free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass...
TRANSCRIPT
���� ������ ��� �� �� �� ������ �������� ����������� ������� ��� ���������� ���� � ����������
Vincenzo Cunsolo1, Salvatore Foti1*, Carmelo La Rosa1, Rosaria Saletti1,G. W. Canters2 and M. Ph. Verbeet21Dipartimento di Scienze Chimiche, Universita degli Studi di Catania, Viale A. Doria 6, 95125 Catania, Italy2Leiden Institute of Chemistry, Gorleaus Laboratories, Leiden University, P.O. Box 9502, 2300 RA Leiden, The Netherlands
�������� �� �� � �� �������� � ���� � �
SPONSOR REFEREE: Dr. R. Graham Cooks, Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA
�� ������� ��� ���������� ����� ���� � ����������� ������ ��� ��� ������������� �� ��� ���� ������
���� �� �������� �� ������� �� ��������� ��� ������ ��� ������ ����� ����� �� �� �� ��������
��� �� � � ����! "��#$��%"��#&'�� �"$�%"&'�� � ���� ������ ������#�� � ���������� ��� ����
������ �� ��� ������������ ������ �� ��� ������� �����(�� �� �������%����� �)*�)*! (%(! + $�)�
��� ������ � ��������� ��� ���� � ����� �� ���� �����(��� ��� � ����� ������ ��� ������ ��
��,�! ������ ������ �� ��� ����(� ���# ������ ��� ��� ������� � �# ������� ���� ��� ���������
����� �� ����� ��� ������ �� ��,� �� ���������� ���� ��� �� �-�������! ��� ���� ������ ��� ���
�������� ������ ��� ��� ����� ������� ���� � ����������� �� �(����� ��� �������� �� ���
������������� ���� ������� � ��� ��� ���� � ����������� � �����! ��� ������������ ������ ���
������ � ./#/�� � �������� �� ��� ��� ���� �� ���� ������� � ����� ���� ������ �������
���� �� ���� ��������� ���������� ���� ��� ���#0� � ����� ��� � ���� �� ����� �����
-���������(� ����������� ���� ��� ������ �������� ������� �� ����� �! ���� � ����� ��� �
� ��� �� ����� ������� ��� ��-����� (��� �� ������� �� ��� �! ��� �� ��� ��������� �������(��� ��
���� � ����������� ���� ��� ��(� ��������� ����� ���� ��� ������ �� ��� � �(����
��(���� ��� ��� �� ������� �������� "� ������ � &**1 2��� 3��� 4 ����! 5���
��� ������� ��� ��� ��������� �� ������ �������� ���
���������� �� ��� ������� �� ��� ������������ ������������
������� ��� ��� ���� ��� ��� ���� ����� �� ����� ����
�������! ��� �������� ����������� �������� ����� ���
���������� ������������ ������� ���������� ����� ��� �����
�������� ��������� ��� �������" ����� ������������! ���
�����#����� ��� �������� �������! ��� �� ������������
�������� �� ��������� ������ ��� �� ���������� �� ����
�� �� ���������� ��� �$ ����������"�!�
%������ ������� ��� �������� �������� �� ����
�������������� ������� �� ��������! �������� ������� �����
�������� &'(�()%*! ������� �������� &+,*! ������ ��������
��������� &-.�*! ������������ �������� ����������� &,%+*!
