imobilisasi antibodi t4 pada parfikel magnetdigilib.batan.go.id/e-prosiding/file...
TRANSCRIPT
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN
IMOBILISASI ANTIBODI T4 PADA PARfIKEL MAGNET
Ratnawati Kukuh, Daniel SantosoPusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional
AHSTRAKIMOBILISASI ANTIBODI T4 PADAPARTlKEL MAGNET. Metode pemisahan antigen
terikat dari antigen bebas merupakan komponen esensial dari sistem RIA. Dalam penelitianini dikembangkan metode pemisahan fase padat dengan tujuan menghindarkan penggunaanalat sentrifugasi, sehingga diharapkan Kit RIAfase padat dapat digunakan secara lebih luas.Untuk maksud ini antibodi diimobilisasikan pada partikel magnet sebagai penunjang padatdengan pengikatan secara kimiawi menggunakan l,l-karbonil-diimidazol (CD!). Antibodiyang digunakan perlu dalam bentuk IgG -T4 murni. Pemurnian dilakukan denganmenggunakan protein-A-sepharosa dan diperoleh fraksi IgG-T4sebesar 610 l1g/ml.Antibodiyang telah diimobilisasikan ini ditentukan titernya. Untuk memperoleh daerah kerja yangdiinginkan, ditentukan volume pereaksi dan waktu inkubasi optimal. Data percobaanmenunjukkan bahwa disain penentuan dengan 50111larutan baku T4/cuplikan, 50 111T4bertanda 1251,dan 50 111suspensi IgG-T4-partikel magnet serta waktu inkubasi 2 jammemberikan hasil yang cukup peka pada daerah keIja yang diperlukan, yaitu antara 25 >1500 nmol/l. Evaluasi lebih lanjut dari hasil kinerja penentuan menunjukkan bahwa kityang telah dibuat sebanding dengan kit buatan DPC dan Amersham. Untuk mengujikestabilan suspensi IgG- T4 partikel magnet dilakukan penentuan waktu kadaluwarsa (shelflife). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa untukjangka waktu lebih kurang 5bulan masihcukup stabil. Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa pemisahan fasa padatmenggunakan partikel magnet memberikan hasil yang cukup memuaskan.
ABSTRACTIMMOBILIZATION OF T4 ANTIBODIES ON MAGNETIC PARTICLES An efficient
method to separate bound from free antigen is an essential component ofa radioimmunoassaysystem. In the present study a solid phase separation method has been developed with theaim to avoid centrifugation and thus enabling more extensive use of radioimmunoassay kitsin hospitals where centrifuges are not available. Antibodies were immobilised onto magnetisedparticles as solid support by means of chemical binding using 1,1-carbonil-diimidazole (CDI).The antibodies to be immobilized should be in the form of purified T4-lgG. Purification wasperformed using Protein-A-Sepharose and a fraction containing 0.610 I1g/mlof T4 wasobtained. The titre of the immobilized antibodies was then determined. Assay design wasoptimised by determining the reagent volumes and length of incubation time suitable for thedesired working range. An assay design using 50111ofT4 standard solution or sample, 50 111of 1251_labeledT4and 50 111of magnetised T4- IgG suspension was found to yield reasonablysensitive results in the working range of interest, i.e. between 25 -> 1500 nmol/l. Furtherevaluation showed that the in-house kit performs comparably with those produced by DPCand Amersham. Stability testing was carried out to determine shelflife. Experimental resultsshowed that up to about 5 months the kits are fairly stable. In general it can be concludedfrom the data obtained, that satisfactory results are obtained using a solid phase separationmethod employing magnetic particles.
PENDAHULUAN
Metode RIA untuk penentuan T4 sudahmerupakan cara pengujian yang rutin digunakan, termasuk di antaranya Kit RIA-T4PPTNyang menggunakan cara pemisahan antibodikedua (second antibody) dan larutan polietilenglikol dalam fase cairoUntuk keperluan rumahsakit metode pemisahan yang menggunakanfase pad at dinilai lebih ekonomis.
Sistem pemisahan fase padat mulai dikembangkan dengan tujuan menghindarkan peng-
gunaan alat sentrifugasi yang diperlukan padapemisahan dalam fase cair, sehingga diharapkan bahwa Kit RIA fase padat dapat digunakansecara lebih luas, terutama pada rumah- rumahsakit yang belum atau tidak mempunyai alatsentrifugasi.
