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ICAMPIONITISSUTALIELOROTRATTAMENTONEILABORATORIDIANATOMIAPATOLOGICA
SerenaBoninDSM-Dip.ScienzeMediche
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ClinicalSampes
BiologicalFluids
Blood
CSF
Urine
Synovialfluid
Lymphaticdrainage
Ascites
TissuesFFPE(99%)
Freshorfrozen(1%)
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SOURCESOFCLINICALMATERIAL
Clinicalsamples
Cytologicalspecimens
Cellularsuspension
Smears
Cytocentrifugationand
Cytoinclusion
Formalin
AlternativeFixatives
BiologicalFluids
CTCs orfcDNA
Biopsy orsurgicalresection
Formalin
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TIPIDICAMPIONE
BIOPSIEESCISSIONALI
INCISIONALI
PERRASCHIAMENTO
AGOBIOPSIE(FNA)
BIOPSIAPUNCH
AUTOPSIE
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ALLPREANALYTICALFACTORSAFFECTRNAINTEGRITYMORESEVERELYTHANDNA
BoninS,StantaG.Nucleicacidsextractionmethodsinfixedandparaffin-embeddedtissuesincancerdiagnostics.ExpRevMol. Diagn.2013,13.
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TissueSAFEVacuumUnit
Dedicatedvacuumunitinstalledin“dirtyroom“adjacenttosurgerysuite.
Eliminationofformalininsurgerytheatre.
Transportbiospecimens in“asfreshconditions”tothePathologylab.
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PRELIEVO
• LAVAGGIODEITESSUTIPRELEVATI (intamponeneutroincondizionifisiologichepertogliereilsangue- consaccarosioodestranoperunabuonaconservazionemorfologicaperilcongelamento)• MODALITA’DIINVIO (infissativoosottovuoto)• TEMPIBREVI:autolisi(tipoditessuto)eputrefazione• STRUMENTI(coltelli,bisturi,forbici,tavolettadisughero,…)• TECNICADELPRELIEVOERISCHIBIOLOGICI• TIPODIMATERIALEINVIATO (pezzooperatorio,biopsia,agobiopsia,prelievoautoptico,materialecitologico)• DESCRIZIONEMACROSCOPICA• DIMENSIONI (adeguateaipreparatiistologiciconspessoreadattoallavelocitàdifissazione)• LOCALIZZAZIONEEDORIENTAMENTO (anatomia,lesione)
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FISSAZIONE• SCOPO:fornireunimmagineistologicailpiùfedelepossibileallarealtàomegliocostantementeriproducibile(IMMAGINEEQUIVALENTE)
• RAPIDITA’DELLAFISSAZIONE:perevitarel’autolisi(liberazioneintracellularedienzimilitici)elaputrefazione(batterisaprofitiedambientali).
• CAPACITA’DIPENETRAZIONEDELFISSATIVO:velocitàdipenetrazioneneitessuti(dipendedallatemperatura,cheaumentaperòancheladegradazione)
• DURATADELLAFISSAZIONE:dipendedaltipodifissativo,daltipoditessuto,dalledimensionidelprelievo
• VOLUMEDELFISSATIVO:1:20perlaformalina• CONDIZIONIDELLAFISSAZIONE:immersionedeitessuti,pH7.3-7.4,pressioneosmotica0.5osm.
• INADEGUATEZZADELLAFISSAZIONE:perditadelcampione
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Tipo
diFissativi
Chimici
Coagulanti
Additivi
Fisici
Calore(fiamma)
Dissecazionear.t.
Congelamento
Sublimazione(dell’acquasottovuoto)
Fornoamicro-onde
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FISSATIVICHIMICI(Agisconosulleproteine)
AZIONESULLAIDRATAZIONEDELLEPROTEINE:• FISSATIVICOAGULANTI:ilfissativosisostituisceall’acquadiidratazionedelleproteinechedenaturanoeprecipitano(COAGULAZIONE)
REAZIONECONICOMPONENTITISSUTALI:• FISSATIVIADDITIVI:lemolecoledelfissativoreagisconochimicamenteconicomponentideltessuto,conconsumodelfissativo
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FISSATIVIADDITIVIFORMALDEIDE:HCOH–gasincoloresolubileinacqua.Formalinaèlasoluzioneacquosadiformaldeideal37%.NellafissazionesiusaformalinatamponatacontamponefosfatoapH fisiologico.