��� ���������� ������������ ��������� &/0�*"
)� ������ �����! ��� ����������� �� ��������� 1����2
���������� ������� ��� �� ������������ ���������� &/%)*
��� �����3��������� ����� ����������4���������� &.�5,)*
��� ������� ���������� �������� �� �� ���� �� ��� ����
������������� ���������������� �� ��������"�!6
/%)�.%! ���� ��� ��#� ������� �� ���� ������� �������
��������� ���� �������� ���� �������! ��� ���� ����������
���� ��� ������� ������� ������������ ��� ��� �������
�� � ��� ������#� �� ����������� ��� ������� �� �������
������� ��� �� ������������ ������������ ������� ����
���3��"789
)� ����! �� �� ��������� �������� ���� �� ������� ������� ��
������� ����� �� ��� ��������� �� ������ ������ ������ ����
��� ���� ������� �� ��� ������ �����" ���� ������������ ���
���� ��������� �������� ������� ��������� �������� ��� �
������� �� ��������� ������":8�� ��� ������ ��� ���� ��������
�� ������� �� ��� ������ ������������� �� �������� �����������
����� &5��! ��� ��� $��* ��� �� ��� ��������� ������ ���� ��
��� ������� �����":!��!�� $����! �������� �� ������ �����
������������ �� �� /%) ���� ������� ��� ���� ��� ��
������ ��� ����������� ���� ��� ����������������� �����
��� �� �������� ��� �� ������� ��� �������� ���� ��������
������� ����������"�6
/%)�.% �� ����������� ���� $4, �3������ ����� ��
������ ���� ����������� ��������� ��� ���� ��� �� ������
��� ������ ��������� �� �������� �� �� ����� ������� �������
���� ���� �� �������� ������� �� � ������� �������"�78�� )� ��
����������� ��������! �������� ������� ����������� �� ����
���� ���� ���� ������ �� ��� ����������� /%)�.% ��������
�� ������� ����������� �������� �� ��������� ��������
�������������"��8�;
%������ ������������ �� /%)�.% �� ��� ������������� ��
������� ��������� �� ������ ������3�� ������ �� �������
*������������� �< %" =���! ,����������� �� %����>� +�������!'���������? ����� %��� �� +������! (���� �" ,���� @! :7��7+������! )����"/�����< �����A������"����"��+�������4����� �������< .'�%�"+�������4����� �������< ��� )������ .��� %����������� -������ "
,B)<� "� �4���"6�: +�������� � � � ��� C���� D %���! 5��"
��0), +B..'-)+��)B-% )- .�%% %0/+��B./��E
��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
���� �������� ���� ��������"�98�7 -�����������! ��� �� ��
/%)�.% �� ��� ����� �� ������� �������� ��� ��������� ����
�������� �� #��������� ������! ������� ��� ������������� ��
������������� ���� ��� �#������� ��������� �� �������
�� ���� ���� ������������� ������ �� ���� �� �� ������� �����"
$������! ���� ������� ������ ��� ����������� ��� /%)�.%
��� �������� ���� ������ ����������� ��� ��� #����������
������������� �� �#������� �������� �� ���������"�@!�;
C� ������ ���� ��� �� �� /%)�.% �� ������ ���������
����� ���� ��� ��� ������������� �� ��� ���� ������ &�F* ���������� �� ��������" ��� �������� ��� ������ ���� �����
�������� ��������� �� ��� ������3�� ������!�9!�: �"�" �����
���� &��* �>���!6 +��4+�@� �>��� �����!6� ��� ��
���������"6�!6�
�>��� ��� ��������� ��� �� �������� �������� ������� ��
��� ����3 ������ �� ������� ��������" �>��� ��� ��9 �����
���� ������� ��� �������� � �������� ������ ����������
+���� ��� +����@ ��� � ������ +�� ���� ) ������! ���� F���
67! $���6@! +������! $�����;! .������ �� ����� �������" ���
�������� ���� �� ��� ����� ��� ����� ���� �� ��� �������
��������������� ���������� �%&+��* → ������&+��*! ����� ��
��������� ����������� ��� ��� ���������� �� @�7 ��"
)� ��� +��4+�@� �>��� �����! �������� �� �����������
����������! ���� ��������� ���� ���� �������� ���� �������
�������" ��� ����� ���������� �� +���� ��� +����@ ����
������� ������� ���� ��� ������ ��� ������� ��������
������� �� +��4+�@� �>��� ����� ���� ������� �� ���
�� �������" )������! ��� ������������� �����#����� �� ���
������� �� ��� �������� ���� ��� ������������! �������� �� �
�������� �������� �� ��� ������������� ��������� �� ���
�������"6�
��������� ��� � @ ����� ���� ������� ��� �������� �
������ +�� ���� ) ������! ���� $���76! +���:�! $���:@! .���::
�� ����� �������"
�67�8�0�9��5
0������ ��� ������������� ����! $05+ ����� ����� ��� �������� ���� ��������
�� 5���%��� &,����! )������*"
5���������� ��������� �>��� ���� ����������� ����� ����
��� �������� ���� %������������ &.����! )����*" +�������
����! ������� ��� ��������� �� ��� +��4+�@� �>��� �����
��� ������� �� �� F������ 5����������� �� ��� 5�����
)������� �� +��������! �� ��������� ���������"6� ���
������� ������� ��������� ��� �������� ��� �����3�����
���� �� �� �� ������ .� :" =�� ��� �3�������� ���
����������� �� ��� ����������� ��������� � ������������
�������� ��� �������� �� ��������� ���������"6�
��� ����� ��� ����� ��������� �� ��� �������! �����
��������� ���� ��� ������������ ���������� �������! ����
������� �� ��� �� �� �������� �������� ���� � ��������
������ ������ � ,� &%������40�� @* �������� ����
0������� F����� &.����! )����*"
0��� � ����������/%)�.% �������� ���� ��������� ���� � =������� 5+G�,���
���������! ���� ��� ���� ����� ���������� ��� ��� �����
��������" 0������ �������� ���� ������ �� � �54���" ���
��������� ���������� ��� ���������� �� ��7°+" .���
������� ���� ��#���� �� �������� ��� ���� �� ��������
���� ; �� � ,� ��� ���� �� ������ ����� ����
��������"
%������ ��� ���� ������������� �������� ���� �������� ��
���������� ����� ������� ���� � ��������4����� �������
&7 <7 ! �4�* �� � ������������� �� �����3������� � �7 ." ���
�$ ��� ��H���� �� �"7 �� ������ ������ ����" %������� ����
���������� �� ���� ���������� ��� /%) ���� ������� ����
�������� �� ���� ��������� &� ���! � �! � �! � �! @ �! : �! �6 �!
