free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass...

9
Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry Vincenzo Cunsolo 1 , Salvatore Foti 1 *, Carmelo La Rosa 1 , Rosaria Saletti 1 , G. W. Canters 2 and M. Ph. Verbeet 2 1 Dipartimento di Scienze Chimiche, Universita ` degli Studi di Catania, Viale A. Doria 6, 95125 Catania, Italy 2 Leiden Institute of Chemistry, Gorleaus Laboratories, Leiden University, P.O. Box 9502, 2300 RA Leiden, The Netherlands Received 13 June 2001; Accepted 2 August 2001 SPONSOR REFEREE: Dr. R. Graham Cooks, Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA An electrospray ionisation ESI) mass spectrometric method for the determination of the free energy DG) of unfolding of proteins is described. The method was tested using three blue copper proteins: wild type azurin, Cys-3Ala/Cys-26Ala C3A/C26A) azurin mutant and wild-type amicyanin. The time course of the denaturation process of the proteins dissolved in methanol/water 50:50, v/v, pH 3.5) was followed by recording ESI mass spectra at time intervals. The spectra showed two series of peaks, corresponding to the native holo-protein and the unfolded apo-protein. From the intensity ratio of these two series of peaks at increasing time and at equilibrium, the free energy for the unfolding process for the three proteins could be determined. To evaluate the reliability of the thermodynamic data obtained by the ESI mass spectrometric approach, the denaturation process was followed by UV-VIS spectroscopy. The two sets of data obtained by these independent methods were in good agreement indicating that the ESI-MS approach can be used to obtain reliable quantitative information about the protein unfolding process. In principle, this approach can be applied to other proteins and requires very low amounts of sample, due to the intrinsic sensitivity of mass spectrometry. This may prove particularly useful when the amount of sample available prevents the use of current methods. Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. The structure and the stability of native proteins are determined by the balance of all non-covalent interactions between the backbone and the side chain of amino acid residues, the covalent inter-chain disulfide bonds and additional interactions between prosthetic groups and water molecules surrounding the protein. These interactions, and consequently the tertiary structure, can be substantially modified by perturbing agents such as denaturants as well as by temperature and pH variations. 1,2 Several methods are commonly employed to study conformational changes of proteins, including optical spec- troscopy UV-VIS), circular dicroism CD), nuclear magnetic resonance NMR), differential scanning calorimetry DSC), and electronic paramagnetic resonance EPR). In recent years, the development of efficient `soft' ionisation methods such as electrospray ionisation ESI) and matrix-assisted laser desorption/ionisation MALDI) has enabled substantial progress to be made in the mass spectrometric characterisation of proteins. 3,4 ESI-MS, with its unique ability to form multiply charged gas-phase ions directly from solution, has been especially useful for studying protein conformation and has emerged as a new technique to investigate the process of protein folding and to characterise non-covalent protein com- plexes. 5±8 In fact, it is generally observed that an unfolded protein in solution leads to the formation of higher charge states than the same protein in its native state. This relationship has been confirmed utilising several different proteins and a variety of denaturing agents. 9±12 The effect has been ascribed to changes in the steric accessibility of possible protonation sites Lys, Arg and His) and to the increased surface area of the unfolded state. 9,11,13 Hence, analysis of charge state distributions in an ESI mass spectrum has been used to reveal new information about the three-dimensional struc- ture of proteins and to provide new insights into protein- folding mechanisms. 14 ESI-MS in combination with H/D exchange alone or coupled with proteolytic reactions has been used to measure the global stability of proteins or to probe dynamic changes that occur in specific regions of a protein molecule. 15±22 In an alternative approach, tertiary structure differences in solu- tion have been probed by the comparative ESI-MS analysis of protein derivatives obtained by selective chemical modifications. 23±27 Several applications of ESI-MS to the determination of binding constants of various complexes formed in solution *Correspondence to : S. Foti, Dipartimento di Scienze Chimiche, Universita Á degli Studi di Catania, Viale A. Doria 6, 95125 Catania, Italy. E-mail: [email protected] Contract/grant sponsor: MURST. Contract/grant sponsor: The Italian Mass Spectrometry Net- work. DOI:10.1002/rcm.439 Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 1817±1825

Upload: vincenzo-cunsolo

Post on 06-Jul-2016

214 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

���� ������ ��� �� �� �� ������ �������� ����������� ������� ��� ���������� ���� � ����������

Vincenzo Cunsolo1, Salvatore Foti1*, Carmelo La Rosa1, Rosaria Saletti1,G. W. Canters2 and M. Ph. Verbeet21Dipartimento di Scienze Chimiche, Universita degli Studi di Catania, Viale A. Doria 6, 95125 Catania, Italy2Leiden Institute of Chemistry, Gorleaus Laboratories, Leiden University, P.O. Box 9502, 2300 RA Leiden, The Netherlands

�������� �� �� � �� �������� � ���� � �

SPONSOR REFEREE: Dr. R. Graham Cooks, Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA

�� ������� ��� ���������� ����� ���� � ����������� ������ ��� ��� ������������� �� ��� ���� ������

���� �� �������� �� ������� �� ��������� ��� ������ ��� ������ ����� ����� �� �� �� ��������

