gralades antimicrobianos 2015

8/17/2019 GRALADES antimicrobianos 2015

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Prueba de sensibilidad a antibióticos.Difusión en agar (Kirby-Bauer). Dilución encaldo. Determinación de la concentración

inhibitoria mínima (CIM) y de la

concentración bactericida mínima (CBM).

Dr. Cecilia Villa


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Temas a desarrollar

Introducción teóricaDefinición

ClasificaciónMecanismos de acción

Mecanismos de resistenciaNuevos antimicrobianos

Descripción teórica de Métodos de Antibiogramas(Difusión en agar, Dilución en caldo, Microdilución en caldo, E-test)

Explicación prácticaDifusión en agarDilución en caldo


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Introducción teórica del tema…


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ANTIMICROBIANOS (ATM)

Sustancias capaces de inhibir el crecimiento e incluso destruir determinadasespecies microbianas de forma específica, a bajas concentraciones y sintoxicidad, o muy baja, para el organismo humano.

Estos compuestos pueden estar producidos por microorganismos vivos(antibióticos) o por síntesis química (quimioterápicos).

Fig. 1.- Fleming y la penicilina. En1928, realizaba varios experimentosen su laboratorio, y el dia 22 cuandoobservaba sus cultivos antes dedescartarlos, notó que la colonia deun hongo había crecidoespontáneamente, comocontaminante en una de las Placas dePetri sembradas con Staphylococcusaureus . Fleming observó mas tardelas placas y comprobó que las coloniasbacterianas que se encontrabanalrededor del hongo (mas tardeidentificado como Penicilliumnotatum) eran transparentes debido auna lisis bacteriana. Penicillium

produce penicilina, la cual poseeefectos antibacterianos.


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Características de unantimicrobiano

1.- Especificidad Se refiere al espectro de la actividadantimicrobiana, definida por su capacidad deunión a un sitio específico de la bacteria.

2.- Eficacia “in vivo” Debe ser bacteriostático o bactericida in vivo ,es decir, su acción no debe ser revertida en elinterior del organismo.

3.- Toxicidad selectiva Debe ser tóxico para el microorganismo, peroser inocuo para el huésped. Esto esindispensable para la utilización delantimicrobiano en clínica.


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Por su origen

Biológicos producidos por microorganismos

• Hongos filamentosos (especialmente Penicillium ) queproducen antibióticos como la penicilina y la griseofulvina.• Bacterias (del género Bacillus) de las que se obtienen

antibióticos como la bacitracina y la polimixina.• Actinomycetos (del género Streptomyces ) que producenantibióticos como la estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina yeritromicina.

Semisintéticos ptan un núcleo básico biológico con radicalesobtenidos por síntesis como cefalosporinas

Sintéticos obtenidos por síntesis química como nitrofuranos,

sulfamidas


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Amplio espectro; G+ y G-cloranfenicoltetraciclinaspenicilinas de amplio espectro

Espectro intermedio; G+

penicilinasmacrólidos

Corto espectro; Cocos G+y bacilos G-

polimixinas

Por su espectro de acción


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Por la forma de acción

Bacteriostáticos

Bactericidas

Bacteriolíticos

sint. de proteínasmet. intermedios

sint. de proteínassint. ácidos nucleicos

sint. pared celularintegridad de la membrana


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- lactámicos: penicilina y cefalosporinas

TetraciclinasPolipéptidos

(ej. valinomicina)

Aminoglicósidos(ej. amikacina)

Macrólidos

Cloranfenicol

Por su estructura


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Por su mecanismo de acción


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Tipos de resistencia

El microorganismo puede carecer de la estructura sobre la queactúa el Ab, puede inactivarlo, puede ser impermeable, puede

modificar la diana del Ab, puede bloquearlo por medio de una viametabólica alterada, puede bombearlo hacia afuera.

Resistencia natural Resistencia adquirida

Una cepa bacteriana es resistente a un ATM determinado cuando parainhibirse necesita concentraciones de fármacos superiores a la concentración

que el agente ATM puede alcanzar en el sitio de la infección.

Incremento de la CIM

Resistencia a los antimicrobianos


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RESISTENCIA ADQUIRIDA

Capacidad adquirida de un microorganismo para resistir los efectos de unantimicrobiano al que es habitualmente sensible.

Bases genéticas

La resistencia adquirida a un antimicrobiano se debe a cambios en la cargagenética de la bacteria.

Cromosómica. Alteración estructural del DNA cromosómico MUTACIÓN

Plasmídica. Adquisición de DNA extracromosómico

Plásmidos de resistencia conjugativos RResistencia a varias drogas a la vezConjugación

Plásmidos de resistencia no conjugativos rFalta de transferibilidad conjugativa .