�� �*"
./#/�� � �������� ���� ������� ���������� ����������� ���� ������� �� ����
� ���� (�7� �����������������" G���> ������� ���� ����
������� ���� ���� ��� ��������"
,� �� ��� ���� ��� ����� �� �>��� ����� ���������!
����������� ���� ������� �� ���� �� �� �>��� ��� ��
���������" %������ ��� '(�()% ����������� ���� ����
����� �� ��� ���� ��������� ������� ��� ��� /%)�.%
�������� �� � ������������� �� �����3������� � �7 ." '(�()%
����������� ���� ������� �� �� ���� ����������
��������� ������� ���������� ��������� �� ���3 &7:; �� ���
�� ��������� ��� @�7 �� ��� �� �>���* �� ���������� �����"
:��� ���������� ���� ����� �� ��� �������� ������� ��� �������� ��
��� #������ �� ��� �������� �! ����� �� ������� �� ��� �����
������� ��� �� �� ��� ������� ��������� �� ��� �������
������������� �� ��� ������ ������������ &� &������** ��� ���
�� �� ��� ������� ��������� �� ��� ������� ������������� ��
��� ������� ����������� &� &�����**<
� � � ��������� �������
���
��� ����� �� ������� � ��� ������� ������� &��* �����
���� ���� ������ �� �3��������� ����� &����������� ��������*
���� ��� ��������� �#����� &�������� ��� �*<
��� � ���� � ��� � ������ ���� ���
����� �& *! �&* ��� �&�* ���������� �� ��� ���� �� ���
#������ �� ��� �������� �� I ! �� ������� ���� ! ��� �� I�!
������������" � ������3 ��������� �� 5���������.��#����
��� ��� �� �������� ��� � �������" ��� �3����������
����� �� � ��� ���� ���� ���� �������� �� �������� �� �����
����������� �����������"
8��.5�� �9: :��".���;9
���#0� ����������������� �������� �������! �������� �� ���������� ����� ��� ����
������� ������������! ��� �������� �� �3������ �� =��� �8�"
��� /%) ���� ������� �� �� �>��� �������� �� � ���
&=��" �&�** ����� ���� ������� �� �!" ���7"�! � �":! �;7�"7!
�77;" ��� �6 �"6! ������������� �� ��� ������������ ����
�� ��� ������ ������� ���������� ��� +�� ��� &������������*!
�������� @! ;! 9! : ��� � �������! ������������" )� ����!
������������66!67 �� ���� ������ �� ���� ���� � ���� ���� ��
�6 6"@ ,� ������������� �� ��� ������>��� &��������� ��
�6 7"� ,�*"
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
�9�9 (" +����� � ���
� ������ ������ �� ��� � �� ������� �� ��� ����� ���� �����
���� ��� ���������" ,����������� �� ��� ������� �������
���� �� ���� ������ ��������� ���� ����� ������� ���������� �� �
������� �� ����� ��� +�� ��� �� ���� &�����������*" ���
������ ����������� ���� ����� ������� ���� ��� ����������� ��
������������ ������� ���� ������� �� ��� ���������"
������� �������� �� ��� /%) ���� ������� �������� �� ������
����� &=��� �&�* ��� �&�** ����� � ������ �������� �� ���
�������� ��������� �� ��� ������� ������������� �� ���
������� �����������"
��� /%) ���� ������� ��� +��4+�@� �>��� �����
�������� �� � ��� &=��" �&�** ���� ����� ��� ������ �� ��� �!