��� �� � � ����! "��#$��%"��#&'�� �"$�%"&'�� � ���� ������ ������#�� � ���������� ��� ����

������ �� ��� ������������ ������ �� ��� ������� �����(�� �� �������%����� �)*�)*! (%(! + $�)�

��� ������ � ��������� ��� ���� � ����� �� ���� �����(��� ��� � ����� ������ ��� ������ ��

��,�! ������ ������ �� ��� ����(� ���# ������ ��� ��� ������� � �# ������� ���� ��� ���������

����� �� ����� ��� ������ �� ��,� �� ���������� ���� ��� �� �-�������! ��� ���� ������ ��� ���

�������� ������ ��� ��� ����� ������� ���� � ����������� �� �(����� ��� �������� �� ���

������������� ���� ������� � ��� ��� ���� � ����������� � �����! ��� ������������ ������ ���

������ � ./#/�� � �������� �� ��� ��� ���� �� ���� ������� � ����� ���� ������ �������

���� �� ���� ��������� ���������� ���� ��� ���#0� � ����� ��� � ���� �� ����� �����

-���������(� ����������� ���� ��� ������ �������� ������� �� ����� �! ���� � ����� ��� �

� ��� �� ����� ������� ��� ��-����� (��� �� ������� �� ��� �! ��� �� ��� ��������� �������(��� ��

���� � ����������� ���� ��� ��(� ��������� ����� ���� ��� ������ �� ��� � �(����

��(���� ��� ��� �� ������� �������� "� ������ � &**1 2��� 3��� 4 ����! 5���

��� ������� ��� ��� ��������� �� ������ �������� ���

���������� �� ��� ������� �� ��� ������������ ������������

������� ��� ��� ���� ��� ��� ���� ����� �� ����� ����

�������! ��� �������� ����������� �������� ����� ���

���������� ������������ ������� ���������� ����� ��� �����

�������� ��������� ��� �������" ����� ������������! ���

�����#����� ��� �������� �������! ��� �� ������������

�������� �� ��������� ������ ��� �� ���������� �� ����

�� �� ���������� ��� �$ ����������"�!�

%������ ������� ��� �������� �������� �� ����

�������������� ������� �� ��������! �������� ������� �����

�������� &'(�()%*! ������� �������� &+,*! ������ ��������

��������� &-.�*! ������������ �������� ����������� &,%+*!

��� ���������� ������������ ��������� &/0�*"

)� ������ �����! ��� ����������� �� ��������� 1����2

���������� ������� ��� �� ������������ ���������� &/%)*

��� �����3��������� ����� ����������4���������� &.�5,)*

��� ������� ���������� �������� �� �� ���� �� ��� ����

������������� ���������������� �� ��������"�!6

/%)�.%! ���� ��� ��#� ������� �� ���� ������� �������

��������� ���� �������� ���� �������! ��� ���� ����������

���� ��� ������� ������� ������������ ��� ��� �������

�� � ��� ������#� �� ����������� ��� ������� �� �������

������� ��� �� ������������ ������������ ������� ����

���3��"789

)� ����! �� �� ��������� �������� ���� �� ������� ������� ��

������� ����� �� ��� ��������� �� ������ ������ ������ ����

��� ���� ������� �� ��� ������ �����" ���� ������������ ���

���� ��������� �������� ������� ��������� �������� ��� �

������� �� ��������� ������":8�� ��� ������ ��� ���� ��������

�� ������� �� ��� ������ ������������� �� �������� �����������

����� &5��! ��� ��� $��* ��� �� ��� ��������� ������ ���� ��

��� ������� �����":!��!�� $����! �������� �� ������ �����

������������ �� �� /%) ���� ������� ��� ���� ��� ��

������ ��� ����������� ���� ��� ����������������� �����

��� �� �������� ��� �� ������� ��� �������� ���� ��������

������� ����������"�6

/%)�.% �� ����������� ���� $4, �3������ ����� ��

������ ���� ����������� ��������� ��� ���� ��� �� ������

��� ������ ��������� �� �������� �� �� ����� ������� �������

���� ���� �� �������� ������� �� � ������� �������"�78�� )� ��

����������� ��������! �������� ������� ����������� �� ����

���� ���� ���� ������ �� ��� ����������� /%)�.% ��������

�� ������� ����������� �������� �� ��������� ��������

�������������"��8�;

%������ ������������ �� /%)�.% �� ��� ������������� ��

������� ��������� �� ������ ������3�� ������ �� �������

*������������� �< %" =���! ,����������� �� %����>� +�������!'���������? ����� %��� �� +������! (���� �" ,���� @! :7��7+������! )����"/�����< �����A������"����"��+�������4����� �������< .'�%�"+�������4����� �������< ��� )������ .��� %����������� -������ "

,B)<� "� �4���"6�: +�������� � � � ��� C���� D %���! 5��"

��0), +B..'-)+��)B-% )- .�%% %0/+��B./��E

��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

Page 2: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

���� �������� ���� ��������"�98�7 -�����������! ��� �� ��

/%)�.% �� ��� ����� �� ������� �������� ��� ��������� ����

�������� �� #��������� ������! ������� ��� ������������� ��

������������� ���� ��� �#������� ��������� �� �������

�� ���� ���� ������������� ������ �� ���� �� �� ������� �����"

