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IDENTIFICACIÓN DE Brucella abortus A PARTIR DE QUESO FRESCO ARTESANAL DE VACA EN VERACRUZ, MÉXICO

IDENTIFICATION OF Brucella abortus FROM ARTISANAL-FRESH COW-MILK CHEESE IN VERACRUZ, MEXICO

Gabriela R. Hernández-Carbajal1, David I. Martínez-Herrera1*, Violeta T. Pardío-Sedas1, Rodolfo Quintana-Castro2, J. Francisco Morales-Álvarez3, Karla M. López-Hernández1,

Rosa M. Olliart-Ros4, José A. Villagómez-Cortés1, Javier C. Huerta-Peña1

1Universidad Veracruzana. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Circunvalación esquina Yáñez s/n, Colonia Unidad Veracruzana, Puerto de Veracruz, Veracruz, México. ([email protected]) ([email protected]) ([email protected]) ([email protected]) ([email protected]) ([email protected]). 2Universidad Veracruzana. Fa-cultad de Bioanálisis. Calle Iturbide s/n, Col. Centro, Puerto de Veracruz, Veracruz, México. ([email protected]). 3CENID Microbiología Animal-INIFAP, km 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Ciudad de México. ([email protected]). 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos. Instituto Tecnológico de Veracruz. Calzada Mi-guel Ángel de Quevedo, Veracruz, México. ([email protected]).

*Autor responsable v Author for correspondence.Recibido: junio, 2018. Aprobado: julio, 2018.Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 52: 55-66. 2018.

RESUMEN

La brucelosis es una zoonosis cuya principal fuente de infección es leche contaminada y productos derivados sin pasteurizar. La dificultad de aislar al agente limita el diagnóstico definitivo, por lo que el uso conjunto de métodos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la inoculación de animales susceptibles pueden representar una alternativa para aislar e identificar Brucella spp. El objetivo fue identificar la presencia de Brucella abortus a partir de muestras de queso fresco artesa-nal de leche de vaca recolectado en cinco centros de acopio de la zona centro del estado de Veracruz mediante un modelo de infección murino y por PCR. El diseño del estudio fue epide-miológico transversal y se recolectaron 100 muestras de queso durante mayo y junio de 2017 que se analizaron mediante microbiología convencional. En una muestra se identificó la presencia de una cepa vacunal S19 de B. abortus mediante PCR multiplex. Para intentar su aislamiento, desde esa muestra de queso, diez ratonas se inocularon por vía intraperitoneal de acuerdo con lo establecido por la NOM-062-ZOO-1999. Las ratonas se sacrificaron por dislocación cervical, se extrajeron muestras de hígado, riñón, bazo y médula ósea y se sembra-ron en placas con Agar-Farell, las cuales se mantuvieron en aerobiosis por 10 d. Ninguna de las ratonas seroconvirtió ni se desarrollaron colonias de Brucella spp. desde los órganos

ABSTRACT

Brucellosis is a zoonosis whose main source of infection is contaminated milk and unpasteurized products. The difficulty of isolating the agent limits the definitive diagnosis, so the joint use of methods such as the polymerase chain reaction (PCR) and the inoculation of susceptible animals may represent an alternative to isolate and identify Brucella spp. The objective was to identify the presence of Brucella abortus from samples of artisanal fresh cow milk cheese collected in five collection centers in the central area of the Mexican state of Veracruz using a murine infection model and PCR. The design of the study was cross-sectional epidemiological and 100 samples of cheese were collected during May and June of 2017 that were analyzed by conventional microbiology. In one sample, the presence of a S19 vaccine strain of B. abortus was identified by multiplex PCR. To try their isolation, from said sample of cheese, ten mice were inoculated intraperitoneally according to the provisions of NOM-062-ZOO-1999. The female mice were sacrificed by cervical dislocation, samples of liver, kidney, spleen and bone marrow were extracted and plated with Agar-Farell plates, which were maintained in aerobiosis for 10 d. None of the female mice were seroconverted nor colonies of Brucella spp. developed from extracted organs, but PCR diagnosis was useful to identify Brucella spp. in fresh cheeses.

Key words: dairy products, artisanal fresh cheese, infection models, brucellosis, Brucella abortus, strain S19.

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AGROCIENCIA, noviembre, 2018

VOLUMEN 52, NÚMERO ESPECIAL

extraídos, pero el diagnóstico por PCR fue útil para identificar Brucella spp. en quesos frescos.

Palabras clave: lácteos, queso artesanal, modelos de infección, brucelosis, Brucella abortus, cepa S19.

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una zoonosis que afecta a es-pecies animales y humanos (Acha y Szyfres, 2001). En México, la brucelosis es una enfer-

medad infecciosa de gran impacto por las pérdidas económicas que genera en la ganadería nacional y por su efecto en la salud pública. Entre las fuentes principales de infección para los humanos están los productos lácteos sin pasteurizar, como el queso fresco artesanal de origen vacuno contaminado con Brucella abortus (López Merino et al,. 1992; Guzmán et al., 2016). De acuerdo con la Secretaría de Salud, durante el segundo trimestre de 2018, en México se presentaron 539 casos de brucelosis humana, de los cuales nueve correspondieron al estado de Veracruz (SSA, 2018). Debido a que México es una zona endémica de brucelosis, en 1973 se creó la Comisión Nacional contra la Brucelosis (CONABRU). De acuerdo con la NOM-041-ZOO-1995 “Campaña Nacional contra la Brucelosis en los Animales”, publicada en el Diario Oficial de la Federación (DOF), y con el objetivo de prevenir la enfermedad, la vacunación fue obligatoria para las hembras bovinas, caprinas y ovinas en zonas en control y erradicación, y opcional para las ubicadas en zonas libres (Aguilar et al., 2011). Las vacunas usadas en la campaña son cepas vivas que confieren inmunidad contra brucelosis y se aplican a hembras de preferencia, con resultados serológicos negativos previos (Díaz et al., 2000). La vacuna S19 se usó para controlar la brucelosis bovina en México hasta 1997, año en que su uso se descontinuó ya que genera persistencia de títulos serológicos que dificultan el diagnóstico porque in-terfiere en el control de la brucelosis animal; además, puede inducir fiebre que causa aborto hasta en 5 % de las hembras gestantes vacunadas. No obstante, a solicitud de productores y profesionales veterinarios se reintrodujo su venta al mercado nacional en 2006 (Aguilar et al., 2011). La cepa S19 en vacas adultas suele excretarse de manera activa en leche, esto es poco frecuente, pero puede presentarse durante el