������������� �� ��� ������ ������������ ��� �� ��� �������
�����������! ������������" $������! ��� ���� �������! ��� /%)
���� ������� �������� �� ������ ����� &=��� �&�* ��� �&�**
���� � ����� ���� �������� �� ��� �������� ��������� �� ���
������� ������������� �� ��� ������� �����������! ��������
��� ���� �� ���� ���� ��� ����������� ������� ����� �� �
������ ����" ���� ����� �� ��������� ����������� �� ��� �������
�� ��� �������� ������ �� ��� ������� �� ��� ����� ����"
��� ������� �� ���� ��������� �������� ������� ������ �
���� ����� ������������ ��� ��� +��4+�@� �>��� �����
Figure 1. ESI mass spectra of wild-type azurin in H2O/CH3OH 1:1, pH 3.5, recorded at (a)30 min, (b) 3 h, and (c) 24 h. Peaks corresponding to the holo-form and unfolded apo-proteinare labelled N and U, respectively.
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9�:
���� ������� �� ��� ��������� ����! ��� �����#����� ��
������ ���������� �� ��� ������ ������������! �������� ���
������� ���� �� ��� ������ ���"
��� /%) ���� ������� �������� �� ��������� ����� ��� ��
��������� ��� ������� �� ��� /%) ���� ������� �������� ���
��� ������� ��� ��������" )� ����! ��� /%) ���� ������� ���
�� ��������� �������� �� � ��� &=��" �&�** ���� ����� ���
������ �� ��� �! ������������� �� ��� ������ ������������ ���
�� ��� ������� �����������! ������������" .�������! ���
�������� ��������� �� ��� ������� ������������� �� ���
������� ����������� ��������� ������������ �� ��� /%) ����
������� �������� �� ������ ����� &=��� �&�* ��� �&�**"
=�� ��� ��� �������� ������������! ����������� �3���������
������ ���� � �������� ��������� ������� ����� ����
������� �� ����� ��������! ��������� ��������� �� ���
��������� ���������� ������� ��� /%)�.% ��������! ����
����>������� ��� �#��������� �� $�B �� ������ �$"
�������������� ���� �������������/����������� ���� ������� �������� �� ���� ��������� ��� ��
�>���! +��4+�@� �>��� ����� ��� �� ���������!
��������� �� ��������� ����������! ������ ���� �����
�������� ������ �������������� ������� �� ��� ������
�������� ������� ���� ��� ������ ��� ��������������"
Figure 2. ESI mass spectra of C3A/C26A azurin mutant in H2O/CH3OH 1:1, pH 3.5, recordedat (a) 30 min, (b) 3 h, and (c) 24 h. Peaks corresponding to the holo-form and unfolded apo-protein are labelled N and U, respectively.
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
�9� (" +����� � ���
����� �������������� ������� ����� �� ��� ������� ��������
�� ��� ��������! ���� ���������� �� ��� ������������� ����
��� ���� �� ��� ������ ���"
)� ����� �� ������ ������������� ����� ���� ��� /%)�.%
����! ��� ��������� ���������� ��� �� ����<6@
�� '������� ����������� ��� ������ ���������� �������
������ ��� ���� /%) ������� ��� ���� ��� ����
�������� �� ������������ �����������
#� ��� ����� ������ ��� ���� ������� �� ������������ �� ���
������������� �� ��� ��� ������
� ��� ������������� �� ��� ��� ����� �� ������������ ��
������������� �� �������� ���
�� -� ����� ���� ��� �� ���� �� ��� ����� �������"
)� �� ����� ������ ���� ���� �� ����� ����������! �"�"! # ���
! ���� ���� ���������6; �������� ����� ���������� �����
���� ��� ����� ���� �������� ������ ��� ���� ������� ��
������������ �� ��� ������������� �� �#������� �� ��� ��
�������" $������! ���� ����� ���������� �� ���������
����� ��� �� �������" =�� ��������! �� �������� �� ���������
�! �� �� �� ��� ���� ��� ������ ��� ��� ������� �������� ���
Figure 3. ESI mass spectra of wild-type amicyanin in H2O/CH3OH 1:1, pH 3.5, recorded at (a)30 min, (b) 3 h, and (c) 24 h. Peaks corresponding to the holo-form and unfolded apo-proteinare labelled N and U, respectively.
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9��
���� ��������� ������� �� ������� ��� ��� ������ �����
���������������! �������� �� ��������� ���� �������� ���
�������" ����! �� �� �������� ���� �������� �������� ���������
��� ���� ������� ��� +�� ��� ��� ����� ���� ���� ������
�� ��� ������� ��#����! ������� �� �3���������� ��������
��� ���� ����3 ������� ��� ��������"
.�������! �� ����� �� ���������� ���� ��� �����������
�������� ���� ���� �� � ������ �� � ��������� �������" �
��������� ������� ��� ������� ����������� �� ��� �������
�������� �� ���� �� ��� ����� ��� ��! �������������! ���� �� ���
����� ��� ��� ����#��� ����������� �� ��� �������" ���
/%) ���� ������� �� ��� ����� �������� ������������ ���� ����
���� ��� ������ �� ������� ������������� �� ��� ������ �����
������� ��� ��� ������� �����������" ����� ������ ������
���� ��� �������� �������������� ������� ��� ��� �������
���� �� ��� ����� ������� ���� ��� ����������� ����������" )�
����! �� ����������� ��������� ����������� ������� ����
�������� � ����� ������ �� ������� ������������� �� ���
������� ������������ �� �� ��� ������ �����������! ��
�������� ���� ��� ����������� ������� �������� ������
������� ������"69!6:
������� ���� ��� ����� ���������� �$� ��� �������! ���
Figure 4. Q value plotted as function of time for (a) wild-type azurin, (b) C3A/C26A azurinmutant, and (c) wild-type amicyanin.