Salah satu bagian terpenting dalam sistempenentuan imunoradio adalah suatu prosedurefisien untuk memisahkan antigen yang terikatpada antibodi terhadap antigen bebas. Pada pe-
312
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Teknologi Menuju Era Tinggal Landas
misahan dengan cara fase padat antibodi diimobilisasikan pada suatu penunjang padat (3,5).
Pada penelitian ini sebagai penunjang fasepadat dipakai partikel magnet (magnetic solidphase microbead) yang pengikatannya dilakukan secara kimiawi menggunakan 1,1- karbonil-diimidazol (CD!). Dengan digunakannyapartikel magnet sebagai cara pemisah fasepadat, maka tidak diperlukan penggunaan alatsentrifugasi. Antigen yang terikat dapat mudahdipisahkan dengan menggunakan pelat magnetik. Pemisahan cara ini sangat sederhana, mudah, efisien, spesifik, memberikan nilai ikatantak spesifik (NSB) rendah, dan dapat dikerjakan dalam waktu yang relatif singkat (4).
Antibodi yang akan diimobilisasikan padapartikel magnet haruslah IgG-T4 yang murni.Pada penelitian ini pemurnian dilakukan dengan menggunakan kolomprotein-A- sepharosa(1,2). IgG-T4yang telah dimurnikan kemudiandiimobilisasikan pada partikel magnet dengancara kimiawi menggunakan 1,1-karbonil- diimidazol (CDI)(4).
Hasil imobilisasi antibodi diuji dengan melakukan penentuan titer. Titer ditentukan dengan cara menginkubasi berbagai variasi volume suspensi IgG-T4partikel magnet dengan sejumlah tertentu antigen radioaktif. Pada akhirinkubasi fraksi terikat dipisahkan menggunakan pelat magnetik, dan persen ikatan BIT(fraksi terikatl keaktifan total) dapat ditentukan.
Disain dan optimasi penentuan dilakukandengan menentukan volume pereaksi dan waktu inkubasi optimal untuk memperoleh daerahkeIja yang diinginkan.
Pengujian kinerja penentuan (assayperformance) dilakukan dengan mengevaluasinilai besaran karakteristik yang diperlukan untuk penentuan imunoradio, misalnya besaranikatan tak spesifik (NSB), ikatan maksimum(Borr), konsentrasi pada 50% BlBo (Ed 50), koefisien variasi antar penentuan cuplikan kontroldan penentuan profil presisi. Sebagai pembanding digunakan kit RIA-l'4tabung bersalut produksi DPC dan kit RIA-T4cara magnetik produksi Amersham.
Untuk menguji kestabilan suspensi IgG-T4partikel magnet, dilakukan penentuan waktukadaluwarsa (shelf life).
Tujuan penelitian ini adalah untuk menjajaki pembuatan kit RIAfase padat dengan mempelajari imobilisasi antibodi 1'4 pada partikelmagnet.
Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BAT/1N
BAHAN DAN TATI\. KERJA
BAHAN DAN PERA U TAN
Bahan yang digunakan
Antibodi yang digunakan adalah antibodihasil penelitian yang terdahulu (6), protein Asepharosa produksi Pharmacia. Larutan daparfosfat O,lM pH 7,4, larutan dapar borat 0,05 MpH 9,6, larutan dapar glisin-HCI pH 2,8, larutandapar Tris, larutan dapar bikarbonat pH 8, danlarutan dapar asetat pH 4. Partikel magnetyang telah ditempeli cm diperoleh dari IAEA.Ase- ton, etanolamin dari E. Merck. Kit RIA'r 4cara magnetik produksi Amersham dan kitRIA-T4 tabung bersalut (coated tube- 1'4)produksi DPC.Peralatan
Peralatan yang digunakan adalah alat pe11.