INTRODUCTION

Brucellosis is a zoonosis that affects animal and human species (Acha and Szyfres, 2001). In Mexico, brucellosis is an infectious disease of

great impact due to the economic losses it generates in the national livestock and its effect on public health. Among the main sources of infection for humans there are unpasteurized dairy products, such as artisanal fresh cheese of cow contaminated by origin with Brucella abortus (López Merino et al., 1992, Guzmán et al., 2016). According to the Secretaria de Salud (Ministry of Health), during the second quarter of 2018, 539 cases of human brucellosis occurred in Mexico, of which nine corresponded to the state of Veracruz (SSA, 2018). Because Mexico is an endemic area of brucellosis, in 1973 the National Commission against Brucellosis (CONABRU, acronym in Spanish) was created. In accordance with the NOM-041-ZOO-1995 “National Campaign against Brucellosis in Animals”, published in the Federation Official Gazette (in Spanish, Diario Oficial de la Federacion or DOF), and with the aim of preventing the disease, vaccination became mandatory for bovine, caprine and ovine females located in areas under control and eradication, and optional for those located in free zones (Aguilar et al., 2011). The vaccines used in the campaign are live strains that confer immunity against brucellosis and are applied to females of preference, with previous negative serological results (Diaz et al., 2000). The S19 vaccine was used for the control of bovine brucellosis in Mexico until 1997, when S19-vaccine use was discontinued as it generated persistence of serological titers that hinder diagnosis because of interference in the control of animal brucellosis. In addition, it can induce fever that causes abortion in up to 5 % of vaccinated pregnant females. However, at the request of producers and veterinary professionals, their sale was reintroduced to the national market in 2006 (Aguilar et al., 2011). Strain S19 in adult cows is usually actively excreted in milk, this is rare, but it may occur during the year after vaccination (Martínez et al., 2006). In a study carried out in adult cows from three to four years, during a complete reproductive cycle, Pacheco et al. (2012) were able to determine the intermittent excretion of vaccine strain S19 in milk and urine of vaccinated cows. Both the vaccine strain and the field


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año posterior a la vacunación (Martínez et al., 2006). En un estudio realizado en vacas adultas de tres a cuatro años, durante un ciclo reproductivo comple-to, Pacheco et al. (2012) determinaron la excreción intermitente de la cepa vacunal S19 en leche y orina de vacas vacunadas. La cepa vacunal y las cepas de campo, por ser lisas, exhiben la presencia de las ca-denas laterales “O” del lipopolisacarido (LPS) y esta similitud complica el diagnóstico por la necesidad de diferenciarlas. Desde 1997 utiliza la vacuna RB51 que al carecer de cadenas laterales, tiene la ventaja de que no induce la presencia de anticuerpos que produzcan interfe-rencia diagnóstica con las pruebas de rutina oficiales establecidas en la NOM-041-ZOO-1995, con lo que permite diferenciar los animales vacunados de los infectados (Peniche et al., 2008). Respecto a las pruebas diagnósticas, la técnica actual con mayor precisión para determinar la pre-sencia de Brucella spp. es el cultivo bacteriológico (Leal-Klevezas et al., 1999). Sin embargo, esta técni-ca tiene serios inconvenientes que dificultan su uso generalizado: el largo tiempo necesario para obtener el aislamiento bacteriano, el riesgo de contagio para el personal, la posibilidad de contaminación del me-dio con otras bacterias, y la gran concentración de Brucella spp. necesaria en la muestra para lograr un aislamiento exitoso (Pacheco y Mosquera, 2015). Por lo tanto, la inoculación de animales de laboratorio es una estrategia para potenciar un aumento en la con-centración de bacterias que favorezca el aislamiento y la recuperación exitosa desde los tejidos animales (Martínez et al., 2008). Ahora hay varias técnicas moleculares para el diagnóstico de Brucella spp. que permiten una identificación rápida, eficiente y sensible a partir de diversas muestras biológicas (Álvarez-Ojeda et al., 2015; Gulbaz y Kamber, 2016). No obstante, las técnicas moleculares no pueden reconocer si la cantidad de material en la muestra es suficiente para provocar una infección en el humano, lo cual si es posible mediante el modelo murino. Por lo anterior, el objetivo de la presente in-vestigación fue identificar la presencia de B. abortus en muestras de queso fresco artesanal de leche de vaca recolectado en cinco centros de acopio de la zona centro del estado de Veracruz, mediante un modelo de infección murino y su confirmación por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

