragmento debe ser el objetivo de los análisis de NT-proBNP para nuevos fines de diagnóstico?
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Materiales y métodosMateriales y métodos Participantes y obtención de muestras
Todos los participantes eran mayores de 18 años y proporcionaron consentimiento por escrito
Se reclutaron 20 pacientes con IC asintomática [New York Heart Association (Asociación del Corazón de Nueva York, NYHA) clase funcional III - IV]
Las muestras de sangre se obtuvieron en tubos de AEDT para minimizar la degradación in vitro de NT-proBNP; se centrifugaron; se separó el plasma y las partes se almacenaron a -80 0C hasta su análisis.
Inmunoprecipitación Utilizada para identificar los principales productos proteolíticos de
NTproBNP en la circulación El plasma de los pacientes con IC (n= 4) se usó para las reacciones
de inmunoprecipitación (IP)
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Materiales y métodos (continuación)Materiales y métodos (continuación)Inmunoprecipitación y espectrometría de masas
El anticuerpo monoclonal NT-proBNP (aminoácidos selectivos 13–20) se conectó químicamente a Dynabeads® M-270 Epoxy (Invitrogen) mediante química EDS-NHS [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida y N-hidroxisuccinimida] conforme a las instrucciones del fabricante.
El NT-proBNP de plasma enriquecido se digirió con tripsina en 50 mmol/l Tris-HCl pH 7.5 con 10 mmol/l ditiotreitol a 37 °C durante 16 h; se quitó la sal con C18 ZipTips (Millipore) y se analizó mediante cromatografía de líquidos (LC)-ionización por electronebulización–espectrometría de masas en tándem (MS/MS) con un sistema Prominence nanoLC (Shimadzu) en un espectrómetro de masas TripleTof 5600 con una interfaz Nanospray III (AB SCIEX)
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Materiales y métodos (continuación)Materiales y métodos (continuación) Inmunoprecipitación y espectrometría de masas
Las proteínas se identificaron mediante Protein Pilot (AB SCIEX) y la búsqueda se realizó en la base de datos LudwigNR 8 (descargada en http://www.wehi.edu.au/faculty/advanced_research_technologies/proteomics/wehi_systems_biology_mascot_server conforme a la actualización del 27 de enero de 2012; 16,818,973 secuencias; 5,891,363,821 residuos)
Se incluyeron los péptidos identificados con un 99 % de confianza y con una tasa de detección falsa local del 1% para su posterior análisis, y se inspeccionaron manualmente los espectros de fragmentación de espectrometría de masas en tándem
Los cromatogramas de iones extraídos se obtuvieron mediante PeakView 1.1
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Figura 1. Los 6 inmunoanálisis utilizan anticuerpos monoclonales de grado diagnóstico para detectar NT-proBNP1-20, NT-proBNP13-45, NT-proBNP1-45, NT-proBNP28-76, NT-proBNP13-76 y NT-proBNP1-76. Los sitios de proteólisis en el extremo N y C terminal detectados por nuestro estudio se muestran con líneas verticales rojas. * Par de anticuerpos con la mayor concentración de NT-proBNP.
Puntos de unión del anticuerpo en los 6 fragmentos de NT-Puntos de unión del anticuerpo en los 6 fragmentos de NT-proBNP glucosiladoproBNP glucosilado
3637
O-glucosilación
44 48 53 58NH2 COOH761
*
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Tabla 1.Tabla 1.
Tabla 1. Péptidos NT-proBNP obtenidos por proteólisis con tripsina total y parcial identificados después de la inmunoprecipitación (IP) del plasma.
Posición* Péptido m/z z mass
1-21 HPLGSPGSASDLETSGLQEQR.N 722.68 3 -0.003
3-21 P.LGSPGSASDLETSGLQEQR.N# 966.46 2 -0.004
4-21 L.GSPGSASDLETSGLQEQR.N 909.92 2 -0.005
7-21 P.GSASDLETSGLQEQR.N 789.36 2 -0.004
67-76 K.MVLYTLRAPR^ 407.23 3 0.001
67-75 K.MVLYTLRAP.R 532.30 2 0.002
67-73 K.MVLYTLR.A 448.25 2 0.001
* , posición de aminoácido in proteína -proBNP. #, los clivajes no trípticos -
aparecen en negrilla.. ^, los clivajes ausentes están subrayados.
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Figura 2. Proporción relativa de péptidos obtenidos por proteólisis con tripsina total y parcial por el extremo N y C terminal de NT-proBNP purificados por IP de pacientes individuales. (A) Péptidos del extremo N terminal: azul, H1-R21; rojo, L3-R21; verde, G4-R21; púrpura, G7-R21. (B) Péptidos del extremo C terminal: naranja, M67-R76; rosado, M67-P75.
Proporción relativa de péptidos obtenidos por proteólisis con Proporción relativa de péptidos obtenidos por proteólisis con tripsina total y parcial por el extremo N y C terminal de NT-tripsina total y parcial por el extremo N y C terminal de NT-proBNP proBNP
Paciente
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Figura 3. Los porcentiles 25, 50 (mediana), 75 se indican en los gráficos de caja y bigotes. * Notablemente diferente de la concentración de NT-proBNP13–
76 al nivel P < 0.05.
Fragmentos circulantes de NT-proBNP en la sangre de Fragmentos circulantes de NT-proBNP en la sangre de pacientes con IC (n=20).pacientes con IC (n=20).
Fragmentos de NT-proBNP
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Figura 4. Se realizó la correlación de Spearman entre los niveles de plasma NT-proBNP13-76 y NT-proBNP1-20 (Spearman r=0.890, p<0.0001) y NT-proBNP13-45 (Spearman r=0.859, p<0.0001).
Correlación de NT-proBNPCorrelación de NT-proBNP13-7613-76 con NT-proBNP con NT-proBNP1-20 1-20 y NT-y NT-
proBNPproBNP13-4513-45 en pacientes con IC. en pacientes con IC.C
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Principales conclusiones Principales conclusiones Los anticuerpos dirigidos al extremo N muestran bajas
concentraciones aparentes (1-76 frente a 13-76; 1-45 frente a 13-45).
Los anticuerpos dirigidos al extremo C muestran bajas concentraciones aparentes (1-76 frente a 1-20)
Los anticuerpos dirigidos a la región glucosilada muestran bajas concentraciones aparentes (1-45 frente a 1-76)
ConclusiónEl NT-proBNP se encuentra proteolíticamente truncado en los extremos N y C, y se encuentra glucosilado en su región central. Para lograr un inmunoanálisis óptimo, los anticuerpos no deberían dirigirse a esas regiones
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