cacah sinar y (Miniassay type 6-20), pH metBr(Metrohm Herisau E 520),pelat magnetik, kornputer IBMIPC, program disket dari IAEA, pipetependorf dengan ukuran 51l1,10III,50 Ill, 100~Ll,tabung reaksi, dan alat suntikan.TATA KERJA
Pemurnian Antibodi
Pemurnian antibodi 1'4 dilakukan denganmenggunakan kolom protein- A-sepharosa (~~).Ke dalam suntikan plastik berukuran 2,5 rnldimasukkan 0,3 g protein A-sepharosa dan 2 rnldapar fosfat 0,1 M pH 7,4. Campuran dikocokdan dibiarkan mengembang selama 15 menit.Setelah mengembang ke dalam kolom kemudian dimasukkan 500 IIIantibodi 1'4yang telahdilarutkan dalam 1ml dapar fosfat 0,1 M pH 7,4.Agar seluruh y-globulin teradsorpsi ke dalamkolom protein-A-sepharosa, maka larutan antibodi dikocok bersama dengan seluruh isi kolomdan dibiarkan selama 30 menit. Kolom kemudian dielusi dengan dapar fosfat 0,1 M pH 7,4.Penampungan dilakukan sebanyak 9 fraksi dantiap fraksi berisi 2 ml. Hasil setiap fraksi ditentukan resapannya dengan spektroskopi UV pada panjang gelombang 280 nm. Setelah resapanmenurun, kolom dicuci dengan 3 ml NaCI 0,9%.Untuk mendesorpsi IgG-T4dari isi kolom, maImkolom dielusi kembali dengan dapar glisin-HCIpH 2,8.Eluat ditampung sebanyak 6 fraksi masing-masing 2 ml dalam vial berisi 1 ml daparTris. Fraksi yang mengandung IgG dapat ditentukan resapannya dengan spektroskopi UV pada panjang gelombang 280 nm. Fraksi IgGdikumpulkan dan didialisis dalam dapar boratpH 9,6 selama 24 jam pada suhu 4°C. Untukmenghitung kadar IgG yang diperoleh,
313
Proreemngs Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
ditentukan sekali lagi resapannya dandibandingkan dengan baku IgG.
lmobilisasi hasil pemurnian antibodi T4 padapartikel magnet
Mula-mula botol yang berisi partikel magnet yang telah ditempeli CDI dalam aseton dikocok perlahan-Iahan hingga diperoleh campuranpartikel magnet yang homogen. Ke dalam vialberukuran 50 ml dimasukkan 10 ml campuranpartikel magnet-CDI-aseton. Partikel diendapkan dengan menggunakan pelat magnetik dan,kemudian dicuci berturut-turut 4 kali dengan 20ml akuades dan 4 kali dengan 20 ml daparbikarbonat pH 8. Setelah dilakukan pencucian,ke dalam partikel magnet tersebut ditambahkan 0,5 ml IgG anti T4 hasil pemisahan dandapar bikarbonat pH 8 hingga volume keseluruhannya menjadi 10 m!. Campuran kemudiandiputar (rotate» selama 24 jam pada suhu y"a
mar. Partikel magnet yang telah diimobilisasidengan IgG anti T4 ini kemudian diendapkandicuci berturut-turut 2 kali dengan 20 ml daparbikarbonat pH 8, dan terakhir dengan 20 mldapar bikarbonat yang mengandung etanolamin (3mlfl). Partikel diendapkan, disuspensiknn dalam 20 ml dapar bikarbonat yang mengandung etanolamin (3 mlfl), kemudian dalam20 ml dapar asetat pH 4. Suspensi dilakukan 30menit pada suhu kamar sambil diputar. Selanjutnya, partikel diendapkan kembali dan dicuci2 kali dengan 20 ml dapar fosfat.
Penentuan titer antibodi yang telah diimobilisasi pada partikel magnet
Titer antibodi ditentukan dengan melakukan suatu seri percobaan menggunakanjumIsh suspensi partikel magnet yang berbeda. Kedalam suatu seri tabung reaksi dimasukkan 5,10, 20, 50, 100, 200 J.lIsuspensi partikel magnetyang telah diimobilisasi dengan antibodi T4 .Untuk memperoleh jumlah volume yang sarnaditambahkan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5.Selanjutnya ke dalam setia p tabung ditambahkan 100J.llT4bertanda 1251. Campuran diinkubasi sambil diputar selama 2 jam pada suhu kamar.Setelah inkubasi ke dalam campuran tersebutditambahkan 1 mllarutan dapar pencuci (daparfosfat 0,05 M pH 7,5, 0.5% tween 20). Partikelmagnet yang mengandung fraksi terikat diendapkan menggunakan pelat magnetik. Endapan dicuci dengan 1mllarutan dapar pencuci dankeaktifannya dicacah dengan menggunakanpencacah sinar y.