MECCANISMOD’AZIONE:-legatraloroleproteineconpontimetilenici(-CH-)tragruppiconunHattivo
R-H+HCHO> R-CH2-OH+H-R’> R-CH2-R’+H2OPOTEREDIPENETRAZIONE:0.8mm/hUSO:-soluzionediluita10X(dettaformalina10%,mainrealtà4%)-Lalucetrasformalaformaldeideinacidoformico(bottigliescure,aggiuntacarbonatodiCa)-Lafissazionedurada12ha4-5gg-Perdegradazionedell’emoglobinaformaunpigmentobrunoscuro,chesipuòeliminareconl’aggiuntadialcool70%(95pp)edammoniaca5%(5pp)
-Capacitàconservative(neimuseiconframmentidimarmo(salidiCa)edopogorgogliamentodigasdicittà,monossidodiC>metaemoglobina,permantenereicolori)
-MummificazioneRISULTATI:-fissazionedeigrassi– scarsacoartazione– scioglieparzialmenteglicogenoeacidouricoPARAFORMALDEIDE: polimerodellaformaldeide
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FISSATIVIADDITIVIMiscele fissatrici a base di acido picrico:
•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale
•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80%, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico
Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e diquello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNAe, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.
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FISSATIVICOAGULANTI
Fissativi alcoolici• Alcool etilico 95°• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti• Alcool metilico• Alcool metilico ed acetone anaparti
L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità dipenetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determinaeccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagulagrossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altrecomponenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.
Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materialeprelevato come prefissaggio in citologia.
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MISCELEDOFISSATIVIABASEDOALCOOL
• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95% ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale
• Liquido di Carnoy e MetaCarnoy : costituito da 6 parti di alcool etilico abs (metilico) , 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico abs ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico abs ed 1 parte di formaldeide 40%
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LAVAGGIODELFISSATIVO
DOPOLAFISSAZIONEIFRAMMENTIDITESSUTODEVONOESSERELAVATIPERALLONTANAREIRESIDUIDELFISSATIVOCHEPOTREBBEINFLUIRESUISUCCESSIVIPROCESSI
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INCLUSIONE-ITESSUTIFISSATI,PERPOTERESSEREOSSERVATIALMICROSCOPIOOTTICO,DEVONOESSERESEZIONATIINFETTINESOTTILI2-8µm
-PEROTTENERESEZIONISOTTILIITESSUTIDEVONOESSERESUFFICIENTEMENTEDURIECOMPATTI>INCLUSIONEINMEZZISEMISOLIDI
-ILTESSUTODEVEESSEREIMBIBITODELLASOSTANZAUSATAPERL’INCLUSIONE>PARAFFINA
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PARAFFINACH3-CH2- - - -CH2-CH3 (CnH2n+2)
-SIOTTIENEDAIRESIDUIDIDISTILLAZIONEDELPETROLIO
-ILPUNTODIFUSIONESIINNALZACONLALUNGHEZZADELLACATENA
-INISTOLOGIASIUSANODAC22 AC28,DIVIDENDOLEPARAFFINEINBASSOFONDENTI(45– 54°C)EALTOFONDENTI(58– 60°C)
-OGGINONSIUSANOPIU’LEPARAFFINENATURALI(SEMPREMISTUREDIVARIALUNGHEZZA),MAPARAFFINESINTETICHE,PUREEOMOGENEE(ES.PARAPLAST)
-ISOLVENTIPERLAPARAFFINASONO:XILENE,CLOROFORMIO,BENZENEETOLUENE
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PROCESSAZIONEPERINCLUSIONEDEITESSUTI1-FISSAZIONE2-LAVAGGIO-ALCOOL70% - 4h I-ALCOOL95% - 4h I 3-DISIDRATAZIONE-ALCOOL100%- 4-6h I-ALCOOL100%- 4-6h I
-XILENE - 1-2h I 4-DIAFANIZZAZIONE-XILENE - 1-2h I
-PARAFFINA2-3X - 3-4hX1 5-INCLUSIONE6-COLATA (BLOCCODIPARAFFINACONTESSUTOORIENTATO)
7-RAFFREDDAMENTO(PARAFFINAOMOGENEA)
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SEZIONIISTOLOGICHEMICROTOMI: -MICROTOMOASLITTA(ALAMAMOBILEOFISSA)
-MICROTOMOROTATIVO(SEZIONISERIATE)
-MICROTOMOCONGELATORE
-CRIOSTATO(MICROTOMOROTATIVOINCAMERAREFRIGERATA)
LAMEDELMICROTOMO:-PRESENTANOFACCETTESECONDARIEDITAGLIO-HANNOUNAINCLINAZIONEREGOLABILERISPETTOALLASUPERFICIEDITAGLIODI10– 15°-INFERIOREA10° LALAMASTRISCIASENZATAGLIARE-SUPERIOREA15° LALAMAFRANTUMALAPARAFFINA
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DEPARAFFINAZIONEDELLESEZIONI
-XILENE - 5min SPARAFFINATURA-XILENE - 5min
-ALCOOL100% - 5min-ALCOOL100% - 5min-ALCOOL95% - 5min IDRATAZIONE-ALCOOL70% - 5min-ACQUADISTILLATA
COLORAZIONE
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DECALCIFICAZIONEDEITESSUTIItessutidevonoprimaesserefissatiperevitarnelamacerazione.Ladecalcificazionevieneeffettuataspostando,medianteacidiforti,quellipiùdeboli(ac fosforico,ac carbonico)dailorosali(fosfatiecarbonatidiCa),perotteneresalidiCasolubili.