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
�9�� (" +����� � ���
����������� � ������ ���� ����������� �������! �� �� ��������
�� ������ ��� ���� ����� �� ��� �������� ������� �� ���
#������ �� ��� �������� � ������� �� /#�" &�*"
��� �3���������� ����� �� � ����� ���� ��� ��� �����
�������� ������������ ��� �������� �� =��" 6 �������� ���� ���
�3��������� ����� ������� �������� �� ������� ����� �3�����
������ ����� ���� /#�" &�*" ����� ����� ���� ��
�3��������� ���� �������� �� � ���� � �������� ���� ��
@": "� ��� �� �>���! "�; " � ��� +��4+�@� �>���
�����! ��� �"� "� ��� �� ��������� �� �������� &��������
���������� ����� �� ��� ���� �� ��� �3���������� ����*" �����
������ �������� ���� ��� ����������� ������� �������� ����
�#������� ������� ��� ������ ������������ &�%����* ��� ���
������� ����������� &�%���* �� ������� �� �������! �������
��� �� /#�" &�*<
������ �� � � ���� ���� ������� ����� ��� ��������� �#������� �������� �3��������
��� �� �������<
& � ������� ������
�������� � ��������
�������� �6�
����� ��� #�������� �� ��� ���������� ���� ������ �����
�������������� ��� J�����K I J�� �K �� � ����� �� ���������
�"
��� ������������� ��������� �� ��� ������� �#�������
��� �� ��������� �� ����� �� ��� �3���������� #������ �
&/#�" &�** �����! ��������� �� ���������� # ��� ��������!
�� �#������� �� ��� ����� �� ��� �������������� �� ��� ���
����� �� ��� ������� �� ��� #��' ���� �� �� ���� ����������!
����� �� ��� ������������ �������"
B� ��� ����� �� ���� �����3�������! �� ��� �����<
� � �����
�����7�
=�����! ���� ��� �������������� ������������ &/#�" &6** ���
����������� ���� ��� �3��������� ��� ����� ���� ��� ���
������ ������������ �� �� ������� ������������� �L����! �� ���
�����<
���� � ���
����� � ���� � � �����@�
����� ����� �� ��� ��������� �3�������� ��� ��� �#�������
�������� �� ��� �� ������� �� � ������� �� ��(� � ��� �L����<
&�� ( ����
�����(� ���������(� �
� � ������(� � �����(� �� �;�
)� ��� ������������� ����� �� � �7 .! ����� ��� ��� ��
����� �� ��� /%)�.% �����������! �� �� �������� ��
�������� ��� ������� �������� �� ����� �������! �� ����
/#�" &;* ��� �� ���������� �#������� �� ��� �#�������
�������� &� �3������� �� ����� �� ������������� ����������
���! ���������! ���� ��� & ���� �� �� �������� �� �������� ���
���� ������ ��� ��� �������� ������� �� �������<
�) � ��* �� & �9���� ������ �� ����� ����������� ��� �������� �� ����� �"
��� ����� �� �) �������� �� ���� ����� ��� ������� �� ���
����� �� ���� ������ �������� ����������" -�����������
���� ���� ����! ���� �� �>���! +��4+�@� �>��� �����!
��� �� ��������� ��� ��������� �� ��������� ����������!