Ban-dung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN
Penentuan daerah herja dengan kepekaan yangdiinginkana). Pembuatau kurva baku dan kurva profil
presisi dengan jumlah suspensi antibodi T4magnetik yang memberikan 50% peru nutterikat.
Untuk pembuatan kurva baku digunakan25 J.lliarutan baku T4dengan konsentrasi 0,10,50, 100, 150, dan 250 nmol/l. Kemudian ditambahkan 100 J.lIT4 bertanda 1251 dan 100 J.lIsuspensi antibodi T4-magnetik. Campuran diaduk dengan pengaduk vortex, diinkubasi sambildiputar selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya ke dalam campuran ditambahkan 1 mllarutan dapar pencuci. Partikel magnet yangmengandung fraksi terikat dipisahkan denganpelat magnetik. Endapan kemudian dicuci dengan 1 ml larutan dapar pencuci dan keaktifannya ditentukan dengan pencacah sinary. Protokol RIA untuk percobaan ini dapat dilihatpada Tabel1 ( lihat halaman berikut).
Dari hasil percobaan kemudian dibuatgrafik antara fraksi terikat dan konsentrasi T4serta grafik profil presisi yang menggambarkanhubungan antara % koefisien variasi (% CV)dengan konsentrasi.b). Penentuan volume pereaksi optimal untuk
mendapatkan daerah kerja dengan kepekaan yang diinginkan.
Untuk maksud ini dilakukan berbagaikombinasi dengan disain percobaan sebagaiberikut:1. 25 J.lIlarutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda
1251,100 J.lIsuspensi T4 magnetik.2.50 J.lI larutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda
1251, 100 J.lIsuspensi T4 magnetik.3.25 J.lI larutan baku T4, 50 J.lIT4 bertanda
1251,50 J.lIsuspensi T4 magnetik.4. 100 J.lIlarutan baku T4, 100 J.lIT4bertanda
1251, 100 J.lIsuspensi T4 magnetik.5. 50 J.lI larutan baku T4, 50 J.lIT4 bertanda
1251,50 J.lIsuspensi T4 magnetik.Percobaan dilakukan sesuai dengan pro
tokol RIA yang tertera pada Tabel1. Dari seluruh percobaan kemudian dibuat grafik antarafraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafikprofil presisi.
5. Optimasi waktu inkubasi
Optimasi inkubasi diperoleh dari variasiwaktu.Pembuatan kurva baku dan kurva profilpresisi dikerjakan sesuai percobaan di atasdengan lama inkubasi 1, 2, 4, dan 24 jam padasuhu kamar.
314
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdun Teknologi Menuju Era Tinggal Landas
Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
Tabell. Protokol RIA-T4 menggunakan pemisah paartikel magnet-
Volume BlangkoKonsentrasi baku T (nmol/l)pembanding
Uti )01050100150250cuplika.n( I!l)
T15free serum
-25------ -
1 1-T4100100100100100100100100100
Larutan baku--252525252525 -
Suspensi antibodiT 4-100"100100100100100100100
partikel magnet Cuplikan
-------- 25
1nkubasi selama 2 iam pada suhu kamar sambil diputar
- Tambahkan 1 mllarutan dapar pencuci- Pisahkan partikel magnet dengan menggunakan pelat magnetik- Pisahkan supernatan dan tentukan keradioaktifan dari endapan..- Suspensi partikel; magnet-CD1 tanpa antibodi
6. Pengujian karakteristik RIA T4 caramagnetik
Setelah diperoleh disain penentuan secaraoptimal maka langkah selanjutnya dilakukanpengujian beberapa parameter pengendalianmutu internal (internal quality control) yangmenggambarkan karakteristik suatu kit RIA.Hal ini dilaksanakan dengan mengevaluasi nilai besaran: ikatan tak spesifik (NSB), ikatanmaksimum (Botr), konsentrasi yang memberikan 50% BlBo (Ed 50) dan koefisien variasiantar penentuan (interassay) cuplikan kontrolserta profil presisi. Sebagai pembanding digunakan kit RIA-T4 tabung bersalut produksiDPC, dan kit RIA-T4 cara magnetik produksiAmersham.