strains, because they are smooth, exhibit the presence of the “O” side chains of lipopolysaccharide (LPS) and this similarity complicates the diagnosis due to the need to differentiate them. Since 1997, the RB51 vaccine is used. Given that it lacks side chains, RB51 has the advantage that it does not induce the presence of antibodies that produce diagnostic interference with the official routine tests established in NOM-041-ZOO-1995, with what allows to differentiate the vaccinated animals from the infected ones (Peniche et al., 2008). Regarding the diagnostic tests, the most accurate technique to determine the presence of Brucella spp. is the bacteriological culture (Leal-Klevezas et al., 1999). However, this technique presents serious drawbacks that hinder its widespread use: the long time needed to obtain bacterial isolation, the risk of infection for personnel, the possibility of contamination of the drug with other bacteria, and the high concentration of Brucella. spp. needed in the sample to achieve successful isolation (Pacheco and Mosquera, 2015). Therefore, the inoculation of laboratory animals is a strategy to promote an increase in the concentration of bacteria that promotes isolation and successful recovery from animal tissues (Martínez et al., 2008). Now there are several molecular techniques for the diagnosis of Brucella spp. that allow rapid, efficient and sensitive identification from various biological samples (Álvarez-Ojeda et al., 2015; Gulbaz and Kamber, 2016). However, molecular techniques cannot recognize whether the amount of material in the sample is sufficient to cause an infection in humans, which is possible through the murine model. Therefore, the objective of the present investigation was to identify the presence of B. abortus in samples of artisanal fresh cow milk cheese collected in five collection centers in the central area of the state of Veracruz (Mexico), through a model of murine infection and further confirmation by the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR).

MATERIALS AND METHODS

Study design

The research was conducted on samples collected in five collection centers in the municipalities of Acajete, Coatepec, Medellin, Tlalixcoyan and Veracruz-Ignacio de la Llave located in the central area of the state of Veracruz (Mexico). One hundred

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MATERIAL Y MÉTODOS

Diseño del estudio

La investigación se realizó en muestras recolectadas en cinco centros de acopio en los municipios de Acajete, Coatepec, Me-dellín, Tlalixcoyan y Veracruz-Ignacio de la Llave ubicados en la zona centro del estado de Veracruz. Cien muestras de queso fresco artesanal de vaca se recolectaron de acuerdo con la NOM-109-SSA1-1994 durante mayo y junio de 2017, que corresponden a la época de secas en esta región.

Análisis microbiológico

De cada muestra de queso se agregaron 10 g a matraces que contenían 100 mL de medio de caldo pre-enriquecido con soya tripticasa (Difco, EUA) y se incubaron 24 h a 37 °C en una estufa de cultivo (ECOSHEL HI-162, EUA). Este caldo contenía 5 % de suero de bovino estéril (SBE) y un suplemento selectivo de Brucella (Oxoid, EUA) con una mezcla de polimixina B, bacitra-cina, natamicina, ácido nalidíxico, nistatina y vancomicina (Díaz et al., 2000). Después, de cada matraz se tomó una muestra del cultivo y se sembró por estría continua con un hisopo estéril en placas de agar de soya tripticasa (TSA) adicionado con 5 % de SBE y el suplemento selectivo de Brucella. Las placas se incuba-ron 5 a 12 d a 37 °C; la mitad de las placas se mantuvo en una atmósfera aerobia y la otra mitad en una atmósfera de CO2 de 5 %a 10 %. Las colonias con morfología sugestiva de Brucella spp. se seleccionaron, se sub-cultivaron en Agar Brucella (Difco, EUA) y se identificaron mediante pruebas bioquímicas con base en la producción de H2S, ureasa, agar TSI, así como su sensibilidad a fucsina y tionina (Alton et al., 1976).

Extracción de ADN

El ADN se obtuvo de las muestras mediante el método de extracción fenol-agua modificado (Rezania et al., 2011). Diez gramos de queso se maceraron con 10 mL de solución salina fisiológica, y 500 L de la muestra macerada se centrifugaron a 1500 g para obtener un pellet al cual se adicionaron 15 L de lisozima. Esta mezcla se colocó en hielo por 45 min, se agregaron 100 L de solución STEMP (SDS 10 %, Tris-HCl 1M, EDTA 0.5M, H2O estéril) y 15 L de proteinasa k, se mantuvo 1 h a 60 °C y se mezcló en un vórtex cada 10 min. Luego se agregó una solución de fenol bufferado (PBS) 1:1, se centrifugó 15 min a 21 500 g para separar la fase acuosa que se trasvasó a un tubo de polipropileno (Eppendorf) y se añadieron 750 L de acetato de potasio y etanol absoluto en una proporción 1:2, se agitó por inversión, se decantó y se evaporó hasta que el pellet quedó

samples of cow milk artisanal fresh cheese were collected according to NOM-109-SSA1-1994 during May and June 2017, which correspond to the dry season in this region.

Microbiological analysis

From each cheese sample, 10g were deposited in flasks containing 100 mL of broth medium pre-enriched with trypticase soy (Difco, USA) and incubated 24 h at 37 °C in a culture oven (ECOSHEL HI-162, USA). This broth contained 5 % sterile bovine serum (SBE) and a selective supplement of Brucella (Oxoid, USA) with a mixture of B-polymyxin, bacitracin, natamycin, nalidixic acid, nystatin and vancomycin (Diaz et al., 2000). Then, a culture sample was taken from each flask and streaked with a sterile swab on trypticase soy agar plates (TSA) supplemented with 5 % SBE and Brucella selective supplement. The plates were incubated from 5 to 12 at 37 °C; half of the plates were kept in an aerobic atmosphere and the other half in a 5 % to 10 % CO2 atmosphere. The colonies with suggestive morphology of Brucella spp. were selected, sub-cultivated in Brucella Agar (Difco, USA) and identified by biochemical tests based on the production of H2S, urease, TSI agar, as well as their sensitivity to fuchsin and thionin (Alton et al., 1976).

