improved solid-phase extraction method for systematictoxicological analysis in biological fluids
DESCRIPTION
Improved Solid-Phase Extraction Method for SystematicToxicological Analysisin Biological FluidsTRANSCRIPT
Improved Solid-Phase Extraction Method for SystematicToxicological Analysis
in Biological Fluids
PRINSIP KERJA
Penetapan kadar senyawa asam, netral dan basa yang diekstraksi dari cairan biologis
dengan SPE kolom C8-kation exchange dan dideteksi dengan menggunakan GC-NPD
TINJAUAN SIFAT FISIKO KIMIA SENYAWA TARGET
Senyawa target : Senyawa asam, netral dan basa.
Senyawa pengotor : - Dalam darah : protein, metabolit dan sel darah
- Dalam urin : metabolit
Medium : cairan biologis (darah dan urin)
Tinjauan Sifat Fisiko Kimia
Senyawa Asam, contohnya phenobarbital, fenitoin dan internal standar (alobarbital)
- Phenobarbital
- pKa : 7,4
- Kelarutan : Larut dalam 1000 bagian air; 8 bagian etanol; 40 bagian
kloroform; 13 bagian eter; 700 bagian benzena
- Jarak Lebur : 174-178 °C
- Fenitoin
- pKa : 8,3
- Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air; larut dalam 60 bagian etanol;
500 bagian kloroform; 30 bagian aseton; 600 bagian eter
- Jarak Lebur : 295-298 °C
- Alobarbital
- pKa : 7,8
- Kelarutan : Larut dalam 700 bagian air; 15 bagian etanol; 20 bagian
eter; larut dalam larutan basa
- Jarak Lebur : 173 °C
Senyawa Basa, contohnya morfin, MDMA, kokain, diazepam, lidokain dan internal
standar (nalorphine, trihexylamine dan prazepam)
- Morfin
- pKa : 8 dan 9,9
- Kelarutan : 1 bagian larut dalam 17,5 bagian air, dalam 100 bagian
etanol, sangat mudah larut dalam campuran kloroform-
isopropanol dan praktis tidak larut dalam eter
- Jarak Lebur : 254-256°C
- MDMA
- pKa : Pada pH 9 dalam benzene (9,41), hexane (8,69), etil asetat
(8,84)
- Kelarutan : larut dalam etil asetat, benzen, dan heksan
- Jarak Lebur : 100-110 °C
- Kokain
- pKa : 8,6
- Kelarutan : Larut dalam 600 bagian air; 6,5 bagian etanol; 0,7 bagian
kloroform; 3,5 bagian eter; larut dalam etil asetat dan
aseton
- Jarak Lebur : 98 °C
- Diazepam
- pKa : 3,3
- Kelarutan : Sedikit larut dalam air; larut dalam 25 bagian etanol; 2
bagian kloroform; 39 bagian eter
- Jarak Lebur : 131-135 °C
- Lidokain
- pKa : 7,9
- Kelarutan : Tidak larut dalam air; larut dalam etanol, kloroform,
benzena dan eter
- Jarak Lebur : 68-69 °C
- Nalorphine
- pKa : 7,8
- Kelarutan : Agak sukarlarut dalam air dan eter; larut dalam etanol,
aseton dan kloroform
- Jarak Lebur : 208 °C
- Trihexylamine
- pKa : -
- Kelarutan : -
- Jarak Lebur : <75 °C
- Prazepam
- pKa : 2,7
- Kelarutan : Larut dalam etanol dan kloroform
- Jarak Lebur : 145-146°C
SKEMA KERJA
pH diatur agar berada dalam rentang 4-
4,5, divortex kemudian dipanaskan pada
suhu 60-65ºC selama 2 jam
pH diatur agar berada dalam rentang 4-
4,5, divortex kemudian dipanaskan pada
suhu 60-65ºC selama 2 jam
+ 0,1 ml Internal Standar
Sampel BiologisSampel Biologis
AsamAsam BasaBasa
Pretreatment Sampel
Sifat Analit
Khusus sampel urin, terlebih
dahulu dihidrolisis dengan
penambahan enzim β-
glucuronidase
Khusus sampel urin, terlebih
dahulu dihidrolisis dengan
penambahan enzim β-
glucuronidase
Disonifikasi selama 10 menitDisonifikasi selama 10 menit
Seluruh jenis sampel dilarutkan dalam 1
ml aquadest
Seluruh jenis sampel dilarutkan dalam 1
ml aquadest
pH diatur agar berada dalam rentang 8-
8,5 dengan penambahan dapar fosfat pH
8
pH diatur agar berada dalam rentang 8-
8,5 dengan penambahan dapar fosfat pH
8
+ 0,1 ml Internal Standar
Dilarutkan dalam 1 ml dapar
fosfat pH 6
Dilarutkan dalam 1 ml dapar
fosfat pH 6
Disonifikasi selama 10
menit
Disonifikasi selama 10
menit
pH diatur agar berada dalam
rentang 6-6,5 dengan