HASILDAN DISKUSI
Dalam penggunaan RIAdengan sistem pemisahan fase padat, antibodi spesifik diimobilisasikan pada suatu penunjang fase padat sebelum assay dilakukan. Untuk maksud ini dibutuhkan antibodi dengan kemurnian, titer,spesifisitas dan aviditas yang tinggi, sebabhanya antibodi dengan sifat tersebut di atasyang memungkinkan terjadinya ikatan antaraantigen dengan antibodi fase padat dan diperolehnya hasil penentuan dengan kepekaantinggi (3).Antibodi dengan titer rendah kurangbaik untuk penentuan RIA fase padat, sebabantigen yang terikat (%Bo/T) sangat rendah.Hal ini akan memberikan bentuk kurva bakulandai yang akan mengurangi kepekaan danpresisi percobaan.
Untuk memperoleh antibodi yang memenuhi persyaratan agar dapat diimobilisasikan
pad a penunjang padat, maka dilakukanpemurnian antibodi T4' Dari berbagai cara, terbukti bahwa pemurnian menggunakan proteinA- sepharosa adalah yang terbaik (2). Dengancara ini diperoleh fraksi 19G-T4 sebesar H10I!g/ml.
Sebelum dilakukan imobilisasi pada partikel magnet, ditentukan terlebih dahulujumlahantibodi maksimum, dan dari hasil percobaanternyata penambahan 0,5 ml 19Ganti T4 memberikan hasil yang optimum. Hasil imobilisasiantibodi pada permukaan partikel magnet diujidengan melakukan penentuan titer. Dari kuX"Vatitrasi 19G-T4fase padat pada Gambar 1 dapatdisimpulkan, bahwa dengan volume suspensi19G-T4-partikel magnet sebesar 50- 100I!lmemberikan hasil yang cukup baik untuk penentuan RIA,yaitu yang memberikan 50%perunutterikat. Dengan kondisi tersebut selanjutnyadilakukan disain dan optimasi assay. Untukmaksud tersebut dilakukan penentuan volumepereaksi dan waktu inkubasi optimal. Data penentuan hasil optimasi dari berbagai kombinasivolume pereaksi dapat dilihat pada Gambar 2dan Tabel 2, dan data hasil optimasi variasiinkubasi dapat dilihat pada Tabel 3. Terbuktibahwa disain penentuan dengan 50 I!l larutanbaku T4 (cuplikan), 50 I!l T4-bertanda 1251Clan50 I!l suspensi 19G-partikel magnet serta waktu inkubasi 2 jam memberikan percobaan yangcukup peka pada daerah kerja yang diinginkan,yaitu antara 25 - >1500 nmol/l. Nilai normal T4berkisar antara 60 - 150 nmol/l. Data menunjukkan bahwa volume pereaksi mempengaruhibatas deteksi. Bila diinginkan penentuan pnda
315
Pror:eedings Seminar Reakror Nuklir dalam Penelitian Sainsclan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas
•".
"
30
'.,i
,0L . 12'5 10 "'50 25 'Ii kel magnet200 '~ Volume par
Gambar 1. Kurva hasil penentuan titer IgG-T4pa rtikel magnet.
Bandung, 8 -10 Okrober 1991PPTN - BATAN
Tabel 2..-
KombinaslBarrEd 50Batas profil
pereaksi
(%)(nmoI/l)presisi(nmoI/l)1.25 !AIbaku
50,993,744 - >1323
50 !AI1251T- 4
50 !Alanti-T4 magnetik2.50 !AIbaku
53,4114,753,4 - 900
100 !AI1251-T4 100 !AIanti-T4magnetik3.100 !AIbaku
47,057,428,0->2000
100 !AI1251_T4 100 !Alanti-T4magnetik4.50 !AIbaku
51,649,525,0 - 650
50 !AI1251-T4 50 !AIanti-T4magnetik5.25 !AIbaku
56,5237,3180 -)1800100 !AI1251-T4 100 !AIanti-T4magnetik
100 !AIX, 100 !AIY, 100 !AIZ;
Gambar 2. Kurva baku dan profil presisi padaberbagai kombinasi pereaksi.
B = fraksi terikat; Bo = fraksi pada konsentrasiO·,X = Iarutan baku; Y = 1251-T4 ; Z = IgG-T4partikel magnet.
50
"CV
a
•. . \... '. ..••....