DNA extraction

The DNA was obtained from the samples by the modified phenol-water extraction method (Rezania et al., 2011). Ten grams of cheese were macerated with 10 mL of physiological saline solution, and 500 L of the macerated sample was centrifuged at 1500 g to obtain a pellet to which 15 L of lysozyme was added. This mixture was placed on ice for 45 min, 100 L of STEMP solution (10 % SDS, 1M Tris-HCl, 0.5M EDTA, sterile H2O) and 15 L of k-proteinase were added; mixture was kept at 1 °C for 60 h and mixed in a vortex every 10 min. Then a solution of buffered phenol (PBS) 1:1 was added, centrifuged 15 min at 21 500 g to separate the aqueous phase that was transferred to a polypropylene tube (Eppendorf) and 750 L of potassium acetate and absolute ethanol were added in a ratio 1:2; mixture was stirred by inversion, decanted and evaporated until the pellet was completely dry. The DNA was resuspended in a TE solution (1M Tris-HCl, 0.5M EDTA, sterile H2O) 10: 1 and frozen at 20 °C until processed.

Endpoint PCR identification

The PCR reaction was performed with the oligonucleotides F4 (5’-TCGAGCGCCCG CAAGGGG-3 ‘ ) and R2 (5’-AACCATAG-TGTCTCCACTAA-3’) directed to the 16S



completamente seco. El ADN se resuspendió en una solución TE (Tris-HCl 1M, EDTA 0.5M, H2O estéril) 10:1 y se congeló a 20 °C hasta su procesamiento.

Identificación por PCR punto final

La reacción de PCR se realizó con los oligonucleótidos F4 (5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3’) y R2 (5’-AACCATAG-TGTCTCCACTAA-3’) dirigidos al gen 16S rRNA, según Padilla et al. (2003). que amplifican a 900 pb. El volumen final usado fue 25 L y contenía 13 L de RedTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma, EUA), 7 L de agua grado ABM libre de RNasas (Thermo Scientifics, EUA), 1 L de cada oligonucleótido (dNTPs) y 3 L de ADN de la muestra. Los ciclos de reacción para la identificación de Brucella spp. fueron: un ciclo de desnaturalización inicial de 95 °C por 10 min, 30 ciclos a 95 °C por 30 s, 30 ciclos a 54 °C por 90 s, 30 ciclos a 72 °C por 90 s y una extensión final a 72 °C por 10 min.

Identificación por PCR multiplex

La identificación se realizó con la amplificación de B. abortus (cepa vacunal RB51) y los siguientes iniciadores: RB51-1 (5’-TTA AGC GCT GAT GCC ATT TCC TTC AC- 3’) y RB51-2 (5’-GCC AAC CAA CCC AAA TGC TCA CAA- 3’), según Vemulapalli et al. (1999), que amplifica un producto de 1298 pb a partir del gen wboA. Para la amplificación de la cepa vacunal S19 se utilizaron los iniciadores ERY-I (5’TTG GCG GCA AGT CCG TCG GT 3’) y ERY-II (5’CCC AGA AGC GAG ACG AAA CG 3’), de acuerdo con Sangari et al. (2000), cuyo producto de amplificación es de 361 pb que corresponde a los genes eryC-eryD. Las cepas control para RB51 amplifican un producto de 1298 pb, mientras que las cepas control no vacunales dan una amplificación de 1063 pb. La PCR se realizó con un volumen final de 50 L que contenía 25 L de amortiguador RedTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma, EUA), 19 L de agua grado ABM libre de ARNasas (Thermo Scientifics, EUA), 1 L de cada oligonucleótido (dNTPs) y 2 L de ADN de cada muestra. Los ciclos de reacción para la identificación de Brucella spp. fueron: un ciclo de desnaturalización inicial de 94 °C por 5 min, 30 ciclos a 94 °C por 1 min, un ciclo de 59 °C por 30 s, un ciclo de 72 °C por 1.5 min y una extensión final por 5 min a 72 °C. Los productos de amplificación se observaron en geles de agarosa al 1% en TAE 0.5X teñidos con bromuro de etidio (0.5 g mL1) con un marcador molecular de 1000 a 3000 pb (Plus ADN Ladder Thermo Scientific). La cámara de electroforesis se colocó en una fuente de poder a 1000 V durante 60 min para observar los pro-ductos amplificados.

rRNA gene, according to Padilla et al. (2003) that amplify to 900 pb. The final volume used was 25 L and it contained 13 L of RedTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma, USA), 7 L of RNAses-free ABM water grade (Thermo Scientifics, USA), 1 L of each oligonucleotide (dNTPs ) and 3 L of sampled DNA. The reaction cycles for the identification of Brucella spp. were: an initial denaturation cycle at 95 °C for 10 min, 30 cycles at 95 °C for 30 s, 30 cycles at 54 °C for 90 s, 30 cycles at 72 °C for 90 s and a final extension at 72 °C for 10 min.

Multiplex PCR identification

The identification was made with the amplification of B. abortus (vaccine strain RB51) and the following primers: RB51-1 (5’-TTA AGC GCT GAT GCC ATT TCC TTC AC-3 ‘) and RB51-2 (5’-GCC AAC CAA CCC AAA TGC TCA CAA- 3 ‘), according to Vemulapalli et al. (1999), which amplifies a 1298 bp product from the wboA gene. For the amplification of the S19 vaccine strain, the ERY-I primers (5’TTG GCG GCA AGT CCG TCG GT 3 ‘) and ERY-II (5’CCC AGA AGC GAG ACG AAA CG 3’) were used, according to Sangari et al. (2000), whose amplification product is 361 bp corresponding to the eryC-eryD genes. The control strains for RB51 amplify a product of 1298 bp, while the non-vaccine control strains give an amplification of 1063 bp. PCR was carried out with a final volume of 50 L containing 25 L of RedTaq ReadyMix PCR Reaction Mix buffer (Sigma, USA), 19 L of RNAses-free ABM-grade water (Thermo Scientifics, USA), 1 L of each oligonucleotide (dNTPs) and 2 L of DNA from each sample. The reaction cycles for the identification of Brucella spp. were: an initial denaturation cycle of 94 °C for 5 min, 30 cycles at 94 °C for 1 min, a cycle of 59 °C for 30 s, a cycle of 72 °C for 1.5 min and a final extension for 5 min at 72 °C. The amplification products were observed in 1 % agarose gels in TAE 0.5X stained with ethidium bromide (0.5 g mL1) with a molecular marker of 1000 to 3000 bp (Plus DNA Ladder Thermo Scientific). The electrophoresis chamber was placed in a power source at 1000 V for 60 min to observe the amplified products.