���� ������� ������� ��������� �������������� �����������"
���! �� �#������� �� �>��� �� ������� �������������
�� ��� ������ ��������� &� I @":*! ������� ��� +��4+�@�
�>��� ����� �� ������������� ������� �� ��� ��������
����" '���� ��� ���� ��������� ����������! ��� ���������
�� �� ��������� �� ������������ ���� ������ ���� ���� �� ��
�>���! ��� �� �#������� ���� ������� �� ������� �� �#��
������ �� ���� ��� ���������"
; ���� ���� ���� ������������M�� ������ �������� ���� �������� ��� ���� ������������� ��
���� ������� �� ������� ������ �������� &+�* ���������� ����
������� 7: ��� @� �� �� �� ��� �������� �� � �������� ����
���� ��� ���� ���� �� ��� ������� ������ �� ��� � ������� ��
��� ������ ��� J�%&+��* → ������&+��*K" ��� ����� �3�����
���� ����������� �� ���� ���� �� ����� ���� ������ ���� ���
����� �3�������� ����������� �� ��� �#��� +�� ��� ���
�����#�����! �� ��� �������� ����! �� ����� ��� ������
��� �� ����! ���� ���������� ���� �� ������" ���� �������� ��
���� ��� �� ������ ��� ����������� ������� ��� �����
�������� �� '(�()% ������� ���������� ����������� ���
�� ��������� ��� ������������� ������������� ����"
M����� �� ��� ���������� ����� ����� �� ���� �� ���
���������� ������� �� ��������� ��� �) �� �������� ��
Figure 5. Normalised optical density plotted as function of timefor (a) wild-type azurin and (b) wild-type amicyanin.
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9��
/%) ���� ������������! ���� ����������� ������ ��� ���
�� ������� ��� ����������� �� ��� ���� ��������"
,� �� ��� ���� ��� ����� �� �>��� ����� ���������!
����������� ���� ���� ���� �� �� �>��� ��� ��
���������" ����� �������� ���� ��������� �� ��� ����
��������� ������� �� ���� ��� ��� /%)�.% �����������
&$�B4+$�B$ �<�! �$ �"7*" ��� �������� ���� ���������� ��
���� ����������! ��� ��� �������� ������� �������� ��
��������� ��� ������� ���������� �� ���3 &7:; �� ��� ��
��������� ��� @�7 �� ��� �� �>���* �� � ������� �� ����"
��� ��������������� �� ������� ������� &B,* &=��" 7* ��
������� �� ���� �������� ��� � ��� ��� ���� �������� &=��" 6*!
������� �� �3��������� ���� �������� �� ���� ��������� ����
� �������� ���� �� �������"
��� B, ��� ��� +� ���� �� ��� ��������� ��� �� ��� ��
�������� ��� ������������� �� ��� ���� ! �� �������<
� � ������
� �����
� �����:�
����� ��&* ��� ��L ��� ��� ������� ���������� �� �������
���� ��� �� I ! ������������" �������� ���� ��� ���������
������ ������������� �� /#�" &@*! ���� ����� �� ��� ���������
�3�������� ��� &!� (<
&�� ( �� ���� �+ � ��(� ���
��(� ��� �
/#����� &� * �� �#������� �� ��� �#������� �������� &�
�3������� �� ����� �� ������������� ����������! ��������
���� ��� �������� ������ �� ����� ������� �� ��� �������
�������������� �������� &�� �7 .*" ���������! ��������
���� /#�" &9*! ���� ������ ���������� �� �) �� ��� ��������
�������! ����� �� ���� ���� ���������� ������ �� ��� ��
�������"
��� ������ ��� �������� ��� ��������� �� ����� �! ��
���������� ���� ��� ������������� ������ �������� �� ���
/%)�.% ��������" ����� ������ ���� ���� ����� �� � ����
��������� ������� ��� /%)�.% ��� B, ����������� ���
�� ���������! ������� ��� �� �>��� ��� ��� ������� ��� ���
���� �� ���� �� ���������� ���� ������������" $������! ��
����� �� ����� ���� ��� �������� ���������� ��� �� �� ����
�3���� ������� �� ������ ����������� ������� ��� ����� �������
������������� ��� ��� ������� ���� �� � �7 . ��� �� ���
�����������" ���! �� ������� ���� ��� ������� ������
�������� ���� ��� ��� ���������� ��� �� ����������
��������� ��� ���� ��������� ���� ���������� � ��� � &���
�����* ��� ������������ �������"
";9"5.��;9�
��� ���� ��������� �� ���� ��� ���� ���� ������������ ����
������������ ��� �� ��� �� ������ #���������� �����������
���� ��� ������������� ��������� �� ��������" )� ����! ���
���� ��������� ������� ��� ������������� ���� ��������
�� /%)�.% ��� '(�()% ������� ���������� �����������
����� ��� ����������� �� ��� /%)�.% ��������" .�������!
