Gabriel Fazito - Gabriela Flávia - Nathália Vieira - Sávio Cicco -

Vinícius Cotta

LINE 1 (L1) -Long interspersed nuclear element

- Sequências altamente repetitivas

- 6k-8k pares de bases

- Retrotransposon

- ~ 20% do genoma consiste de sequências de LINE1

- ORF1 (proteína que se liga ao RNA – chaperona)

- ORF2 (transcriptase reversa e endonuclease)

Fonte: http://www.eb.tuebingen.mpg.de/news/Cycle_english.jpg

Ciclo de retrotransposição do elemento LINE1 humano

“Full-lenght” L1

- Existem ~ 7.000 (304 = subfamília L1Hs)

- L1Hs: 5’ UTR conservado, com ~900bp que contém um promotor interno de RNA polimerase II

- Os locais de ligação para RUNX3, SRY e YY1 nos bp iniciais do UTR são importantes para a expressão adequada do transcrito

- Atividade de YY1 promove o início da transcrição

- L1s propagam-se através de transcrição reversa do transcrito primário e se integra ao genoma

- Este processo é ineficiente, então a maioria dos produtos são truncados 5’ (contendo apenas a parte 3’ do elemento)

- Elementos ancestrais e truncados perderam a habilidade de retrotranspor, porém os mais recentes evolucionariamente são ativos (locais de inserção polimórficos)

- Pelo menos 40 elementos L1Hs são capazes de realizar retrotransposição

- Elementos que perderam ORF1 e 2 interferem na regulação transcricional

L1s

Trans-mobilização de sequências como Alus e SVAs

Recrutamento da metilação do DNA e na formação da

heterocromatina no cromossomo X inativo

L1s em tecidos somáticos pareciam ser quiescentes (silenciados por metilação de

citosina e modificação de histona)

L1s expressos geralmente são abortados prematuramente por splicing interno ou

poliadenilação

Todo L1 sofre supressão?

L1 pode ser transcrito e móvel

- quantos?

Objetivo:

Ver o número e a natureza dos elementos L1 que contribuem para o transcriptoma de células somáticas

Materiais e Métodos

Resultados

Linhagem celular de linfoblastóide

Isolamento do DNA genômico e RNAT total

(KIT)

Isolamento de expression tag

(3’RACE e 5’RACE – Rapid Amplification of cDNA ends )

Clonados e sequenciados (Sanger)

3’RACE

Primer inicial antisenso (c/ seq de extensão específica 5’ = âncora)

Incorporado na etapa da transcriptase reversa

Primer senso p/ gerar seq complementar à seq original da âncora

PCR é iniciada usando primer senso interno e primer da seq âncora

5’RACE

Primer inicial antisenso interno

Poly(dA) é adicionada no 3’end do cDNA com transferase terminal

Primer senso com seq específica de extensão (âncora) – fita molde

PCR é iniciada usando primer interno e primer da seq âncora

RT-PCR quantitativo

Pirosequenciamento (5’RACE)

Análises Bioinformáticas

Resultados

Caracterização das Etiquetas de Expressão de

L1

Construção das Tag's:

Isolamento de etiquetas de expressão 3' derivada de

transcritos L1

A expressão de L1 não termina exatamente no fim do elemento.

Ocorre a geração de Etiquetas diferenciadas em tamanho mas em constituição são altamente semelhantes (baixa complexidade).

De um modo geral, obteve-se 2.152 seqüências da região estudada de um indivíduo Euro-Americano.

1.148 etiquetas foram únicas no genoma de referência, representando 204 sítios distintos e 54 dos quais representaram o elemento inteiro.

Prediu-se 363 sítios de expressão.38 etiquetas não puderam ser mapeados adjacente a

um elemento no genoma.

Etiquetas pequenas localizadas em média a 34 nucleotídeos de distância do fim do elemento de referência. E 75% dos sítios etiquetados encerrou a transcrição menos 40nt's do fim do elemento.

Além da primeira amostragem, dois afro-americanos, dois afro-americanos, um mulçumano, e dois euro-americanos parente do primeiro indivíduo forneceram amostras para análise.

No total, 3.828 tags de expressão foram obtidas, compreendendo 1.592 seqüências correspondendo a 271 sítios únicos.

Desses sítios, 228 correspondem um elemento L1 do genoma de referência e o restante (43) não foram mapeados podendo apresentar polimorfismos privados de inserção.

Além disso, 63 elementos inteiros foram encontrados no genoma de referência. E desses, 30 foram encontrados inseridos em genes, onde a maioria encontrava-se na mesma orientação, indicando a possibilidade de atuarem como efetores laterais de transcrição desses genes.

Sete elementos inteiros continham as duas ORF's intactas e portanto competentes para a retrotranposição. E 4 elementos continham potencialmente ORF2 ativas na ausência da ORF1.