Murine infection model

In the study 10 sexually mature female mice (Mus musculus), with a body weight of 30 to 50 g, were used and housed in plexiglass boxes (30 cm long, 20 cm wide and 15 cm high) washed, disinfected and with 24 h of ventilation. The adaptation protocol was of 8 d, during which water (250 mL) and food (8 g) were provided, in accordance with the provisions of the animal welfare regulations of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics of the Universidad Veracruzana. At the end of the adaptation

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period and after evaluating the health of each female mouse, they were inoculated. Two suspensions were used for the inoculation: 1) the first contained 100 mL of trypticase soy broth (TSB) (Difco, USA) plus Farrell selective supplement (Oxoid, USA), 10 % of the positive sample to the S19 vaccine strain and 5 % SBE, and incubated for 6 to 8 h at 37 °C; 2) the second was prepared with ultrapasteurized milk (UHT) added only with Farrell selective supplement (Oxoid, USA). The 10 female mice were separated into two groups and inoculated with 1 mL intraperitoneally. The first group was inoculated with the TSB medium containing the sample, and the second group (control group) was inoculated with UTH milk. To determine whether there was seroconversion induced by the S19 strain of B. abortus identified by PCR from artisanal fresh cheese, in all inoculated female mice a serological card test (PRONABIVE, Mexico) was performed for B. abortus at a concentration of 8 %, on days 7, 14 and 21 after inoculation. Blood from the retro-orbital sinus was extracted from each female mouse with capillary tubes, which were sealed with a Bunsen burner and kept in a horizontal position to allow the formation of a clot and facilitate the release of blood serum. The blood samples were centrifuged 5 min at 21 500 g, to obtain 30 L of serum to which an equal volume of antigen was added for the card test which was mixed for 4 min on a glass plate to show agglutination. The sacrifice of the female mice was carried out on the 21st day after the inoculation by cervical dislocation (NOM-062-ZOO-1999) and the necropsy was performed under sterile conditions to extract the liver, spleen, kidneys and bone marrow of the femur bone. Samples from each organ were seeded in duplicate in boxes with TSA agar (Difco, USA) with a supplement of Farrell selective medium (Oxoid, USA) and 5 % SBE. Half of the boxes were incubated at 37 °C under aerobiosis and the other half under CO2 pressure for 10 d, with a daily check-up from the third day on. The colonies with suggestive morphology of the genus Brucella spp. they were selected to perform confirmatory biochemical tests (Alton et al., 1976; Diaz et al., 2000).

Statistical analysis

The frequency of isolations of Brucella spp. it was calculated with the online program Vassarstats with the results of PCR and of the inoculated female mice.

RESULTS AND DISCUSSION

A presumptive colony of Brucella spp. (1.0 %, 95 % CI: 0.5-6.24) was isolated by conventional microbiology from only one sample of artisanal

Modelo de infección murino

En el estudio se usaron 10 ratonas (Mus musculus) sexualmente maduras, con un peso corporal de 30 a 50 g, y se alojaron en cajas de plexiglás (30 cm de largo, 20 cm de ancho y 15 cm de altura) lavadas, desinfectadas y con 24 h de ventilación. El protocolo de adaptación fue de 8 d, durante los cuales se proporcionó agua (250 mL) y alimento (8 g), de acuerdo con lo establecido por el reglamento de bienestar animal de la Facultad de Medicina Ve-terinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana. Al término del periodo de adaptación y después de valorar la salud de cada ratona, se inocularon. Para la inoculación se usaron dos suspensiones: 1) la pri-mera tenía 100 mL de caldo de soya tripticasa (TSB) (Difco, EUA) más suplemento selectivo de Farrell (Oxoid, EUA), 10 % de la muestra positiva a la cepa vacunal S19 y 5 % de SBE, y se incubó por 6 a 8 h a 37 °C; 2) la segunda se preparó con leche ultrapasteurizada (UHT) más suplemento selectivo de Farrell (Oxoid, EUA). Las 10 ratonas se separaron en dos grupos y se inocularon con 1 mL por vía intraperitoneal. El primer grupo se inoculó con el medio de TSB que contenía la muestra, y el segundo (grupo testigo) se inoculó con leche UTH. Para determinar si existía seroconversión inducida por la cepa de S19 de B. abortus identificada por PCR a partir del queso fresco artesanal, en todas las ratonas inoculadas se realizó una prueba serológica de tarjeta (PRONABIVE, México) para B. abortus a una concentración de 8 %, durante los días 7, 14 y 21 después de la inoculación. De cada ratón se extrajo sangre del seno retro-orbital con tubos capilares, los cuales se sellaron con un mechero bunsen y se mantuvieron en posición horizontal para permitir la forma-ción de un coágulo y facilitar la liberación de suero sanguíneo. Las muestras de sangre se centrifugaron 5 min a 21 500 g, para obtener 30 L de suero al cual se añadió un volumen igual de antígeno para la prueba de tarjeta que se mezcló por 4 min en una placa de vidrio para evidenciar la aglutinación. El sacrificio de las ratonas se realizó el día 21 después de la inoculación mediante dislocación cervical (NOM-062-ZOO-1999) y la necropsia se efectuó en condiciones de esterilidad para extraer hígado, bazo, riñones y médula ósea del hueso fémur. Muestras de cada órgano se sembraron por duplicado en cajas con agar TSA (Difco, EUA) con un suplemento de medio selectivo de Farrell (Oxoid, EUA) y 5 % de SBE. La mitad de las cajas se incubó a 37 °C bajo aerobiosis y la otra mitad bajo presión de CO2 durante 10 d, con una revisión diaria desde el tercer día. La colonias con morfología sugestiva del género Brucella spp. se seleccionaron para realizar las pruebas bioquímicas confir-matorias (Alton et al., 1976; Díaz et al., 2000).