$������! ���� ������� ������ ��� ����������� ��� /%)�.%

��� �������� ���� ������ ����������� ��� ��� #����������

������������� �� �#������� �������� �� ���������"�@!�;

C� ������ ���� ��� �� �� /%)�.% �� ������ ���������

����� ���� ��� ��� ������������� �� ��� ���� ������ &�F* ���������� �� ��������" ��� �������� ��� ������ ���� �����

�������� ��������� �� ��� ������3�� ������!�9!�: �"�" �����

���� &��* �>���!6 +��4+�@� �>��� �����!6� ��� ��

���������"6�!6�

�>��� ��� ��������� ��� �� �������� �������� ������� ��

��� ����3 ������ �� ������� ��������" �>��� ��� ��9 �����

���� ������� ��� �������� � �������� ������ ����������

+���� ��� +����@ ��� � ������ +�� ���� ) ������! ���� F���

67! $���6@! +������! $�����;! .������ �� ����� �������" ���

�������� ���� �� ��� ����� ��� ����� ���� �� ��� �������

��������������� ���������� �%&+��* → ������&+��*! ����� ��

��������� ����������� ��� ��� ���������� �� @�7 ��"

)� ��� +��4+�@� �>��� �����! �������� �� �����������

����������! ���� ��������� ���� ���� �������� ���� �������

�������" ��� ����� ���������� �� +���� ��� +����@ ����

������� ������� ���� ��� ������ ��� ������� ��������

������� �� +��4+�@� �>��� ����� ���� ������� �� ���

�� �������" )������! ��� ������������� �����#����� �� ���

������� �� ��� �������� ���� ��� ������������! �������� �� �

�������� �������� �� ��� ������������� ��������� �� ���

�������"6�

��������� ��� � @ ����� ���� ������� ��� �������� �

������ +�� ���� ) ������! ���� $���76! +���:�! $���:@! .���::

�� ����� �������"

�67�8�0�9��5

0������ ��� ������������� ����! $05+ ����� ����� ��� �������� ���� ��������

�� 5���%��� &,����! )������*"

5���������� ��������� �>��� ���� ����������� ����� ����

��� �������� ���� %������������ &.����! )����*" +�������

����! ������� ��� ��������� �� ��� +��4+�@� �>��� �����

��� ������� �� �� F������ 5����������� �� ��� 5�����

)������� �� +��������! �� ��������� ���������"6� ���

������� ������� ��������� ��� �������� ��� �����3�����

���� �� �� �� ������ .� :" =�� ��� �3�������� ���

����������� �� ��� ����������� ��������� � ������������

�������� ��� �������� �� ��������� ���������"6�

��� ����� ��� ����� ��������� �� ��� �������! �����

��������� ���� ��� ������������ ���������� �������! ����

������� �� ��� �� �� �������� �������� ���� � ��������

������ ������ � ,� &%������40�� @* �������� ����

0������� F����� &.����! )����*"

0��� � ����������/%)�.% �������� ���� ��������� ���� � =������� 5+G�,���

���������! ���� ��� ���� ����� ���������� ��� ��� �����

��������" 0������ �������� ���� ������ �� � �54���" ���

��������� ���������� ��� ���������� �� ��7°+" .���

������� ���� ��#���� �� �������� ��� ���� �� ��������

���� ; �� � ,� ��� ���� �� ������ ����� ����

��������"

%������ ��� ���� ������������� �������� ���� �������� ��

���������� ����� ������� ���� � ��������4����� �������

&7 <7 ! �4�* �� � ������������� �� �����3������� � �7 ." ���

�$ ��� ��H���� �� �"7 �� ������ ������ ����" %������� ����

���������� �� ���� ���������� ��� /%) ���� ������� ����

�������� �� ���� ��������� &� ���! � �! � �! � �! @ �! : �! �6 �!

�� �*"

./#/�� � �������� ���� ������� ���������� ����������� ���� ������� �� ����

� ���� (�7� �����������������" G���> ������� ���� ����

������� ���� ���� ��� ��������"

,� �� ��� ���� ��� ����� �� �>��� ����� ���������!

����������� ���� ������� �� ���� �� �� �>��� ��� ��

���������" %������ ��� '(�()% ����������� ���� ����

����� �� ��� ���� ��������� ������� ��� ��� /%)�.%

�������� �� � ������������� �� �����3������� � �7 ." '(�()%

����������� ���� ������� �� �� ���� ����������

��������� ������� ���������� ��������� �� ���3 &7:; �� ���

�� ��������� ��� @�7 �� ��� �� �>���* �� ���������� �����"

:��� ���������� ���� ����� �� ��� �������� ������� ��� �������� ��

��� #������ �� ��� �������� �! ����� �� ������� �� ��� �����

������� ��� �� �� ��� ������� ��������� �� ��� �������

������������� �� ��� ������ ������������ &� &������** ��� ���

�� �� ��� ������� ��������� �� ��� ������� ������������� ��

��� ������� ����������� &� &�����**<

� � � ��������� �������

���

��� ����� �� ������� � ��� ������� ������� &��* �����

���� ���� ������ �� �3��������� ����� &����������� ��������*

���� ��� ��������� �#����� &�������� ��� �*<

��� � ���� � ��� � ������ ���� ���

����� �& *! �&* ��� �&�* ���������� �� ��� ���� �� ���

#������ �� ��� �������� �� I ! �� ������� ���� ! ��� �� I�!