\<':,:~;;~~;~.;:~-.~,<'_i\.~~,~,. _..• '"
~ SO 100 500 1000 nmolll 5000Konsentrasi
Tabel 3. Hasil variasi waktu inkubasi
Waktu BolTEd 50Batas profilinkubasi
(%)(nmoI/l)presisi(nmoI/l)1jam
75,946,121 - 700
2 jam76,255,825 - > 1500
4jam72,055,625 - 650
24jam62,359,929 - 600
daerah konsentrasi rendah, maka dibutuhkanvolume cuplikanyang Iebih besar. Faktor utamayang mempengaruhi waktu inkubasi ialah aviditas antibodi yang digunakan. Makin tinggiaviditas suatu antibodi, maka waktu yang dibutuhkan untuk mencapai keseimbangan makinpendek. Hal lain yang berpengaruh adalah bobot molekul antigen yang akan ditentukan.Mengingat bahwa T4mempunyai bobot molekul777, maka untuk mencapai keseimbangan tidakdibutuhkan waktu inkubasi yang terlalu lama.Untuk memperoleh kepekaan analisis dan pre-
316
Proceedings Seminar ReMwr Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas
Bandung, 8- 10 Okwber lS91PPTN - BATiW
.untuk kadar rendah, menengah dan tinggi. Darihasil pengujian kinerja penentuan dapat disimpulkan bahwa ketiga kit tersebut mempunyaipersamaan karena tidak menunjukkan perbedaan yang nyata .
Untuk menguji kestabilan suspensi IgG··T4partikel magnet dilakukan penentuan waktukadaluwarsa. Hasil pengamatan menunjukkanbahwa suspensi partikel magnet tersebut ma:sihcukup stabil untuk jangka waktu lebih kurang5 bulan. Hasil dapat dilihat pada Tabel 5.
sisi percobaan yang lebih baik biasanya dibu- berturut-turut untult kadar rendah, menengahtuhkan waktu inkubasi yang lebih lama. dan tinggi. Untuk h~ RIA-T4 tabung bersalut
Hasil pengujian kinerja penentuan (assay produksi DPC diperoleh nilai ikatan tak spe-performance) dapat dilihat pada Tabel 4. sifik (4,5 ± 0,5)%, ikatan maksimum (55,5 ±
Data percobaan menunjukkan bahwa 3,1)%, konsentrasi pada 50% B/Bo: (115,5 ±penggunaan IgG-T4 partikel magnet sebagai 13,3)nmol/l dan untuk cuplikan kontrol mempemisah rase padat pada kit PPTN memberikan berikan nilai (34,8 ± 6,1) nmol/l, (88,5 ± 6,5)nilai ikatan tak spesifik (NSB) berkisar antara nmol/l, dan (144,8 ± 6,9) nmol/l berturut-turut
Tabel 4. Hasil pengujian kinerja penentuan dari berbagai macam kit
PPTNAmershamDPC
(magnetik)(magnetik)(coated tube)
Borr (%)
54,2 ± 8,373,7 ± 3,255,5 ± 3,1Kemiringan
1,06 ± 0,091,06 ± 0,051,04 ± 0,04Ed 50 (nmol/l)
44,9 ± 5,055,5 ± 1,9115,5 ± 13,3NSB (%)
3,9 ± 0,63,8± 0,44,5 ± 0,5Cup. rendah (nmol/l)
37,7 ± 3,534,2 ± 0,734,8 ± 6,1Cup.menengah
96,2 ± 5,294,1 ± 1,588,5 ± 6,5(nmol/l) Cup. tinggi (nmol/l)
146,3 ± 6,7149,7 ± 7,9144,8 ± 6,9
(3,9 ± 0,6)%, ikatan maksimum (Bo/T)(54,2 ±8,3)%. Konsentrasi 50% B/Bo (Ed 50) diperolehnilai (44,9 ± 5,0) nmol/l dari 9 kali penentuan.Penentuan cuplikan kontrol antar assay memberikan hasil (37,7± 3,5) nmol/l untuk cuplikankadar rendah, (96,2± 5,2)nmol/l untuk cuplikankadar menengah, dan (146,3± 6,7) nmol/l untukcuplikan kontrol kadar tinggi. Untuk kit RIA-T4cara magnetik produksi Amersham diperolehnilai-nilai ikatan takspesifik (3,8± 0,4)%,ikatanmaksimum (73,7± 3,2)%,konsentrasi pada 50%B/Bo :(55,5 ± 1,9)nmol/l dan untuk cuplikankontrol memberikan nilai (34,2 ± 0,7) nmol/l,(94,1 ± 1,5) nmol/l, dan (149,7 ± 7,9)nmol/l
Tabel 5. Hasil penentuan kestabilan suspensi IgG-T4 partikel magnet
Waktu0141119
(minggu)Borr (%)
55,461,664,559,753,2Kemiringan
0,91,11,01,20,9Ed 50 (nmol/l)
45,943,846,037,433,9NSB (%)
3,14,44,44,810,1QC-A (nmol/l)
34,532,335,838,348,8QC-B (nmol/l)
101,288,8106,294,199,4QC-C(nmol/l)
159,8147,4142,6145,0162,5
Catatan : Batas nilai cuplikan kontrol
QC-A: 32,3 - 46,5 nmol/l; QC-B : 87,6 - 104,0 nmol/l; QC-C : 138,0 - 163,0 nmol/l.