fresh cheese from the production center of Veracruz, Veracruz. The bacterial growth in the cultures of other samples was limited due to contamination by other bacteria present in the samples that prevented reaching the biochemical identification. According to Ilhan et al. (2008), the success of bacteriological methods depends on the viability, the number of colony forming units (CFU) in the sample and the contamination with other types of bacteria. Furthermore, for an isolation to be successful from dairy products and that these can cause infection in the consumer, the concentration of bacteria must be 100 CFU g1 or mL1 of sample (Lopez et al., 1991). The presumptive sample from the Veracruz production center analyzed by the PCR technique was positive (Figure 1), with an amplification product of 900 bp, according to the indicated sequence of the 16S rRNA of Brucella spp. (Padilla et al., 2003). When the multiplex PCR technique was performed in this sample, an amplification of 361 bp was obtained (Figure 2), which coincides with the S19 strain of B. abortus. Martínez et al. (2005) identified the presence of two S19 vaccine strains in milk samples with the same amplification product, and Miyashiro et al. (2007) found strain S19 in 81.08 % of mature cheese samples in Brazil with PCR, but without achieving successful isolation. The most important disadvantages of the vaccine strain S19 are: 1) the development of post-vaccine antibodies, which, being a smooth strain, interferes with the conventional serological diagnosis due to the fact that its structure presents antigens with smooth (LPS) lipopolysaccharides, which are also found in smooth vaccine strains such as S19 of B. abortus and Rev-1 of B. melitensis, as well as in field strains; 2) they are live attenuated vaccines that can cause disease in humans (Martinez et al., 2011). Likewise, strain S19 is actively excreted in the milk of cows vaccinated in adulthood (Diaz et al., 2000), and it can be a risk if it is not applied correctly in the dose and at the appropriate age of the female subjects to vaccination. The results obtained with the murine infection model by serology by Card Test with 8 % antigen of B. abortus and the conventional bacteriological examination in organs were negative. It should be noted that mice inoculated with vaccinal strains of B. abortus eliminate the agent rapidly around four weeks after inoculation, because there is low virulence of the microorganism and little persistence in the tissues of

Análisis estadístico

La frecuencia de aislamientos de Brucella spp. se calculó con el programa en línea Vassarstats con los resultados de PCR y de las ratonas inoculadas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Una colonia presuntiva a Brucella spp. (1.0 %; IC95%: 0.5-6.24) se aisló por microbiología con-vencional desde solo una muestra de queso fresco artesanal procedente del centro de producción de Veracruz, Veracruz. El crecimiento bacteriano en los cultivos de otras muestras estuvo limitado debido a la contaminación por otras bacterias presentes en las muestras que impidió llegar a la identificación bioquímica. Según Ilhan et al. (2008), el éxito de los métodos bacteriológicos depende de la viabilidad, del número de unidades formadoras de colonia (UFC) en la muestra y de la contaminación con otro tipo de bacterias. Además, para que un aislamiento sea exitoso desde productos lácteos y que estos puedan causar infección en el consumidor, la concentración de bacterias debe ser 100 UFC g1 o mL1de muestra (López et al., 1991). La muestra presuntiva del centro de producción de Veracruz analizada por la técnica de PCR, fue positiva (Figura 1), con un producto de amplificación de 900 pb, de acuerdo con la secuencia indicada del 16S rRNA de Brucella spp. (Padilla et al., 2003). Cuando en esta muestra se realizó la técnica de PCR multiplex se obtuvo una amplificación de 361 pb (Figura 2), la cual coincide con la cepa S19 de B. abortus. Martínez et al. (2005) identificaron la presencia de dos cepas vacunales S19 en muestras de leche con el mismo producto de amplificación, y Miyashiro et al. (2007) encontraron la cepa S19 en 81.08 % de muestras en quesos maduros en Brasil con PCR, pero sin lograr un aislamiento exitoso. Las desventajas más importantes de la cepa vacunal S19 son: 1) el desarrollo de anticuerpos post-vacunales, que al tratarse de una cepa lisa interfiere con el diag-nóstico serológico convencional debido a que en su estructura presenta antígenos con lipopolisácaridos (LPS) lisos, los cuales se encuentran en cepas vacu-nales lisas como la S19 de B. abortus y la Rev-1 de B. melitensis, así como en las cepas de campo; 2) son vacunas vivas atenuadas que pueden causar enferme-dad en el humano (Martínez et al., 2011). Además,

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Figura 1. Perfil electroforético de PCR punto final para la identificación de Brucella spp. a partir de muestras de queso fresco artesanal de vaca. Carril 1: Brucella abortus S19. Carril 2: Brucella melitensis 16M. Carril 3: Muestra positiva de queso fresco del centro de acopio de Veracruz QV8. Carril 4: Brucella abortus 832. Carril 5: Brucella melitensis REV-1. Carril 6: Brucella abortus RB51. Carril 7: Brucella abortus S19. Carril 8: Muestra de leche sin pasteurizar del centro de acopio Veracruz. Carril 9: Brucella abortus 2303. Carril 10: Muestra de leche sin pasteurizar negativa. Carril 11: Muestra de queso negativo. Carril 12: Testigo negativo. Carril 13: marcador de peso molecular de ADN (100 a 3000 pb).