CaCO3+2HNO3 >Ca(NO3)2+H2O+CO2
Ladecalcificazionesipuòeseguirecon:-ac.nitrico 5-7.5%-ac.tricloroacetico 5%-ac.formico concentrato
Illiquidodecalcificantevacambiato2Xnelle24hedprocessodurapiùgiorni.Pertestareseiltessutoèdecalcificatosiusaunago.
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COLORAZIONIISTOLOGICHE
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COLORAZIONIISTOLOGICHE
-NEIPREPARATIISTOLOGICINATURALIILCONTRASTOFRALEVARIESTRUTTUREE’SCARSOOASSENTE
-ILCONTRASTOSIOTTIENECONISPECIFICICOLORANTIUSATIINISTOLOGIACHEHANNOPERLEVARIESTRUTTURETISSUTALIDIVERSAAFFINITA’
-ICOLORANTIUSATIINISTOLOGIASONOANIMALI,VAGETALIEDISINTESI(aniline)
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COLORANTI : sono usulamente composti organici aromatici contenenti un gruppo CROMOFORO ( Luce visibile 400-800 mm) e uno AUXOCROMO.Nel cromoforo si trovano sempre gruppi funzionali dai quali dipende il colore. GRUPPI CROMOFORI: CARBOSSILE (C=O), AZO (-N=N-), NITROSO (-N=O), NITRO (–NO2), ETILENE (C=C)…………IL COLORE E’ PRESENTE MA DI BASSA INTENSITA’ E CON LA PRESENZA DI GRUPPI AUXOCROMI IL COLORE DIVIENE INTENSO.L’auxocromo è un gruppo chimico ionizzabile, unito covalentemente al cromoforo L’auxocromo è responsabile:
– della solubilita in acqua del colorante – della sua ionizzabilita – della capacita di contrarre legami stabili (spesso mediante legami di tipo salino) con le proteine o con altri componenti dei tessuti
A seconda della carica assunta in soluzione, l’auxocromo puo essere – acido (quando ionizza come anione) – basico (quando ionizza come catione) Questa caratteristica genera la fondamentale distinzione dei coloranti istologici in acidi e basici
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Tipidiauxocromo•Gliauxocromiacidisonoigruppi:–solfonico(-SO3Hilpiufrequente)–carbossilico(-COOH)–idrossilico(-OH)•Gliauxocromibasicisono:–ilgruppoaminico(-NH2)edisuoiderivati–imetalli(nellecosiddettelacche)•Icolorantivengonoingenerepostiincommerciosottoformadisali:–Acidi:comesalidisodio,talvoltadipotassio,dicalcioodiammonio–Basici:comecloruri,talvoltacomeacetatiosolfati
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COLORANTI2SIPOSSONODIVIDEREICOLORANTIINBASEALLACARICAELETTRICAIN:
BASICI -CATIONICONCARICAPOSITIVA
ACIDI -ANIONICONCARICANEGATIVA
NEUTRI -SIACARICHEPOSITIVECHENEGATIVE
ANFOTERI-LACARICADIPENDEDALpH
INDIFFERENTI -SENZACARICA
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COLORAZIONEINDIRETTA-LACOLORAZIONEE’POSSIBILESOLODOPOUNPRETRATTAMENTOCONUNASOSTANZADETTAMORDENTE CHELIBERAIGRUPPIREATTIVICHESILEGANOALCOLORANTE
-QUESTOPROCESSOSIDEFINISCEMORDENZATURA
-SECOLORANTEEMORDENTEVENGONOUSATICONTEMPORANEAMENTESIHAUNALACCA
-IMORDENTISONOSOSTANZEOSSIDANTIQUALIACIDIESALIMETALLICI(ACCROMICO,SUBLIMATOCORROSIVO,…),AC.PICRICO,FENOLO,TETROSSIDOD’OSMIOEL’ALLUME(AlK(SO4)2*12H2O– SALEDOPPIOIDRATO)
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DIFFERENZIAZIONESERVEPERLAVAREILCOLORANTEINECCESSO,MASOPRATTUTTOPERFISSARELACOLORAZIONESPECIFICA
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COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA1EMATOSSILINA:colorantevegetaleincristalligiallo-bruni,solubileinacqua(alcooleglicerina).-Ilverocolorantenonèl’ematossilina,mal’EMATEINAcheèilsuoprodottodiossidazione.