penambahan 1M KOH atau 1M
HCl
pH diatur agar berada dalam
rentang 6-6,5 dengan
penambahan 1M KOH atau 1M
HCl
Disonifikasi kembali selama 10 menitDisonifikasi kembali selama 10 menit
Disentrifugasi selama 10 menit pada
kecepatan 2500 rpm
Disentrifugasi selama 10 menit pada
kecepatan 2500 rpm
SPE (Solid Phase Extraction)SPE (Solid Phase Extraction)
GC-NPD
SPE Senyawa Asam
- 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol
(80:20), lalu dikeringkan dengan vakum
selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min
- 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan
dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5
mL/min
- 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan
vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min
Pengkondisian Kolom
- 2 ml metanol
- 2 ml buffer fosfat pH 6
Pemasukan Sampel
Dibiarkan selama 2 menit agar
sampel meresap ke dalam kolom
Pencucian
Pengelusian Analit
kolom dielusi dengan menggunakan 4
ml metilenklorida
Eluat diuapkan pada suhu kamar dengan
bantuan gas nitrogen
SPE Senyawa Basa
2 ml air, laju alir 2 mL/min
2 ml buffer asetat pH 4, laju alir 1 mL/min
Pengkondisian KolomPengkondisian Kolom
2 ml metanol
2 ml air
Pemasukan SampelPemasukan Sampel
Dibiarkan selama 2 menit agar
sampel meresap ke dalam kolom
PencucianPencucian
Pengelusian Analit Tahap 1Pengelusian Analit Tahap 1
kolom dielusi dengan menggunakan 2 ml
asetonitril, eluat ditampung, kolom dibiarkan
mengering dengan vakum selama 2 menit
Eluat
(Benzodiazepin)
Eluat
(Benzodiazepin)
Pengelusian Analit Tahap 2Pengelusian Analit Tahap 2
kolom dielusi kembali dengan menggunakan 4
ml kloroform yang dijenuhkan dengan
ammonia: isopropanol (80:20) (2%)
Eluat (Senyawa Basa Lainnya)Eluat (Senyawa Basa Lainnya)
Ditambahkan dengan 0,1 ml methanol yang diasamkan
(0,1 ml HCl dalam 100 ml methanol) kemudian diuapkan
pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen
Ditambahkan dengan 0,1 ml methanol yang diasamkan
(0,1 ml HCl dalam 100 ml methanol) kemudian diuapkan
pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen
PEMBAHASAN
Senyawa Asam
Preperlakuan sampel
Darah atau urin (2.5 mL) dilarutkan dengan 1 mL bufer fosfat (pH 6), dan
ditambahkan 0,1 mL larutan internal standar (alobarbital). Penambahan bufer fosfat
dtujukan untuk mengatur pH sampel menjadi asam. Dengan demikian senyawa yang
bersifat asam akan berubah menjadi bentuk bebasnya dan nantinya dapat tertambat dalam
fase diam C8 yang bersifat non polar. Sedangkan alobarbital dipilih sebagai internal
standar karena alobarbital jarang digunakan dalam pengobatan ataupun disalahgunakan.
Selain itu alobarbital memiliki sifat fisikokimia dan karakter retensi yang mirip dekat
dengan sebagian besar analit asam. Sampel kemudian disonik selama 10 min, lalu pH
diatur hingga 6-6.5 dengan KOH 1 M atau HCl 1 M. Sampel kemudian disonik kembali
selama 10 min, dilakukan pengaturan pH kembali jika perluhingga 6-6.5. Sampel lalu
disentrifugasi selama 10 min (250 rpm). Sonifikasi bertujuan untuk mencampur sampel
dengan dapar dan internal standar yang telah ditambahkan sebelumnya. Selain itu
sonifikasi bertujuan untuk melepaskan obat dari ikatan protein pada plasma. Pengaturan
pH yang berulangkali bertujuan agar pH sampel tetap sama, terutam pada darah dimana
sering terjadi fluktuasi.Lapisan supernatan kemudian diambil.
Proses SPE
Pengkondisian Kolom
Ditambahkan 2 mL metanol, dikuti 2 mL bufer fosfat pH 6. Kolom dijaga agar
tidak sampai kering. Penambahan metanol bertujuan untuk mengaktifkan kolom,
sedangkan penambahan bufer fosfat pH 6 bertujuan agar kondisi kolom sama dengan
kondisi sampel sehingga analit tetap berada dalam bentuk bebasnya.