������������" � ������3 ��������� �� 5���������.��#����

��� ��� �� �������� ��� � �������" ��� �3����������

����� �� � ��� ���� ���� ���� �������� �� �������� �� �����

����������� �����������"

8��.5�� �9: :��".���;9

���#0� ����������������� �������� �������! �������� �� ���������� ����� ��� ����

������� ������������! ��� �������� �� �3������ �� =��� �8�"

��� /%) ���� ������� �� �� �>��� �������� �� � ���

&=��" �&�** ����� ���� ������� �� �!" ���7"�! � �":! �;7�"7!

�77;" ��� �6 �"6! ������������� �� ��� ������������ ����

�� ��� ������ ������� ���������� ��� +�� ��� &������������*!

�������� @! ;! 9! : ��� � �������! ������������" )� ����!

������������66!67 �� ���� ������ �� ���� ���� � ���� ���� ��

�6 6"@ ,� ������������� �� ��� ������>��� &��������� ��

�6 7"� ,�*"

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

�9�9 (" +����� � ���

Page 3: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

� ������ ������ �� ��� � �� ������� �� ��� ����� ���� �����

���� ��� ���������" ,����������� �� ��� ������� �������

���� �� ���� ������ ��������� ���� ����� ������� ���������� �� �

������� �� ����� ��� +�� ��� �� ���� &�����������*" ���

������ ����������� ���� ����� ������� ���� ��� ����������� ��

������������ ������� ���� ������� �� ��� ���������"

������� �������� �� ��� /%) ���� ������� �������� �� ������

����� &=��� �&�* ��� �&�** ����� � ������ �������� �� ���

�������� ��������� �� ��� ������� ������������� �� ���

������� �����������"

��� /%) ���� ������� ��� +��4+�@� �>��� �����

�������� �� � ��� &=��" �&�** ���� ����� ��� ������ �� ��� �!

������������� �� ��� ������ ������������ ��� �� ��� �������

�����������! ������������" $������! ��� ���� �������! ��� /%)

���� ������� �������� �� ������ ����� &=��� �&�* ��� �&�**

���� � ����� ���� �������� �� ��� �������� ��������� �� ���

������� ������������� �� ��� ������� �����������! ��������

��� ���� �� ���� ���� ��� ����������� ������� ����� �� �

������ ����" ���� ����� �� ��������� ����������� �� ��� �������

�� ��� �������� ������ �� ��� ������� �� ��� ����� ����"

��� ������� �� ���� ��������� �������� ������� ������ �

���� ����� ������������ ��� ��� +��4+�@� �>��� �����

Figure 1. ESI mass spectra of wild-type azurin in H2O/CH3OH 1:1, pH 3.5, recorded at (a)30 min, (b) 3 h, and (c) 24 h. Peaks corresponding to the holo-form and unfolded apo-proteinare labelled N and U, respectively.

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9�:

Page 4: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

���� ������� �� ��� ��������� ����! ��� �����#����� ��

������ ���������� �� ��� ������ ������������! �������� ���

������� ���� �� ��� ������ ���"

��� /%) ���� ������� �������� �� ��������� ����� ��� ��

��������� ��� ������� �� ��� /%) ���� ������� �������� ���

��� ������� ��� ��������" )� ����! ��� /%) ���� ������� ���

�� ��������� �������� �� � ��� &=��" �&�** ���� ����� ���

������ �� ��� �! ������������� �� ��� ������ ������������ ���

�� ��� ������� �����������! ������������" .�������! ���

�������� ��������� �� ��� ������� ������������� �� ���

������� ����������� ��������� ������������ �� ��� /%) ����

������� �������� �� ������ ����� &=��� �&�* ��� �&�**"

=�� ��� ��� �������� ������������! ����������� �3���������

������ ���� � �������� ��������� ������� ����� ����

������� �� ����� ��������! ��������� ��������� �� ���

��������� ���������� ������� ��� /%)�.% ��������! ����

����>������� ��� �#��������� �� $�B �� ������ �$"

�������������� ���� �������������/����������� ���� ������� �������� �� ���� ��������� ��� ��

�>���! +��4+�@� �>��� ����� ��� �� ���������!

��������� �� ��������� ����������! ������ ���� �����

�������� ������ �������������� ������� �� ��� ������

�������� ������� ���� ��� ������ ��� ��������������"

Figure 2. ESI mass spectra of C3A/C26A azurin mutant in H2O/CH3OH 1:1, pH 3.5, recordedat (a) 30 min, (b) 3 h, and (c) 24 h. Peaks corresponding to the holo-form and unfolded apo-protein are labelled N and U, respectively.