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
EMATOSSILINA EMATEINA
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COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA2
• -Perottenerel’emateinasilasciamaturareall’ariaovengonoaggiuntesostanzeossidanti(permanganatodiK….).• -Vieneusataassiemeall’allume(mordente,aformareunalacca)l’EMALLUME.• -Asecondadell’ossidanteemordenteusaticisonoleematossilineprendonovarinomi(Carazzi,Mayer,Harry,ferrica,…).• -E’uncolorantebasicocheagiscemeglioinambienteacidoereagisceconigruppifosforicidegliacidinucleici,colorandoinucleiinviolettoscuro.• -Ladifferenziazioneavvieneinacquacorrentechefavirareilcoloredalviolettoall’azzurro.
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COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA3EOSINA:coloranteartificialeacido(varieformedicuilapiùcomuneèl’eosinagialla).-E’solubileinacqua,siusainsoluzione1%.-Coloraicitoplasmi,lefibreelasostanzaintercellulareinrosapiùomenointenso.-Ladifferenziazionesifaconalcool95%.
COOH
Br Br
BrBr
O
O O
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COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA4
• Dopoaveridratatolesezioni:
• -EMATOSSILINA 10min• -DIFF.ACQUACORRENTE 30min• -EOSINA 1min• -DIFF.ALCOOL95% rapida
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MONTAGGIOCOLORAZIONE
-ALCOOL70°-ALCOOL95° DISIDRATAZIONE-ALCOOL100°-ALCOOL100°
-XILENE DIAFANIZZAZIONE-XILENE
MONTAGGIOBalsamodelCanadaoEukitt+vetrinocoprioggetto
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SEZIONISUTESSUTICONGELATI1Sipuòeseguireunesameistologicosusezioniditessutocongelato.
Lesezionisipossonotagliareda:
a)Tessutifissatiinformalina:iltessutoprimadiesserecongelatodevevenirlavatoestensivamenteconacqua.
b)Tessutifreschi: -sultessutolavatodalsanguesiesegueunprelievodellospessoredi2-3mm
-vienepostosuunsupportometallico-congelatoperqualchesecondosuivaporidiazotoliquido-immersoinazotoliquidoperunminuto
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Iltagliovieneeseguitonelcriostato:
-Regolazionedellatemperatura(troppofreddoiltessutorisultafriabile,temperaturatroppoaltailtessutoèpastoso)
-Nellazonaditaglioc’èunalastrinaditefloncheraccoglieautomaticamentelasezione.
-Sitrasferiscelasezionedallalastrinaavvicinandounvetrinofreddo,l’adesioneeladistensionesulvetrinoavvieneperilcaloretrasferitodalpolpastrellodeldito
-Siessicarapidamenteagitandoilvetrinonell’aria
-Sipuòeseguireunarapidafissazionedi1mininacetoneoalcool
SEZIONISUTESSUTICONGELATI2
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EMATOSSILINAEOSINA-EmatossilinadiHarryconcentrataper1min.-Acidocloridrico0.5%- 20immersioni-Ammoniaca2%inalcool– 20immersioni-Eosina1min.-Differenziazioneinalcool95%- rapida
DISIDRATAZIONE
DIAFANIZZAZIONE
MONTAGGIO
COLORAZIONERAPIDA