Figure 1. Electrophoretic profile of endpoint PCR for Brucella spp. identification from cow milk artisanal fresh cheese samples. Track 1: Brucella abortus S19. Track 2: Brucella melitensis 16M. Track 3: Positive sample of fresh cheese from the QV8 collection center in Veracruz. Track 4: Brucella abortus 832. Track 5: Brucella melitensis REV-1. Track 6: Brucella abortus RB51. Track 7: Brucella abortus S19. Track 8: Unpasteurized milk sample from the collection center in Veracruz. Track 9: Brucella abortus 2303. Track 10: Negative unpasteurized milk sample. Track 11: Negative cheese sample. Track 12. Negative Control sample. Track 13: Molecular (100 to 3000 pb) DNA marker.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

900 pb

Figura 2. Perfil electroforético de PCR multiplex para la identificación de cepa vacunal S19 a partir de muestras de queso fresco artesanal de vaca. Carril 1: Brucella abortus S19. Carril 2: Brucella abortus RB51. Carril 3: Brucella abortus 2308. Carril 4: Muestra positiva de queso fresco del centro de acopio de Veracruz QV8. Carril 5: Testigo negativo. Carril 6: marcador de peso molecular de ADN (100 a 3000 pb).

Figure 2. Electrophoretic profile of Multiplex PCR identification of S19 vaccinal strain from artisanal fresh cow milk cheese samples. Track 1: Brucella abortus S19. Track 2: Brucella abortus RB51. Track 3: Brucella abortus 2308. Track 4: Positive sample of fresh cheese from the QV8 collection center in Veracruz. Track 5: Negative control sample. Track 6: Molecular (100 to 3000 pb) DNA marker.

1 2 3 4 5 6

361 pb



la cepa S19 se excreta de manera activa en la leche de vacas vacunadas en edad adulta (Díaz et al., 2000), y puede ser un riesgo si no se aplica de forma correcta en la dosis y a la edad adecuada de las hembras sujetas a vacunación. Los resultados obtenidos con el modelo de in-fección murino mediante serología por Prueba de Tarjeta con antígeno al 8 % de B. abortus y el examen bacteriológico convencional en órganos fueron nega-tivos. Cabe destacar que los ratones inoculados con cepas vacunales de B. abortus eliminan el agente de forma rápida alrededor de cuatro semanas después de la inoculación, porque hay una baja virulencia del microorganismo y poca persistencia en los tejidos de los animales inmunizados (Martínez et al., 2008). La utilización de animales de laboratorio para determi-nar la presencia de Brucella spp. puede dar diferentes resultados porque: 1) depende de manera estricta de la concentración inicial de UFC en la muestra usada, ya que la concentración mínima necesaria para gene-rar infección es 100 UFC mL1 o g de muestra; 2) hígado, bazo y nódulos linfáticos son los órganos en que con mayor frecuencia se puede recuperar las bacterias después de la inoculación (Alton et al., 1976; Martínez et al., 2008). La ausencia de seroconversión en las ratonas inoculadas puede indicar la falta de viabilidad o de la baja concentración de la cepa S19 en la muestra de queso. Sin embargo, la PCR punto final por ser una prueba más sensible y específica ayuda a identificar Brucella spp. y, en combinación con la PCR multiplex, permite determinar la especie y el tipo de cepa (Martínez et al., 2006; Miyashiro et al., 2007). Martínez et al. (2006) identificaron cepas vacuna-les contra brucelosis en la leche de vacas vacunadas, lo cual es relevante porque indica que los procesos de vacunación no se realizan de forma adecuada. En términos oficiales, una becerra de 3 a 6 meses de edad debe vacunarse con la cepa S19 o RB51 a una dosis de 6 a 121010 UFC, y una hembra bovina mayor de 6 meses, incluso si está gestante, se puede vacunar con una dosis de 3108 a 3109 UFC. Esta vacunación por una sola vez suele ser suficiente para garantizar una sólida inmunidad de por vida al animal (NOM-041-ZOO-1995). No obstante, una hembra vacunada como becerra podrá ser revacunada una sola vez hasta los 22 meses de edad con la dosis de 3108 a 3109 UFC (Aguilar et al., 2011). Si no se respetan estos lineamientos, es posible que la cepa vacunal se elimine a través de leche, lo cual es un riesgo para la

the immunized animals (Martinez et al., 2008). The use of laboratory animals to determine the presence of Brucella spp. it can yield different results because: 1) it depends strictly on the initial concentration of CFU in the sample used, since the minimum concentration necessary to generate infection is 100 CFU mL1 or g of sample; 2) Liver, spleen and lymph nodes are the organs in which the bacteria can be recovered most frequently after inoculation (Alton et al., 1976; Martinez et al., 2008). The absence of seroconversion in the inoculated female mice may indicate the lack of viability or the low concentration of strain S19 in the cheese sample. However, the PCR endpoint for being a more sensitive and specific test helps to identify Brucella spp. and, in combination with multiplex PCR, allows to determine the species and type of strain (Martinez et al., 2006, Miyashiro et al., 2007). Martinez et al. (2006) identified vaccine strains against brucellosis in the milk of vaccinated cows, which is relevant because it indicates that the vaccination processes are not carried out properly. In official terms, a calf of 3 to 6 months of age should be vaccinated with strain S19 or RB51 at a dose of 6 to 121010 CFU, and a bovine female older than 6 months, even if pregnant, can be vaccinated with a dose of 3108 to 3109 CFU. This one-time vaccination is usually enough to guarantee a strong lifelong immunity to the animal (NOM-041-ZOO-1995). However, a female vaccinated as a calf may be revaccinated only once until 22 months of age with a dose of 3108 to 3109 CFU (Aguilar et al., 2011). If these guidelines are not respected, it is possible that the vaccine strain is eliminated through milk, which represents a risk to public health and for the animals to become ill with the vaccine strains (OIE, 2004). The identification of the S19 vaccine strain in the sample of artisanal fresh cow milk cheese by PCR was possible because the sensitivity of the technique is 50 ng. The murine model showed that the amount of sample of fresh artisan cow cheese inoculated did not have the feasibility or sufficient concentration to cause infection, although Lopez et al. (1991) suggest that strain S19 can cause infection at a concentration of 80 CFU g1. Furthermore, the concentration of the S19 vaccine strain in the inoculated cheese sample could be insufficient to invade the murine tissues where 100 CFU g1would be necessary, and this prevented its subsequent isolation.