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

�9� (" +����� � ���

Page 5: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

����� �������������� ������� ����� �� ��� ������� ��������

�� ��� ��������! ���� ���������� �� ��� ������������� ����

��� ���� �� ��� ������ ���"

)� ����� �� ������ ������������� ����� ���� ��� /%)�.%

����! ��� ��������� ���������� ��� �� ����<6@

�� '������� ����������� ��� ������ ���������� �������

������ ��� ���� /%) ������� ��� ���� ��� ����

�������� �� ������������ �����������

#� ��� ����� ������ ��� ���� ������� �� ������������ �� ���

������������� �� ��� ��� ������

� ��� ������������� �� ��� ��� ����� �� ������������ ��

������������� �� �������� ���

�� -� ����� ���� ��� �� ���� �� ��� ����� �������"

)� �� ����� ������ ���� ���� �� ����� ����������! �"�"! # ���

! ���� ���� ���������6; �������� ����� ���������� �����

���� ��� ����� ���� �������� ������ ��� ���� ������� ��

������������ �� ��� ������������� �� �#������� �� ��� ��

�������" $������! ���� ����� ���������� �� ���������

����� ��� �� �������" =�� ��������! �� �������� �� ���������

�! �� �� �� ��� ���� ��� ������ ��� ��� ������� �������� ���

Figure 3. ESI mass spectra of wild-type amicyanin in H2O/CH3OH 1:1, pH 3.5, recorded at (a)30 min, (b) 3 h, and (c) 24 h. Peaks corresponding to the holo-form and unfolded apo-proteinare labelled N and U, respectively.

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9��

Page 6: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

���� ��������� ������� �� ������� ��� ��� ������ �����

���������������! �������� �� ��������� ���� �������� ���

�������" ����! �� �� �������� ���� �������� �������� ���������

��� ���� ������� ��� +�� ��� ��� ����� ���� ���� ������

�� ��� ������� ��#����! ������� �� �3���������� ��������

��� ���� ����3 ������� ��� ��������"

.�������! �� ����� �� ���������� ���� ��� �����������

�������� ���� ���� �� � ������ �� � ��������� �������" �

��������� ������� ��� ������� ����������� �� ��� �������

�������� �� ���� �� ��� ����� ��� ��! �������������! ���� �� ���

����� ��� ��� ����#��� ����������� �� ��� �������" ���

/%) ���� ������� �� ��� ����� �������� ������������ ���� ����

���� ��� ������ �� ������� ������������� �� ��� ������ �����

������� ��� ��� ������� �����������" ����� ������ ������

���� ��� �������� �������������� ������� ��� ��� �������

���� �� ��� ����� ������� ���� ��� ����������� ����������" )�

����! �� ����������� ��������� ����������� ������� ����

�������� � ����� ������ �� ������� ������������� �� ���

������� ������������ �� �� ��� ������ �����������! ��

�������� ���� ��� ����������� ������� �������� ������

������� ������"69!6:

������� ���� ��� ����� ���������� �$� ��� �������! ���

Figure 4. Q value plotted as function of time for (a) wild-type azurin, (b) C3A/C26A azurinmutant, and (c) wild-type amicyanin.

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

�9�� (" +����� � ���

Page 7: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

����������� � ������ ���� ����������� �������! �� �� ��������

�� ������ ��� ���� ����� �� ��� �������� ������� �� ���

#������ �� ��� �������� � ������� �� /#�" &�*"

��� �3���������� ����� �� � ����� ���� ��� ��� �����

�������� ������������ ��� �������� �� =��" 6 �������� ���� ���

�3��������� ����� ������� �������� �� ������� ����� �3�����

������ ����� ���� /#�" &�*" ����� ����� ���� ��

�3��������� ���� �������� �� � ���� � �������� ���� ��

@": "� ��� �� �>���! "�; " � ��� +��4+�@� �>���

�����! ��� �"� "� ��� �� ��������� �� �������� &��������

���������� ����� �� ��� ���� �� ��� �3���������� ����*" �����

������ �������� ���� ��� ����������� ������� �������� ����

�#������� ������� ��� ������ ������������ &�%����* ��� ���

������� ����������� &�%���* �� ������� �� �������! �������

��� �� /#�" &�*<

������ �� � � ���� ���� ������� ����� ��� ��������� �#������� �������� �3��������

��� �� �������<

& � ������� ������

�������� � ��������

�������� �6�

����� ��� #�������� �� ��� ���������� ���� ������ �����

�������������� ��� J�����K I J�� �K �� � ����� �� ���������

�"

��� ������������� ��������� �� ��� ������� �#�������

��� �� ��������� �� ����� �� ��� �3���������� #������ �

&/#�" &�** �����! ��������� �� ���������� # ��� ��������!

�� �#������� �� ��� ����� �� ��� �������������� �� ��� ���

����� �� ��� ������� �� ��� #��' ���� �� �� ���� ����������!

����� �� ��� ������������ �������"

B� ��� ����� �� ���� �����3�������! �� ��� �����<

� � �����

�����7�

=�����! ���� ��� �������������� ������������ &/#�" &6** ���

����������� ���� ��� �3��������� ��� ����� ���� ��� ���

������ ������������ �� �� ������� ������������� �L����! �� ���

�����<

���� � ���

����� � ���� � � �����@�

����� ����� �� ��� ��������� �3�������� ��� ��� �#�������

�������� �� ��� �� ������� �� � ������� �� ��(� � ��� �L����<

&�� ( ����

�����(� ���������(� �

� � ������(� � �����(� �� �;�

)� ��� ������������� ����� �� � �7 .! ����� ��� ��� ��

����� �� ��� /%)�.% �����������! �� �� �������� ��

�������� ��� ������� �������� �� ����� �������! �� ����

/#�" &;* ��� �� ���������� �#������� �� ��� �#�������

�������� &� �3������� �� ����� �� ������������� ����������

���! ���������! ���� ��� & ���� �� �� �������� �� �������� ���

���� ������ ��� ��� �������� ������� �� �������<

�) � ��* �� & �9���� ������ �� ����� ����������� ��� �������� �� ����� �"

��� ����� �� �) �������� �� ���� ����� ��� ������� �� ���

����� �� ���� ������ �������� ����������" -�����������

���� ���� ����! ���� �� �>���! +��4+�@� �>��� �����!