Transformación / Transducción

Espectro de resistencia menor (rara vez resistencia múltiple).Son de tamaño menor a R.


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Resistencia a antimicrobianos: Mecanismos bioquímicos

Peleg, A. Y. et al (2010) Hospital-acquired infections due to gram-negative bacteria. The New England Journal of Medicine, Volume362:1804-1813, May 13 2010

Inactivación enzimática delantibiótico. Ej. PenicilinaDisminución de la permeabilidad

hacia el antibiótico . Ej.Tetraciclina

Modificación química de ladiana sobre la que actúa elantibiótico. Alteración de laproteínas P10 ribosomal. Ej.

Estreptomicina

Desarrollo de viasmetabólicas

alternativas. Síntesis de

una enzima resistente.Capacidad para usar ácidofólico preformado norequieren PABA (ác.

paraminobenzoico). El cualdesplaza sulfonamida desdedihidropteroato sintetasa.

Ej. Sulfonamidas

Eliminación deantibiótico medianteBomba de Eflujo.


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El antibiótico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistenteseliminando las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presión deselección.

El aumento de la frecuencia de las cepas resistentes va unido casi siempreal uso intensivo del antibiótico en cuestión.

• Prescripción formal o libre de medicamentos para uso terapéutico en humanos o animales.• Utilización generalizada de antimicrobianos en pacientes inmunocomprometidos y en launidad de cuidados intensivos.• Uso de dosis o duración inadecuada de la terapia antimicrobiana.• Desconocimiento de los perfiles de sensibilidad a los diferentes microorganismos.


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Nuevos análogos de los antimicrobianos existentesRealizando sustituciones químicas que le otorga ventajas como mayor solubilidad,afinidad o menor reconocimiento por los factores de resistencia

Productos naturales. Péptidos antimicrobianos ( de plantas y animales), por ej.:-Magainina , péptido catiónico que actúa como agente protector. Se encuentra en la pielde ciertas ranas. Forma canales en la membrana citoplasmática.-Platensimicina , descubierto recientemente de Streptomyces platensis, inhibe la síntesisde lípidos en bacterias. Fármaco especialmente activo contra bacterias gram-positivas

multiresistentes.

Diseño de medicamentos por ordenador. Saquinavir, inhibidor de proteasa, HIV

Genes antisense DNA complementario que se une a genes de virulencia del

patógeno y previenen la transcripción Ej: fornivirsen

Nuevos antimicrobianos


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Debido a la resistencia a antibióticos, debe determinarse lasensibilidad a antibióticos de las bacterias aisladas de muestras

clínicas. Antibiogramas

Técnica que permite demostrar la sensibilidad o resistencia de

un microorganismo a la acción de distintos antimicrobianos.

Los principales métodos para aerobios y anaerobiosfacultativos son:

Difusión en agar (Kirby-Bauer) Dilución en caldo

Técnica del Epsilómetro (E-test)


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Método de difusión en agar (Kirby-Bauer)

Es el recomendado por CLSI (Clinical and Laboratory StandarsInstitute)(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing) y es el

método descrito de manera más completa para el cual se han desarrollado tablasde interpretación que están respaldadas por datos clínicos y de laboratorio.

Es más accesible y de uso común en los laboratorios de diagnóstico clínico.

Ha sido estandarizado para patógenos de rápido desarrollo:Staphylococcus spp.,Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae

Y ha sido modificado para probar algunos microorganismos nutricionalmenteexigentes como Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcuspneumoniae , estreptococos β hemolíticos y del grupo víridans y Micobacterias .

El principio del método involucra el uso de una cantidad constante deantimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicados sobre la

superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo encuestión.


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Estandarización del método

Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán sercontrolados y estandarizados.

El medio de cultivo: Agar Müeller Hinton (4 mm de alto; pH 7,2 - 7,4 ).

•Presenta buena reproducibilidad de resultados de lote a lote.•Es pobre en contenido de timina o timidina (compiten con sulfonamidas,

trimetroprimas y tetraciclinas), lo que daría falsas resistencias.•Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas.•Existen suficientes datos que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidadrealizadas en este medio.

El inóculo: cultivo joven, densidad de microorganismos (1x108 UFC/ml),

preparación reciente.

La colocación de los discos: tiempo de colocación luego de la siembra (3 – 5min), distancia entre discos (22 mm) y número por placa (3 -5).

Temperatura y tiempo de incubación: 35 a 37ºC durante 18 a 24 horas.