����� ������ ������ ���� ��� �������� ��� ����������� �� /%)
���� �������! ���� �������� ���� ��������� /%) ���������
����������! ��� ��� �������� �� ����������� ���������� ���
���� ��� ���������� ���� ��� ������������ ����������" )�
���������! �� ��� �������� �� ��������� �#�������
��������� ��� ���� �������� ��� �������� ��������� ��
��������� ���������� ���� /%) ���� �������" )� ����
��������� ����! ��� ���� �������� �� ���� ������ ���� ����
���� �� �>���! +��4+�@� �>��� ����� ��� ��
��������� ��� ��������� �� ��������� ���������� ����
������ �������������� ������� �� ������ �������� �������
���� ��� ������ ��� ��������������" ����� ��������������
������� ����� �� ��� ������� �������� �� ��� �������� ����
���������� �� ��� ������������� ���� ��� ���� �� ��� ������
���"
/%) ���� ������� ���� ���� ��� ������ �� �������
������������� �� ��� ������ ������������ ��� ��� �������
�����������! ���������� ���� ��� �������� ��������������
������� ��� ��� ���������� �� ��� ������������� ���� ���
���������� ��� ������������ ������! �"�" ������� �����
������� �� ������ �����������! �� �3������! ���� � ����������
��������� ��� ��� ��� �������� �� ��� ���� ������������"
���������! ��� ����� �� �) �������� ��� �������� �� ���
��������� ��� ������ �������� �������<
�������� �� ������� � ������
��� �������� ��� �������� �������������� ��� ������
������� ���� ��������� �� ��� ��������� ���������� ���"
����� ������ ���� ���� ���� ��� ����� �������� ��������
����� ������� ��������� �������������� ���������! �� ���������
�� ��� ��������� �) ����� ��������" ��� ���������� �� ���
����� �) ������� �� �>��� ��� +��4+�@� �>���
����� �� ���������� �� ��� ������� �� ��� �������� ������
�� ��� ������� �� ��� ����� ����! ����� ���������� � ����
����� ������������ ��� ��� ����� ���� ���� ������� �� ���
��������� ���� ��� �����#����� �� ������ ���������� �� ���
������ ������������! �������� ��� ������� ���� �� ��� ������
���" ����� ������ ��� ���������� ���� ����� �������� ��������
��� ��� ���� �������� ���� ������������ ��� �������������
�������"6 !6�
=������! �� ������� ���� ��� /%)�.% �������� ��� ���������
Table 1.
/%)�.% B,
��(� �&N,� (*L �) & 4���* ��(� �&&!� (*L �) & 4���*
C�������� �>��� @": "� &�"9�� � �;* �9"� ";�7 " 6 &�"�6� � �@* ��":
+��4+�@� �>��� "�; " � &�":;� � �7* �@"; O O
C�������� ��������� �"� "� &6"��� � �@* � "7 "�@@6 " 7 &�"�� � �7* �9"�
L %������� �����< � ���45
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
�9�6 (" +����� � ���
#���������� ������������� ���� ���� ��������� ���! ��
���������! �� ������� �� ����� �������� ��� ��#���� ���� ���
������ �� ������! �� �� ��� ��������� ����������� �� ����
������������" ���� ��� ����� ����������� ���� ���� ���
����� �� ������ ��������� �������� ��� �� �� ������
������� &'(�()%! -.�! ,%+! +,! ���"*"
/3����������� �� ����� ������ �� ������������� ������
����� ��� ������ �$ �� ����� �� ������ �#������� ���������
��� ���� ������ ��������� �������������� �� ��� ������ �������
������� �� ���� �� ��������� ��������"
��,������������.��� �������� ���� ���� �������� �� �� ��������� �� ���
1���� �� %������������ �� .���� ��� +-�! -��� ; 5%.B�+�2"
���� ��� ��� �������� �� � ����� ���� .'�%�"
8���8�9"��
�" +�������� �/" - ����� .� �:: � 1< �; "�" 0������� 05" )� ���� � /��� ��! +�������� �/ &��*" C" $"=������ +�"< -�� E�� ! �::�� 9�"
�" C��� �! +���� M�" ����� �� �� - ������� �::6� )< ;;"6" .��� .! C��� ." *����� - ����� � � �::7� &*< ��:"7" ������ �! ,�� � �! N���� ." .� 0�� ��� ���� ��������:::� 1*< � "
@" F���� M! 5� E�! $����� ," .� 0�� ����� ��� �::�� 11$< @�:6";" F���� M! 5� E�! $����� ," .� 0�� ����� ��� �::�� 11$< ;9�9"9" $���� +5! .� �F! ,����� ," - ���� ��� �::;� $'<� �9"
:" N���� (! +���� M�" .� 0�� ����� ��� �::�� 11$< 97�6"� " N���� (! +���� M�" .� 0�� ����� ��� �::�� 11)< @��;"��" .��>� '�! +���� %5! +���� M�" 0���� ����� �::�� ')< �"��" N�������� 5! +������� M�! ,����� ," - ���� ��� �::;�
$'< 7776"��" =��� M" .� 0�� ��� ���� ������� �::�� << �76"�6" C������ �5! =��>������ .+" ���� ������� ���� �::;� 1'<
�@7! ��� ���������� ����� �������"�7" .���� �� �,! �������� +(! ������� %/! ,����� +."