317
Prcx<eedingsSerrU/'UU"Reahtor Nuklir dalam Penelitian Sainsclan Tekrwlogi Menuju Era TInggal Landas
KESIMPUIAN:Pemisahan fase padat menggunakan par
tikel magnet memberikan hasil yang cukup mem\.:laskan.Hasil penelitian ini diharapkan akan
DAFfAR PUSTAKA
Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
sangat bergun..l untuk pembuatan Kit RIA-T4fase padat.
1. Gembicki, M., A. Polanska, J. Kosowicz, "T3dan T4 solid phase radioimmunoassay with theIspesificantibodies isolated by affinity chromatography", Radioimmunoassay and Related Pro.:;edurein Medicine, 1982, IAEA,Vienna (1982) 95-105.
2. Nanny, K H. dan kawan-kawan, "Isolasi imunogamaglobulin anti-T4 dari antisera", SeminarPendayagunaan Reaktor Nuklir untuk Kesejahteraan Masyarakat, PPTN- BATAN, Bandung (1990).
3. Edward, R., "Solid-phase immunoassay", Regional Training Course on Production and Useof Bulk Reagents for RIA of Thyroid Related Hormones, Bangkok, Thailand (1986).
4. Sufi, S. and Micallef, J., "Immobilisation of antibodies", International Atomic Energy AgencyRegional Course on Optimisation of Production Techniques and Distribution Schemes forReagents for Radioimmunoassay, National Institute of Health Nonthabury, Thailand (1989).
5. Catt, KJ., Niall, H.D., Tregear,G.W., Solid-phase radioimmunoassay of .human growth hormone, Biochem.J. 100 (1966) 31c.
6. Ratnawati K., dan Pringgo Soedigdo, "Pembuatan antibodi T4 untuk bahan pereaksi RIA",Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuklir untuk Kesejahteraan Masyarakat , PPTN-BATAN,Bandung (1990).
DISKUSI
Nanny Kartini:1. Bila dilihat dari hasil percobaan membandingkan RIA-magnetik yang dibuat dengan kit RIAkomersiallain, terlihat bahwa ED-50 dari partikel magnetik 49 nmol/l sedangkan DPC = 115nmol/l. Apakah yang menyebabkan perbedaan ini ?2. Berapakah kadar normal dari T4 ?Ratnawati K :1. Biasanya Ed-50 berada disekitar daerah normal T4 dan terlihat bahwa pada kit DPC, ED-50nya cenderung lebih tinggi, ini berarti bahwa kit DPC lebih peka di daerah tinggi. Ed50 daripartikel magnet PPTN = 49 nmol/l, walaupun ED-50 nya berbeda cukup besar, tetapi masihmencakup daerah kerja yang cukup lebar yaitu antara 25 - > 1500 nmol/l, sehingga perbedaanED-50 antara kit DPC dan kit PPTN partikel magnet tidak berpengaruh besar.2. Kadar normal dari T4 adalah 60 - 150 nmol/l.
n[)onSuparman :Mohon dijelaskan prinsip penempelan antibodi T4 pada partikel magnet!Ratnawati Kukuh:Prinsip penempelan antibodi T4 pada cellulosa-partikel magnet adalah sebagai berikut :Penempelan dilakukan secara kimia dengan terlebih dahulu mereaksikan cellulosa-partikel
magnet + CDI (carboni! di imidazol). Selanjutnya antibodi T4 (gugus amida pada antibodi T4 )bereaksi dengan gugus carbonil dari CD!.
318