Isolamento de etiquetas de expressão 5' derivada de transcritos

L1

De um modo geral, obteve-se 36.088 seqüências das quais 14.488 correspondiam a 427 locais no genoma de referência.

Prediu-se 429 sítios, indicando que esses loci compreenderam a maioria dos sítios expressos do indivíduo.

Encontrou-se 6 elementos inteiros sobrepostos àqueles encontrados pela análise 3'. Isso ocorre pois os 3' tags são capazes de compreender elementos inteiros apresentando a região 5' truncados que geralmente é muito encontrado no genoma.

Tem-se 347 sítios correspondendo a elementos inteiros, 76 dos quais correspondiam a subfamílias L1P1, L2P2, L1P3 deletados ou degenerados.

Quatro etiquetas não corresponderam a elementos da família L.

De um modo geral, dos elementos inteiros identificados, 24 pertenciam a subfamília L1H.

Elementos jovens também foram encontrados - L1Pa2 e L1Pa3 - em grande quantidade, enquanto que os antigos - L1Pa5 e LaPa6 - encontraram-se subestimados.

Isso é consistente com a hipótese de que elementos jovens apresentam maior probabilidade de terem seqüências retidas no genoma passíveis de transcrição.

Dos 24 elementos inteiros, 8 continham as duas ORF's intactas, 2 continham apenas a ORF2 intacta e 9 apresentaram apenas a ORF1.

Caracterização de 4 L1’s

L1 no 4p15.32

Família L1HsAltamente expresso em linfoblastóidesFixado em 4 populações humanas

(heterozigose ≤ 0.05)

L1 no 4p15.32

Possui o gene para ORF1 intacto e o da ORF2 truncado 96 aminoácidos antes

Indicação de atividade em passado recente

Polimorfismo Transcricional no 4p15.32

Níveis de RNA do L1 no 4p15.32 em familias do CEPH são diferentes

O gene CD38 é transcrito em uma frequência muito maior

L1 no 13q14.2

Pertence a subfamília L1Hs Não tem ORFs intactas

L1 no 13q14.2Detecção de expressão diferencial entre

individuosA expressão do gene RB1 é maior

L1 no 6p22.2

Possui ambas ORFs intactas

L1 no 1p22.3

Pertence a subfamília L1Hs ORFs intactasIntergênicoVariação na expressão

L1 no 1p22.3Análise de metilação da citosina individual

Discussões

692 elementos L1 distintos;

Destes, 410 correspondem a elementos completos;

Inclui também 52 de 304 só da sub-família humana;

Só 16 destes apresentaram ORF1 e ORF2 intactas e somente 5 foram representados por mais de 5 expression tags

Só 6 dos L1’s intactos corresponderam aos que se conhecem serem muito ativos;

Isto pode ser dada a repressão a nível celular ou a variação alélica populacional;

6 elementos íntegros codificam ORF2, mas não ORF1;

Estudo anterior demonstrou que a região transcrita para elementos novos possui uma pequena região 5’ anterior ao elemento;

O atual estudo demonstra que em elementos mais antigos, esta região pode sofrer um aumento considerável;

Isto pode ser devido a atuação de promotores nas regiões flanqueadoras.

Análise de 4 elementos íntegrons específicos de humanos em membros de uma família de Utah:Grande variação interpessoal e interalélica de elementos L1 muito ativos;

Hipotetiza-se que haja uma variação no nível de regulação genômica para explicar a variação.

Supõe-se que elementos em íntrons suprimiriam o gene;

Achou-se o contrário, expressão de L1 em 4p15.32, 13q14.2, e 6p22.2 era tão alta quanto dos éxons circundantes;

Não necessariamente o promotor dos genes está envolvido na transcrição dos transposons – pode ser devido a alterações na cromatina.

O término 3’ do transcrito está próximo do término 3’ do elemento (pequenas transduções);

Em alguns casos, diferenças de mais de 50 nucleotídios foram observadas;

Poliadenilação no final do L1 pode levar ao término abrupto da transcrição de um gene.

Metilação por citosina suprime a atividade de promotores endógenos de L1;

No entanto, esse estudo em questão não encontrou esse sinal;

Outros fatores podem atuar como reostatos para a produção de RNA: alterações histonais, SNPs, fatores em trans

As limitações desse estudo são:Só foi possível detectar transcritos que carreiam seqüências únicas na porção 3’ ou 5’;

Só um indivíduo foi analisado para o 5’ e só um para uma análise in-depth para o 3’;

Só um tipo celular;

O que se descobriu foi um pequeno subset dos sítios L1.

Conclusões

Esse estudo identificou ESTs correspondentes a 692 elementos L1, indicando que estas sequências fazem parte do transcriptoma celular;

Há extensiva variação de expressão dentro da mesma família de retrotransposons (L1Hs);

Estudos populacionais mais amplos são necessários.

Obrigado!!