��� �� ��������� ��� ��������� �� ��������� ����������!

���� ������� ������� ��������� �������������� �����������"

���! �� �#������� �� �>��� �� ������� �������������

�� ��� ������ ��������� &� I @":*! ������� ��� +��4+�@�

�>��� ����� �� ������������� ������� �� ��� ��������

����" '���� ��� ���� ��������� ����������! ��� ���������

�� �� ��������� �� ������������ ���� ������ ���� ���� �� ��

�>���! ��� �� �#������� ���� ������� �� ������� �� �#��

������ �� ���� ��� ���������"

; ���� ���� ���� ������������M�� ������ �������� ���� �������� ��� ���� ������������� ��

���� ������� �� ������� ������ �������� &+�* ���������� ����

������� 7: ��� @� �� �� �� ��� �������� �� � �������� ����

���� ��� ���� ���� �� ��� ������� ������ �� ��� � ������� ��

��� ������ ��� J�%&+��* → ������&+��*K" ��� ����� �3�����

���� ����������� �� ���� ���� �� ����� ���� ������ ���� ���

����� �3�������� ����������� �� ��� �#��� +�� ��� ���

�����#�����! �� ��� �������� ����! �� ����� ��� ������

��� �� ����! ���� ���������� ���� �� ������" ���� �������� ��

���� ��� �� ������ ��� ����������� ������� ��� �����

�������� �� '(�()% ������� ���������� ����������� ���

�� ��������� ��� ������������� ������������� ����"

M����� �� ��� ���������� ����� ����� �� ���� �� ���

���������� ������� �� ��������� ��� �) �� �������� ��

Figure 5. Normalised optical density plotted as function of timefor (a) wild-type azurin and (b) wild-type amicyanin.

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9��

Page 8: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

/%) ���� ������������! ���� ����������� ������ ��� ���

�� ������� ��� ����������� �� ��� ���� ��������"

,� �� ��� ���� ��� ����� �� �>��� ����� ���������!

����������� ���� ���� ���� �� �� �>��� ��� ��

���������" ����� �������� ���� ��������� �� ��� ����

��������� ������� �� ���� ��� ��� /%)�.% �����������

&$�B4+$�B$ �<�! �$ �"7*" ��� �������� ���� ���������� ��

���� ����������! ��� ��� �������� ������� �������� ��

��������� ��� ������� ���������� �� ���3 &7:; �� ��� ��

��������� ��� @�7 �� ��� �� �>���* �� � ������� �� ����"

��� ��������������� �� ������� ������� &B,* &=��" 7* ��

������� �� ���� �������� ��� � ��� ��� ���� �������� &=��" 6*!

������� �� �3��������� ���� �������� �� ���� ��������� ����

� �������� ���� �� �������"

��� B, ��� ��� +� ���� �� ��� ��������� ��� �� ��� ��

�������� ��� ������������� �� ��� ���� ! �� �������<

� � ������

� �����

� �����:�

����� ��&* ��� ��L ��� ��� ������� ���������� �� �������

���� ��� �� I ! ������������" �������� ���� ��� ���������

������ ������������� �� /#�" &@*! ���� ����� �� ��� ���������

�3�������� ��� &!� (<

&�� ( �� ���� �+ � ��(� ���

��(� ��� �

/#����� &� * �� �#������� �� ��� �#������� �������� &�

�3������� �� ����� �� ������������� ����������! ��������

���� ��� �������� ������ �� ����� ������� �� ��� �������

�������������� �������� &�� �7 .*" ���������! ��������

���� /#�" &9*! ���� ������ ���������� �� �) �� ��� ��������

�������! ����� �� ���� ���� ���������� ������ �� ��� ��

�������"

��� ������ ��� �������� ��� ��������� �� ����� �! ��

���������� ���� ��� ������������� ������ �������� �� ���

/%)�.% ��������" ����� ������ ���� ���� ����� �� � ����

��������� ������� ��� /%)�.% ��� B, ����������� ���

�� ���������! ������� ��� �� �>��� ��� ��� ������� ��� ���

���� �� ���� �� ���������� ���� ������������" $������! ��

����� �� ����� ���� ��� �������� ���������� ��� �� �� ����

�3���� ������� �� ������ ����������� ������� ��� ����� �������

������������� ��� ��� ������� ���� �� � �7 . ��� �� ���

�����������" ���! �� ������� ���� ��� ������� ������

�������� ���� ��� ��� ���������� ��� �� ����������

��������� ��� ���� ��������� ���� ���������� � ��� � &���

�����* ��� ������������ �������"

";9"5.��;9�

��� ���� ��������� �� ���� ��� ���� ���� ������������ ����

������������ ��� �� ��� �� ������ #���������� �����������

���� ��� ������������� ��������� �� ��������" )� ����! ���

���� ��������� ������� ��� ������������� ���� ��������

�� /%)�.% ��� '(�()% ������� ���������� �����������

����� ��� ����������� �� ��� /%)�.% ��������" .�������!