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salud pública y para que los animales enfermen con las cepas vacunales (OIE, 2004). La identificación de la cepa vacunal S19 en la muestra de queso fresco artesanal de vaca por PCR fue posible porque la sensibilidad de la técnica es 50 ng. El modelo murino evidenció que la cantidad de muestra de queso fresco artesanal de vaca inoculada no tenía la viabilidad o la concentración suficiente para causar infección, aunque López et al. (1991) sugieren que la cepa S19 puede causar infección a una concentración de 80 UFC g1. Aún más, la concentración de la cepa vacunal S19 en la muestra de queso inoculada pudo ser insuficiente para invadir los tejidos del murino donde serían necesario 100 UFC g1, y ello impidió su posterior aislamiento. El realizar un diagnóstico rápido y eficaz es necesario para controlar varias enfermedades; sin embargo, para la identificación de Brucella spp. el cultivo bacteriológico es la prueba estándar, si bien puede ser difícil realizar esta técnica (Leal-Klevezas et al., 1999; Pacheco y Mosquera, 2015). En un estudio con queso fresco artesanal elaborado con leche de vaca sin pasteurizar, Colorado Galán et al. (2015) mediante PCR encontraron una frecuencia de 2.1 % (IC95 %: 0.0-6.6) de Brucella spp., pero con microbiología convencional la bacteria no se pudo evidenciar en estos quesos procedentes de la zona centro del estado de Veracruz. Como se observa en nuestro estudio, la técnica de PCR es una me-todología confiable para identificar la presencia de B. abortus en muestras de queso fresco, por lo cual la inoculación de animales de laboratorio es una estrategia para potenciar un aumento en la concen-tración de bacterias que favorezca el aislamiento y la recuperación exitosa desde tejidos animales, porque se considera correcto evaluar las vacunas vivas en estos modelos murinos (Díaz et al., 2000), como lo demostraron Martínez et al. (2008) quienes usaron ratonas albinas (Mus musculus) como modelo de infección para Brucella spp. y aislaron la cepa RB51 de B. abortus. En México, el consumo de quesos elaborados con leche sin pasteurizar es una práctica común, por lo que la notificación de casos de brucelosis humana en el país continuará a pesar de los esfuerzos realizados por las instancias gubernamentales para lograr un control de la enfermedad mediante la vacunación animal. Por lo tanto, además de esta estrategia, es indispensable que la leche empleada en la preparación de productos

Making a quick and effective diagnosis is necessary to control several diseases. However, for the identification of Brucella spp. bacteriological culture is the standard test, although it can be difficult to perform this technique (Leal-Klevezas et al., 1999; Pacheco and Mosquera, 2015). In a study with fresh artisanal cheese made from unpasteurized cow milk, Colorado-Galan et al. (2015) by PCR found a frequency of 2.1% (IC95 %: 0.0-6.6) of Brucella spp., but with conventional microbiology the bacteria could not be evidenced in these cheeses from the central zone of the state of Veracruz. As observed in our study, the PCR technique is a reliable methodology to identify the presence of B. abortus in samples of fresh cheese, so the inoculation of laboratory animals is a strategy to enhance an increase in the concentration of bacteria that favors isolation and successful recovery from animal tissues, because it is considered correct to evaluate live vaccines in these murine models (Diaz et al., 2000), as demonstrated by Martinez et al. (2008) who used female albino mice (Mus musculus) as an infection model for Brucella spp. and isolated the RB51 strain of B. abortus. In Mexico, the consumption of cheese made with unpasteurized milk is a common practice, so the notification of cases of human brucellosis in the country will continue despite the efforts made by government agencies to achieve control of the disease through the animal vaccination. Therefore, in addition to this strategy, it is essential that the milk used in the preparation of dairy products is subjected to pasteurization to prevent human brucellosis.

CONCLUSIONS

The presence of the S19 vaccine strain of Brucella abortus in samples of artisanal fresh cow milk cheese was identified by the multiplex PCR in this study and S19 strain represents a risk to public health. Although the amount of Colony Formation Units (CFU) inoculated in the female mice was insufficient to make the infection clear, the PCR technique did identify the presence of a vaccine strain of Brucella spp., which is why it is the technique of choice for a faster diagnosis, reliable and effective to identify Brucella species in fresh artisanal cow cheeses.

—End of the English version—



lácteos sea sometida a la pasteurización para prevenir la brucelosis humana.

CONCLUSIONES

La presencia de la cepa vacunal S19 de Brucella abortus en muestras de queso fresco artesanal de leche de vaca se identificó por la reacción de PCR multiplex en este estudio y representa un riesgo para la salud pública. A pesar de que la cantidad de UFC inoculada en las ratonas fue insuficiente para hacer patente la infección, la técnica de PCR sí identificó la presencia de una cepa vacunal de Brucella spp., por lo cual es la técnica de elección para un diagnóstico más rápido, confiable y eficaz para identificar especies de Brucella en quesos frescos artesanales de vaca.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue apoyada por el proyecto PRODEP Apoyo a la Integración de Redes Temáticas de Colaboración Académica No. DSA/I03.5/I5/I4220 titulado “Caracterización fenotípica y genotípica de la resistencia a antimicrobianos en cepas de Brucella spp.” así como al equipo del Laboratorio de Microbiología CENID-INIFAP por el apoyo brindado, así como el uso de las instalaciones para el diagnóstico molecular.

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