Pemasukkan Sampel
Sampel yang telah diberi praperlakuan kemudian dimasukkan. Sampel dibiarkan
meresap pada kolom selama kurang lebih 2 menit. Hal ini bertujuan agar analit dapat
tertambat dengan sempurna pada kolom.
Pencucian
Kolom dicuci berturut-turut dengan:
1. 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol (80:20), lalu dikeringkan dengan vakum
selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min.Campuran ini ditujukan untuk mengganggu
ikatan ionik dan hidrofobik lemah antara pengotor dan penjerap. Campuran ini
mampu mengeleminasi pengotor yang bersifat basa lemah dan kuat, sedangkan
senyawa yang bersifat asam akan tetap tertambat pada penjerap. Hal ini
dimungkinkan karena pH campuran bersifat asam sehingga senyawa yang bersifat
basa akan berubah menjadi bentuk ionnya dan telepas dari penjerap yang bersifat
non polar.
2. 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir
1.5 mL/min. Pencucian dengan asam asetat ditujukan untuk menghilangkan
pengotor lain sementara analit tetap dalam bentuk bebas dan tertambat pada
kolom.
3. 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5
mL/min.Penggunaan n-hexana ini ditujukan untuk mengeleminasi pengotor
seperti lemak. Selain itu n-hexana ini ditujukan untuk mengusir air. Adanya air
akan menyebabkan proses pengeringan sampel nantinya akan menjadi lebih sulit.
Pengelusian analit
Vakum dimatikan lalu kemudian dimasukkan 4 mL metilenklorida untuk
mengelusi analit. Metilenklorida ditampung tanpa menggunakan vakum. Metilenklorida
digunakan sebagai pengelusi karena sifatnya yang non polar, sehingga analit yang bersifat
non polar akan terlarut ke dalamnya. Selain itu, metilenklorida memiliki titik didih yang
rendah (40oC), sehingga mudah dihilangkan. Proses pengelusian ini tidak menggunakan
vakum dan hanya memanfaatkan gravitasi. Hal ini bertujuan agar pelarut dapat
mengalami kontak dengan lebih sempurna dengan analit.
Senyawa Basa
Sampel pretreatment untuk senyawa basa
Darah (2,5 ml) dilarutkan dengan 1 ml air dan 0,1 ml internal standar
(nalorphine 100 mg/l) dan trihexylamine dan prazepam 10
mg/l).Sampel disonik selama 10 menit pada temperatur ruang, pH
diadjust sampai 8-8,5 dengan buffer fosfat pH 8. Penambahan air serta
sonifikasi ini berguna untuk memecah ikatan protein pada sampel.
Internal standar yang digunakan lebih dari 1 jenis, hal ini diakibatkan
karena analit yang diekstraksi memiliki berbagai struktur kimia yang
berbeda, yaitu golongan opiat, golongan amfetamin, golongan kokain
dan golongan benzodiazeopin. Nalorphine dipih sebagai internal
standar karena memiliki profil ekstraksi dan kromatografi yang mirip
dengan morfin. Namun pada senyawa lain hal ini tidak terpenuhi,
karena itu digunakan trihexylamine (THA) untuk internal standar
golongan amfetamin dan kokain. Alasan lain penggunaan dua internal
standar ini adalah waktu retensinya. THA terelusi diawal sedangkan
nalorphine terelusi mendekati akhir dari kromatogram sehingga
memberikan rentang yang luas. Untuk golongan benzodiazepine
digunakan prazepam yang memiliki karakter fisikokimia dan
kromatografi yang sama dengan benzodiazepine. Selain itu prazepam
tidak digunakan dalam drug of abuse maupun obat yang diresepkan.
Penggunaan buffer pH 8 digunakan untuk mengkondisikan analit yang
bersifat basa berada dalam bentuk ion sehingga dapat tertambat
dalam kolom SPE yang penukar ion yang bersifat polar.
Gambar 1. Kromatogram GC-NPD dari fraksi senyawa basa yang diperoleh dari
sampel urin pengguna opiat, kokain dan amfetamin IS2=nalorphine, IS3=THA
Gambar 2. Kromatogram GC-NPD dari fraksi senyawa glongan benzodiazepin yang
diperoleh dari sampel empedu
Sampel disonik kembali selama 10 menit, pH dicek kembali. Hal
ini dilakukan karena setelah sonifikasi tersebut dapat terjadi fluktuasi
pH akibat berat jenis sampel yang tinggi. Sampel lalu disentrifugasi
2500 rpm selama 10 menit, hal ini dilakukan untuk memisahkan
pengotor berupa protein dari matriks sampel berdasarkan perbedaan
berat jenis. Pengotor tersebut akan ada di fase bawah sedangkan analit
ada pada supernatan. Supernatan digunakan kembali untuk ekstraksi
lebih lanjut.