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Elección del antimicrobiano

Existen tablas sugeridas por CLSI, con las recomendaciones de los antimicrobianosa estudiar para cada grupo bacteriano, que se basan en factores microbiológicos,clínicos y farmacológicos.

•Todos los antibióticos deberán usarse por su nombre genérico.

•En general, deberá incluirse sólo un representante de cada grupo de drogasrelacionadas con actividad casi idéntica y para las cuales la interpretación podría serla misma.

•Rara vez se realizan pruebas de sensibilidad para microorganismos sensibles a unadroga altamente eficaz, por ejemplo Streptococcus pyogenes y Neisseriameningitidis que han mantenido invariable su sensibilidad a la penicilina.


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Método de dilución en caldo

Para cuantificar la actividad antimicrobiana se puede medir la sensibilidad de uncultivo por la técnica de dilución en caldo.

Es uno de los primeros que se llevó a cabo y aún hoy sirve como método de referenciaporque permite la determinación cuantitativa de la sensibilidad al antibiótico, pero eslaborioso y costoso, por lo tanto se limita su uso a casos especiales.

En el método de dilución en caldo se colocan concentraciones decrecientes del

agente antimicrobiano, generalmente diluciones al medio (1:2) en tubos con un caldode cultivo que sostendrá el desarrollo de los microorganismos. El caldo máscomúnmente usado es el de Mueller-Hinton. Además se realizan un C + y C -.

Inóculo estándar del microorganismo: 1 x 106 organismos/ml.

Se incuba de 18-24 h a 35°C y se observa la turbidez de los tubos que indicarádesarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control positivo y en todoslos otros que no contengan suficiente antimicrobiano.

Se determina la CIM Y CBM.


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Concentración inhibitoriamínima (CIM)

Corresponde a la menor concentración deantimicrobiano que inhibe el crecimiento

bacteriano luego de 18 a 24 horas deincubación.

Concentración bactericida

mínima (CBM)Corresponde a la menor concentraciónde antimicrobiano capaz de matar un

99,9% de la población bacteriana.

CIM

CIM

CBM


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Método de microdilución en caldo

Es una adaptación de la prueba de dilución en caldo a policubetas para microdilución.

Estas microplacas de 96 pocillos se pueden adquirir en el comercio y tienen la ventaja de habersido preparadas bajo estándares de control de calidad muy estrictos que aseguran resultadosconsistentes.

Empleo de autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia) o, simple lectura óptica.

Otra ventaja es que se pueden estudiar varias cepas al mismo tiempo y con varios

antimicrobianos


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Método del Epsilómetro (E-Test)

Consiste en una tira plástica estéril no porosa de 6 cm de largo por 5 mm de ancho

que incorpora de un lado un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a15 diluciones, y del otro lado presenta una escala de lectura e interpretación.

La inoculación y el cultivo se realiza igual que en la técnica de Kirby-Bauer.

Para leer el resultado se valora la zona de inhibición, de forma elíptica, alrededor de

cada tira. La CIM se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse quepresente crecimiento.

Características

Permite estudiar una cepa individual frente a diferentes agentes.

Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que resulta un métodoideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio,incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientosespeciales para crecer.


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En la fotograf í a inferior de la izquierdase muestra una vista general de una

placa con crecimiento bacteriano y con

dos tiras de E-test. Las elipses másoscuras que rodean la parte superior de

las tiras E-test marcan las zonas en que

los respectivos antibióticos han inhibido,

con mayor o menor eficacia, elcrecimiento del microorganismo en

estudio. En la foto inferior de la derecha se

aprecia como el pico de la zona másestrecha de la elipse en la tira de MZ

coincide, en la escala graduada, con la

franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo

que nos indicar í a que la CIM de este

antibiótico (MZ) para estemicroorganismo ser í a de 2 µg/ml.


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En el Trabajo Práctico de Laboratorio…


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Explicación método dedifusión en agar

(Kirby-Bauer)

Preparación del inóculoSe toman 4 o 5 colonias bien aisladas y de igual morfología dela placa de cultivo de 18 a 24 horas de incubación, con unansa y se introducen en 5 ml de caldo tripteína soja. Si laturbidez obtenida es la adecuada, no es necesario unaincubación posterior, caso contrario, se incuba a 37ºC hastalograr la turbidez del testigo, la que termina de ajustarseagregando solución fisiológica si es necesario. El testigo a usar

corresponde al 0,5 de la escala de Mc Farland.