/0��- .� �::@� 1*< :�"�@" %���� ,5! ,��� E! P���� P" .� ���� ������� �::;� $&< ��7"�;" .���� �� �! �������� +(! ������� %/! ����� ��! ,�����
+." � ��� �::�� &'&< 9:@"�9" C��� =! ���� Q" - ���� ��� �::@� $)< 6 @:"�:" C����� ,%! �������� �" 0���� ����� �::6� ''< ; @"� " ,��������� N! %���� ,5" 0���� ����� �::@� '=< ��6 "��" ��>� �%! ,��������� N! %���� ,5" .� ���� ������� � � $)<
@��"��" /���� %! ������� %/! �������� +(! ,����� +." - ���� ���
�::6� $$< �� �9"
��" 0�>����� � ." 0��� ���� ������� �::7� 1$< �7;"�6" F��� �� .B! M������� +! =������C! %� � ,! 0�>����� � ."
- ���1���� ����� �::6� )< 79�"�7" %� � ,! .� .! 0�>����� � ." ���� ���� 0��� � � ��0
�::�� =>< 7@� "�@" 0�>����� � .! M������� +! %� � ,! .� .! ����� � ." )�
��� ��� 233 %�������� +$! /����� �- &���*" /����<���������! �::�� 9�"
�;" 0�>����� � .! F��� �� .B" 0���4� ����� +�� ��� ����� �::@�$)< 9 @"
�9" 5�� �! $ 0!.�+������! .����� .�! %����� �N! ��������(" .� 0�� ��� ���� ������� �::;� =< ��6"
�:" 5�� $N! $���� E5! F���� M! $����� " .� ���� ��������::7� $*< ; 9"
� " F���� .! F�� $! +����� 55! %����� $! F������ �$" .�0�� ����� ��� �::7� 11?< � ;@7"
��" F������ �$! $��������� %�! %������5����� N�! /� �� ,!+��� � %�" ���� ���� 0��� � � ��0 �:::� >'< � ��:"
��" 0����� .+! C������ �! M����� .! M�������� �5! M������ �"���� 56� 0��� ���7� ���� ��������� ��� 0�� �� *�� �!,�����! �Q! �� ��8�;��! �:::� @�68@�7"
��" �������� �,! ���������� 0! $�� ��" 0���� ����� �::9� ?*<66�;"
�6" E��� ,%! $�� $E! 5� 5N" ��� � ������� ���� ��������::;� 11< ;@:"
�7" N����� /+! M������� %" 0���� ����� � � ?&< 76��"�@" B���>��� �5�� ��! F������� ,�! %���� �,! 5�� �" .� 0��
����� ��� �::�� 11)< 6�:�"�;" ,��� E! %���� ,5" 0���� ����� �:::� &?'< �7 "�9" ����� /�" )� *�� � � �������� ��� ������� - ������
���������� ��! ���" �" $������� 0. &��*" .��.�����< -��E�� ! �:9@� �86�"
�:" ����� /�" ����� �� �� ���� - ����� �::�� 1< 9:7"6 " 5� ���� +! F����� ,.! .������ ,! F>>� �! %�������� 5" .�
����� ����� �::7� >>< �69@6! ��� ���������� ����� �������"6�" F>>� �! %�������� 5! 5� ���� +! .������ ,! F����� ,.!
(������ .0�! +������ FC" - ������ .� �:::� ??< � 7�! ������������� ����� �������"
6�" N������� N0! C������ %%! 5����� �! ��� �� (�� =.!$������ +C! +������ FC" .� ���� - ��� �::6� &<*< �79"
6�" ������ �! -�� $! .������������ �! N�������� �0! +������FC! ,���� �! .������ =%" .� ���� - ��� �::6� &$'< ��:@"
66" =��� M! .��� .! .��� +N! C��� %=! C�������� +."���� ������� ���� �:: � >< �;"
67" %���� �,! 5�� �! 5�� ��B! M���� .! '����� $�" ����������� ���� �::�� 1*< �7:"
6@" C������ �.! M��� $5! M�������� �5! 0������ %M! M������.�" ���� � � � � � >< ���"
6;" N������ 0" .� ���� ������� � � $)< 9 6"69" N�������� 5! ,����� ," ��� � ������� ���� �������
�::9� 1&< 6�7"6:" /���� %! ,����� �! F������� 5.! N�������� )�" .� ����
������� �:::� $<< ��9:"
+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7
/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9�7