Untuk sampel urin, 2 ml larutan glukoronidase (5000 unit/ml)
ditambahkan dalam 2,5 ml sampel dan pH diadjust hingga 4-4,5.
Sampel lalu divortex, dan diinkubasi pada waterbath pada suhu 60-650
C. Penambahan glukoronidase berguna untuk menghilangkan ikatan
glukoronida, yang biasanya merupakan hasil metabolisme pada
senyawa morfin, kodein dan benzodiazepine, pengaturan pH hingga 4
bertujuan untuk membantu proses hidrolisis glukoronid tersebut.
Setelah 2 jam, pH diatur hingga 8-8,5 dengan buffer pH 8. Prosedur
selanjutnya sama dengan sampel darah.
SPE untuk senyawa basa (termasuk benzodiazepine)
Pengkondisian Kolom
Pertama, kolom diprekondisikan dengan menggunakan 2 ml metanol dan 2 ml air
berturut-turut. Hal ini dilakukan untuk pengaktifan kolom sebelum digunakan untuk
mengekstraksi.Vakum tidak dihidupkan untuk mencegah kolom kering.
Pemasukan Sampel
Sampel yang telah dikondisikan dimasukkan ke dalam kolom. Paling tidak
dibutuhkan 2 menit untuk melewatkan sampel ke dalam kolom agar terserap sempurna
dalam kolom.
Pencucian
Dua ml air (2 ml/menit) dan 2 ml buffer asetat pH 4 dialirkan ke kolom dengan
laju alir 1 ml/menit berturut-turut. Penambahan air digunakan untuk mengelusi senyawa
yang bersifat polar dari dalam kolom, sementara analit yang terikat dalam kolom tidak
ikut terelusi karena air tidak dapat mengganggu ikatan ion antara analit dengan kolom.
Penambahan buffer fosfat selanjutnya akan mengubah analit golongan benzodiazepine
dalam bentuk bebasnya sementara analit golongan lain tetap berada dalam bentuk ionnya.
Benzodiazepine memiliki rentang pKa yang luas dari 1,2-12 serta memiliki dua nilai pKa
(bromazepam, lorazepam, flurazepam, nitrazepam) sehingga dapat berada dalam bentuk
bebas pada pH 4.
Pengelusian
1. Kolom lalu dialiri dengan 2 ml asetonitril dan dielusi tanpa menggunakan vakum.
Asetonitril lalu diuapkan dengan bantuan nitrogen dan direkonstitusi dalam 100 µl
metanol (fraksi C, yang mengandung senyawa benzodiazepin). Karena
benzodiazepine telah berada dalam bentuk bebas, senyawa tersebut dapat terelusi
pada pelarut organic seperti asetonitril yang bersifat semipolar. Sedangkan analit
lain yang berbentuk ion tidak ikut terelusi.
2. Kolom lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit untuk menghilangkan sisa
asetonitril dalam kolom.
3. Kolom dialiri dengan 4 ml kloroform yang dijenuhkan dengan ammonia:
isopropanol (80:20) (2%) tanpa menggunakan vakum, eluat yang diperoleh
ditampung. Dengan menggunakan pelarut kloroform yang dijenuhkan dengan
ammonia yang bersifat basa, dapat mengganggu ikatan antara analit dengan
kolom. Ammonia yang bersifat basa akan memecah ikatan antara analit yang
bersifat ion dengan kolom, sehingga analit akan terpisah dari kolom dan berada
dalambentuk bebas akibat peningkatan pH. Analit yang sudah dalam bentuk
bebasnya ini kemudian akan terelusi oleh campuran pelarut kloroform dan
isopropanol yang bersifat semipolar.
4. Terakhir, 0,1 ml metanol yang diasamkan (0,1 ml HCl dalam 100 ml metanol)
ditambahkan ke dalam fraksi, lalu diuapkan dengan bantuan nitrogen pada suhu
kamar dan direkonstitusi dalam 100 µl metanol (step 7). Penambahan metanol
yang diasamkan dengan HCl ini bertujuan untuk membuat senyawa golongan
amfetamin yaitu MDMA, MDA dan MDEA berada dalam bentuk garamnya,
karena senyawa tersebut dalam bentuk bebasnya mudah menguap.