����� ������ ������ ���� ��� �������� ��� ����������� �� /%)

���� �������! ���� �������� ���� ��������� /%) ���������

����������! ��� ��� �������� �� ����������� ���������� ���

���� ��� ���������� ���� ��� ������������ ����������" )�

���������! �� ��� �������� �� ��������� �#�������

��������� ��� ���� �������� ��� �������� ��������� ��

��������� ���������� ���� /%) ���� �������" )� ����

��������� ����! ��� ���� �������� �� ���� ������ ���� ����

���� �� �>���! +��4+�@� �>��� ����� ��� ��

��������� ��� ��������� �� ��������� ���������� ����

������ �������������� ������� �� ������ �������� �������

���� ��� ������ ��� ��������������" ����� ��������������

������� ����� �� ��� ������� �������� �� ��� �������� ����

���������� �� ��� ������������� ���� ��� ���� �� ��� ������

���"

/%) ���� ������� ���� ���� ��� ������ �� �������

������������� �� ��� ������ ������������ ��� ��� �������

�����������! ���������� ���� ��� �������� ��������������

������� ��� ��� ���������� �� ��� ������������� ���� ���

���������� ��� ������������ ������! �"�" ������� �����

������� �� ������ �����������! �� �3������! ���� � ����������

��������� ��� ��� ��� �������� �� ��� ���� ������������"

���������! ��� ����� �� �) �������� ��� �������� �� ���

��������� ��� ������ �������� �������<

�������� �� ������� � ������

��� �������� ��� �������� �������������� ��� ������

������� ���� ��������� �� ��� ��������� ���������� ���"

����� ������ ���� ���� ���� ��� ����� �������� ��������

����� ������� ��������� �������������� ���������! �� ���������

�� ��� ��������� �) ����� ��������" ��� ���������� �� ���

����� �) ������� �� �>��� ��� +��4+�@� �>���

����� �� ���������� �� ��� ������� �� ��� �������� ������

�� ��� ������� �� ��� ����� ����! ����� ���������� � ����

����� ������������ ��� ��� ����� ���� ���� ������� �� ���

��������� ���� ��� �����#����� �� ������ ���������� �� ���

������ ������������! �������� ��� ������� ���� �� ��� ������

���" ����� ������ ��� ���������� ���� ����� �������� ��������

��� ��� ���� �������� ���� ������������ ��� �������������

�������"6 !6�

=������! �� ������� ���� ��� /%)�.% �������� ��� ���������

Table 1.

/%)�.% B,

��(� �&N,� (*L �) & 4���* ��(� �&&!� (*L �) & 4���*

C�������� �>��� @": "� &�"9�� � �;* �9"� ";�7 " 6 &�"�6� � �@* ��":

+��4+�@� �>��� "�; " � &�":;� � �7* �@"; O O

C�������� ��������� �"� "� &6"��� � �@* � "7 "�@@6 " 7 &�"�� � �7* �9"�

L %������� �����< � ���45

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

�9�6 (" +����� � ���

Page 9: Free energy for blue copper protein unfolding determined by electrospray ionisation mass spectrometry

#���������� ������������� ���� ���� ��������� ���! ��

���������! �� ������� �� ����� �������� ��� ��#���� ���� ���

������ �� ������! �� �� ��� ��������� ����������� �� ����

������������" ���� ��� ����� ����������� ���� ���� ���

����� �� ������ ��������� �������� ��� �� �� ������

������� &'(�()%! -.�! ,%+! +,! ���"*"

/3����������� �� ����� ������ �� ������������� ������

����� ��� ������ �$ �� ����� �� ������ �#������� ���������

��� ���� ������ ��������� �������������� �� ��� ������ �������

������� �� ���� �� ��������� ��������"

��,������������.��� �������� ���� ���� �������� �� �� ��������� �� ���

1���� �� %������������ �� .���� ��� +-�! -��� ; 5%.B�+�2"

���� ��� ��� �������� �� � ����� ���� .'�%�"

8���8�9"��

�" +�������� �/" - ����� .� �:: � 1< �; "�" 0������� 05" )� ���� � /��� ��! +�������� �/ &��*" C" $"=������ +�"< -�� E�� ! �::�� 9�"

�" C��� �! +���� M�" ����� �� �� - ������� �::6� )< ;;"6" .��� .! C��� ." *����� - ����� � � �::7� &*< ��:"7" ������ �! ,�� � �! N���� ." .� 0�� ��� ���� ��������:::� 1*< � "

@" F���� M! 5� E�! $����� ," .� 0�� ����� ��� �::�� 11$< @�:6";" F���� M! 5� E�! $����� ," .� 0�� ����� ��� �::�� 11$< ;9�9"9" $���� +5! .� �F! ,����� ," - ���� ��� �::;� $'<� �9"

:" N���� (! +���� M�" .� 0�� ����� ��� �::�� 11$< 97�6"� " N���� (! +���� M�" .� 0�� ����� ��� �::�� 11)< @��;"��" .��>� '�! +���� %5! +���� M�" 0���� ����� �::�� ')< �"��" N�������� 5! +������� M�! ,����� ," - ���� ��� �::;�

$'< 7776"��" =��� M" .� 0�� ��� ���� ������� �::�� << �76"�6" C������ �5! =��>������ .+" ���� ������� ���� �::;� 1'<

�@7! ��� ���������� ����� �������"�7" .���� �� �,! �������� +(! ������� %/! ,����� +."