Preparación de las placas con el medio de cultivo

Se vierten 25 a 30 ml de agar Müeller Hinton fundido en placasestériles de 100 mm de diámetro, para obtener una altura de 4mm. Para eliminar la humedad se colocan las placas de 15 a 30min. en estufa de cultivo a 37ºC.

MATERIALES•Mecheros• Ansa en anillo•Tubos con solución fisiológica estéril•Placas estériles•Hisopos estériles

•Medio de cultivo agar Müeller Hinton•Pinzas metálicas•Reglas•Discos con antimicrobianos•Microorganismos de ensayo•Patrón de turbidez (escala de Mc Farland)Día 1


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Incubación de las placasIncubar las placas invertidas, en grupos no superiores a 5placas, a 35ºC en atmósfera aeróbica antes de que transcurran15 minutos durante 18 a 24 horas.

Siembra de las placasSe sumerge un hisopo de algodón estéril en elinóculo, oprimiendo el algodón contra las paredes

internas del tubo para descartar el exceso delíquido. Se aplica el hisopo sobre la superficie delas placas estriando uniformemente y rotando laplaca cada 60º.

Colocación de los discosEsperar entre 3 a 5 minutos y no más de 15 minutosantes de aplicar los discos, para que el exceso dehumedad superficial sea absorbido. Colocar los discoscon una pinza estéril cuidando que tengan un buencontacto con la superficie del agar haciendo una ligerapresión. (22mm y 15 mm)


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Diámetro

la cantidad de antimicrobiano añadidoal discola solubilidad del agenteel coeficiente de difusiónla eficacia del ATM

Medición de las zonas de inhibición

Con una regla ocalibre, se mide eldiámetro de los

halos incluyendo el

disco de 6 mm.

Día 2


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Resultados

Categorías Interpretativas.

Sensible Una infección debido a una cepa puede ser apropiadamente tratada con la dosis deagente antimicrobiano recomendado para ese tipo de infección y especie infectante.

Intermedio Implica eficacia clínica en sitios del cuerpo donde la droga es fisiológicamenteconcentrada (por ej. quinolonas y ß-lactámicos en orina) o cuando una dosis mayor que lonormal de una droga puede ser usada (por ej. ß-lactámicos).

Resistente Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentración sistémica usualmentealcanzable de un agente cuando los esquemas de dosificación normal son usados.

Estándares de interpretación dezonas de diámetro.

Existen tablas específicas CLSIperiodicamente publicadas que indicanlos criterios para interpretar losdiámetros de zonas para categorizarexactamente los niveles desusceptibilidad de los microorganismos

a diferentes agentes antimicrobianos.


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Resultados erróneos


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Día 1 Colocar 1 ml del inóculo a cada uno delos tubos que contienen 1ml de caldo

con el antibiótico en las concentracionesindicadas (µg/ml) y al control sinantimicrobiano (C +), dejar un tubo sin

inocular (C -).

Tomar 100 µl del control negativo e

inocularlo en agar

Los tubos contienen ahora 2ml con 5 x105 UFC/ml y el antibiótico en las

concentraciones indicadas (µg/ml)

Los agentesantimicrobianos

se preparan en

soluciones

concentradas y

luego se diluyen

en caldo.

Estandarizar el inóculo: Se obtiene realizando diluciones de unasuspensión bacteriana comparando con el tubo número 1 de laescala de Mc Farland (1 x 106 UFC/ml), preparar 10 ml.

Incubar 24 h a 37°C .

Explicación método dedilución en caldo (tubo)

MATERIALES •Tubos con el microorganismo desarrollado•Tubos para estandarizar el inóculo•Tubos con 1 ml de concentraciones decrecientes del antibiótico encaldo Müeller-Hinton•Tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton

•Placas con agar para recuento


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Día 2

Día 3

Se observa turbidez a simple vista.

0,1 ml de los caldos no turbios se subcultiva en

agar.

CIM: Menor concentración

de antimicrobiano que

inhibe el crecimiento

bacteriano.

Se determinan las UFC en el tubo

control por recuento de colonias

(500 UFC= 5 x 105/ml inóculo

original) Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan

totalmente una población bacteriana, para medir la capacidad de unantimicrobiano de matar a un microorganismo se debe realizar la

prueba de actividad bactericida.

Se determinan las UFC en los subcultivos

de los caldos no turbios.

7 UFC = 70 UFC/ml en el tubo quecontiene 8 µg/ml de antibiótico.

7 UFC/ml < 0,1% de 5 x 105/ml que

contenía el inóculo original. CBM: Menor concentración de

antimicrobiano capaz de matar un

99,9% de la población bacteriana.


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Bibliografía…


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gralades antimicrobianos 2015

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