/0��- .� �::@� 1*< :�"�@" %���� ,5! ,��� E! P���� P" .� ���� ������� �::;� $&< ��7"�;" .���� �� �! �������� +(! ������� %/! ����� ��! ,�����

+." � ��� �::�� &'&< 9:@"�9" C��� =! ���� Q" - ���� ��� �::@� $)< 6 @:"�:" C����� ,%! �������� �" 0���� ����� �::6� ''< ; @"� " ,��������� N! %���� ,5" 0���� ����� �::@� '=< ��6 "��" ��>� �%! ,��������� N! %���� ,5" .� ���� ������� � � $)<

@��"��" /���� %! ������� %/! �������� +(! ,����� +." - ���� ���

�::6� $$< �� �9"

��" 0�>����� � ." 0��� ���� ������� �::7� 1$< �7;"�6" F��� �� .B! M������� +! =������C! %� � ,! 0�>����� � ."

- ���1���� ����� �::6� )< 79�"�7" %� � ,! .� .! 0�>����� � ." ���� ���� 0��� � � ��0

�::�� =>< 7@� "�@" 0�>����� � .! M������� +! %� � ,! .� .! ����� � ." )�

��� ��� 233 %�������� +$! /����� �- &���*" /����<���������! �::�� 9�"

�;" 0�>����� � .! F��� �� .B" 0���4� ����� +�� ��� ����� �::@�$)< 9 @"

�9" 5�� �! $ 0!.�+������! .����� .�! %����� �N! ��������(" .� 0�� ��� ���� ������� �::;� =< ��6"

�:" 5�� $N! $���� E5! F���� M! $����� " .� ���� ��������::7� $*< ; 9"

� " F���� .! F�� $! +����� 55! %����� $! F������ �$" .�0�� ����� ��� �::7� 11?< � ;@7"

��" F������ �$! $��������� %�! %������5����� N�! /� �� ,!+��� � %�" ���� ���� 0��� � � ��0 �:::� >'< � ��:"

��" 0����� .+! C������ �! M����� .! M�������� �5! M������ �"���� 56� 0��� ���7� ���� ��������� ��� 0�� �� *�� �!,�����! �Q! �� ��8�;��! �:::� @�68@�7"

��" �������� �,! ���������� 0! $�� ��" 0���� ����� �::9� ?*<66�;"

�6" E��� ,%! $�� $E! 5� 5N" ��� � ������� ���� ��������::;� 11< ;@:"

�7" N����� /+! M������� %" 0���� ����� � � ?&< 76��"�@" B���>��� �5�� ��! F������� ,�! %���� �,! 5�� �" .� 0��

����� ��� �::�� 11)< 6�:�"�;" ,��� E! %���� ,5" 0���� ����� �:::� &?'< �7 "�9" ����� /�" )� *�� � � �������� ��� ������� - ������

���������� ��! ���" �" $������� 0. &��*" .��.�����< -��E�� ! �:9@� �86�"

�:" ����� /�" ����� �� �� ���� - ����� �::�� 1< 9:7"6 " 5� ���� +! F����� ,.! .������ ,! F>>� �! %�������� 5" .�

����� ����� �::7� >>< �69@6! ��� ���������� ����� �������"6�" F>>� �! %�������� 5! 5� ���� +! .������ ,! F����� ,.!

(������ .0�! +������ FC" - ������ .� �:::� ??< � 7�! ������������� ����� �������"

6�" N������� N0! C������ %%! 5����� �! ��� �� (�� =.!$������ +C! +������ FC" .� ���� - ��� �::6� &<*< �79"

6�" ������ �! -�� $! .������������ �! N�������� �0! +������FC! ,���� �! .������ =%" .� ���� - ��� �::6� &$'< ��:@"

66" =��� M! .��� .! .��� +N! C��� %=! C�������� +."���� ������� ���� �:: � >< �;"

67" %���� �,! 5�� �! 5�� ��B! M���� .! '����� $�" ����������� ���� �::�� 1*< �7:"

6@" C������ �.! M��� $5! M�������� �5! 0������ %M! M������.�" ���� � � � � � >< ���"

6;" N������ 0" .� ���� ������� � � $)< 9 6"69" N�������� 5! ,����� ," ��� � ������� ���� �������

�::9� 1&< 6�7"6:" /���� %! ,����� �! F������� 5.! N�������� )�" .� ����

������� �:::� $<< ��9:"

+�������� � � � ��� C���� D %���! 5��" ��� � ������� ���� ������� � �� 1)< �9�;8�9�7

/%�.% ������������� �� ���� ������ ������ ��� ������� �������� �9�7